（发酵工程专业论文）液体深层培养猪苓菌丝体及猪苓多糖的研究.pdf

摘要 摘要 猪苓( g r i f o l au m b e l l a t a ) 是近年来研究、开发的比较多的珍奇药食用菌之一，其多 糖和多糖复合物在抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、增强免疫、降血糖、治疗糖尿病等多方面 具有明显的效果。本实验通过单因素影响试验确定了发酵培养基的碳、氮源，在此研究 基础上，首先运用二水平实验设计对发酵培养基的6 个因素进行筛选，选取了3 个重要因 素进行响应面实验分析。应用s a s 软件进行岭脊分析，得到了最佳培养基组成：蔗糖4 ， 玉米粉1 5 ，豆饼粉3 6 5 ，玉米浆粉o 6 1 ，麸皮0 5 ，k h 2 p 0 40 2 ，m g s 0 40 2 4 。 研究了发酵最佳培养条件为：培养基的起始p h5 0 、温度2 6 、装液量1 0 0 m l 2 5 0 m l 和接种量8 。在这些条件下培养6 天，其菌体干重为4 7 8 l ，胞内多糖产率达3 1 7 9 l 。 在猪苓基础培养基中添加一定量的中草药提取液，以猪苓的菌丝生长量和多糖产量 为指标，筛选出对猪苓菌丝生长和多糖产量有促进作用的中草药：黄芪、薏苡仁、枸杞 子和山药。黄芪、薏苡仁、枸杞子的合适剂量为1 5 0 9 l ，山药的合适剂量为5 0 9 l 。为 利用猪苓深层发酵活性多糖提供了优良配方。 对发酵得到的猪苓菌体胞内多糖的提取工艺条件进行了研究。采用匀浆法处理猪苓 菌丝体时，其最佳提取工艺为：提取温度9 0 c ，水料比为8 ：1 ，提取时间1 5 小时，提 取次数2 次，加3 倍体积的无水乙醇沉淀，醇沉温度4 。在上述条件下，胞内多糖提 取率为5 8 3 m g g 。此外，对不同的提取工艺进行了比较。 对猪苓多糖的性质进行了初步鉴定，研究发现其胞内的总糖含量为7 0 8 8 、单糖 含量为0 9 8 、肽含量为1 7 2 3 。经h p g f c 检测其有效成分峰的分子量为111 6 8 d a 和 7 8 1 6 6 8 d a ，归一化含量为6 0 。胞外多糖总糖含量为6 2 8 6 、单糖含量为o 3 1 、肽 含量为2 4 。5 1 ，有效成分峰的分子量为9 9 1 9 d a ，归一化含量为6 3 ，2 3 。 最后，对猪苓胞内多糖和胞外多糖进行了氨基酸分析，结果表明两者都含有1 7 种 氨基酸，其中必需氨基酸含量分别占氨基酸总量的2 0 1 1 和3 2 0 8 。 关键词：猪苓液体发酵胞内多糖性质鉴定 。 a b i s t r a c t a b s t r a c c 西咖l au m b e l l a t ai sav e r yr a r ep e r e n n i a lm u s h r o o m i t sf r u i t i n gb o d yi sc a l l e d “z h u l i n g ”i nc h i n e s e w h i c hh a sr e c e n t l ya t t r a c t e dc o n s i d e r a b l ea t t e n t i o nf o ri t sv a r i o u sp h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e s ，s u c ha s a n t i - t u m o r , a n t i i n f l a m m a t o r y , a n t i o x i d a n t ，h y p o g l y c e m i c ， h y p o c h o l e s t e r o l e i m i ca n di m m u n o s t i m u l a t i n ga c t i v i t i e s i nt h i sw o r k ，t h ef e r m e n t a t i o nc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e so fg ，f 疡l au m b e l l a t aw e r e d e t e r m i n e db a s e do nt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n to ff e r m e n t a t i o n t h e no nt h eb a s i so f t h i s ，u s i n gt h et w ol e v e ld e s i g ne x p e r i m e n tt os e l e c tt h r e ei m p o r t a n tf a c t o r sf r o ms i xf a c t o r so f t h ec u l t u r em e d i u m t h et l k e ei m p o r t a n tf a c t o r sw e r ea n a l y z e db yt h ee x p e r i m e n to f r e s p o n s e s u r f a c ea