（环境科学专业论文）萘对斑马鱼danio+rerio胚胎发育毒性效应的研究.pdf

j z ， 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究 工作所取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人 承担。 学位论文作者签名：尘堑丛日期： 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东：l l _ ! j f f i 范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其它复制手段保存、汇编本学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：垒雪拯 日 期：型芝：区乒 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：名粒 e l 期：鎏盘笸：髯 电话： 邮编： t j 工产j z j 摘要 由于长期的燃料燃烧、石油泄漏等人为释放，多环芳烃化合物( p o l y c y c l i ca r o m a t i c h y d r o c a r b o n s ，简称p a h s ) 己经对自然环境和人类健康构成了严重威胁。萘( n a p h t h a l e n e ， n a p ) 是结构最简单、挥发性最强的p a h s ，具有光毒效应，其毒性研究已经成为一个备 受关注的全球性课题。 本研究以斑马鱼( d a n i or e r i o ) 胚胎和仔鱼为试验体，应用胚胎发育技术探讨p a l - i s 的代表萘对斑马鱼胚胎的发育毒性。在萘急性毒性试验基础上，通过亚致死毒性、 致畸性和组织病理学等指标评价了萘的水生毒性。胚胎急性毒性实验结果表明，萘2 4 h 、 4 8 h 半数致死浓度( m e d i a nl e t h a lc o n c e n t r a t i o n ，l c 5 0 ) 分别为1 0 0 4m g l 、8 9 6m g l 。 萘导致斑马鱼胚胎发育中出现多种致死及亚致死反应，包括胚胎自溶、发育停滞、 发育异常和2 0 s 内无自主活动、心律显著减少、黑色素细胞不发育、孵化延迟、7 2 h 畸 形等，其中最敏感指标是7 2 h 畸形，半数效应浓度值e c 5 0 为1 0 6 4m g l 。致畸症状包括 卵黄囊肿( y o me d e m a , y e ) 、心包水肿( p e r i c a r d i a le d e m a , p e ) ( 出现心脏线状畸变) 以及 脊柱弯曲( s p i n a lf l e c t i o n ，s f ) 。 在胚胎毒性实验的基础上，使用组织切片技术，考察萘在组织器官水平上的毒性， 暴露3 d 的斑马鱼仔鱼主要在卵黄囊、心包、脊柱三种器官上出现畸形。 关键词：萘：斑马鱼胚胎：发育毒性：组织毒性 a b s t r a c t a st h el o n g t e r mf u e lc o m b u s t i o n , o i ls p i l l sa n do t h e ra n t h r o p o g e n i ce m i s s i o n s ，p a h s ( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，r e f e r r e d 勰p a n s ) h a v ep o s e das e r i o u st h r e a tt ot h e n a t u r a le n v i r o n m e n ta n dh u m a nh e a l t h n a p h t h a l e n e ( n a p ) ，p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ， d i