（海洋生物学专业论文）受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究.pdf

受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 注；如煎直墓他盂蔓挂别岂明的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 缀签字日期：弦，孑年歹月夕日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 垄拖 导师签字： 五l 苁办 签字日期：2 o ，鬈年箩月矽日签字日期：砌矿年岁月刃日 受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 中文摘要 本论文以脱氧胆酸为疏水基团，制备了疏水修饰的透明质酸一脱氧胆酸耦合 物，研究了这种两亲性分子在水溶液中的自组装行为；以阿霉素为模型药物制备 了载药的透明质酸纳米粒，研究了其在体外的药物缓释效果；以人宫颈癌上皮细 胞系( h u m a ne p i t h e l i o i dc e r v i c a lc a n c e rc e l ll i n e ，h e l a ) 细胞为模型细胞，考察了 载药纳米粒的体外肿瘤细胞杀伤率，并探讨了细胞对纳米粒的吞噬机制。 利用e d c 作为交联剂，通过酰胺键共价连接脱氧胆酸( d o x y c h o l i ca c i d 。 d o c a ) 到透明质酸( h y a l u r o n i ca c i d 。h a ) 上制备h a - d o c a ( h d ) 化学耦合物， 并改变脱氧胆酸与透明质酸的反应摩尔比制成三种不同取代度的样品( h d 6 、 皿7 、皿9 ) 。利用核磁共振检测证明了产物的结构：利用微量滴定法测定了产 物的取代度，每个h a 链约含有5 9 - 9 4 个d o c a 分子。通过超声法制备h d 纳米 粒悬液，利用荧光探针检测了纳米粒的自聚集性质，发现h d 纳米粒的临界聚集 浓度( c a c ) 随着取代度的增加而降低，三种样品的c a c 值分别是：0 0 5 6 m g m l 、 o 0 3 7 m g m l 、0 0 2 5 m g m l ；纳米粒内核的疏水性随取代度的增加而提高；利用荧 光淬灭技术研究了纳米粒内部疏水簇的交联数量和其显微结构，疏水微区的浓度 ( n d o c a ) 和聚合物链的聚集数量( 虬蛔所) 随着脱氧胆酸取代度的增加而增加， 表明h d 纳米粒内部形成了多个疏水的内核；利用动态激光散射与透射电子显微 镜技术对纳米粒的形态进行了表征，纳米粒的大小随取代度增加而减小，三种样 品的平均粒径分别是：11 4 4 r i m ，4 4 7 n m ，2 0 8 n m ，纳米粒近似球形，形态完整。 利用疏水相互作用，把模型药物一阿霉素装载进入纳米粒的疏水内核中，制 备载药纳米粒。通过改变药物与纳米粒的重量比，制备不同载药量的样品，然后 在确定重量比的情况下，制备不同取代度的载药纳米粒，并研究了这些样品在体 外的药物释放情况。结果表明，加药量越高纳米粒载药量越大，h d 6 纳米粒的最 高载药量可达1 1 5 8 ，载药率则随着载药量的增加而降低：取代度越高，载药 量越大，载药率越高；三种取代度的纳米粒均有较好的药物缓释效果，缓释时间 可达5 天以上，体外药物释放呈三段模式，先是初期的突释，接着是一接近匀速 的释放，最后是缓慢和持续的长时间释放，载药量和取代度均对药物释放有较大 的影响，载药量越大、取代度越高药物与纳米粒内核的结合越紧密，部分药物在 受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 纳米粒中结晶化，使得药物释放的突释量降低、缓释效果增强。 本文还用m t t 比色的方法研究了h d 纳米粒的细胞毒性和不同取代度的载 阿霉素h d 纳米粒的对肿瘤细胞杀伤的有效性，并利用荧光酶标仪与荧光显微镜 检测了细胞对于荧光标记的h d 纳米粒的吞噬情况。结果表明，空白h d 纳米粒对 h e l a 细胞无显著毒性，孵育3 天存活率仍在9 5 以上；不同取代度载药纳米粒均 显示了肿瘤细胞生长抑止作用，随取代度升高对癌细胞的杀伤率增加，载药纳米 粒细胞毒性体现出浓度与时间的依赖性，药物浓度为l o 肛g m l 时，孵育3 天内三种 载药纳米粒的细胞杀伤率分别达到：3 3 7 2 ，4 1 2 7 ，4 9 7 6 ，与阿霉素注射剂 相比，在卜5 “幽_ i l l 时h d 9 载药纳米粒显运出更高的细胞毒性，在l o p g m l 时亦表现 出与其相当的抗肿瘤细胞活性；h e l a 细胞对h d 纳米粒的吞噬依赖于纳米粒的 浓度与孵育的时间，4 个小时内细胞对纳米粒的吞噬呈线性增长，浓度越低细胞 的吞噬率越高，最高吞噬率达5 0 以上；取代度是影响细胞对纳米粒吞噬的另一 关键因素，相同条件下，取代度越高细胞对纳米粒的吞噬速度越快，效率越高， 孵育时间内有一半以上的h d 9 纳米粒被吞噬到细胞中；荧光显微镜观测可直观的 看到纳米粒与细胞特异结合到被吞噬到胞质内的过程，显示出很强的时间依赖 性，与荧光酶标仪的测定结果一致。 