n a l y s i s t h r o u g hr i d g ea n a l y s i s ，t h eo p t i m a lf e r m e - n t a t i o nm e d i u mw a sd e t e r m i n e d ： s u c r o s e4 ，c o r nf l o u r1 5 ，s o y b e a nc a k e3 6 5 ，c o r ns t e e pf l o u ro 6i ，w h e a tb r a n0 5 ， k 2 h p 0 40 2 a n dm g s 0 40 2 4 刀j es u i t a b l ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ：t h ei n i t i a l p ho fm e d i u mw a s5 0 c u l t u r e t e m p e r a t u r ew a s2 6 ，v o l u m eo fm e d i u mw a s10 0 m lm e d i u mi n s i z e2 5 0 m ls h a k i n gf l a s k a n di n o c u l u ms i z ew a s8 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s t h em a x i u mi n t e r c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e w a s3 17 9 la n dt h eb i o m a s sw a s4 7 s g l t h em e t h o do fa d d i n gs o m ec h i n e s em e d i c i n e se x t r a c t st og r 帕l au m b e l l a t ab a s i c m e d i u mw a sa d o p t e dt os e l e c tt h ek i n d sa n dt h a tc a ns t i m u l a t et h eg r o w t ho fg r f 彩坛 u m b e l l a t aa n dt h ep r o d u c t i o no ft h eg ，扣l au m b e l l a t ap o l y s a c c h a r i d e sb yt h es t a n d a r d so ft h e w e i g h to fm y c e l i u ma n dt h ep r o d u c t i o no fp o l y s a c c h a r i d e s ，i no r d e rt op r o v i d et h ef i t t e s tk i n d s o fc h i n e s em e d i c i n ep r e s c r i p t i o nt of e r m e n tp r o d u c t i n gp o l y s a c c h a r i d e s t h er e s u l t ss h o w e d ： a s t r a g a l u sm e m b r a n a c e u s ( 15 0 9 l ) ，c o i xl a c h r y m a l ( 15 0 9 l ) ，l y c i u mb a r b a r u m ( 15 0 9 l ) a n d d i o s c o r e ao p p o s i t e ( 5 0 9 l ) c a ni n c r e a s et h eb i o m a s sa n dt h ep r o d u c t i o no f p o l y s a c c h a r i d e e x t r a c t i o nc o n d i t i o n so fp o l y s a c c h a r i d ew e r es t u d i e d w h e nt h em y c e l i u mw a st r e a t e d w i t hh o m o g e n i z a t i o n ，t h eo p t i m a le x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e ：e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e9 0 ， t h er a t i oo fm a t e r i a lt ow a t e r1 ：8 ，e x t r a c t i o nt i m e1 5h o u r s ，e x t r a c t i o nt i m e s2t i m e s ，t h e v o l u m i n a lr a t i oo fe t h a n o lt os u p e r n a t e3 ：1a n dd e p o s i t i o nt e m p e