s t r i b u t ew i d e l y ，w h i c hh a sp h o t o t o x i ce f f e c t s t h er e s e a r c ho ni t st o x i c i t yh a sb e c o m ea l l i s s u eo fg l o b a lc o n c e r n i nt h i sp a p e r ，z e b r a f i s h ( d a n i or e r i o ) e m b r y o sa n dl a r v a ew e r es e l e c t e d 嬲t h et e s tb o d i e s w eu s e dt h et e c h n i c a lo fe m b r y o n i cd e v e l o p m e n tt o s t u d yt h et o x i c i t yo fn a p h t h a l e n eo n z e b r a f i s he m b r y o n i cd e v e l o p m e n t o nt h eb a s eo fa c u t et o x i c i t yt e s to nn a p h t h a l e n e ，w e v e a s s e s s e dt h ea q u a t i ct o x i c i t yo fn a p h t h a l e n eb ys u b - l e t h a lt o x i c i t ya n dt e r a t o g e n i c i t y t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h em e d i a nl e t h a ln a p h t h a l e n ec o n c e n t r a t i o n ( l c s o ) i ne m b r y o n i ca c u t e t o x i c i t yt e s t si n2 4 h , 4 8 hw e r e10 0 4m g l ，8 9 6m g l n a p h t h a l e n el e dt o t h ep r o b l e mo fl e t h a la n ds u b l e t h a le f f e c t si nz e b r a f i s he m b r y o s d e v e l o p m e n t , i n c l u d i n g f i e t a l a u t o l y s i s ，s t a g n a n tg r o w t h , d e v e l o p m e n t a la b n o r m a l i t i e s ， n o n - a u t o n o m o u sa c t i v i t yw i t h i n2 0 s ，t h es i g n i f i c a n tr e d u c t i o no fh e a r tr a t e ，m e l a n o m ac e l l a p l a s i a , d e l a y e dh a t c h i n g ，7 2 hm a l f o r m a t i o n s t h em o s ts e n s i t i v ei n d i c a t o rw a sd e f o r m i t y w i t h i n7 2 h , t h ee c s ov a l u ew a s10 6 4m g l s y m p t o m si n c l u d e dy o l ke d e m a ，p e r i c a r d i a l e d e m a ( 1 i n e a rd i s t o r t i o no fh e a r t ) ，a n