（环境科学专业论文）葡萄糖氧化酶产生菌分离筛选及发酵条件优化研究.pdf

c l a s s i f i e di i l d e x ：q 8 9 u d c ： d i s s e r t a t i o nf o rt h em a s l e rd e g r e ei ne n g i n e e r n g s e p i a r a t i o na n ds c r e e n i n go f g l u c o s eo x i d a s ep r o d u c i n g s t r a i na n ds t u d yo nt h ee n z y m e p r o d u c i n gc o n g d i t o n g s o p t i m i z a r r i o n c a n d i d a t e ： s u p e n r i s o r ： a c a d e m i cd e g r e e a p p l i e d f o r ： s p e c i a l 蚵： d a t eo fo r a le x a m i n a t i o n ： u n i v e r s i 够： m a s t e ro fs c i e n c e e n v i r o i m l e n t a ls c i e n c e 硕士学位论文 葡萄糖氧化酶产生菌分离及发酵条件 优化研究 学位论文答辩日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 三蒸 青岛理工大理学硕士学位论文 目录 摘要。i a b s 仃a c t i i 第1 章绪论。1 1 1 前言。l 1 2 葡萄糖氧化酶的来源及应用2 1 2 1 葡萄糖氧化酶的来源2 1 2 2 葡萄糖氧化酶在食品工业中的应用2 1 2 3 葡萄糖氧化酶在饲料工业中的应用3 1 2 4 葡萄糖氧化酶在医药工业中的应用j 4 1 2 5 生产葡萄糖酸盐5 1 2 6 其他方面6 1 3 葡萄糖氧化酶的催化反应原理6 1 4 葡萄糖氧化酶的酶学性质7 1 5 葡萄糖氧化酶的酶活测定方法7 1 6 产酶菌株的筛选、育种及产酶优化的研究9 1 7 本课题研究的背景目的、意义及主要内容1 0 1 7 1 研究目的、意义1o 1 7 2 研究内容10 第2 章研究背景1 1 2 1 前言1 1 2 2 材料与方法1 1 2 2 1 土壤样品采集1 l 2 2 2 实验方法1 1 2 2 3 实验试剂l1 2 2 4 实验仪器1 2 2 2 5 酶活测定方法1 2 2 3 结果与分析1 2 2 3 1 真菌培养基筛选1 2 i 青岛理工大理学硕士学位论文 2 3 2 黑曲霉镜检图片13 2 3 3 真菌鉴定结果1 3 2 - 3 4 产酶活性筛选1 6 2 4 结j 硷l6 第3 章葡萄糖氧化酶产生茵培养基优化17 3 1 前言17 3 2 实验材料和方法17 3 2 1 实验菌种1 7 3 2 2 培养基选择17 3 2 3 实验仪器17 3 2 4 实验方法17 3 2 5 酶活测定方法：18 3 3 结果与分析- 1 8 3 3 1 培养基碳源筛选1 8 3 3 2 培养基碳源浓度筛选1 8 3 3 3 培养基最佳氮源筛选1 9 3 3 3 1 无机氮源1 9 3 3 3 2 有机氮源2 0 3 3 4 氮源浓度筛选2 0 3 3 4 1 无机氮源浓度2 0 3 3 4 2 有机氮源浓度2 1 3 3 5 磷酸二氢钾浓度2 2 3 3 6 碳酸钙浓度2 2 3 3 7 硫酸镁浓度2 3 3 3 8 氯化钾浓度2 4 3 4 培养基验证试验2 4 3 5 讨论2 4 3 5 1 碳源成分及浓度对产酶的影响2 4 3 5 2 氮源成分及浓度对产酶的影响2 5 3 5 3 其他营养元素浓度对产酶的影响2 5 n 青岛理工大理学硕士学位论文 3 6 结论2 6 第4 章葡萄糖氧化酶产生菌发酵条件优化2 7 4 1 前言2 7 4 2 材料与方法2 7 4 2 1 实验菌种。2 7 4 2 2 实验仪器：2 7 4 2 3 实验方法2 7 4 2 4 酶活测定方法2 7 4 3 结果与分析2 7 4 3 1 发酵时间2 7 4 3 2 培养基p h 值2 8 4 3 3 发酵温度。