（水产品加工及贮藏工程专业论文）总状蕨藻硫酸多糖的提取、分离及其抗肿瘤与免疫活性.pdf

总状蕨藻硫酸多糖的提取、分离及其抗肿瘤与免疫活性 中文摘要 大量研究表明，海藻的主要成分硫酸多糖具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗 肿瘤与免疫调节等多种生理功能，但至目前为止，研究的海藻硫酸多糖主要来源于红 藻与褐藻，来源于绿藻的极少。总状蕨藻( c a u l e r p ar a c e m o s a ) 属绿藻f - ( c h l o r o p h y t a ) 蕨藻科植物，是世界性的热带藻类，不仅广泛分布于我国的台湾、海南和广东，还分 布于日本、马来半岛和太平洋东岸等地，产量高，但目前尚未得到充分利用。为了充 分认识与高值化利用该资源提供科学依据，本文对其硫酸多糖的提取、分离、理化性 质、抗肿瘤与免疫活性进行了初步研究。 本文的主要工作及结果如下： 1 在单因素实验基础上，采用正交实验，确定了总状蕨藻多糖的提取工艺与工 艺参数。总状蕨藻多糖提取工艺为：热水与蛋白酶酶解相结合提取。工艺参数为固液 比l ：1 0 ，蛋白酶用量1 3 6 5 u g ，6 0 酶法提取2 5 h 后，再将固液比调至1 ：2 0 ，在温 度9 5 条件下继续进行热水提取2 5h ，多糖得率为6 7 ，比单纯热水提取时的多糖 得率提高了1 3 1 0 ，还大大简化了后续繁琐的除蛋白工艺。 2 热水与蛋白酶酶解相结合浸提得到的总状蕨藻多糖提取液经s e v a g e 法和透析 法等步骤初步纯化后得到的总状蕨藻硫酸多糖( c a u l e r p ar a c e m o s as u l f a t e d p o l y s a c c h a r i d e ，简称为c r s p l ) ；以d e a e 5 2 纤维素为固定相和不同浓度的n a c l 为流 动相对c r s p l 进行分段洗脱，分别得到o 5 m 和1 o m n a c l 洗脱的两个主要级分c r s p l a 和c r s p i b 。 3 采用苯酚硫酸法、硫酸咔唑法、f o l i n 酚法和b a c l 2 明胶法分别对c r s p l 、 c r s p l a 和c r s p l b 的中性糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量和硫酸基含量进行了测 定；采用气相色谱法分析了c r s p l 、c r s p l a 和c r s p l b 的单糖组分；采用氨基酸自 动分析仪分析了c r s p l 、c r s p l a 和c r s p l b 的氨基酸组成；采用s e p h a r o s e 4 b 凝胶柱 测定了c r s p l a 和c r s p l b 的分子量分布。化学组成测定结果显示，c r s p l 、c r s p l a 和c r s p i b 的中性糖含量分别为5 3 7 、3 6 0 和4 5 1 ，糖醛酸含量分别为7 9 、3 9 和7 6 ，蛋白质含量分别为9 9 、1 4 o 和2 0 ，硫酸基含量分别为2 7 6 、4 5 6 和 4 8 3 ；气相色谱分析结果显示，c r s p l 由1 1 4 甘露糖、5 6 8 葡萄糖和3 1 8 半乳 糖组成，c r s p l a 由1 0 9 甘露糖和8 9 1 葡萄糖组成，c r s p l b 由0 8 葡萄糖和9 9 2 半乳糖组成；氨基酸分析结果显示，c r s p l 、c r s p l a 和c r s p l b 中的氨基酸组成相 似，天门冬氨酸和谷氨酸含量异常高，其次是丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸，色氨酸和组 氨酸含量最低；分子量测定结果表明，c r s p l a 和c r s p l b 是至少含有两个组分的混 合物，c r s p l a 由分子量为1 3 6 5 1 0 4 和1 4 4 1 0 4 的两部分组成，c r s p l b 由分子量为 1 4 4 1 0 4 和9 9 1 0 4 的两部分组成。 4 采用m t t 法检测了未去游离蛋白总状蕨藻多糖c r s p 、去游离蛋白多糖c r s p l 以及c r s p l a 和c r s p l b 对k 5 6 2 细胞增殖的抑制作用，体内实验采用灌胃给药观察 了c r s p 和c r s p l 对小鼠h 2 2 实体瘤的抑制作用。结果发现，c r s p 和c r s p l 在体 内外均具有抑制肿瘤细胞生长的作用，并且在相同剂量条件下，c r s p l 的抗肿瘤活 性明显强于c r s p 的抗肿瘤活性；c r s p l 、c r s p l a 和c r s p l b 在体外对k 5 6 2 细胞 生长都具有显著抑制作用，同剂量下c r s p l 的抑制率最高，其次是c r s p l a ，c r s p l b 的抑制率最低，其中c r s p l 和c r s p l a 在中剂量的抑制率达到最高值，而c r s p l b 的抑制率随着剂量的增加呈递减趋势。 