关键词：透明质酸；疏水修饰；h d 纳米粒；缓释；m t t ；细胞吞噬 2 受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 t h es t u d yo fr e c e p t o r 。m e dia t e dt u m o rt ar g e tin g n a n o p a r t icie sb a s e do nh y aiu r o nica gida sd r u gd eiiv e r y s y s t e m a b s t r a c t h y d r o p h o b i c a l l ym o d i f i e dh y a l l 】r o n i ca c i d - d o x y c h o l i ca c i d ( h d ) c o n j u g a t e sw e r e p r e p a r e d w i t h d o x y c h o l i ca c i d ( d o c a ) a st h eh y d r o p h o b i c 黟o u p s t h e s e l f - a s s e m b l e db e h a v i o ro ft h ea m p h i p h i l e si nw a t e rs o l u t i o nw a si n v e s t i g a t e d a d r i a r n y c i n ( a d r ) w a sc h o s e na sam o d e ld r u gt of a b r i c a t et h ed r u g - l o a d e d h y a l u r o n i ca c i d ( h a ) n a n o p a r t i c l e sa n dt h e i nv i t r or e l e a s eo fa d rf o r mt h e n a n o p a r t i c l e sw a sa n a l y z e d h u m a ne p i t h e l i o i dc e r v i c a lc a n c e rc e l ll i n e ( h e l a ) w a s u s e dt oi m a g ea n dm e a s u r et h ec e l lu p t a k eo fn a n o p a r t i c l e s c a n c e rc e l lv i a b i l i t yo f t h ea d r - l o a d e dh i ) n a n o p a r t i c l e sw a sm e a s u r e db ym t t a s s a y t h ec h e m i c a l c o n j u g a t e so fh aa n dd o c aw e r es y n t h e s i z e db yc o v a l e n t a t t a c h m e n to fd o c at oh a 、肮t l la m i d ef o r m a t i o nt h o u g he d c - m e d i a t e dr e a c t i o n v a r i o u sh dc o n j u g a t e sw i t hd i f f e r e n td e g r e eo fs u b s t i t u t i o n ( d s lw e _ bp r e p a r e db y c h a n g i n gt h ef r e em o l er a t i o so fd o c a t oh aa n dt h ed s ，d e f i n e da st h en u m b e ro f d o c a p e ro n eh am o l e c u l e ，w a sd e t e r m i n e db yat i t r a t i o nm e t h o d t h es t r u c t u r eo f h dc o n j u g a t e sw a si d e n t i f i e d b y 1 hn m rs p e c t r a t h es e l f - a s s e m b l e dh d n a n o p a r t i c l e ss o l u t i o nw a so b t a i n e db ys o n i c a t i o na n dt h es e l f - a s s e m b l i n gp r o p e r t i e s w e r ea n a l y z e db yt h ef l u o r e s c e n c ep r o b et e s t t h ec r i t i c a la g g r e g a t i o nc o n c e n t r a t i o n ( c a c ) o fh dn a n o p a r t