2 9 4 3 4 振荡器转速2 9 4 3 5 接种量3 0 4 3 6 种齿令31 4 4 讨论31 4 4 1 发酵时间对产酶的影响3 1 4 4 2 培养基p h 值对产酶的影响3 2 4 4 3 发酵温度对产酶的影响3 2 4 4 4 振荡器转速对产酶的影响3 2 4 4 5 接种量对产酶的影响3 2 4 4 6 菌龄对产酶的影响3 2 4 5 结论3 3 第5 章发酵罐发酵实验3 4 5 1 前言3 4 5 2 实验材料及方法3 4 5 2 1 实验菌种3 4 5 2 2 培养基选择3 4 5 2 3 实验仪器3 4 5 2 4 实验方法3 4 m 青岛理工大理学硕士学位论文 5 2 5 分析方法3 5 5 3 结果与分析3 5 5 3 1 发酵液残糖含量变化3 5 5 3 2 发酵液产酶活性变化3 5 5 4 讨论3 6 5 5 结论3 7 第6 章麸皮固态发酵实验3 8 6 1 前言3 8 6 2 实验材料及方法3 8 6 2 1 种液制备3 8 6 2 2 实验仪器- 3 8 6 2 3 实验方法3 8 6 3 结果与分析。3 9 6 2 1 固态发酵时间3 9 6 2 2 固态发酵温度3 9 6 2 3 液料比：4 0 6 3 结论j 4 0 第7 章结论和建议4 1 7 1 结j 沦4 1 7 2 建议4 1 参考文献4 2 攻读硕士学位期间发表的学术论文4 8 致谢4 9 青岛理工大理学硕士学位论文 摘要 葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d 鹊e ，e c 1 1 3 4 ，简称g o d ) 能够在有氧条件下催 化葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用，广泛 应用于食品、饲料、医药等行业。葡萄糖氧化酶分布于动物、植物和微生物体内， 但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要 来源。目前，工业生产上主要利用黑曲霉或青霉发酵生产葡萄糖氧化酶。 本研究从土壤中分离纯化得到一株葡萄糖氧化酶产生菌，经b i o l o g 微生物鉴 定系统鉴定为黑曲霉( 爿印e 删- - c ，s 刀驯，研究了培养基组成和理化因子对产生 葡萄糖氧化酶酶活力的影响，确定了最佳发酵条件。通过研究得到如下结论： ( 1 ) 培养基中主要营养物最佳成分分别为葡萄糖、蛋白胨、硝酸钠。 ( 2 ) 培养基中各营养物最佳浓度分别为葡萄糖1 0 0 酣，蛋白胨4 酊，硝酸钠 3 胡，磷酸氢二钾2 妒，硫酸镁0 7 朗，碳酸钙3 5 鲫，氯化钾0 5g l 。使用优化 后的培养基产酶活性为1 1 7 岬o l m m ，较未优化前( 0 7 9 岬0 1 m i n ) 有明显提高。 ( 3 ) 黑曲霉菌摇床发酵产葡萄糖氧化酶的最佳时间为7 2 h 、培养基p h 为6 、 培养温度为2 8 、振荡器转速为2 0 0 转分、接种量为l o 、菌龄为3 6 h 。 ( 4 ) 黑曲霉发酵罐发酵试验的最佳条件为温度2 8 、搅拌器转速为2 0 0 转 分、p h 为6 、发酵时间4 8 h 。 ( 5 ) 麸皮固态发酵发酵黑曲霉产葡萄糖氧化酶的最适条件为：温度3 0 、周 期7 2 h 、液料比为1 5 。 关键词：葡萄糖氧化酶；黑曲霉；培养基：发酵条件；优化 a bs t r a c t g l u c 0 s eo x i d 勰ec 趾c a t a l y z e 西u c o s et op r o d u c ea n d 酉u c o n a t eh y d r o g e np e r 0 ) 【i d e 训也o x y g e nc o n d i t i o n s g l u c o s eo x i d a s ei sw i d e l yd i s t r i b u t e di n 锄i n l a l s ，p l a n t sa i l d m i c r o o 唱a i l i s m s b e c a u s e o fm i c r o o 唱孤i s m sg r o w t l la n dr 印r o d u c t i o nf - a s t ，s o 也e y b e c o m em em a i ns o u r c eo f 西u c o s eo x i d a s ep r o d u c e g l u c 0 s eo x i d a s ei s 、) l ，i d e l yu s e di n f o o d f c c d 锄dp h 锄a