5 采用腹腔注射与灌胃两种方式给药，观察了c r s p l 对小鼠s 1 8 0 肉瘤的抑制 作用以及对小鼠免疫器官和碳廓清指数的影响，结果显示，c r s p l 采用腹腔注射与 灌胃两种方式给药，对小鼠s 1 8 0 肉瘤均具有显著的抑制作用，且腹腔注射能显著地 增加小鼠的脾脏指数，灌胃给药能显著升高小鼠碳廓清指数。这些事实表明，增强机 体的免疫功能可能是总状蕨藻多糖抗肿瘤作用的机制之一。 6 采用体外免疫试验方法检测了c r s p l 、c r s p l a 和c r s p l b 直接或协同有丝 分裂原c o n a 对正常小鼠脾淋巴细胞的增殖作用以及其对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中 性红和分泌一氧化氮的影响。结果显示，三者在一定剂量范围内，直接或协同有丝分 裂原c o n a 对小鼠脾淋巴细胞增殖均有一定的促进作用，还能够有效地促进小鼠腹腔 巨噬细胞m o 吞噬中性红和分泌n o 的数量，说明c r s p l 、c r s p l a 和c r s p l b 能增 强机体的免疫功能，进而发挥抗肿瘤作用。 关键词：总状蕨藻，硫酸多糖，提取工艺，理化性质，抗肿瘤，免疫活性 s t u d yo nt h ee x t r a c t i o n ，i s o l a t i o na n da n t i t u m o ra n d i m m u n o m o d u l a t i o na c t i v i t i e so fs u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e sf r o m c a u l e r p ar a c e m o s a a b s t r a c t a g r e a td e a l o fs t u d i e si n d i c a t e dt h a ts u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e s ，t h es e a w e e dm a i n c o m p o n e n t ，h a v es h o w na n t i v i r u s ，a n t i c o a g u l a n t ，a n t i h y p e r l i p i d e m i a , a n t i - t u m o r a n d i m m u n o m o d u l a t i o nb i o l o g i c a la c t i v i t i e s h o w e v e r ，a l g a ls u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e sh a v e b e e ns t u d i e dm a i n l yf r o mr e ds e a w e e d sa n db r o w ns e a w e e d s ，a n df e w e rf r o mg r e e na l g a e s of a r c a u l e r p ar a c e m o s a ，aw o r l dt r o p i c a l a l g a ，w h i c hb e l o n g st oc h l o r o p h y t a c a u l e r p a c e a e ，i sw i d e l yd i s t r i b u t e di nt r o p i c a la n ds u b t r o p i c a la r e a ss u c ha st h ec o a s t so f t a i w a n ，h a i n a na n dg u a n g d o n gi nc h i n a ，j a p a n ，m a l a yp e n i n s u l aa n dp a c i f i ce a s tc o a s t s a n ds oo n ，b u th a sn o ty e tb e e nu t i l i z e d i no r d e rt o p r o v i d eb a s i cd a t a f o rf u l l u n d e r s t a n d i n ga n da p p l i c a t i o no ft h i sa l g a , i nt h i ss t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h ee x t r a c t i o n ， i s o l a t i o n ，p h y s i c o c h e m i c a lc h a r a c t e r s ，a n t i t u m o ra n di m m u n o m o d u l a t i o na c t i v i t i e so ft h e s u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e sf r o mt h i sa l g a t h em a i nt a s k sa n dc o n c