r a t u r e4 u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s ，e x t r a c t i n g r a t eo fp o l y s a c c h a r o p e p t i d ew a s5 8 3 m g g d i f f e r e n te x t r a c t i o n t e c h n o l o g i e sw e r ea l s oc o m p a r e d t h ec h a r a c t e r i z a t i o no fp o l y s a c c h a r i d ew a sp r i m a r i l yi d e n t i f i e d t h er e s u l t ss h o w e d ： t o t a ls u g a rc o n t e n tw a s7 0 8 8 ，p e p t i d ec o n t e n tw a s17 2 3 ，r e d u c i n gs u g a rc o n t e n tw a s 0 9 8 i ni n t e r c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d ea n dt o t a ls u g a rc o n t e n tw a s6 2 8 6 ，p e p t i d ec o n t e n t w a s2 4 51 ，r e d u c i n gs u g a rc o n t e n tw a s0 31 i ne x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e 1 1 1 e c h r o m a t o g r a ma n a l y s i ss h o w e dt h ei n t e r c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d em o l e c u l a rw e i g h to fv a l i d p e a ka r e1 116 8 d aa n d7 816 6 8 d a ，t h e i rc o n t e n t si s6 0 i nt o t a la n dt h ee x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d em o l e c u l a rw e i g h to fv a l i dp e a ki s9 919 d aa n di t sc o n t e n ti s6 3 2 3 t h ea m i n oa c i d so ft h ei n t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d ea n de x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e w e r ea l s oa n a l y z e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e r ew e r es e v e n t e e nk i n d so fa m i n oa c i d si nt h e m e s s e n t i a la m i n oa c i d so ft h e ma c c o u n t e df o r2 0 1 1 a n d3 2 0 8 o ft h et o t a l r e s p e c t i v e l y i i a b s t r a e t i k e y w o r d s ：g r 和l au m b e l l a t e ，s u b m e r g e d f e r m e n t a t i o n ，i n t e r c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e ， c h a r a c t e r i z a t i o n i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知；除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名：期：纱罾、坼f 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 真茵多糖 1 1 1 真菌多糖的发酵调控 近年来有关真菌多糖的分离纯化、生物活性和化学组成及结构修饰等方面的研究已 有了较大的进展【l 】。2 0 世纪6 0 年代，人们逐渐发现真菌多糖具有多方面的生物活性， 如香菇多糖、银耳多糖、灵芝多糖、茯苓多糖及蜜环菌多糖等都具有增强免疫功能和抗 癌等作用。真菌多糖存在于真菌菌丝、子实体及其发酵液中i 是由1 0 个以上的单糖以 糖苷键连接而成的多糖或蛋白结合多糖体，且大多数真菌的抗肿瘤活性物质均具有特定 结构。