i c l e sd e c r e a s e d 、砘mt h ei n c r e a s i n go fd sa n dt h ec a c d e t e r m i n e df o rh dc o n j u g a t e sh d 6 ，h d 7a n dh d 9w e r e0 0 5 6 m g m l ，0 0 3 7 m g m l a n do 0 2 5 m g m lr e s p e c t i v e l y t h eh y d r o p h o b i c i t yo ft h ec o r eo fn a n o p a r t i c l e sw a s i n c r e a s e da s t h e i n c r e a s i n g o fd s t o i n v e s t i g a t e t h e a s s o c i a t i n gn u m b e ro f h y d r o p h o b i cm o i e t i e si no n es e l f - a g g r e g a t ea n dt oi d e n t i f yt h em i c r o s t r u c t u r eo f n a n o p a r t i c l e s ，af l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gm e t h o dw a su s e d t h em e a na g g r e g a t i o n n u m b e ro fd o c ag r o u p s ( n o o c , oa n dt h een u m b e ro fp o l y m e rc h a i n s ( c 妇f n ) p e r 3 受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 s i n g l eh y d r o p h o b i cd o m a i ni n c r e a s e d 、j l ，i t l li n c r e a s i n gd so fd o c a t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a to n eh dn a n o p a r t i c l ec o u l dh a v em u l t i p l eh y d r o p h o b i ci n t e r - c o r e s t h e f o r m a t i o no fl i dn a n o p a r t i c l e sw a sc h a r a c t e r i z e db yd y n a m i cl a s e rl i g h ts c a t t e r i n g a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) t h ep a r t i c l es i z ew a sd e c r e a s e dw i t h d si n c r e a s e da n dt h em e a nd i a m e t e ro fh dn a n o p a r t i c l e sw i t had so f5 9 7 4a n d 9 6w e r e114 4 n m ，4 4 7 n ma n d2 0 8 n m ，r e s p e c t i v e l y 1 1 1 et e mo b s e r v a t i o n d e m o n s t r a t e dt h en e a rs p h e r i c a ls h a p eo fs e l f - a g g r e g a t e sw i 廿la i n t e g r a t e df o r m a d rw a su s e da sam o d e ld r u gt oi n c o r p o r a t ei n t oh y d r o p h o b i ci n t e r c o r eo fh d n a n o p a r t i c l e st h o u g hh y d r o p h o b i ei n t e r a c t i o nt op r e p a r ed r u g l o a d e dn a n o p a r t i c l e s v a r i o u ss w a t c h e sw e r es y n t h e s i z e db yc h a n g et h ef e e dw e i g h tr a t i oo fa d rt oh d c o n j u g a t e s t h ed r u g - l o a d e dn a n o p a r t i c l e s 、而t l ld i f f e r e n td sw e r es y n t h e s i z e dw i t h s a l l