l u s i o n so ft h ep a p e ra r ea sf o l l o w s ： 1 b a s e do nt h er e s u l t so fs i n g l ef a c t o rt e s t ，t h eo r t h o g o n a ld e s i g nw a se m p l o y e dt o o p t i m i z et h ee x t r a c t i o nt e c h n o l o g ya n di t sp a r a m e t e r t h et e c h n o l o g ye s t a b l i s h e dw a st h e c o m b i n e dp r o c e d u r eo fp r o t e a s ea n dh o tw a t e r t h ep a r a m e t e r sg o tw e r et h es o l i d l i q u i d r a t i o 1 ：1 0 ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o n1 3 6 5 u g ，h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e6 0 。c ，e n z y m a t i c h y d r o l y s i st i m e2 5 h ，t h e na d j u s t e dt h es o l i d l i q u i dr a t i ot ol ：2 0 ，a n dc o n t i n u e dt oe x t r a c t f o r2 5 hu n d e r9 5 u n d e rt h i sc o n d i t i o n t h ey i e l do fp o l y s a c c h a r i d ew a s6 7 c o m p a r e dw i t hh o tw a t e re x t r a c t i o n ，t h ec o m b i n e dp r o c e d u r eo fp r o t e a s ea n dh o tw a t e rn o t o n l yc a ni n c r e a s et h ey i e l db y131 o b u ta l s oc a ns i g n i f i c a n t l ys i m p l i f yt h er e m o v a lo f f r e ep r o t e i ni nt h ep u r i f i c a t i o np r o c e d u r e 2 f r e ep r o t e i n sa n ds m a l lm o l e c u l e si nt h es u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e s ( c r s p ) e x t r a c t e d w i 也t h ec o m b i n e dp r o c e d u r eo fp r o t e a s ea n db o i l i n gw a t e rw e r ef u r t h e rm m o v e db yu s i n g s e v a g em e t h o da n dd i a l y s i s ，r e s p e c t i v e l y t h ep o l y s a c c h a r i d ew h i c hr e m o v e df r e ep r o t e i n s a n ds m a l lm o l e c u l e sw a s p r e c i p i t a t e db ya l c o h o la n df r o z e nd r y i n ga n dw a sn a m e d c r s p1 c r s p1o b t a i n e dw a sf r a c t i o n a t e dw i t hd e a e c e l l u l o s e5 2a n de l u t e dw i t ho f0 1m 、 0 5 m 、1 0 ma n d2 0 mn a c l ，r e s p e c t i v e l y t w om a i nf r a c t i o n se l u t e dw i t ho 5 ma n d1 0 m n a c lw e r ef r e e z e d r i e d r e s p e c t i v e l y , a n d d e s i g n a t e d a sc r s p1aa n dc r s p1b r e s p e c t i v e l y 3 t h ec a r b o h y d r a t e ，u r o n i ca c i d ，p r o t e i na n ds u l f a t ec o n t e n to fc r s p1 ，c r s p1a a n d c r s