dt h es p i n a lf l e c t i o n o nt h eb a s eo ft h ee m b r y ot o x i c i t yt e s t , w e v eu s e dt h eb i o p s yt e c h n i q u et os t u d y n a p h t h a l e n et o x i c i t yo nt h el e v e lo ft i s s u ea n do r g a n w h e nz e b r a f i s hl a r v a ew e r ee x p o s e do n n a p h t h a l e n ef o r3 d ，t h es y m p t o m sw e r em a i n l yi nt h ey o l ks a c ，p e r i c a r d i u m ，a n ds p i n a l d e f o r m i t yo nt h et h r e eo r g a n s k e yw o r d s ：n a p h t h a l e n e , z e b r a f i s h ( d a n i or e r i o ) e m b r y o s ，d e v e l o p m e n t a lt o x i c i t y , o r g a n i z a t i o nt o x i c i t y n 二 q 目录 摘 要。i a b s t r a c t i i 目 录i i l 第1 章前言。l 1 1 多环芳烃概述1 1 2萘的概述2 1 3萘污染现状。2 1 4 p a h s 胁迫下鱼类生理生化响应3 1 5 斑马鱼与毒理学研究5 1 6 斑马鱼胚胎发育方法与毒理学研究。5 1 7石蜡切片技术。8 1 8 研究目的与意义8 1 8 1 研究目的与内容8 1 8 2 研究意义9 1 8 3 技术路线9 第2 章实验材料与方法1 0 2 1实验试剂与仪器1 0 2 1 1主要试剂l o 2 1 2主要仪器1 0 2 2实验方法1 1 2 2 1 萘助溶剂的选择1 l 2 2 2 实验动物驯养1 1 2 2 3 受精卵的收集1 l 2 2 4 斑马鱼胚胎急性毒性实验1 1 2 3萘暴露实验1 2 2 4石蜡切片的制备1 2 2 5 组织显微观察1 3 2 6萘挥发的测定l3 2 7数据统计和分析方法1 3 第3 章结果与分析1 4 i i i 3 1萘对斑马鱼胚胎的急性毒性1 4 3 2萘挥发分析14 3 3萘的梯度暴露试验1 5 3 4 斑马鱼胚胎发育的毒理学终点1 5 3 5 萘对斑马鱼仔鱼的致畸效应。1 8 3 5 1 卵黄囊肿( y o l ke d e m a , y e ) 。2 0 3 5 2 心包水肿( p e d c a r d i a le d e m a , p e ) 2 1 3 5 3 脊柱弯曲( s p i n a lf l e c t i o n , s f ) 一2 1 第4 章讨论与结论 2 7 4 1萘对斑马鱼胚胎的发育毒性2 7 4 2萘对7 2 h p f 斑马鱼仔鱼的致畸毒性2 8 4 2 1卵黄囊肿2 8 4 2 2心包水肿2 9 4 2 3脊柱弯曲3 0 4 3 结论。3 0 参考文献 后记”- ”- ”3 6 i v ： j 东北师范大学硕士学位论文 第1 章前言 1 1多环芳烃概述 多环芳烃化合物( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，简称p a h s ) 是指由两个或两个 以上苯环以线状、角状或簇状排列的中性或非极性碳氢化合物【l 】。p a h s 按照连接方式 可分为两类1 2 3 4 】：第一类为稠环芳烃或称芳香稠环型，即分子中相邻的苯环至少有两个 共用碳原子的多环芳烃，其性质介于苯和烯烃之间，如萘、葸、菲、芘、苯并 a 】芘等； 第二类为孤立多环芳烃或称芳香非稠环型，即苯环直接通过单键联合或通过个或几个 碳原子连接的碳氢化合物，如联苯、三联苯、l ，2 二苯基乙烷等。