c e i l t i c a li n d u s t r i e s ，嬲m e yc 锄r e m o v e 酉u c o s e ，o x y g e n 趾d s t 舐1 i z a t i o ne 虢c t n o w ，a s p e 呼l l u sa n dp e n i c i l l 讪mi su s e dt of e m e i l t a t i o no f 舀u c o s e o ) d d 鹤ei nt h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o n 1 1 1 er e s e a 暂c hi s o l a t e 觚d 邮f i yag l u c o s eo x i d a s ep r o d u c i n gs 仃咖缸i m 也es o i l ni si d c n t i f i e dt 0b ea s p 嘲画1 1 u sn i g e rb yt h eb i 0 1 0 9m i c r o b e si d e n t i f i c a t i o ns y s t 锄ni s s t u d i 。dm a tt 1 1 ee 日b c to fm e d i u mc 0 i n p o s i t i o np 崎s i c a la n dc _ h e m i 曲哆f 撕o n t og o d p r o d u c ： t i o n 肖m dm a ：k es l l l i e 也eb e s tf 毫r i n 铋tc 0 n d i t i o n t h ec o n c l u s i o n so ft h er e s e a r c hw e r es h o w na sf i o l l o w s ： ( 1 ) t h eb e s tc o m p o s i t i o no f 也em i a n 姗t r i e n ti nm e d i 啪雒e 百u c o s e ，p 印t o n ea n d ( 2 ) t h eb e s tc o n c 仃a t i o no fm em e d i u ma r e 百u c o s e1o o g l ，p e p t o n e4 9 l ，s o d i u m n i t r a t e3 9 l ，p o t a s s i u mh y d r o g e np h o s p h a t e2 9 1 ，m a g n e s i u ms u l f i a t eo 7 9 l ，c a l c i 啪 3 5 9 l ，p o t a s s i 眦c h l o r i d e0 5 9 1 g o dp r o d u “o n 枷v i t yw i mt 1 1 e m 础u m 硪e r o p 缸i z a t i o n i s1 17 i | m 0 1 m i n ，c o m p 砌 w i t h n o p r e o p t i m i z e d m e d i u m ( 0 7 9 m o l m i n ) h a u so b v i o u s l yi n c r e a s e d ( 3 ) t h eo p t i n l a l t i m eo fa s p e r 舀l l u sn i g e rr o t a t ef 缸n e n t a t i o np r o d u c e 酉u c o s e o x i d a s ei s7 2 h ，m e d i 啪p hi s6 ，也e 伽1 t u r et e m p e r a t u r ei s2 8 ，r o t a t i o ns p e e di s 2 0 0 r m i n ，i n o c u l u mi s1o ，s t r a i na g ei s3 6 h ( 4 ) t h eo p t i l n a lc o n d i t i o no fa s p e r 百1 l u sz l i g e r 硒e n t - p o tf e r m 即谢o np r o d u c c 西u c o s eo x i d 鹤e a r e2 8 ，m i xs p e e d2 0 0 r m i n ，m c d i 啪p h6 ，触1 e n tt i m e4 