p1bw e b gd e t e r m i n e db yu s i n gp h e n o l s u l p h u r i ca c i dm e t h o d ，t h ef o l i n - p h e n o l i i i m e t h o d ，c a r b a z o l er e a c t i o na n db a c l 2 - g l u t i nm e t h o d ，r e s p e c t i v e l y t h es u g a rc o m p o s i t i o n o fc r s p1 ，c r s p1aa n dc r s p1bw a sa n a l y z e db yg c t h ea m i n oa c i dc o m p o s i t i o no f t h e mw a sd e t e r m i n e db ya m i n oa c i da u t o m a t i ca n a l y z e r t h em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n o fc r s p1aa n dc r s p1bw e r ea l s oe s t i m a t e d b ys e p h a r o s e 4 bg e lp e r m e a t i o n c h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t sd e t e r m i n e do fc h e m i c a lc o m p o s i t i o n so fc r s p1 ，c r s p 1a a n dc r s p l bs h o w e dt h a tt h e i rc a r b o h y d r a t ec o n t e n ta r e5 3 7 3 6 o a n d4 5 1 r e s p e c t i v e l y , u r o n i ca c i dc o n t e n t7 9 ，3 9 a n d 7 6 r e s p e c t i v e l y , p r o t e i nc o n t e n t9 9 ， 1 4 o a n d2 o r e s p e c t i v e l y , a n ds u l f a t ec o n t e n t2 7 6 ，4 5 6 a n d4 8 3 r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t so fg ci n d i c a t e dt h a tc r s p1i sm a d eu po f11 4 m a n n o s e 5 6 8 g l u c o s ea n d 31 8 g a l a c t o s e ，c r s p l ai sc o m p o s e do f1 0 9 m a n n o s ea n d8 9 1 g l u c o s e ，c r s p l b c o n s i s t so f0 8 g l u c o s ea n d9 9 2 g a l a c t o s e t h er e s u l t sa n a l y z e do fa m i n oa c i ds h o w e d t h a tt h ea m i n oa c i dc o m p o s i t i o n so fc r s p 1 ，c r s p 1aa n dc r s p1ba r es i m i l a r , n a m e l y a s p a r t i ca c i da n dg l u t a m i ca c i dw e r ep r e d o m i n a n t ，f o l l o w e db ya l a n i n e ，g l y c i na n dv a l i n e ， a n dt r y p t o p h a na n dh i s t i d i n e t h er e s u l t sa n a l y z e do fg e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y j n d i c a t e dt h a tc r s p1aa n dc r s p1bw e r es t i l lam i x t u r eo fa tl e a s tt w of r a c t i o n s c r s p1ac o n s i s t e do f13 9 5x10 4d a l t o nf r a c t i o na n d14 4 x10 4d a l t o nf r a c t i o n ，a n d c r s p1bw a sc o m p o s e do f13 6 5x10 4d a l t o nf r a c t i o na n d9 9 x10 4d a l t o nf r a c t i o n 4 m t tm e t h o d w a