从物理化学性质角度， 2 - 3 环的低分子量p a h s 如萘、芴、菲和葸等，易挥发，对水生生物有一定毒性；4 - 7 环的高分子量p a h s 如芘、荧葸、苯并芘等，沸点高，不易挥发，具有“三致”效应【5 1 。 目前已知的p a i l s 约有1 0 0 多种，广泛分布于天然环境中，主要来源于人类活动和 能源利用过程如石油、煤、木材等的燃烧过程、石油及石油化工产品生产过程、海上石 油开发及石油运输中的溢漏等都是环境中p a h s 的主要来源。此外，森林火灾、火山活 动、植物和生物的内源性合成等自然过程亦构成了环境中p a h s 的天然本底值【6 1 。 p a h s 具有“三致”效应、光致毒效应【7 】以及环境激素作用，是典型的持久性有机污染 物，也是已知的人类致癌、致突变和发育毒性物质【8 】。p a h s 可以通过呼吸道、皮肤和消 化道等多种途径进入人体，导致内分泌失调，造成呼吸、消化、神经、造血等系统的损 害，诱发各种癌症如肺癌、胃癌、皮肤癌等并增加其发病率。p a h s 污染对免疫系统较 薄弱的儿童健康影响尤为突出【9 - 1 们，董少霞等【1 1 】研究表明p a h s 对新生儿的短期和长期危 害更为严重。 研究表明i l l 1 2 j ，p a l - i s 本身并无直接毒性，其进入机体后，主要经过i 、i i 相酶 ( c y p l a l 及g s t m l 、g s t t l 是主要的代谢酶类) 代谢活化而呈现致癌作用。p a h s 在体内 所发生的一系列代谢的改变，主要是在位于细胞内质网上的细胞色素p 4 5 0 混合功能氧 化酶( m i x e df u n c t i o no x y g e n a s e s ，m f o ) 的参与下进行的。鱼类体内细胞色素p 4 5 0 同功 酶的功能，只有一些与p a h s 的新陈代谢有关。s t e g e m a n 1 3 】详细地描述了这些酶承担的 多样的功能。 p a h s 在体内首先经m f o 催化，形成p a h s 环氧化物，然后再经环氧水化酶催化， 形成p a h s 二氢二醇衍生物，后者可以形成具有亲电子性的正碳离子，它可与生物体内 d n a 分子鸟嘌呤n 2 结合，形成共价键，使d n a 的遗传信息发生改变、引起突变、构 成癌变的基础。p a h s 代谢产物1 羟芘葡糖苷酸( 1 o h p g ) 和2 萘酚( 2 n a p h t h 0 1 ) 以及1 羟基芘( 1 o h p ) 等常作为生物标志物用以评价人体对p a h s 的暴露【1 4 , 1 5 1 。 东北师范大学硕士学位论文 1 2萘的概述 萘( n a p h t h a l e n e ，n a p ) ，分子式c l o h 8 ，熔点8 0 2 ，沸点2 1 7 9 c ，光亮的白色鳞片 状晶体，具有特殊的煤焦油样气味，易挥发，易升华；不溶于水，溶于乙醇、乙醚、苯、 丙酮等有机溶剂。萘在环境中的应用广泛，可用于生产染料、树脂、炸药、消毒剂、杀 虫剂、防蛀剂和碳化照明气。萘在化学药品生产中通常作为溶剂、润滑剂，并用来作为 合成苯二甲酐的化工原料。萘及其衍生物作为有机合成原料，常应用于塑料、石油和煤 加工工业、制革、纺织和皮毛生产中，也用于染料和制药工业，其生产废水中均发现萘 及其衍生物的存在。 萘对机体具有多器官和多系统的损害作用，常见的是呼吸、消化、神经、造血等系 统的损害，长时期的萘作业可导致眼白内障。萘吸入时易被吸收，在肝微粒体内经细胞 色素p 4 5 0 氧化酶作用，代谢产生1 ，2 环氧化物和氧化萘，经环氧化物水解酶等代谢成萘 酚、萘醌及l ，2 二氢1 ，2 - 羟萘、二硫1 ，4 二羟萘等多种代谢产物。研究表明，萘对呼吸 系统、眼的损害主要是通过其代谢产物实现的。人体实验显示，吸入的萘有6 3 0 o - 8 5 以一羟基萘的形式排出【1 6 】。