目前，真菌多糖已被广泛应用于免疫缺陷性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤等的临 。 床治疗中，被称为重要的生物效应调节剂。近年来药用真菌多糖及其复合物的研究已成 为分子生物学、医药及食品科学等领域的研究热点。 以往的真菌多糖多由子实体萃取得到，来源十分有限。现已知约有5 0 的食药用真 菌于液态培养条件下可以产生胞外多糖，所以通过发酵作用来进行多糖提取，成为大批 量生产多糖的有效途径。在液态培养时，各种理化因素都会影响食药用真菌的生长速度， 生物量的多少及代谢特征等。因此，可以通过培养基碳、氮源的筛选来选择多糖产生的 适宜条件。多糖的产生除受营养物质的影响外，也受到其他因素的影响，例如氧对多糖 的合成有较显著的促进作用。 1 1 2 真菌多糖的结构 1 1 2 1 真菌多糖的结构层次 真菌多糖及其复合物的结构大多数指得是其多糖糖链上割单糖的连接序列及其在 空间中的构象。多糖的结构一般分为初级结构和高级结构，一级结构为初级结构，二、 三、四级结构为高级结构。多糖的一级结构是指糖基的组成，糖基排列顺序，相邻糖基 的连接方式，异头碳构型以及糖链有无分支，分支的位置与长短等。多糖的二级结构是 指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象。多糖的三级结构和四级结构 是指以二级结构为基础，由于糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序的空 间里产生的有规则的构象【2 j 。 1 1 2 2 真菌多糖的结构分析 真菌多糖的结构分析包括对其一级结构和高级结构的分析。真菌多糖的一级结构分 析包括对单糖组分，糖基连接方式，糖苷键的构型及不同糖苷键组成比例等的分析。在 单糖组分的分析中，般先对多糖进行完全水解，再用纸层析、薄层层析、气相层析等方 法进行鉴定；在糖基连接方式的分析中，通常采用甲基化分析法、高碘酸氧化法、s m i t h 降解法、核磁共振等方法：在糖苷键构型的分析中，可采用糖苷酶水解、核磁共振、质 谱等方法；对不同糖苷键比例的分析可通过测红外光谱相对面积来完成。对一级结构的 分析，除以上各种方法外，目前还有毛细管电泳、同位素、免疫化学法等方法。目前， 对真菌多糖高级结构的分析还没有深入，测定方法还未达到像核酸和蛋白质结构测定那 样自动化、微量化和标准化，现在主要是应用物理方法进行分析，j t i ：i x - - 射线纤维衍射、 核磁共振、电子衍射等。 江南大学硕士论文 1 1 3 真茵多糖的功效 1 1 3 1 抗肿瘤、提高免疫 高等真菌已有5 0 个属1 7 8 种的提取物都具有抑制小鼠s 一1 8 0 肉瘤及艾氏腹水瘤 等细胞生长的生物学效应，明显促进肝脏蛋白质、核酸的合成及骨髓造血功能，促进体 细胞免疫和体液免疫功能，如香菇、银耳、竹荪、灰树花、姬松茸、柳松菇、灵芝、云 芝、裂褶菌、双孢蘑菇、裂蹄木层菌等【3 ，4 】。真菌多糖中复合组合的多糖抑瘤活性强，因 此一般来说粗多糖表现较纯多糖较高的活性，但也有少数例外p j 。羧甲茯苓多糖可以对人 外周血淋巴细胞产生肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素等，从而抑制肿瘤及调节免疫 功能【6 】d 香菇多糖是研究的较透彻的多糖之一，它的抗肿瘤作用主要是活化t 淋巴细 胞，还可激活补体系统的经典和替代途径，导致巨噬细胞的非特异细胞毒性提高和中性 白细胞对肿瘤组织的侵润，是目前已知的最强免疫增强剂之一【3 7 j 。真菌多糖特别是在结 合放疗、化疗过程使用时，可以显著提高疗效。 1 1 3 2 降血压、血脂 冬虫夏草多糖对心律失常、房性早搏有疗效，灵芝多糖对心血管系统具有调节作用， 可强心、降血压、降胆固醇、降血糖等 8 】，姬松茸多糖能降血脂、提高耐氧能力。低分 子量的右旋糖( 如香菇多糖) 硫酸酯具有抗凝血作用，作为抗血栓药物已在临床上应用。 另外，匀多糖的硫酸酯抗病毒活性大于杂多糖硫酸酯的活性。真菌多糖可增强冠体流量 与心肌供氧，降低血脂，预防动脉粥样硬化斑的形成。 1 1 3 3 健胃保肝 香菇多糖、树舌提取物有保肝并增强排毒能力，降低由c c l 4 引起的血清转氨酶水 平，刺激切除了肝的老鼠部分肝的再生，以及增强了洋地黄毒素毒性的抵抗能力例。猴头 菌多糖可增加骨液分泌、稀释胃酸、保护溃疡面、促进粘膜再生，对胃癌、慢性萎缩性 胃炎、食道癌、十二指肠溃疡有显著疗效【l 训。云芝多糖对慢性肝炎、乙型肝炎皆有防治 作用。茯苓多糖含有茯苓酸、层孔酸等1 6 种具有药理作用的物质，具有增强机体免疫能 力，有护肝解毒作用。 1 1 4 真菌多糖的活性与构效关系 真菌多糖的生物活性与其化学结构有着密切的关系，一直是人们关注的焦点。由于 真菌多糖结构的复杂性，现在的结构研究大多还局限于一级结构上。对一级结构而言， 影响其生物活性的因素包括三个：第一，单糖的组成，有抗肿瘤作用的真菌多糖大多是 由葡聚糖组成的，如香菇多糖、裂褶多糖、灵芝多糖等；第二，糖苷键的类型，大多活 性多糖的主链上都具有p ( 1 _ 3 ) 糖苷键，l e u n g 等从金针菇细胞壁中提取出一种碱溶性 多糖，它f i l l 3 ( 1 - - - + 3 ) d 葡聚糖组成，经试验证明该多糖有抑瘤活性【1 1 】；第三，连接在 b d 葡聚糖骨架上的一些基团如聚羟基、聚醛基、羧甲基、乙酰基、硫酸基等对真菌 多糖的生物活性发挥起重要作用，例如从茯苓多糖菌核中得到的茯苓多糖，基本没有抗 肿瘤活性，但制成羧甲基多糖后，水溶性增大，并具有强烈的抗肿瘤活性。