l ef e e dw e i g h tr a t i oo fa d rt oh dc o n j u g a t e s t h ed r u gr e l e a s ep r o f i l eo fa l lt h e s a m p l e sw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h e d r u gl o a d i n g c o n t e n t i n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gt h ef e e dw e i g h tr a t i oo fa d rt oh dc o n j u g a t e sa n dt h e m a x i m u ml o a d i n gc o n t e n to fh d 6n a n o p a r t i c l e sw a sd e t e r m i n e dt o11 5 8w t 。t h e l o a d i n ge f f i c i e n c yr e d u c e d 、i t l lt h ei n c r e a s i n gf e e dw e i g h tr a t i oo fa d r t h ed r u g l o a d i n gc o n t e n ta n de f f i c i e n c yw e r ei n c r e a s e d 、砘n lt h ei n c r e a s i n gd s t h ed r u gw a s s u s t a i n e dr e l e a s e df o r ma l lt h et h r e eh dn a n o p a r t i c l e s 、析廿1d i f f e r e n td sa n dt h e c u m u l a t e dr e l e a s et i m ec o u l da c h i e v e5d a y s t h er e l e a s eb e h a v i o ro fa d re x h i b i t e d at r i p h a s i cp a t t e mc h a r a c t e r i z e db yaf a s ti n i t i a lr e l e a s e ，f o l l o w e db yac o n s t a n tr e l e a s e a n dt h eas l o w e ra n dc o n t i n u o u sr e l e a s e t h er e l e a s ep r o f i l ew a ss i g n i f i c a n t l y i n f l u e n c e db yt h ed sa n dt h ed r u gl o a d i n gc o n t e n t t h eh y d r o p h o b i cd r u gi n n a n o p a r t i c l e sp a r t i a l l yc r y s t a l l i z e da tah i g h e rd r u gc o n t e n ta n dah i g h e rd sw h i c h e n h a n c e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na d ra n dt h en a n o p a r t i c l e s 1 1 1 ei n i t i a lb u r s tc o n t e n t d e c r e a s e da n dt h es u s t a i n e dr e l e a s ei m p r o v e do w i n gt ot h ec r y s t a l l i z a t i o n t h ei nv i t r oc y t o t o x i c i t yo fb l a n kh dn a n o p a r t i c l e sa n dc y t o s t a t i ca c t i v i t yo f a d r - l o a d e dn a n o p a r t i c l e sw i n ld i f f e r e n td sw e r ea n a l y z e db yt h em t tm o t h o d t h e c e l l u l a ru p t a k eo ff l u o r e s c e n th dn a n o p a r t i c l e sw a sa s s a y e da n dv i s u a l i z e db yu s i n g f l u o r e s c e n c em i c r o p l a t er e a d e ra n df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y t h eb l