b a k k e 1 7 1 研究白鼠对萘的代谢及排泄机理，结果表明8 0 的 萘以二羟基萘的形式经尿液排出，而4 6 以一羟基萘或其葡糖酸酐结合物形式在尿中排 出。 1 3萘污染现状 萘是结构最简单的二环多环芳烃，也是挥发性最强的多环芳烃，属于中等毒性物质， 近年来一些国家及国际机构( 如i a r c 、d f g 、e p a ) 已经将萘归为潜在的致癌物质。1 9 9 3 后，我国停止了含萘卫生球的生产和销售。美国及欧共体环境保护机构把萘等有机污染 物列入环境优先污染物，我国也将其列为优先控制污染物【1 8 1 9 1 。 萘广泛存在于大气、土壤和水体中。 大气中的萘以气态及赋存在颗粒相上为主。在粤港澳地区，低环p a h s 在气相中的 比例相对较高，而萘在气相中的比例超过5 0 ，而“环芳烃在气相中的相对量却均在 0 2 5 以下f 2 们。2 0 0 8 年哈尔滨市大气中总p a h s 的浓度为8 1 - 3 7 2 n g m j ，平均值为 1 8 2 n g m 3 ；其中低环p a h s 主要集中在气相，高环p a h s 则吸附在颗粒相上，颗粒相中 p a h s 的含量随着分子量的增加而增大，而气相中表现出相反的现象。吸附在大气颗粒 物中的p a h s 随颗粒物降落在地面或水体，然后又以蒸汽的形式进入大气环境，引起二 次污染【2 1 1 。工业区上方空气中苯并 a 】芘( a a p ) 的浓度通常比周围空气高几个数量级，城 市交通干线空气中的p a h s 污染较为严重【2 2 1 ，除此之外，工业燃料的不完全燃烧、煤和 石油的燃烧、垃圾的焚烧等都是大气中p a h s 污染的主要来源。 唐明金【2 0 】等在粤港澳地区的研究表明，美国环保局( u se p a ) 规定的1 6 种优先控 制p a h s 在大气、水体、土壤、沉积物、作物和鱼体中依次占1 3 、0 0 5 、5 6 8 、 4 1 8 、0 0 0 01 和0 0 0 3 ，土壤和沉积物中的p a h s 占环境中p a h s 总量的9 8 6 ，说 明土壤和沉积物是p a h s 的主要储存库。我国土壤中的p a h s 总含量范围从o 8 3n g g 到 1 4 6 6 8 9 n g g 不等，p a h s 平均含量范围在3 9 8 - 5 6 8 8 3 n g 分1 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 l 之间，而且1 6 2 j 东北师范大学硕士学位论文 种优先控制p a h s 都有不同程度的检出，且检出率非常高【2 9 1 。土壤中的p a h s 主要源于 大气中的p a h s 干湿沉降、地表径流的p a i l s 入渗、农用污水污泥、地下蓄油装备的渗 漏等。通过大气沉降作用进入土壤的p a h s 可能淋溶到地下水中、迁移到地表水中、挥 发到大气中或经植物叶片、植物根吸收( 3 环以下p a h s 化合物如萘) 并在植物体内迁 移、代谢和积累，产生毒性更强的代谢物或转移到生物体内，从而通过多种暴露途径对 人类生存与环境构成威胁。 沉积物是p a h s 的另一个重要储存库，江苏太湖、云龙湖、山东南四湖、滇池、红 枫湖、巢湖、密云水库和扎龙湿地等内陆湖泊和湿地的沉积物中均有p a h s 存在 3 0 , 3 1 , 3 2 , 3 3 , 3 4 】，胶州湾表层沉积物中p a h s 总含量范围已达到8 2 4 5 6 7n e d g ，相当于中等 污染水平，渤海、湄洲湾以及经济发达的珠江三角洲地区的污染状况可能更加严重 3 5 ，3 6 ，3 7 o 工业污水、农业污水、生活污水排放及大气沉降是水体中多环芳烃的主要来源，那 些与人口密集、工业化城市化程度较高的地区毗邻的河流与湖泊的p a h s 污染已相当严 重。其中，黄浦江表层水体萘的平均浓度为1 2 3 n g l t 3 引，黄河兰州段1 6 种优先控制的p a h s 均有检出，水体总p a h s 浓度范围为2 9 2 0 6 6 8 0 n g l 【3 9 】。