8h o u r s ( 5 ) t h eo p t i i n a lc o n d i t i o no fa s p e r 西l l u sn i g e r0 1 i ds t a t e 钕m e n t a t i o nw i t hb r a n a r e3 0 ，胁l e i l tt i m e7 2h o u r s ，c o m p e t eo f l i q u i da i l df e e d1 5 青岛理工大理学硕士学位论文 k e yw o r d ：g o d ；彳印e 啊盯凇万瓣，；m e d j l l m ；硒e n 伽o nc o n d i t i o n s ；o p t i m i z 撕o n i i i 青岛理工大理学硕士学位论文 1 1 前言 第1 章绪论 自1 9 世纪末德国生物学家毕希纳( e d w a r db u c h n c r ) 证明酵母无细胞提取液能 使糖发酵产生酒精，第一次提出酶的名称以来，人类已经发现并鉴定出3 0 0 0 多酶【l 】。 酶作为一种催化剂，已被广泛地应用于工业生产及人民生活的各个生产领域。近 几十年来，随着酶工程的迅猛发展，酶在生物工程、生物传感器、环保、医药、 食品等方面的应用也日益扩大，可以说酶已成为国民经济中不可缺少的一部分， 现实生活中，人们的衣、食、住、行及其他方面的新技术几乎都离不开酶【2 1 。 葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s e ，e c 1 1 3 4 ，简称g o d ) 能够在有氧气的条件 下专性催化葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，反应式如下： 0 2 + c6 h1 20 6 + h2 0 c 6h 1 2 07 + h 2 0 2 早在1 9 0 4 年人们就发现了葡萄糖氧化酶，但由于当时对其商业价值认识不足， 没有引起人们的足够注视。直到1 9 2 8 年，m u l l e r 首先从黑曲霉的无细胞提取液中发 现葡萄糖氧化酶，并研究了催化机理才正式命名为葡萄糖氧化酶，将其归入脱氢 酶类【3 卅。葡萄糖氧化酶广泛地分布于动物、植物和微生物体内，但由于微生物具 有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源。葡萄糖氧 化酶广泛应用于食品、饲料、医药等行业中，起到了去除葡萄糖、脱氧、杀菌等 作用。我国从2 0 世纪7 0 年代开始成立了葡萄糖氧化酶研究协作组，对其展开了系 统研究工作。 发酵工业上一般采用黑曲霉和青霉属菌株作为葡萄糖氧化酶的生产菌。我国 生产采用点青霉及黄色青霉，美国亦采用此类菌种，尼崎青霉系日本生产常用菌 种，生机青霉系俄罗斯生产使用菌株，其它菌株也曾被许多研究者试验过。近年 来有报道胶霉属( g 厅d c 勉d 缸肌) 、拟青霉属( 砌p c f z d 叼，化，) 和帚霉属( & 印“肠肮邵括) 霉 菌也能产生葡萄糖氧化酶。 青岛理工大理学硕士学位论文 1 2 葡萄糖氧化酶的来源及应用 1 2 1 葡萄糖氧化酶的来源 葡萄糖氧化酶在生物界分布广泛，但其工业化生产是主要是利用微生物发酵 法，即通过微生物的高效生物分解及合成能力，在对营养物的消耗同时产生所需 酶类。大部分微生物都可以生产葡萄糖氧化酶，其中可以生产葡萄糖氧化酶的微 生物主要有细菌和霉菌。目前，工业生产上主要应用黑曲霉及青霉发酵生产葡萄 糖氧化酶。 1 2 2 葡萄糖氧化酶在食品工业中的应用 葡萄糖氧化酶在食品领域具有广泛的应用价值，葡萄糖氧化酶可以专性催化 消耗葡萄糖并吸收空气中氧气的同时产生过氧化氢及葡萄糖酸，可以用来提高食 品的保质和保鲜期【5 】，生成的过氧化氢还可以改良面粉，使其产生更具弹性的面筋。 一 ( 1 ) 面粉改良剂 葡萄糖氧化酶是一种新型的面粉品质改良剂，属强筋剂类。传统的小麦粉强 筋剂主要是一些化学物质，包括溴酸钾、偶氮苯甲酞、过氧化钙、维生素c 等， 其中以溴酸钾的应用最为普遍。自从w h o 通报全世界溴酸钾是动物组织致癌毒物 后，许多国家己经相继禁止使用漠酸钾作为小麦粉改良剂。目前，利用葡萄糖氧 化酶制剂替代澳酸钾引起了广泛关注，我国在这方面的研究己取得了一些初步的 研究成果。