真菌多糖所 具有的缔合、胶束结构、憎水键以及多糖分子的挠曲度等高级结构都对其活性产生影响。 具有p - 3 股螺旋结构的葡聚糖大多都具有免疫活性。另外，真菌多糖的分子量、溶解度、 第一章绪论 粘度、给药剂量和给药途径等都影响其功能活性。 最近多糖受体的发现，认为：当多糖与受体作用时，只有分子中几个寡糖片段与受 体结合，在多糖分子中存在一个或几个寡糖片段的“活性中心 。如香菇多糖分子量为 5 0 万，其分子中的七糖重复单元是它的中心1 1 2 j 。 1 2 猪苓简介 猪苓 g 厂咖肠u m b e l l a t a ( p e r s e xf r ) p , i l a t 另, j 名野猪苓、猪屎苓、鸡屎苓、假猪屎等。 在分类学上属于担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、猪苓属。其菌核入药已有两千年的历 史。本草纲目上就己载有猪苓功能“开滕理、治淋肿、脚气、白带浊下、妊娠子淋、 胎肿、小便不利”【l 引。1 9 7 3 年日本首先从猪苓菌核中分离出猪苓多糖，并证明其对动物 移植性肿瘤有抑制作用。之后许多临床实验表明，猪苓多糖具有免疫刺激作用，可提高 人体免疫功能，并有良好的抗癌作用，对肺癌、食道癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、肠癌均 有一定疗效【1 4 1 。猪苓菌核大量应用于医药生产造成了其野生资源的匾乏。同时，我国中 医研究院发现，猪苓菌丝体发酵液多糖与野生菌核多糖一样对小鼠肉瘤细胞有明显抑制 作用l l 引，显示出以猪苓菌丝体发酵液多糖代替生药猪苓的可能性。 1 3 猪苓多糖的国内外研究进展 猪苓多糖是从中药猪苓中提取的有效成分，化学结构为6 支链d 1 ，3 葡聚糖，即猪苓 多糖( p o l y p o r u sp o l y s a c c h a r i d e ) 。1 9 7 3 年日本学者发现，猪苓多糖对动物移植性肿瘤有抑 制作用【l ，以后的许多实验表明，猪苓多糖能提高人体免疫力，对肺癌、肝癌、食道癌、 宫颈癌等多种肿瘤都有一定疗效，在治疗病毒性肝炎和抗放射等方面也有良好的效果 【3 4 】 o 7 0 年代，国内开展了猪苓深层发酵及其制剂的研究。菌核分离菌种采用常规方法即 可，培养基为p d a ，液体培养除氮、碳源外，附加适量无机元素即可。大罐发酵，起始 p h 为5 5 ，接种量4 6 ，通气量1 ：0 3 ，罐温2 4 2 6 ，搅拌速度2 2 0 r m i n ，加入少量 花生油作消沫剂，发酵时间5 旺7 0 小时即可收获。另据报道，在猪苓菌丝发酵过程中 加入蜜环菌、假单胞杆菌、灵芝、金针菇等几种菌的发酵液对猪苓菌丝的生长和猪苓多 糖产生有促进作用1 1 7 】。 2 0 0 1 年，周晓艳等采用经选育的猪苓p u 9 9 菌株作为生产菌株在1 t 罐中生产猪苓菌 丝体，发酵周期3 6h ，其菌丝体获得率为2 3 ，粗多糖获得率为3 1 o 。对得到的猪苓 菌丝体进行了有效成分提取，测定猪苓多糖分子量为2 90 5 4 ，蜂面积7 2 0 2 。该发酵 工艺已经过小试、中试和生产性试验，可以迸行工厂化生产【1 8 】。 2 0 0 7 年，h u n g c h a n gh u a n g ，y u n g - c h a n gl i u 研究出了一种加速猪苓菌丝生长和提 高多糖产量的方法：他们将培养5 7 天的猪苓发酵液进行滤纸过滤，浓缩，膜过滤后制 成一种发酵促进齐i j ( g b c ) ，然后将g b c 按一定量加入培养基中，结果发现，发酵周期明 显缩短，生物量和多糖产量也有相应的增加【1 9 】。 1 4 药理 1 4 1 利尿作用 1 9 5 7 年报道正常人体实验口服猪苓煎剂后6 小时尿量和其中氯化物含量分别增加 江雨大学坝上论文 6 2 矛1 14 5 2 0 1 。王利文等报道猪苓煎剂静脉或肌肉注射对不麻醉犬具较明显的利尿作 用，并能促进n a + ，c 1 。，k + 等电解质的排出1 2 1 】。推测其利尿作用主要是由于抑制了肾小 管重吸收机能的结果【2 2 j 。 1 4 2 抗肿瘤作用 1 9 7 5 年中国中医研究院中药研究所发现猪苓提取物( 7 5 7 ) 对小鼠肉瘤1 8 0 的生长有 抑制作用。瘤体抑制率达5 0 7 0 ，瘤重抑制率在3 0 以上【2 3 】。猪苓多糖抗小鼠s 1 8 0 腹水癌细胞的机理主要是抑制癌细胞内d n a 的合成及c a m p 磷酸二酯酶的活性，提高 c a m p 的含量，而c a m p 能促使肿瘤细胞向正常细胞转化【2 4 j 。猪苓多糖可提高脾l a k 细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；提高红细胞c 3 b 受体的活性【2 引。 1 4 3 对免疫功能的影响 猪苓多糖是一种非特异性免疫刺激剂，能促使荷瘤小鼠脾脏抗体形成细胞明显增 多，提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，增加i g m 抗体产生，从而增强荷瘤小鼠的 免疫功能【2 6 ，2 7 1 。 