a n kn a n o p a r t i c l e s e x h i b i t e dn oc y t o t o x i c i t yf o rt u m o rc e l l sa n dt h ec e l lv i a b i l i t yw a sh i g h e rt h a n9 5 4 受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 w i t h i n3d a y s a l lt h et h r e ed i f f e r e n tn a n o p a r t i e l et y p e so fa d r a p p e a r e dac e r t a i n e x t e n ta n t i c a n c e ra c t i v i t y ，w h i c hi n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n go fd s t h ek i l lr a t eo f h e l aw i t ht h r e eo ft h ed r u g - l o a d e dn a n o p a r t i c l e sw e r e3 3 7 2 ，4 1 2 7 ，4 9 7 6 r e s p e c t i v e l yw i t h i ni n c u b a t i n g3d a y sa tt h elo i x g m ld r u gc o n c e n t r a t i o n a d r - l o a d e d h d 9n a n o p a r t i c l e ss h o w e dh i g h e r c y t o t o x i c i t y v e i s b sf r e ea d ra tt h ed r u g c o n c e n t r a t i o nr a n g eo f1 - 5 p g m la n da c h i e v e de q u i v a l e n t l ya n t i c a n c e ra c t i v i t yt h e o i _ t g m d r u gc o n c e n t r a t i o n c e l l u l a ru p t a k eo fh dn a n o p a r t i c l e sd e p e n d e do n n a n o p a r t i c l ec o n c e n t r a t i o na n di n c u b a t i o nt i m e t h eu p t a k er a t eo fh dn a n o p a r t i c l e s t oh e l ac e l l ss h o w e dal i n e a r i n c r e a s i n gw i t h i n4 h t h el o w e rn a n o p a r t i c l e c o n c e n t r a t i o nt h eh i g h e rc e l l u l a ru p t a k ee f f i c i e n c y ，t h em a x i m u mr a t ew a sa b o v e5 0 t h ed sw a sa n o t h e rk e yf a c t o ri n f l u e n c i n gt h ec e l l u l a ru p t a k eo fn a n o p a r t i c l e s t h e d e g r e e o ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h en a n o p a r t i c l e sa n dt h ec e l l si n c r e a s e dw i t h i n c r e a s i n gd su n d e ri d e n t i c a lc o n d i t i o n a b o v e5 0 h d 9n a n o a p a r t i c l e s 、 ，i t l lt h e h i g h e s td sw e r ei m e m a l i z e di n t oc e l l sw i t h i ni n c u b a t i o nt i m e v i s u a le v i d e n c eo f s p e c i f i cc o u p l i n gb e t w e e nn a n o p a r t i c l ea n dc e l la n dt h en a n o p a r t i c l e s su p t a k eb y h e l ac e l l sw a so b t a i n e dw i t l lf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y t h ei n t e r