用g o d 作面粉改良剂的作用机理是，该酶能将葡萄糖氧化成葡萄糖酸、 水及氧，面筋蛋白中的s h 经生成的氧氧化后，形成s s ，从而有助于面筋蛋白 之间形成较好的蛋白质网络空间结构，生成更强更具弹性的面团，从而对增加面 团的流动性，改善面粉的粉质等方面有十分显著的作用，有研究表明，g o d 若与 淀粉酶、脂肪酶、木聚糖酶及维生素c 协同使用效果更好【伽。 ( 2 ) 葡萄糖酒、啤酒保鲜 在红葡萄酒中通过添加葡萄糖氧化酶可以将葡萄酒中的葡萄糖氧化成葡萄糖 酸内酯，在消耗氧气的同时产生过氧化氢，过氧化氢本身就是一种杀菌剂，同时 由于此反应消除了残留的氧气，这样就在一定程度上抑制了细菌的生长，降低了 杂菌的污染，提高了葡萄酒的货架期，保持了葡萄酒的色泽和风味的稳定性。葡 萄糖氧化酶在啤酒中的应用原理与葡萄酒中相似，它的主要作用也是去除啤酒中 2 青岛理工大理学硕士学位论文 的溶解氧，氧气的存在一方面会导致啤酒的色泽加深、使啤酒易氧化变质，同时 氧气的存在又为微生物的生长提供了便利条件，降低保存期，通过添加无毒副作 用的葡萄糖氧化酶可以消耗啤酒中的溶解氧，明显降低啤酒的老化，延长其保质 期，更由于葡萄糖氧化酶的高度专一性，不会与啤酒中的其他物质产生反应，影 响啤酒的品质【8 】。 ( 3 ) 葡萄糖的定量分析 葡萄糖氧化酶能专一的氧化葡萄糖，故可用于测定各种食品和混合物中的葡 萄糖含量。在白酒和啤酒的生产过程中，发酵期内还原糖浓度的变化是指示发酵 进程的重要参数，因此准确快速测定还原糖浓度具有实际意义，但食品中还原糖 测定的常规方法都是常量法，不适于微量糖的测定，并且测定方法繁琐，操作比 较困难，不利于快速分析，用葡萄糖氧化酶偶联反应测定葡萄糖含量可解决上述 问题。目前利用固定化技术制成的葡萄糖氧化酶分析仪已广泛地用于发酵行业中 发酵液残糖量的测定，此外，根据葡萄糖氧化酶法分析原理制成的葡萄糖测定试 剂盒可定量地测定果汁、饮料及牛奶等各种食品中葡萄糖的含量【9 】。 ( 4 ) 脱氧杀菌 葡萄糖氧化酶是一种高效生物去氧剂，可快速去除食品中的氧气，防止产品 氧化变色，抑制微生物的生长，延长食品贮藏期。生产中可将葡萄糖和葡萄糖氧 化酶与过氧化氢酶封入具有高氧气穿透能力和低水分穿透速度的塑料袋中，并且 使袋中含有足够水分，再将这一塑料袋装入装有食品的容器中。这样，葡萄糖氧 化酶便可利用葡萄糖的氧化来消耗食品中的氧气，其特点是除氧速度快、热稳定 性好，使用过程中无须添置任何设备或改变生产工艺，而且添加量小、添加方法 简单、使用后去氧效果明显，而且不会出现混浊沉淀现象，可保持食品、饮料原 有的色、香、味。g o d 能去除氧，防止好氧菌的生长繁殖，同时由于产生过氧化 氢，可同时起到杀菌作用【1 们。 1 2 3 葡萄糖氧化酶在饲料工业中的应用 我国的饲料添加剂研究起步于2 0 世纪8 0 年代初，经过2 0 多年的发展，饲料 添加剂已从注重畜产品、水产品的数量转变到品质上来。在现代配合饲料中，常 使用多种维生素、鱼粉和油脂类，以获得蛋白质、维生素和无机盐等营养成分的 平衡。然而，其中的一些成分如脂肪、维生素a 、胡萝卜素等易氧化变质，甚至 3 青岛理工大理学硕士学位论文 产生过氧化物等有害物质，危害畜禽健康。另外，大规模集约化饲养，大量的药 物及其他添加剂的使用造成畜禽应激伤害及疾病的易感性。因此如果在饲料中添 加一些安全性高、效果好的抗氧化剂，便可以有效地避免上述不利影响、减少饲 料营养物质损失和氧化损伤。生产实践中，常用的两种抗氧化剂为维生素e 和硒 制品，其中维生素e 和有机硒价格较高，且无机硒一亚硒酸钠是一种剧毒品，吸 收率较低，能够与其他微量元素互相影响。 葡萄糖氧化酶在氧分子存在下能氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。因此， 葡萄糖氧化酶用作饲料添加剂的作用包括：( 1 ) 消除肠道病原菌生存环境，保持禽 畜肠道菌群生态平衡；( 2 ) 改善禽畜肠道酸性消化环境；( 3 ) 保护肠道上皮完整；( 4 ) 解除肠道霉菌毒素中毒。 将葡萄糖氧化酶加入青贮饲料中，因其消耗了氧而利于厌氧性乳酸菌的增殖， 加快了乳酸菌的发酵过程，可迅速产生大量乳酸，使青贮饲料中的p h 值很快下降， 抑制了有害细菌的繁殖，避免了异常发酵，最终保证青贮饲料的质量，有利于禽 畜的育肥。 葡萄糖氧化酶具有抑菌、促生长作用且无毒、无抗药性，作为一种替代抗生 素的新型添加剂，在饲料工业中具有广阔的应用前景。 1 2 4 葡萄糖氧化酶在医药工业中的应用 ( 1 ) 血糖含量的测定 由于葡萄糖氧化酶作用的高度专一性，它被用于一些复杂生化体系中葡萄糖 的定量测定，如用于血搪的测定，以及尿搪、尿酮体的检查等，可制成糖尿试纸 或试剂盒用于临床诊断。