1 4 4 治疗慢性病毒性肝炎 猪苓多糖能减轻四氯化碳和半乳糖胺引起的肝组织损伤，促进肝损伤的恢复和肝组 织再生能力。临床经验表明对病毒性肝炎患者疗效显著。能显著减轻肝癌患者症状，降 低谷丙转氨酶活性，抑制病毒复发，对肝组织损伤有修复作用l l 引。 1 4 5 抗辐射作用 在致死量照射前4 小时，给小鼠0 5 m g 猪苓多糖能提高小鼠血浆皮质酮含量，提高 照射引起的体液免疫和细胞免疫的抑制，有明显抗放射作用【2 酬。 1 4 6 其它 猪苓的醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑制作用【26 | 。张辉等报道猪苓多糖 能降低环磷酰胺的致突变作用，稳定和促进d n a 修复、具抗突变作用 2 8 1 。近来试验还 证明猪苓多糖能使高龄细胞的d n a 含量增多，因而可能有延缓衰老的作用 2 9 1 。另据报 道，现已研究出能改善艾滋病症状的猪苓制剂【3 0 j 。 1 4 7 临床应用 猪苓提取物目前的临床应用主要包括与肺癌化疗药物的配合使用、对病毒性肝炎的 治疗、对银屑病的治疗等1 3 。 1 5 微生物发酵中药研究概况 微生物有着非常强大的分解转化物质的能力，并能产生丰富的次生代谢产物，通过 微生物的生长代谢和生命活动来炮制中药，可以比一般的物理或化学的炮制手段更大幅 度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症。由于真菌在微生物中具有种类 多、次生代谢产物多、培养条件比较简单等特点，因此应当是发酵中药的主要功能菌【3 2 】。 1 5 1 中药发酵的特点【3 3 】 中药发酵制药技术的典型特点就是生物转化。可概括如下几点：( 1 ) 药物的有效组分、 活性物质最大限度的得以提取、利用；( 2 ) 药物进入人体后不能直接被利用的有效活性组 分，因在体外得以完成而被直接利用，迅速发挥应有效能；( 3 ) 优选的人体有益菌种本身 4 第一章绪论 具有补充或增强原有药物的功能；( 4 ) 发酵制药与原有药物相比产生了新的活性物质，从 而具有新的保健、预防或治疗功能；( 5 ) 是实现中药现代化、具有高科技水平的又一新技 术，生产工艺可控，所得产物精确，制剂方便，便于与国际接轨。 1 5 2 微生物的药用历史 真菌是我国传统医药学的重要组成部分，我国也是世界上最早利用真菌防病治病的 国家，早在东汉年间成书的我国第一部药物学神农本草经中，就有灵芝、茯苓、猪 苓、雷丸等药用真菌分别列项论述，这些药物至今沿用不衰p 4 1 。 从这些真菌中药中已经分离到相应的纯菌种，有些已实行人工种植物代替野生品， 不能人工种植子实体的，也可以通过培养菌丝体来代替，充分满足了医疗用药的要求， 也为环境保护和经济发展作出了贡献。近5 0 年来，国内外学者在药用微生物分类、化学、 药理学、临床医学、制剂学及遗传育种、栽培驯化、发酵培养方面进行了深入研究，取 得了良好的效果加微生态制剂、灵芝菌、虫草菌、蜜环菌、阿氏假囊酵母、竹红菌等在 保健品和药品开发中占有非常突出的位置。由于微生物代谢产物具有各种各样独特的化 学结构及生理活性，因此受到化学工作者和药学工作者的极大关注。 1 5 3 微生物是中药发酵的有力工具 发酵也是传统中药加工炮制的重要方法之一。从某种意义上说，虫草是蝙蝠蛾幼虫 经虫草菌、僵蚕是家蚕经白僵菌感染发酵而成的。这些经典药物都是经微生物发酵后产 生了新的药理活性，其中虫草是非常名贵的中药。但这些品种都是利用自然界天然的菌 种发酵的，一般多为霉菌、酵母、细菌等，由于菌种不纯，针对性不强，不能利用现代 研究成果定向改变药物的性能或有意识地根据药物之间的特性进行有目的的组合，同时 接入的微生物种类范围受到了极大限制，也不可能根据需要将几种微生物组合接种在一 起；另一方面，对那些在自然界中不占优势、生长条件要求比较严格的微生物来说，就 不可能在药物上生长起来。这就极大地限制了微生物的作用。另外，是否会落入有害菌 也不明确所以微生物在药物中的潜在效能没有最大限度地发挥出来。 微生物在生长过程中会产生各种各样的生物活性物质，并易于组织工业化生产。现 代工业中许多生物产品都是通过微生物发酵生产的，如各式各样的酶、抗生素。酶是一 切生物体进行生命活动的基础，它可以使复杂的化学反应在常温常压下迅速完成，这些 酶中既有胞内酶，也有胞外酶；既有合成酶，也有分解酶。有些微生物在生长过程中可以 分泌几十种胞外酶到培养基中去，微生物进行生命活动所产生的胞内酶更是有成百上 千，这些丰富而强大的酶系是中药发生化学反应的物质基础，可以将药物的成分分解转 化形成新的成分，这些新成分就是新的活性药物筛选的物质基础。这就是微生物可以用 来发酵炮制中药的理论根据加酶法己成为中药炮制的一种方法【3 5 , 3 6 l 。另一方面，由于微 生物也会形成丰富多样的次生代谢产物，它们有些本身就是功效良好的药物；或以中药中 的有效成分为前体，经微生物的代谢可以形成新的化合物或微生物的次生代谢产物和中 药中成分发生反应形成新的化合物。 微生物次生代谢产物可以和中药的有效成分发生复方、协同作用。