n a l i z e dp r o c e s s e x h i b i t e dh i g hd e p e n d e n c eo fi n c u b a t i o nt i m ec o r r e s p o n d e dt ot h eq u a n t i t a t i v et e s t w i t hf l u o r e s c e n c em i c r o p l a t er e a d e r k e yw o r d s ：h y a i u r o n i ca c i d ：h y d r o p h o b i c a ii ym o d i f i e d ：h dn a n o p a r t i c i e s ： s u s t a i n e dr e i e a s e ：m t t ：c o i i u l a ru p t a k e 5 受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 0 刖罱 0 1 基于疏水化修饰水溶性多糖的纳米粒制备及应用研究进展 在生物体系中，生物大分子( 如d n a 、多糖、蛋白等) 的自组装及分子间的 相互作用，是一种可控制的非共价的方式，例如静电相互作用、氢键和疏水作用 等。其中生物大分子的兼性性质对其在液相中的分子自组装非常重要。例如，在 生物体内多肽链可通过氢键作用形成二级结构，然后通过疏水作用折叠成近乎球 型的三级结构，具有三级结构的亚基可通过静电相互作用、氢键和疏水作用等进 一步组装成四级结构。近年来模拟体内生物大分子的结构特点在体外合成了各种 两亲性聚合物分子，如嵌段共聚物和疏水修饰的水溶性聚合物等，并研究了这些 两亲性聚合物分子自聚集体的结构与功f l 皂( a k i y o s h i ，1 9 9 6 ) 。在合成方法上由于疏 水化修饰的水溶性聚合物的制备比嵌段共聚物容易，因此开发来自疏水修饰的水 溶性聚合物的聚合自聚集体要比嵌段共聚物更有发展前途。水溶性聚合物经疏水 化修饰后即成为两亲性分子，通常是由亲水性的主链携带有一小部分疏水基团如 烷基、胆固醇、脱氧胆酸等( m i w a , 1 9 9 8 ；l e e ，1 9 9 8 ) 。当其溶于液相介质中时， 由于最小化自由能的需要，疏水化聚合物能够通过分子间和分子内的疏水部分之 间的相互交联自发的形成胶束或自聚集体。以这种方法制备的纳米级自组织体有 一些独特的性质，如：1 ) 纳米级尺寸和窄的粒径分布，可以使其逃脱网状内皮 细胞体系和肾脏的排空机制，延长血浆半衰期( k w o n ，1 9 9 6 ) ；2 ) 核壳结构，核是 指纳米粒内部存在的疏水性微结构域；外壳则由多糖的亲水骨架构成。其中亲水 外壳具有生物相容性，并对粒子分散在水中起立体稳定作用，而内核可以通过非 共价作用既可以结合亲水性生物大分子如蛋白质、d n a 等，又可以结合疏水性 小分子如抗癌药物紫杉醇、寡霉素等。其特点是载药量大，在生物体内分布主要 由粒子的物理化学性质决定( a k i y o s h i ，2 0 0 2 ；l e e ，1 9 9 8 ) ；3 ) 临界聚集浓度低 ( c a c ) ，与小分子表面活性剂相比，聚合物的c a c 很低，使之在各种生理条件 下有很好的稳定性，保证药物以足够的浓度到达病灶部位( t a e ，2 0 0 2 ) 。 最近，兼性多糖及其自组装纳米粒的制备引起了广泛的关注。这是因为与人 工合成的多聚物( 如p v a ，p l g a 等) 和天然多聚物( 如胶原、白蛋白等) 相比， 多糖有很多特点宜于作为药物运输系统，如生物可降解性高、免疫原性低、良好 的生物相容性及容易进行化学改性等。 8 受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 0 1 2 凝胶纳米粒的制各方法 以疏水修饰多糖为基质制备纳米粒的方法主要两种：超声波破碎法与乳化 法。 0 1 2 1 超声波破碎法 把疏水修饰的多糖聚合物悬浮于水溶液中，通过超声波的破碎作用，把亲水 的多糖长链骨架打断，利用耦合的疏水基团之间的疏水相互作用，产生分子间和 分子内的自聚集，从而形成自组装纳米粒。例如，l i l l 等( l i u ，2 0 0 5 ) 把亚油酸修 饰的壳聚糖悬浮于p b s0 h7 4 ) 中，在3 7 。c 轻微振荡2 4 d 时，然后利用探针型超 声波破碎仪对其进行超声处理。超声过程共重复三次可获得完全澄清的溶液，把 超声后溶液用0 4 5pm 的虑膜过滤去除杂质即得到完全的纳米粒溶液。 o 1 2 2 乳化法 纳米粒亦可以通过乳化溶剂扩散法进行制备。乳化法可以分为油，水( o w ) 乳化与水，油( w o ) 乳化两种。 疏水化多糖纳米粒的制备主要使用油，水( o w ) 乳化法。这种方法中一些 参数，如有机溶剂类型、油相与水相的比例、乳化液的均制速率等会影响纳米粒 的制备和物理化学性质( l e m o s s e n n a , 1 9 9 8 ) 。我们将油酰化壳聚糖溶于0 1 m 的醋酸 溶液中，分别加入不同数量的氯仿作为油相，同时搅拌改变油，水的比例，随后 利用均制机使其变成分布均匀的微粒。