su s e dt o i n v e s t i g a t ec r s p ( n or e m o v e d f r e e p r o t e i n ) ， c r s p l ( r e m o v e df r e ep r o t e i n ) ，c r s p1aa n dc r s p 1bi nv i t r oa n t i t u m o ra c t i v i t i e so n k 5 6 2t u m o rc e l l ，i nv i v oc r s pa n dc r s p1w e r ea s s a y e df o ra n t i t u m o ra c t i v i t ya g a i n s t h 2 2s o l i dt u m o ri m p l a n t e di nm o u s eu n d e ro pp a s s a g e r e s u l t ss u g g e s t e dt h a tc r s pa n d c r s p1h a v ea n t i - t u m o ra c t i v i t i e sn o to n l yi nv i t r ob u ta l s oi nv i v o ，a n di ns a m e c o n c e n t r a t i o n ，c r s p1h a dr e l a t i v e l yh i g h e ri n h i b i t i o nr a t i ot h a nc r s p ；i nv i t r oc r s p1 ， c r s p1aa n dc r s p1be x h i b i t e di n h i b i t i o ne f f e c to nk 5 6 2t u m o rc e l lg r o w t h ，a n da ts a m e c o n c e n t r a t i o nt e s t e d ，c r s p1h a dt h eh i g h e s ti n h i b i t i o nr a t i o ，f o l l o w e db yc r s p1a ，a n d c r s p1b u n d e ra na d m i n i s t r a t i o nr a n g e ，t h ei n h i b i t i o nr a t i oo fc r s p 1a n dc r s p1a ， w h i c hr e a c h e sm a x i m u mv a l u ea tm i d d l ed o s e ，w a si nn o r m a ld i s t r i b u t i o nw i t hd o s e i n c r e m e n t ，w h i l et h a to fc r s p1bd e c r e a s e dw i t h d o s ei n c r e m e n t 5 i nv i v oc r s p1w a si n v e s t i g a t e df u r t h e rf o ra n t i - t u m o ra c t i v i t ya g a i n s ts a r c o m a 18 0s o l i dt u m o ri m p l a n t e di nm i c eu n d e ri n t r a p e r i t o n e a la n do r a l p a s s a g ea n dt h e i r i n f l u e n c eo ni m m u n o l o g yo r g a n sa n dc a r b o nc l e a r a n c ei n d e x t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e y h a ds i g n i f i c a n ta n t i t u m o re f f e c t su n d e ri n t r a p e r i t o n e a la n do r a lp a s s a g e ，t h e i rs i g n i f i c a n t a r g u m e n to fs p l e e ni n d e xa n dc a r b o nc l e a r a n c ei n d e xw e r ea l s of o u n du n d e ri n t r a p e r i t o n e a l a n do r a lp a s s a g e ，r e s p e c t i v e l y t h e s ef a c t si n d i c a t e dt h a ts u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e sf r o m c a u l e r p ar a c e m o s ap r o b a b l yi n h i b i t e dt u m o rg r o w t hb ym e a n