微生物在中药的 特殊环境中也有可能会产生新的代谢反应，因为中药的物质可能对微生物的生长和代谢 5 江南大学硕士论文 有促进或抑制作用，从而改变微生物的代谢途径，从而形成新的成分或改变各成分的相 互比例。 微生物的分解作用有可能将中药中的有毒物质进行分解，从而降低药物的毒副作用； 也有可能经微生物的分解作用使原来不易消化吸收的物质变得易于吸收。由于微生物生 长主要消耗的是动植物的蛋白质、糖等常规物质，有可能对有效成分有浓缩作用，如发 酵法提取薯蓣皂苷就是通过发酵去除薯蓣中的淀粉。就微生态制剂而言，有益菌本身就 是很好的药物加双歧杆菌。 微生物的生物多样性为我们提供了丰富的可供选择菌株，不同的微生物具有不同的 特性，可能在中药发酵中具有不同的效果。但不同的微生物有时会产生大体上类似的生 理活性物质。微生物中发现的活性成分的功能是多方面的，己成为发现新药的重要领域。 现在，除了抗菌、抗肿瘤等抗生素外，非抗微生物生理活性物质的发现越来越多，如： 免疫抑制剂、降血脂、抗氧化、受体拮抗剂和特异性酶抑制剂等。 1 5 4 发展方向 对某一具体发酵中药的研究来说，主要需做好以下工作：( 1 ) 加强功能微生物的菌种 选育工作；( 2 ) 中药发酵技术及装备研究；( 3 ) 发酵中药的组方及药理活性研究；( 4 ) 复合 微生物发酵技术研究；( 5 ) 建立有效的筛选模型；( 6 ) 应用现代化学分析技术，建立快速 灵敏的分析检测手段；仍在研究发酵中药过程中如何贯彻中医理论的指导并吸收现代中 医药的其它新成果。可以预见，通过努力，利用现代生物技术发酵中药必将对扩大中药 治疗范围、剂型改进、创制新药方面提供新的技术手段，为中药吸收现代科技成果提供 新途径，给中药研究注入新的内容和活力p 。 1 6 本课题研究的意义 长期以来，恶性肿瘤一直是危害人民生命和健康的严重疾病之一，特别是近年来由 于环境污染，人们生活节奏加快，精神紧张与外界诱因的增加，世界各地的癌症发病率 也急剧上升，在我国也不例外地出现了明显上升的态势。多少年来，人们一直在杀灭癌 细胞，增强人体免疫力等种种途径中寻找战胜癌症的方法和有效药物，虽取得了一些进 展，但在杀灭癌细胞的同时，也杀伤了正常的细胞。如西医常用的手术及放、化疗，很 多情况下是权宜之计，难以彻底治愈。非手术的放、化疗会对患者造成副反应，如出现 红细胞数量下降，出现脱发、恶心、呕吐、贫血等，其痛苦不亚于疾病本身，致使大多 数患者因耐受不了放、化疗的毒副作用，限制了用药剂量，有的甚至被迫停止治疗，使 肿瘤进一步恶化。猪苓多糖是食药用真菌多糖家族中的一个重要成员，为一毒副作用小、 安全、疗效高的抗肿瘤免疫调节剂。它是在不伤害正常细胞的情况下，通过增强机体的 免疫功能发挥其抗肿瘤活性，具有任何化学合成抗癌药物无可取代的优越性，在肿瘤的 免疫治疗( 生物学治疗) 方面具有良好的应用前景。因此，研究与开发猪苓多糖有重要意 义。 1 7 本课题研究的内容 本课题拟在以下几个方面展开研究： 6 第一章绪论 # 1 猪苓液体深层发酵培养基组成的优化和发酵条件的优化，提高猪苓胞内多糖产量。 2 中药提取物对猪苓菌发酵的影响研究。 3 猪苓胞内多糖的提取工艺的优化。 4 猪苓多糖性质的初步研究。 7 江南火学硕士论文 第二章猪苓深层培养条件的研究 微生物的生长和代谢产物的积累既受到菌种本身的影响，也受到营养和环境条件的 影响，其生物合成途径、产物种类及其性质、产量及产率与碳源、氮源、无机盐、p h 值、温度、接种量和通气状况等多种因素有密切关系。如何快速地找出主要因素并进行 优化并非易事。通常优化发酵培养基的方法是单次单因子法和正交试验设计法，但这两 种方法都无法找到各种因素的在整个实验区域的最佳组合【3 8 1 。响应面分析方法则能研究 几种因素间的交互作用，且试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高，并能够通过 求得的方程获得实验区域内各因素的最优组合3 9 1 。本研究以单因素实验确定了主要的碳 源和氮源，利用p l a c k e t t b u r m a n 二水平设计法筛选出影响粗多糖产量的三个主要因素， 继而采用中心组合设计及响应面分析确定了主要影响因子的最佳浓度。最后得出液体发 酵产胞内多糖的最佳培养基，并进一步优化了发酵培养条件，为猪苓胞内多糖的扩大化 生产奠定一些实验基础。 2 1 材料与方法 2 1 1 实验材料 2 1 1 1 菌种 猪苓( g r i f o l au m b e l l a t e ) 为本实验室筛选并保藏；每两月传代一次，4 。c 保藏。 2 1 1 2 主要试剂 葡萄糖分析纯国药集团化学试剂有限公司 蔗糖分析纯国药集团化学试剂有限公司 可溶性淀粉 分析纯国药集团化学试剂有限公司 甘油分析纯国药集团化学试剂有限公司 酵母粉 生化试剂英国o x o i d 公司 乳糖 分析纯国药集团化学试剂有限公司 木糖分析纯国药集团化学试剂有限公司 麦芽糖 生化试剂国药集团化学试剂有限公司 蛋白胨 生化试剂国药集团化学试剂有限公司 豆饼粉、玉米粉、黄豆粉、玉米浆粉均为市售 2 1 1 3 主要仪器 数显六联电动升降搅拌器 苏州威尔实验用品有限公司 电热恒温培养箱 上海跃进医疗器材厂 u v - 2 1 0 0 分光光度计 美国尤尼科公司 真空泵 巩义市英峪华仪器厂 台式恒温摇床 江苏太仓市实验设备厂 电热恒温培养箱 上海跃进医疗器材厂 电热式压力蒸汽消毒器 无锡第二医疗器材厂 超净工作台苏州空气净化设备厂 第二章猪苓深层培养条件的研究 p h 计 t g l 1 6 c 台式离心机 x w 二8 0 a 漩涡混合器 2 。