氯仿可以在水相中快速的分散，促进纳米 粒在溶剂蒸发的过程中形成。蒸发去除氯仿后，加入多聚磷酸钠作为交联剂可进 一步固化纳米粒( c h e n ，2 0 0 3 ) 。 0 1 3 纳米粒的性质与特征 水溶性多糖，像普鲁兰糖、壳聚糖和肝素，可以被各种疏水基团如长烷基链、 胆固醇和脱氧胆酸等部分的取代。疏水化修饰使得这些多糖的溶解性发生了较大 的改变，而疏水基团的相互作用可以控制多糖聚合物的构象，最终影响其在液相 中的流变学属性( a k i y o s h i ，1 9 9 7 ) 。例如，普鲁兰糖( c h p ) 被胆固醇修饰取代， 每1 0 0 个葡萄糖单位上可以结合5 6 个胆固醇残基。经过对其水悬浮液的超声后可 以通过自聚集形成单分散相的稳定纳米粒。这种普鲁兰糖一胆固醇自聚集体含有 大量的水分。随着凝胶纳米粒中胆固醇基团的增多，具有较高的普鲁兰糖一胆固 醇耦合物可以形成更加致密的颗粒( g k i y o s h i ，1 9 9 6 ) 。 9 受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 聚合纳米粒是非常稳定的分子聚集体系。其稳定性分为静态与动态两个方 面，静态稳定性是指单个聚合物链和整个纳米粒结构之间的平衡常数，通俗的称 为临界聚集浓度( c a c ) ，即聚合物链通过分子间和分子内的交联形成自聚集体 的开始浓度。一般来说，自聚集体纳米粒显示非常低的c a c 值，其c a c 要远低于 各种表面活性剂所形成的胶束的临界胶束浓度。如亚油酸疏水修饰的壳聚糖自聚 集体纳米粒，其c a c 值为5 1 0 m g m l ，要远低于十二烷基磺酸钠与脱氧胆酸在 水相中的2 3 m g m l 与1 0 m g m l 的临界聚集浓度( l i u ，2 0 0 5 ) 。动态稳定性是指聚合物 纳米结构受破坏的比率，在有机体内的药物运输方面它要比静态稳定性更加重 要，因为在生理环境中，新陈代谢、人体排泄机制以及与各种生物因子( 比如细 胞、蛋白和脂质等) 的相互反应都会破坏纳米粒的结构。较低的受破坏比率使得 聚合纳米粒可以更长时间的保持他们的结构从而使其充分的到达目标组织 ( a l d y o s h i ，2 0 0 2 ) 。同时纳米粒的聚集和沉淀率也是其动态稳定性的一个重要的方 面。在生理环境中，纳米粒对于生物活性因子主要是蛋白质的吸附会不同程度的 造成颗粒的聚集沉淀，从而使其不能充分运送药物到达病灶部位，而且还会因其 在非病理部位的聚集造成药物对正常组织的损伤。亲水性外壳是保持纳米粒稳定 的重要因素，疏水修饰的水溶性聚合物构成的纳米粒因其主链骨架是水溶性物 质，要比嵌段共聚物胶束具有更高亲水性的外壳，从而保证了其良好的水相稳定 性( y o o ，2 0 0 1 ) 。k i m 等制备的脱氧胆酸修饰的乙二醇壳聚糖纳米粒其颗粒平均直 径在磷酸缓冲液( p h = 7 4 ) 中可以保持1 0 天以上( k i m ，2 0 0 5 ) 。 自聚集体在水相中的形成可以用荧光光谱法进行研究，利用芘作为分子探 针。芘是一种几乎不溶于水，在极性环境下可以自我促灭的试剂。当自聚集体或 其它的疏水微区在水溶液中形成的时候，芘依赖疏水相互作用会靠近或进入疏水 微区内部，由于芘密集的芳香族结构对极性非常敏感，就会产生强烈的激发态荧 光( k a l y a n a s u n d a r a m ，1 9 7 7 ；h u , 2 0 0 3 ) 。临界聚集浓度可以通过观测芘散射荧光光 谱峰1 与峰3 之间荧光强度比率的变化来确定。自组装纳米粒内部微区的疏水性可 以通过测定芘在水相与纳米粒间的分配平衡常数来确定。自聚集体的临界聚集浓 度和内核的疏水性随着疏水修饰基团取代度的增加而分别降低和增加。k w o n 等 ( k w o n ，2 0 0 3 ) 利用5 p 胆酸修饰乙二醇壳聚糖制备自聚集纳米粒，随着5 b 胆酸取 代度的增加( 1 1 0 1 1 5 0 个5 p 胆酸分子1 0 0 个葡萄糖残基) ，临界聚集浓度从 l o 受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 0 2 1 9 m g m l 降低至0 0 4 7 m g m l ，芘分配平衡常数，勋，由2 3 7 x 1 0 4 增加至4 0 4 x 1 0 4 。 以十二烷基氯化吡啶( c e t y l p y r i d i n i u mc h l o r i d ec p c ) 作为芘的促灭剂的稳态 荧光促灭试验可以测定疏水微区在颗粒内的分布和颗粒内交联的疏水簇的数量 ( a k i y o s h i ，1 9 9 7 ) 。纳米粒内部疏水微区的浓度可以通过测定在自聚集体存在的 情况下随c p c 浓度变化而变化的荧光强度曲线的斜率来确定。自聚集体颗粒内部 交联的疏水簇的数量与每个疏水微区含有的聚合物链的数量依赖疏水簇取代度 而变化。p a r k 等( p a r k , 2 0 0 4 ) 制备的脱氧胆酸一肝素自聚集体纳米粒，每个疏水 微区含有3 2 5 8 8 1 个脱氧胆酸基团，约有5 9 个肝素一脱氧胆酸聚合物链构 成一个疏水微区，在纳米粒内部形成一种多核结构。 