so fa c t i v a t i n gt h e i v i m m u n o c o m p e t e n c eo ft h eb o d y 6 r e s u l t so fi nv i t r oi m m u n es h o w e dt h a tt h ep o l y s a c c h a r i d e sf r o mc a u l e r p a r a c e m o s ac a np r o m o t em i c es p l e e nl y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o nw i t hd i r e c t l yo rc o o p e r a t i n g w i t hm i t o g e n i cf a c t o rc o n a ，a n ds i g n i f i c a n t l yi m p r o v et h ea b i l i t i e so fm i c ep e r i t o n e a l c a v i t ym i c r o p h a g ee a t i n gn e u t r a lr e da n de x c r e t i n gn i t r oo x i d eu n d e ra c e r t a i nd o s es c o p e s op o l y s a c c h a r i d e sf r o mc a u l e r p ar a c e m o s ac a na c t i v a t et h ei m m u n o c o m p e t e n c eo ft h e b o d y , a c c o r d i n g l yt oe x e r ta n t i - t u m o re f f e c t k e y w o r d s ：c a u l e r p ar a c e m o s a ；s u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e s ；e x t r a c t i o nt e c h n o l o g y ； p h y s i c o - c h e m i c a lc h a r a c t e r s ；a n t i - t u m o r ；i m m u n o m o d u l a t i o n v 缩写 b i u 垤 b w c r s p c o n a i l 1 1 p m w m m t t n k o p p m n p m a t n f u v v e 缩写词 全称 b i o l o g i c a lr e s p o n s em o d i f i e r b o d yw e i g n t c a u l e r p ar a c e m o s as u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e c o n c a n a v a l i na i n t e r l e u k i n 1 i n t r a p e r i t o n e a lp a s s a g e m o l e c u l a rw e i g h t m a c r o p h a g e 3 一( 4 ，5 一d i m e t h y l t h i a z a l 一2 y 1 ) 2 ，5 - d i p h e n y l t e r a z o l i u m b r o m i d e n a t u r ek i l l e r o r a lp a s s a g e p o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r o p h i s p h o r b o lm y r i s t a t ea c e t a l e t u m o rn e c r o s i sf a c t o r u l t r a v i o l e t e 1 u t ev o l u m e 中文 生物效应调节剂 体重 总状蕨藻硫酸多糖 刀豆蛋白a 白细胞介素l 腹腔注射 分子量 巨噬细胞 四甲基偶氮唑盐 自然杀伤 灌胃 多型核白细胞 豆寇酰佛波醇乙酯 肿瘤坏死因子 紫外线 洗脱体积 广东海洋大学 学位论文独创性及知识产权声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得本校或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 本学位论文成果归广东海洋大学所有。 研究生签名：卯晦搀 秒- 辟6 月件日 砬厂付 豸印 t-1孙叶 签月 师6 教事撒辞 广东海洋大学硕士学位论文 第一章绪论弟一旱珀t 匕 海洋是生命的摇篮，在漫长的演变过程中，孕育了最原始的生命。与陆地生物资 源相比，海洋生物生长周期短，再生速度快，与其周围生物间有更为密切的相互依存、 相互制约关系。随着陆地资源日渐匮乏，开发和利用海洋这个古老而又神秘的资源宝 库，在海洋中寻找新的生存空间，已成为人类的普遍共识。 