血糖试剂盒用于定量测定血清中血糖的含量，适用于各 种型号的半自动生化分析仪和各种开放性通道的全自动生化分析仪，此试剂盒取 血方便、操作简单、省时省力。 近年来，科学家一直致力于研制一种可以连续对血糖进行监控的设备，主要 是针对i 型糖尿病患者或胰岛素依赖型糖尿病患者。目前主要通过一种葡萄糖荧光 传感器，即流酶电极。这一技术的原理是葡萄糖氧化酶被固定在植入皮下的电线 的一端，一些荧光分子和葡萄糖分子中的特定部分联结起来，当葡萄糖被联在一 起时，荧光的程度也随之改变，这时就可以把探针植入皮下进行测试。这项技术 十分灵敏，通常不受干扰因素的制约，能够准确测定血糖含量。 4 青岛理工大理学硕士学位论文 ( 2 ) 尿糖试纸 在医学上尿糖试纸可以用来测定糖尿病人尿中葡萄糖含量。其原理是根据 g o d 酶促反应中产生的过氧化氢被过氧化氢酶或过氧化物酶进一步催化分解可以 产生水和原子氧，原子氧将试纸上的还原型无色邻联甲苯胺染料氧化成蓝色物质， 而蓝色物质的生成量与葡萄糖浓度成比例，因此可以将试纸颜色的深浅与标准色 板比较，从而判断尿中葡萄糖的含量多少。葡萄糖氧化酶氧速率法测定葡萄糖的 线性范围广、准确度高、重复性良好、反应特异强、抗干扰强，可以用于尿糖的 测定。 ( 3 ) 口腔疾病的防治 葡萄糖氧化酶作用于葡萄糖底物，形成6 葡萄糖酸内酯，进而生成葡萄糖酸， 使得寄生在口腔中的一些病原菌不能生存；此外，葡萄糖氧化酶还能去除氧，防 止好氧菌的生长繁殖，因此可在牙膏中添加葡萄糖氧化酶，制成生物酶牙膏，以 防止口腔疾病和牙病的发生。 ( 4 ) 生物传感器 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的高度专一性可以用来生产生物传感器。早期的葡 萄糖传感器都是利用酶在生化反应中特殊的催化作用。反应过程中消耗或产生的 化学物质即可用转换器转变为电信号记录下来。目前，国际上已经研制成功的酶 传感器有几十种。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 首次将葡萄糖氧化酶膜覆盖在铂电极 上制成酶传感器，用于定量检测血清中葡萄糖的含量，成功地制成了第一支葡萄 糖生物传感器。 葡萄糖氧化酶生物传感器，可用于发酵过程中葡萄糖浓度的在线检测，以及 控制食品加工生产过程和检验葡萄糖含量。 根据葡萄氧化酶在反应中消耗氧的量，应用一种蛋壳膜传感器，监测植物种 子中氧的消耗，此种方法不受种子中干扰物的影响，测定准确。 近年来，采用二价汞离子作为葡萄糖氧化酶的一种抑制剂，在p h 值较低的酸 性环境中，能与酶活性中心的某些位点结合从而抑制酶的活性的原理，研制成的 一种酶生物传感器，可用于土壤浸出液中汞离子回收率的测定1 1 1 6 1 。 1 2 5 生产葡萄糖酸盐 葡萄糖是人类维持正常生活、生理功能最主要、最基本的营养钧质之一。而 5 青岛理工大理学硕士学位论文 无机金属离子，如钠、钾、钙和镁等离子，在体内既维持体液酸碱平衡，又对生 长，发育有重要影响，近年来研究结果还表明，体内微量金属离子，如铁、锌、 铜、锰等离子对机体处于健康状态有十分重要作用。以往，人们一般都直接服用 葡萄糖以补充能量，同时，要分别摄人硫酸锌、硫酸亚铁、碳酸镁、钙片等药物 以治疗各类疾病，这样的无机物，不易于消化吸收，同时，某些无机酸阴离子在 体内还会产生副作用。因此，将葡萄糖酸与某些无机金属离子结合制成葡萄糖酸 盐，供人们治病、保健之用，是一项重要的改进措施。 葡萄糖氧化酶可以催化葡萄糖产生葡萄糖酸，进一步与金属离子反应生产葡 萄糖酸钾、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸钙等葡萄糖酸盐，所以葡萄糖氧化酶在葡萄糖 酸盐等保健品的生产上具有广泛的应用前景。 1 2 6 其他方面 近年来随着研究的深入，葡萄糖氧化酶在化工、金属器械的防腐、纺织工业、 制药及污水处理等方面也有广泛的应用【1 刀。 1 3 葡萄糖氧化酶的催化反应原理 葡萄糖氧化酶能利用分子氧或原子氧进行葡萄糖的氧化，消耗溶解氧，降低 氧的氧化作用，从而保护食品中易氧化成分不被氧化。