0 1 4 疏水化多糖纳米粒的应用 研究结果显示，胶体系统作为药物输送体系具有低毒副作用和增进药物治疗 的效果。这类药物输送系统作为小分子药物、蛋白类药物、抗原和基因的运载体 系有广阔的应用前景。作为胶体系统的一种，自聚集聚合物纳米粒具有核壳结构 和很好的热稳定性，在生物技术以及制药学上有广泛的应用。 0 1 4 1 与疏水性药物的复合 绝大部分的药物分子结构中都含有疏水基团，这类药物通过疏水相互作用可 被包裹进纳米粒内核中。大多数被研究的聚合纳米粒药物载体都利用疏水相互作 用负载药物，增加它们的生物利用度并延长在血液中的循环时间( l a v a s a n i f a r , 2 0 0 2 ) 。 普鲁兰糖一胆固醇自聚集体可以结合各种疏水成份，如荧光探针、卟啉、胆 红素和阿霉素等，结合常数随着底物疏水性的增强而增加。疏水成分一般定位于 自聚集体内疏水的胆固醇交联区。研究认为，普鲁兰糖具有很多手中心，故其自 聚集体纳米粒含有手性的结合位点( a k i y o s h i ，1 9 9 6 ) 。a m y o s h i 等( a k i y o s h i ，1 9 9 6 ) 研究了阿霉素( a d r ) 与普鲁兰糖胆固醇自聚集体纳米粒之间的相互作用，发 现：1 ) 一个凝胶纳米粒可以结合1 0 0 个以上的阿霉素分子；2 ) 结合以后，阿霉 素的化学稳定性显著提高；3 ) 阿霉素从结合物中自发释放的速率很慢，在p h7 4 的p b s 中孵育7 天后，7 0 以上的阿霉素仍然保留在结合物中。 疏水修饰的壳聚糖自聚集纳米粒也可以提高疏水药物的利用率，比如脱氧胆 酸一壳聚糖耦合物、具5 b 胆酸7 , - - 醇壳聚糖、硬脂酸接枝壳寡糖复合物等。 受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 l e e 等( l e e ，2 0 0 0 ) 用脱氧胆酸修饰壳聚糖，开发了一种新型简单的阿霉素运 载方法。最大阿霉素捕获量可达壳聚糖白聚集体的t 6 5 w t ，在p h7 2 的p b s 中阿霉素可以缓慢的从自聚集体中释放出来。后来，k i m 等( k i m ，2 0 0 6 ) 继续发 展了这种方法并用它作为另一种抗癌药物紫杉醇( p t x ) 的载体。他们以5 b 胆 酸为疏水簇修饰7 - - 醇壳聚糖( h g c ) 形成自聚集纳米粒。通过透析将紫杉醇包 裹到乙二醇壳聚糖纳米粒中。紫杉醇的装载效率在9 0 以上，最大载药量达纳 米粒的1 0 w t 。这种p t x - - h g c 载药纳米粒在生理环境下平均直径可以保持1 0 天，显示出良好的稳定性。p t x - - h g c 载药纳米粒的抗癌效果与商用紫杉醇剂 型相近，但是毒副作用要低的多。虽然壳聚糖作为药物载体具有很多功能性特征， 但是高分子量、高粘性和在生理p h 值下不溶于水，限制了它在体内的应用。壳 聚糖的降解产物一壳寡糖，克服了壳聚糖的应用局限性。h u 等( h u ，2 0 0 6 ) 以硬脂 酸接枝壳寡糖自聚集体作为紫杉醇的载体，可使紫杉醇增溶达2 0 倍以上，在不 同的疏水取代度下，最大包埋率可达9 9 1 4 。 除疏水簇外，亦可用疏水药物直接对多糖进行疏水修饰，构建自聚集纳米粒。 p a r k 等通过可酸性裂解的链接把阿霉素共价耦合到乙二醇壳聚糖上形成致密的 纳米级自聚集体。利用这种形式，大量的阿霉素可以被包埋进自聚集体中，载药 量高达3 8 。这种自聚集体具有比5 d 胆酸耦合的乙二醇壳聚糖更低的临界聚集 浓度。在水相介质中，它的胶体稳定性可保持8 天以上。自聚集体中阿霉素的释 放速率依赖于介质的p h 值，p h 越低释放越快，在生理p h 附近释放缓慢而持续。 体外细胞毒性检测发现，这种阿霉素剂型比纯药有更高的癌细胞杀伤率( p a r k , 2 0 0 6 ) 。 本课题组( l i u ，2 0 0 7 ) 利用亚油酰羧甲基壳聚糖自聚集纳米粒作为阿霉素的载 体，阿霉素包埋效率和药物装载量与最初加入的阿霉素的量成正比。生理环境下 阿霉素从壳聚糖纳米粒中的释放非常缓慢。其释放曲线可分为两段：1 ) 突释阶 段，大约1 9 4 的载入药物在6 h 内释放出来；2 ) 缓释阶段，3 7 8 的载入药物在 7 2 h 内持续的释放出来。释放介质的p h 值对阿霉素的释放速率有显著的影响。在 酸性环境下( p h3 0 或5 6 ) ，2 4 h 内阿霉素从纳米粒中的释放量要比碱性环境下 有显著增加。 0 1 4 2 与蛋白的复合 受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究 两亲性聚合物分子的疏水微区，可以提供交联位点以非共价形式与蛋白结 合。如，r 一胰凝乳蛋白酶二聚物( c h y ) 可以自发的与c h p 自聚集体凝胶纳米粒 复合，复合物具有很好的胶体稳定性，而且纳米粒负载的c h y 的热稳定性显著提 高( n i s h i k a w a , 1 9 9 4 ) 。c h p 自聚集体的最大蛋白负载量依赖于蛋白加入量，结合 常数随着蛋白量的增加而增加。自聚集体的凝胶结构会影响大分子蛋白质与聚集 体复合常数，但c h p 结合的蛋白分子数目不会随着胆固醇簇取代度的改变而变化 ( n i s h i k a w a ,