海藻是生长于海洋中的低等隐花植物，是海洋中有机物的原始生产者和无机物的 天然富集者，海洋这个特殊的生长环境，导致其代谢产物与代谢特点与陆地植物有相 当大差异。我国位于欧亚大陆东南部，海岸线漫长，地跨热带、亚热带、温带和亚温 带，海藻资源极为丰富，仅经济海藻就有5 1 0 多种，包括了6 6 种蓝藻，2 2 6 种红藻， 11 5 种褐藻和1 0 3 种绿藻。现已开发利用的经济藻类主要有褐藻门的海带( l a m i n a r i a ) 、 裙带菜( u n d a r i a ) 、巨藻( m a c r o c y s t i s ) 、马尾藻( s a r g a s s u m ) 、蓝藻门的螺旋藻( s p r i u l i n a l 和红藻门的紫菜( p o r p h y r a ) 、江蓠( g r a c i l a r i a ) 、麒麟菜( e u c h e u m a ) 、石花菜( g e l i d i u m ) 竺【l 】 寸0 多糖是海藻的主要成分，根据藻体内的分布情况，可以分为三类：最外层是细胞 壁多糖，多呈微细纤维状结晶，如纤维素和半纤维素；第二类是细胞壁多糖间的粘多 糖，多为无定型的胶状，如褐藻胶、琼胶、岩藻多糖、琼脂糖与硫酸糖等；第三类是 细胞内的贮藏多糖，如海藻淀粉。其中构成细胞粘多糖的褐藻胶、琼胶、岩藻多糖、 琼脂糖与硫酸糖等是藻类所特有的糖类，也是藻类工业生产与应用最广泛的糖类，如 琼脂、卡拉胶和褐藻酸盐已长期在食品、医药、卫生等方面广泛应用【2 4 1 。近年来， 海藻多糖作为药物和药物中间体的潜在功能，受到越来越多的科学家关注，大量研究 表明，海藻多糖具有抗衰老、降血脂、免疫调节、抗肿瘤、抗病毒和抗辐射等多种生 理活性【5 _ 7 1 。 1 1 海藻多糖的提取与分离纯化 1 1 1 海藻多糖的提取 多糖的提取就是将存在于生物体内的多糖解离出来的过程。常用的方法是溶剂提 取，大多采用水、稀碱或稀盐溶液，尽量避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的 断裂，稀酸提取时，时间宜短，温度不易超过5 0 。c t 引。通常为了提高分离的选择性， 在提取之前对原料用醇或醚回流进行脱脂或脱色处理；为提高多糖的得率，可使用超 声波、微波和一些酶进行辅助提取。各种提取方法及其优缺点的比较见表1 1 。 利用多糖在有机溶剂中溶解度很小的特点，获得的多糖提取液常用乙醇等有机溶 总状蕨藻硫酸多糖的提取、分离及其抗肿瘤与免疫活性 剂沉淀其中的多糖；也可利用阳离子表面活性剂能与高分子电解质产生沉淀的性质， 采用季胺盐类如氯化十六烷基吡啶( c p c ) 或溴化十六烷基三甲基铵( c t a b ) 使多糖 沉淀下来。沉淀得到的多糖称为粗多糖，其中还含有无机盐、有机溶剂不溶的一些低 分子有机物、大分子的蛋白质等杂质，需要进一步的纯化。 表1 1 不同提取方法的比较 t a b 1 1c o m p a r i s o no fd i f f e r e n te x t r a c t i o nm e t h o d s 1 1 2 海藻多糖的纯化 多糖纯化的目的就是先去除其中的非多糖组分，然后再对纯化的多糖进一步分 级，将混杂的多糖组分分成不同的单一组分进行深入研究。 一般首先是脱蛋白，多糖脱蛋白的方法有： ( 1 ) s e v a g e 法：s e v a g e 法是经典的脱蛋白方法，条件较温和，但需反复多次才能 除去尽量多的蛋白质，有机试剂用量大，耗时较长，并且多糖损失较为严重，另外在 生产过程中得到的多糖溶液还残留有毒性较大的有机溶剂，需蒸发才能除去。 ( 2 ) 蛋白酶结合s e v a g e 法法：利用蛋白酶来酶解蛋白成为分子量较小的多肽或者 更为彻底的氨基酸，该法除蛋白的效率高，但成本也高。 ( 3 ) 三氯乙酸法：三氯乙酸作为一种有机酸，可以使试样中的蛋白质因为有机酸 的作用变性而沉淀。但是在酸性溶液中多糖链可能被三氯乙酸降解。 然后脱去其他小分子，去小分子的方法有：乙醇重沉淀法、透析法、凝胶过滤法、 离子交换树脂法等。 经过纯化的多糖还需要进一步分级，根据多糖的性质，主要有以下不同的分级方 法： ( 1 ) 离子交换柱层析法：是根据多糖所带电荷数的多少而被分成不同级分；常用 2 广东海洋大学硕士学位论文 的交换介质有d e a e 纤维素，d e a e s e p h a d e x ，q s e p h a r o s e 等，此法适宜于选择性 分离各种酸性、中性或粘性多糖。 ( 2 ) 凝胶柱层析法：是根据多糖分子的大小和形状而进行分离的，通常用来作进 一步的纯化，常用的凝胶有s e p h a d e x ，a g r o s e ，s e p h a c 巧l 等 ( 3 ) 沉淀法：主要有乙醇重沉淀法和季胺盐类沉淀法。乙醇重沉淀法是利用不同 浓度的乙醇分步沉淀出不同的多糖级分而纯化；季胺盐类沉淀法是用c p c 或十六烷 三甲基溴化胺( c t a b ) 能与具有高分子量的阴离子型硫酸多糖产生沉淀而分离。此 外用于多糖分级纯化的方法还有超滤法、盐析法、区带电泳、亲和层析法等。 1 1 3 海藻多糖的纯度鉴定 多糖的纯度不能用通常小分子化合物的纯度标准来衡量，因为即使是多糖纯品， 其微观结构也是不均一的。