对岷江成都段7 个断面水样中的 1 6 种多环芳烃化合物进行分析，检出率为5 1 9 ，萘检出率最高，达至0 1 0 0 ；从1 6 种 多环芳烃的浓度分布来看，萘、二氢苊、芘、苊、芴、菲、荧葸等7 种化合物浓度占9 7 ，其它9 种只占3 ，尤以萘为最高，达4 5 【4 0 1 。2 0 0 3 年，马健【4 1 】等在松花江肇源段面 采集了江水、底质、鸭蛋、蚌、鲶鱼和人乳，测定其多环芳烃的含量，其中萘的检出量 最高，芴、菲、荧葸、芘四种多环芳烃的含量大小顺序依次为底质、鲶鱼、蚌，大多数 都在同一数量级上而萘检出量比其他四种多环芳烃高一个数量级，随着分子量的逐渐增 大，鲶鱼对江水中多环芳烃富集倍数也逐渐增大。 工业集中分布的第二松花江的某些江段( 如吉林和哈尔滨江段) ，污染物排放量大， 致使污染物远远超过水体自然净化能力，污染严重。哨口至松花江村江段( 属于第二松 花江) 鱼肉中萘、葵烷、十二烷、甲苯、硝基苯、2 , 4 二硝基甲苯6 种可疑致癌物平均含 量高达3 7 m g k g 4 2 ；枯水期松花江饮马河断面萘的浓度为8 6 9 9 l ，大于允许浓度 5 0 b t g l 4 3 】。 近年来，由于人类对能源的需求日益加剧，频繁发生的海上石油泄漏事故使海洋中 p a h s 污染现象日趋严重，中国的厦门西港【州、渤海【4 5 】和南海【4 6 1 等均受到了不同程度的 p a h s 污染，且部分海域p a h s 含量较高。p a h s 具有强烈的憎水性和吸附性，在海洋环境 中大部分p a h s 吸附在悬浮颗粒物上并最终进入沉积物中。p a h s 在水体悬浮物中的浓度 随环数的上升有增大的趋势，由于其高的脂溶性，p a h s 容易转移至生物有机体内，生 物累积效应非常显著。 1 4p a h s 胁迫下鱼类生理生化响应 目前，鱼类在多环芳烃胁迫下的研究主要集中在p a h s 对成体鱼组织器官结构的影 响 4 7 , 4 8 1 、细胞超微结构与酶系统的响应 4 9 , 5 0 5 l 5 2 ，5 3 】以及对生殖机能的影响1 5 4 , 5 5 , 5 6 , 5 7 , 5 8 等领 东北师范大学硕士学位论文 域。 吴玲玲【4 8 】等将斑马色_ _ ( b r a c h y d a n i or e r i o ) 成体暴露在菲水溶液中3 6 d ，结果显示， 斑马鱼的鳃和肝组织均受到了损害，主要表现为鳃小片上皮细胞肿大和水肿；部分肝细 胞出现肿大、细胞质中出现空泡。张民【4 9 】等研究了1 甲基菲、并四苯等稠环芳烃对鲫鱼 肝脏微粒体芳烃羟化酶活性的影响，1 1 种多环芳烃和联苯类化合物中9 种化合物对鲫鱼 肝脏微粒体芳烃羟化酶表现出不同程度的诱导或抑制。大洋和未污染湖水中p a h s 含量 往往低于l p g l ，靠近油田和其他污染源的p a h s 浓度可高达5 0j t g l 。刘冰【5 0 j 研究了苯 并 a 芘对长江河口弹涂鱼肝细胞超微结构、抗氧化酶系统的影响。发现标志性酶活力等 生化指标的变化是一个动态的过程，污染胁迫较轻时，这些生化指标可能会产生适应性 诱导反应，以减缓或消除污染物代谢过程中产生的各种有害中间产物，而当污染胁迫严 重，超过机体适应能力时，这些生化指标则可能产生抑制性中毒反应。尽管苯并【a 花和 重金属具有不同的理化性质，在生物体内具有不同的代谢途径，但对鱼体重要的解毒器 官肝脏的细胞超微结构的影响却有很多相似之处，如重金属离子亚急性暴露产生的毒性 影响主要表现在对细胞膜质结构的破坏，以及对线粒体等功能性细胞器的损伤。徐楠垆l j 以鲤鱼肝微粒体为实验体系，研究了被五种多环芳烃化合物菲、9 ，1 0 一菲醌、芘、1 - 羟基 芘、苯并芘污染后，其芳烃羟化酶( a n n ) 的活性变化。发现多环芳烃对a h h 的诱导具 有良好的剂量效应关系。a h h 活性升高的大小可以作为监测多环芳烃对水体污染程度 的一种生物指标。五种多环芳烃对a h h 诱导能力的大小为1 2 羟基芘 苯并芘，9 ，1 0 - 菲醌 芘 菲，与其毒性大小相关。 