葡萄糖氧化酶的催化反应 按反应条件有3 种形式： ( 1 ) 没有过氧化氢酶存在时，每氧化1 克分子葡萄糖消耗1 克分予氧 c 6 h 1 2 0 6 + 0 2 _ c 6 h 1 2 0 7 卜h 2 0 2 b d 葡萄糖+ 0 2 6 d 葡萄糖内酯+ h 2 0 2 ( 2 ) 有氧化氢存在时，每氧化1 克分子葡萄糖消耗l 克原子氧 c 6 h 1 2 0 6 + 1 2 0 2 c 6 h 1 2 0 7 + h 2 0 2 ( 3 ) 有乙醇及过氧化氢酶存在下，过氧化氢也可用于乙醇的氧化，每氧化1 克 分子葡萄糖消耗1 克分子氧 c 6 h 1 2 0 6 + 0 2 + c 2 h 5 0 h c 6 h 1 2 0 7 + h 2 0 2 + c h 3 c h o 此外，g o d 催化b d 葡萄糖的速度要比催化a d 葡萄糖的速度快1 5 0 倍。 6 青岛理工大理学硕士学位论文 1 4 葡萄糖氧化酶的酶学性质 高纯度的葡萄糖氧化酶为淡黄色晶体、易溶于水，可溶于水制成液体制剂。 完全不溶于乙醚、甘油等有机溶剂。一般酶制剂中除葡萄糖氧化酶外还有过氧化 氢酶，以及菌类及其载体，共同构成复合酶1 8 。9 1 。 葡萄糖氧化酶的分子量一般在1 5 万道尔顿左右，其p h 值作用范围在3 5 6 5 ， 最适p h 值在6 0 左右，在没有保护剂存在的条件下p h 值 8 o 或p h 值 硝酸铵 亚硝酸钠 硫酸铵 氯化铵；在选定的四种 有机碳源中：蛋白胨 牛肉膏 酵母膏 尿素。这主要是因为硝酸盐是微生物最容易 利用的无极氮，硝酸铵中的铵根离子对微生物的生长有抑制作用；蛋白胨可以直 接为微生物提供合成蛋白质所需的氮源。刘峰等人通过研究了葡萄糖氧化酶产生 菌发酵工艺。实验结果表明选择硝酸钠作为无机氮源的产酶效果最好，与本研究 结果相同；选择牛肉膏作为有机氮源时的产酶效果略高于蛋白胨，与本研究不尽 相刚6 0 1 。 氮源浓度对产酶的影响变化趋势同碳源类似，都是开始随浓度升高而增大， 至最高点后逐渐下降，这是因为黑曲霉生长的代谢物在发酵液中的积累达到或超 过一定限度，开始对微生物的生长产生抑制作用。 3 5 3 其他营养元素浓度对产酶的影响 其他无机元素作为微生物生长必须的营养元素，对产酶也有一定影响，但没 青岛理工大理学硕士学位论文 有碳源氮源明显。本研究表明碳酸钙的最佳浓度为3 5g l ，磷酸氢二钾为2 9 1 ，硫 酸镁为0 7g l ，氯化钾为0 5g l 。杨惠英等人在研究黑曲霉发酵过程中发现，随碳 酸钙浓度增大，葡萄糖氧化酶的活力增加。当碳酸钙浓度高于3 5g l 时，菌体受 到抑制，采用碳酸钙浓度为3 5g l 进行发酵较合适【6 1 娥】。这与本研究结果相同， 对于其他无机成分浓度对葡萄糖氧化酶活力的影响则未见报道。 3 6 结论 ( 1 ) 培养基中主要营养物最佳成分分别为葡萄糖、蛋白胨、硝酸钠。 ( 2 ) 培养基中各营养物最佳浓度分别为葡萄糖1 0 0 酊，蛋白胨4g l ，硝酸钠 3g l ，磷酸氢二钾2 9 1 ，硫酸镁o 7g l ，碳酸钙3 5g 1 ，氯化钾0 5g l 。 ( 3 ) 使用优化后的培养基产酶活性达到1 1 7 岬o l m i n ，较未优化前 ( o 7 9 岬0 1 m i n ) 有明显提高。 2 6 青岛理工大理学硕士学位论文 第4 章葡萄糖氧化酶产生菌发酵条件优化 4 1 前言 环境条件对微生物发酵反应有很大的影响，影响微生物发酵的条件主要有温 度、时间、d o 、p h 、菌种的接种量及菌龄等。本研究通过实验确定葡萄糖氧化酶 产生菌的最佳发酵条件，包括时间、p h 、温度、振荡器转速、接种量及菌龄等。 4 2 材料与方法 4 2 1 实验菌种 ， 从土壤中分离筛选出的高活性黑曲霉菌经扩大培养后的种液。 4 2 2 实验仪器 ， 恒温生化培养箱、超净工作台、恒温水浴振荡器、多点磁力搅拌器 4 2 3 实验方法 设定不同的的发酵条件，包括发酵时间、p h 值、温度、振荡器转速、接种量、 种龄，研究发酵条件对产酶活性的影响，确定最佳发酵条件。 4 2 4 酶活测定方法 采用u n d e r b o f l c r 滴定法 4 3 结果与分析 4 3 1 发酵时间 对菌株接入培养基在振荡器中以2 8 进行发酵培养三天，每隔2 4 h 测定产酶 活性，实验结果如下图4 1 。 青岛理工大理学硕士学位论文 2 4 h4 8 h7 2 h9 6 h1 z o h 图4 1 发酵时间对产酶的影响 f i g4 - 1t h ee 妇to f 融m a t i o nt i m eo ng o dp r o d u c t i o n 由图可知产酶活性随发酵时间增加而增大，增大到一定峰值后逐渐减小。