多糖的纯度只代表相似链长的平均分布。我们通常所说的 纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。常用的纯度鉴定的方法有四种：比旋度法、 超离心法、高压电泳法和凝胶过滤法。前三种误差较大，现在应用较多的是h p l c 法。 通常要肯定某一种多糖的均一性，必须要有两种方法以上的鉴定结果才能肯定。 1 2 海藻多糖的组成结构与功能 1 2 1 海藻多糖的组成结构 海藻多糖是一类多组分混合物，由不同的单糖基通过糖苷键( 一般为c l ，3 键和 c 1 ，4 - 键) 相连而成，是海藻细胞间和细胞内所含的各种高分子碳水化合物的总称。 一般为水溶性，大多含有硫酸基，多具高黏度或凝固能力。海藻多糖的种类很多，根 据其来源不同，分为红藻多糖、绿藻多糖、褐藻多糖等，其中褐藻多糖的种类和数量 最多习( 见表1 2 ) 。不同来源的海藻多糖，组成多糖的糖基单体也不相同。海藻多糖 由于成分复杂，分离纯化难度较大，因此，对其结构的研究主要集中于其所包含的糖 单元组成及含量。 卡拉胶是某些红藻的细胞壁多糖，已知8 2 种红藻的提取物及产物含有卡拉胶。 其本质是一种硫酸半乳糖，主要由一系列半乳糖分子通过糖苷键交替连接而成，为吡 喃半乳糖的硫酸匀聚物。卡拉胶分子量一般在5 0 0 ，0 0 0 ( 从海藻中提取) 至5 ，0 0 0 ( 经商业处理) 。 来源于红藻的另一大类多糖琼胶则由琼胶素和琼胶脂组成，前者由d 半乳 糖和内醚l 半乳糖组成，后者在组成中含有葡萄糖醛酸、丙酮酸及多量的硫酸根。 琼胶具有凝固性。 褐藻多糖硫酸酯，又称褐藻糖胶或岩藻多糖，是褐藻细胞间的天然产物，其组成 以岩藻糖和有机硫酸酯为主，还含有半乳糖、木糖及少量葡萄糖醛酸。 另外，对海藻多糖结构的研究还侧重于其结构对活性的影响。由于海藻多糖具有 多方面生物活性，其作用机制受到研究人员的普遍重视，并努力将一些活性不高的多 总状蕨藻硫酸多糖的提取、分离及其抗肿瘤与免疫活性 糖通过化学修饰，得到活性较高的多糖。如法国科学家从褐藻中提取出高分子岩藻聚 糖后，利用其结构与抗凝血的低分子量的岩藻聚糖之间的关系，通过自由基降解和离 子交换色谱法，制得具有抗凝血性的低分子量的岩藻聚糖1 4 】。 表2 2 主要的海藻及其多糖产物 t a b 2 - 2m a i ns e a w e e d sa n dt h e i rp o l y s a c c h a r i d e s 1 2 2 海藻多糖构效关系 根据对多糖的结构分析和药理研究，发现多糖存在明显的构效关系。多糖的构效 关系【l5 j 是指多糖的一级结构和高级结构与生物活性之间的关系，是当前糖化学和糖生 物学共同关注的焦点问题。就其一级结构而言，多糖中的单糖组成、糖苷键类型以及 一些官能团对其生物活性都有影响；多糖的高级结构的研究还较少，但科学家已肯定 多糖的高级结构对功能的影响比一级结构重要得多。到目前为止，除了对肝素碎片寡 糖的构效关系研究得较详细外，其他多糖( 及寡糖) 的构效关系研究至今尚不多【l 6 j 1 2 2 1 单糖组成和糖苷键类型对其生物活性的影响 研究表明，藻类多糖的抗肿瘤作用与单糖间糖苷键的结合方式有关i l 。水溶性的 d 葡聚糖有抗肿瘤作用，尤其是直链、无过长支链、不易被体内d 葡聚糖酶水解的 多糖具有明确的抗肿瘤活性。目前认为以p 一1 ，3 d 一葡聚糖和以b l ，4 d 葡聚糖占优 势的多糖具有明显的抗肿瘤活性。亦有研究表明，以0 t , d 葡聚糖为主的多糖也有抗 肿瘤作用。对具有抗病毒活性的硫酸酯化多糖而言，硫酸酯化匀多糖的活性大于硫酸 酯化杂多糖，且d 1 ，3 d 葡聚糖和以p l ，3 d 葡聚糖为主的多糖的活性明显高于p 1 ， 6 一d 葡聚糖i 悄j 。 1 2 2 2 海藻多糖中的一些官能团对其生物活性的影响 多糖中的官能团的种类或有无对其生物活性有极大的影响，而这些官能团往往可 以通过一定的化学方式进行添加或消除，所以多糖中官能团的改造已成为研究构效关 系的有力手段。而对不同的多糖来说，不同官能团改造方法对其生物活性的影响各不 相同，除了大多数硫酸酯化多糖具有明显的抗病毒作用外，其他官能团对多糖生物活 性的影响尚无规律可循，这无形之中增加了多糖构效关系研究的繁杂程度和难度。藻 类含有的硫酸多糖就其抗病毒来说，硫酸化是多糖类抗病毒的必要条件【1 9 , 2 0 。一般地， 4 广东海洋大学硕士学位论文 硫酸根含量在每个糖残基平均含1 5 2 0 为最佳。对一系列生物和非生物硫酸聚阴离 子对单纯疱疹病毒的抑制作用进行的分析发现，抑制作用随分子中硫酸化程度而发生 变化，当多糖中每个己糖单位含有1 个硫酸基时，抑制活性最强。有研究表明，褐藻 多糖的生物活性与硫酸基的含量之间存在密切的联系。褐藻糖胶的抗凝血活性随着硫 酸化程度增加而增加，脱硫处理则活性降低，硫酸基含量减少2 0 就完全失去抗凝活 性【2 i 】。 1 2 2 3 分子量、溶解度、粘度等对其生物活性的影响 研究表明，多糖的生物活性与其分子量的大小关系密切。一般认为中等分子量的 多糖，其生物活性大于高分子量或低分子量的多糖1 2 2 | 。另外，近年多糖受体的发现， 使得学者推测多糖分子可能存在一个或几个寡糖片段的“活性中心”，多糖与受体作用 时，只有分子中的“活性中心”与受体结合【23 。，因而在