有研究【5 9 】报导在萘和燃油中暴露后，细须石首鱼血浆中雌二醇和睾酮浓度降低， 且这一结果与卵巢组织对激素刺激的应激性降低有关，于是提出一些p a h s 能干扰目标 组织的激素膜受体。然而，就脑垂体组织而言，目前并未得出结论。然而，在m e l i s s a 等【6 0 】的研究中发现，在萘、b 2 萘黄酮( 1 3 2 n a p h t h o f l a v o n e ) 和惹烯( r e t e n e ) 中暴露后的鲫 ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 的睾酮生成却得到促进。p a h s 的新陈代谢与生理和激素的循环有着 密切的关系并且表现出明显的的性别季节变化和个体差掣6 1 】。鱼体内细胞色素p 4 5 0 同 功酶的功能，只有一些与p a h s 的新陈代谢有关。s t e g e m a n l 6 2 】详细地描述了这些酶承担 的多样的功能。 刘睿智【5 8 】等将褐菖鲇长期暴露于含低浓度o 号柴油水溶性成分( d i e s e lo i ls o l u b l e f r a c t i o n , d w s f ) 的海水中，对褐菖鼬机体与生殖机能有关的生理生化指标及性腺的组织 学变化进行观察，未发现明显的性腺组织损伤，性体指数也没有明显影响。许多研究p m 证实油污染造成海洋硬骨鱼生殖参数的下降，观察到的情况包括改变生殖激素的水平， 抑制性腺发育，减少卵和仔鱼的生存发育能力等。 鱼类从水体中摄取p a h s 随接触浓度的增加而加快，且不同化合物其富集倍数也 不相同，如萘、芴、菲、苊和苯并【a 】芘的富集倍数分别为8 0 、1 5 0 、7 5 、3 9 0 和9 3 0 。 以石油为主的污染物在水体中的沉降往往导致其在鱼组织中迅速短期积累。实验表明 1 6 3 1 ，把乌贼暴露于原油9 0 d ，其组织中的主要p a h s 与原油中相同，如萘和苯残留量达 到8 5 1 0 七和2 9 1 0 。6 ，富集倍数分别为1 5 0 和4 5 0 。 4 东北师范大学硕士学位论文 1 5斑马鱼与毒理学研究 斑马鱼( d a n i or e r i o ) 是生活在印度、孟加拉国水域内的一种暖水性( 2 1 3 2 c ) 热带淡 水鱼，属辐鳍亚纲口c t i n o p t e r y g i i ) 鲤：科( c y p r i n i d a e ) 短担尼鱼属( d a n i o ) 的一种。最初由美 国俄勒冈大学d r g c o r g es t r e i s i n g e r 引入实验室，现在，斑马鱼已经成为发育生物学和 人类疾病研究领域最主要的脊椎动物模型之一，被广泛地应用于遗传和发育毒理学、环 境毒理学、病理毒理学、药物毒理学等毒理学领域的研究中【6 4 , 6 5 】。 2 0 世纪7 0 年代末期，国外开始运用斑马鱼进行化合物的急性毒性研究，研究的化 合物包括锌、镉、硒、汞等重金属以及苯酚、苯胺、环己胺等有机物【6 6 】，9 0 年代初开 始被用于混合化合物的急、慢性毒性检测【6 7 1 。 作为模式生物，斑马鱼具有以下特点： 个体小( 4 - 5 c m ) ，饲养成本低，适合大规模饲养； 遗传背景清晰，基因组序列测序工作已经完成，共有约1 0 5 个基因，全长1 7 g b ， 与人类基因组的同源性约为6 0 t 6 8 】： 遗传图谱、突变技术已成功建立，对有价值的突变体进行分析并发展了转基因 斑马鱼技术，可方便地用来生成基因抑制( k n o c k d o 、n ) 鱼和转基i 天l ( t r a n s g e n i c ) 鱼。 斑马鱼是脊椎动物，比果蝇和线虫更接近人类：与其他脊椎动物在心血管、血 液、消化道、肝脏、肾脏以及视觉系统等器官的发育和系统发育均有着许多相 同或相似的特点，是研究脊椎动物特别是人类的理想模型。 由于斑马鱼的鳃、肝等组织对毒性物质反应敏感、结构变化显著，因此很多毒理学 研究选择斑马鱼鳃、肝等组织为研究对象。