1 2 培养基 斜面培养基p d a ( g l ) 氢钾1 o 、琼脂2 5 北京h a n n a 公司 上海安亭科学仪器厂 上海医科大学仪器厂 马铃薯2 0 0 、葡萄糖1 0 、蛋白胨2 0 、酵母粉1 o 、磷酸二 液体种子培养基( g l ) ：、葡萄糖3 0 、蛋白胨2 o 、酵母粉3 o 、磷酸二氢钾2 0 、硫 酸镁0 5 。 1 2 1 灭菌2 5 r a i n ，冷却，接种，2 5 ，1 0 0 m l 2 5 0 m l ，1 5 0 r m i n 培养4 天。 2 1 3 分析测定方法 2 1 1 1 还原糖测定 采用d n s 法【4 0 】：d n s 试剂与还原糖发生氧化还原反应生成棕红色的氨基化合物， 在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系。 2 1 1 2 茵丝体干重和胞内多糖的测定 所取样品在4 以1 00 0 0r m i n 高速离心1 0m i n ，收集沉淀物，去离子水洗涤3 次，真 空干燥箱6 0 烘至恒重，所得即为菌丝体干重。将液体培养的发酵液先过滤，所得的湿 菌丝体洗涤后再过滤，接着把得到的菌丝体加水充分破碎，破碎后在热水中浸提2 小时， 抽完后过滤，并把滤渣再热水浸提ld , 时，再次过滤，然后合并这两次滤液，减压浓缩 至原体积的1 4 ，n 3 倍体积的9 5 酒精沉淀，静置数小时后过滤，沉淀物烘干得到胞内 粗多糖。 胞内多糖产率( g l ) = 胞内多糖含量( g ) ( 2 - 1 ) 初始发酵液体积( l ) 2 1 4 实验设计 2 1 4 1 二水平实验设计 选取6 个因素、实验次数为8 的p l a c k e t t b u r m a n 二水平设计，考察各因素的主效应 和交互作用的一级作用，对实验结果进行方差分析，从中选取对胞内多糖有显著影响的 三个因素。 2 1 4 2 响应面实验 逼近最大产多糖区域后，进行响应面实验。采用响应面实验结果来建立多项式回归 模型，多项式回归模型表达式为： 444 y = b o + 6 j 而+ 6 ux i 而+ 叼2 月蚵卢 其中，b o 常数项；岛一次项回归系数；互作回归系数；二次项回归系数。 2 1 4 3 统计分析 采用国际上最常用的统计软件s a s 8 1 对实验数据进行回归分析，并根据回归方程 、和岭脊分析预测出最佳点。 、 9 江南大学硕士论文 2 2 结果与讨论 2 2 1 不同碳源对猪苓胞内多糖产率的影响 碳源是培养基的最主要成分，是菌体的骨架。根据资料 硎和工业生产实际，在蛋白 胨0 3 、酵母粉0 2 、磷酸二氢钾0 。1 、硫酸镁0 0 5 的培养基中分别加入2 的葡 萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、木糖、可溶性淀粉、玉米粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉作为 碳源，实验重复三次，其结果见图2 1 。 3 、 o 咖 k 舞 ，、 一 3 1 田 卜 最 糖- | ll | | ll 爹番毋爹翟搿 一菌丝体干重( g l ) 口粗多糖( g l ) 图2 - 1 不同碳源对猪苓液体发酵的影响 f i g 2 - 1e f f e c t so fd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e so i ll i q u i df e r m e n t a t i o no fg r i f o l au m b e l l a t e 从实验结果可以看出，猪苓在这几种碳源均能生长，并能产胞内多糖。由图可知， 不同碳源对菌丝体生长及胞内多糖产量的影响有差异。当碳源为蔗糖时，菌丝体最好， 菌体干重最高，其次是玉米粉与可溶性淀粉，木糖最差。最有利于胞内多糖形成的碳源 是蔗糖，其多糖产率可达1 7 7 ( g l ) ，其次是玉米粉，而在木糖作为碳源时胞内多糖产率 最少。因此，从菌丝体生长量、胞内多糖产率等因素综合考虑，采用蔗糖与玉米粉的复 合碳源。 2 2 。1 2 蔗糖浓度的影响 分别加入2 、3 、4 、5 的蔗糖，考察蔗糖浓度对猪苓液体发酵的影响，结果 见表2 1 0 第二章猪苓深层培养条件的研究 表2 1 蔗糖浓度对猪苓液体发酵的影响 t a b 2 - 1e f f e c t so ft h ec o n c e n t r a t i o no fs u c r o s eo nl i q u i df e r m e n t a t i o no fg r i f o l au m b e l l a t e 从表2 1 中可以看出，随着蔗糖浓度的增加，其菌体量也随之增加。猪苓胞内多糖 产率也随之增加，当蔗糖浓度从4 时再增加到5 时，多糖产率反而有所下降。故蔗 糖浓度太高，不利于胞内多糖的积累，同时也造成原料的浪费。 2 2 1 3 玉米粉浓度的影响 分另0 加入0 5 、1 、1 5 、2 的玉米粉，考察玉米粉浓度对猪苓液体发酵的影