发 酵7 2 h 酶活达到最高值1 0 2 岫1 0 l m i n ，此后活性逐渐下降，因此可以确定最佳发酵 时间为7 2 h 。 4 3 2 培养基p h 值 一 滴加0 1 m o l 1 n a o h 溶液及o 1 m o l 1 h c l 溶液调节培养基p h 值为4 、5 、6 、 7 、8 ，接种菌液在振荡器中以2 8 、2 0 0 转分进行发酵培养三天后测定发酵液产 酶活性，研究p h 值对产酶的影响，结果见下图4 2 。 45678 图4 2 培养基初始p h 值对产酶的影响 f i g 4 2t h ee 丘to fi i l i t i a lm e d i u mp h0 ng o dp r o d u c t i o n 从图中可以看出当初始p h 值从4 增加到6 时，产酶活性逐渐增加，p h 值6 2 8 2 l 8 6 4 2 o 1 o 0 0 o ，u!iii一0u昌挈5溢 2 1 8 6 4 2 o l m m n n ：u!骞lo莹一蜉蹴 青岛理工大理学硕士学位论文 时葡萄糖氧化酶活性达到峰值1 0 3 u m o i n ，其后随p h 值增加产酶活性逐渐降低， 因此培养基最佳p h 为6 。 4 3 3 发酵温度 分别调节恒温水浴振荡器温度为2 4 、2 6 、2 8 、3 0 ，接种菌液在振荡器中 以2 0 0 转分进行发酵培养三天后测定产酶活性，研究温度对产酶活性的影响， 其结果如下图4 3 。 7 a 、 姜 量 西 避 1 1 5 1 1 0 9 o 8 5 2 4 2 6 2 8 3 0 图4 3 发酵温度对产酶的影响 f i 9 4 3 t h ee 髓c t o f f 锄a t i o n t 锄p 咖0 n g o d m c t i o n 从图中可以看出从2 4 2 8 随温度的增加产酶活性逐渐增大，至2 8 时达 到峰值1 0 9 岬o l m i n ，温度增加到3 0 产酶活性下降，因此可以确定最佳发酵 温度为2 8 。 4 3 4 振荡器转速 分别调节振荡器转速为1 2 0 、1 5 0 、1 8 0 、2 0 0 、2 5 0 转分，温度为2 8 接种发 酵液进行发酵，三天后测定发酵液活性，研究转速对产酶活性的影响，实验结果 见下图4 4 。 2 9 青岛理工大理学硕士学位论文 口 墨 弓 呈 蜒 龌 1 2 1 o 2 0 图“振荡器转速对产酶的影响 。 f i 9 4 - 4 me 胝t o f s h 翻n g t a b l e f o t a t e s p e e d o n g o d p d u c t i o n 一一 从图中可以看出振荡器转速从1 4 0 增加到2 0 0 转分，产酶活性逐渐增加，到 2 0 0 转分时达到峰值1 0 8 岬1 0 1 m i n ，然后转速增加产酶活性减小，因此振荡器最 佳转速为2 0 0 转分。 4 3 5 接种量 在培养基中分别以5 、1 0 、1 5 、2 0 的接种量接种种液- ，在振荡器中 以2 8 、2 0 0 转分进行发酵培养三天后研究接种量对产酶的影响。实验结果见 图4 5 。 1 2 1 7 口0 8 g o 墅6 蜒 4 o 2 o 5 1 0 1 5 2 0 图4 5 接种量对产酶的影响 f i g4 - 5t 1 l ee 觚to fi n o c u l 砌v o d 啪e 伽g o dp f o d u c 廿蛐 从图4 5 可看到，以5 接种组的产酶活性最低，仅为0 6 7 岬o l m i n ，1 0 3 0 青岛理工大理学硕士学位论文 的接种组的酶活最高，为1 0 3 岬o i n ，1 5 、2 0 接种组的活性分别为0 9 1 和0 8 7 胂o i n 。因此接种量为1 0 时所得发酵液产酶最多。 4 3 6 种龄 菌龄即菌种的年龄，选择适当的接种菌龄十分重要，太年轻或过老的菌种 对发酵不利。分别接种菌龄为1 2 、2 4 、3 6 、4 8 、6 0 、7 2 h 的种液发酵，在振荡 器中以2 8 、2 0 0 转分进行发酵培养三天后，研究菌龄对产酶的影响，实验结 果见下图4 6 。 ：口 墨 量 避 1 2 1 o 2 o 缈_ 疆 翻 蠡爰 霸 爹! “翊 妒。 蘧 冀；嘲 扣“舞 l 鍪；叠 篓 l ，l 冬。嗣 一e、8 秽_ 融。驽 擎j l 翻 溺 ，；” 、 # 一tr “ i 墨 江0 势 嘲 巍奄 黧蓉嗣e ，：。，绷芄浅锎 1 22 43 64 86 07 2 图4 6 菌龄对产酶的影响 f i 9 4 - 6 n e