吴玲玲【4 8 】等将斑马鱼( b 僦厅州锄加r e r i o ) 成体 暴露在浓度为5 0 o n g l 的菲水溶液中3 6 d ，研究了其对受试鱼鳃和肝组织结构的影响。 结果显示，斑马鱼的鳃和肝组织均受到了损害，主要表现为鳃小片上皮细胞肿大和水肿： 部分肝细胞出现肿大、细胞质中出现空泡。通过h e 染色研究显示：o 0 5 和1 0 0 0 “g l 的菲溶液暴露3 6 d 后受试鱼的鳃受到损伤，均发生鳃小片上皮细胞肥大和水肿；菲浓度 为1 0 0 0 0 g l 时，受试鱼还发生鳃丝上皮增厚、鳃小片上皮隆起现象。此外，菲暴露造 成斑马鱼的肝组织损伤，0 0 5 “g l 的菲溶液暴露下，受试鱼的肝细胞发生肿大，胞质产 生空泡；菲浓度为1 0 0 0 p g l 时，受试鱼的肝细胞变得不规则，细胞核萎缩变形和偏离 细胞中心，部分肝细胞空泡化程度加重，发生核溶解或细胞溶解，造成局部肝组织坏死。 表明水环境中菲浓度达到0 0 5 r t g l 即已对斑马鱼的鳃、肝产生毒性作用；而菲浓度达到 1 0 0 0 肛g l 时，受试鱼的鳃、肝将受到较严重的损伤；伴随菲浓度的升高，鱼的鳃、肝 损伤加重。 1 6 斑马鱼胚胎发育方法与毒理学研究 1 9 9 6 年，o c e d 将斑马鱼胚胎发育方法列入测定单一化学品毒性的标准方法之一， 并制定了详细的操作指南【6 9 】。b r a u n b e c k 和l a m m e r 7 0 】对o e c d 标准进行了扩展，详细 描述了胚胎的整个发育情况及测试要求。 东北p 币范大学硕士学位论文 与传统的斑马鱼成鱼急性实验相比，斑马鱼胚胎发育技术具有鲜明的特点： 雌鱼常年产卵且一次可以产几百枚卵，胚胎实验的可重复性好、成本低、灵 敏度高( 有研究证实，斑马鱼胚胎比成年斑马鱼和i u g 2 细胞敏感【7 l j ) 、影 响因素少； 胚胎体外受精、体外发育、胚体透明，可清晰的观察其发育过程、利于操作， 胚胎发育同步且发育速度快：2 4 h p f 长出主要器官原基，心脏开始跳动，3 0 h p f 大部分器官发育基本完成，7 2h p 纵膜( c h o r i o n ) ：里孵化出来，能自由游动，3 个月进入性成熟【7 2 j ； 斑马鱼胚胎从受精卵至仔鱼孵化，可以观察到近2 0 种不同表现的反应指标【7 3 】 ( 表1 6 、1 7 ) ，表1 7 9i 类指标代表致死性，类指标揭示化合物特定的作 用方式( 非致死性指标) ，可以此判断污染物的致毒机理。 表1 6 可以观察的毒理学终剧7 4 】 染毒时间毒理学终点 t i m ea f t e r t o x i c o l o g i c a le n d p o i n t s e x p o s u r e ( h ) 4 8 1 2 1 6 2 4 3 6 4 8 卵凝结c o a g u l a t e de g g s 囊胚发育d e v e l o p m e n to f b l a s t u l a 外包活动阶段s t a g eo f e p i b o l i em o v e m e n t 原肠胚终止t e r m i n a t i o no f g a s t r u l a t i o n 胚孔关闭c l o s i n go fb l a s t o p o r u s 体节数n u m b e ro fs o m i t e s 尾部延展e x t e n s i o no f t a i l 2 0 s 内主动活动s p o n t a n e o u sm o v e m e n t sw i t h i n2 0s e c 眼点发育d e v e l o p m e n t o ft h ee y e 心跳、血液循环s t a r t i n go f h e a r t b e a ta n d c i r c u l a t i o n 黑素细胞、耳石的发育 d e v e l o p m e n to fm e l a n o c y t e sa n do t o l i t h 心律r a t eo f h e a r t b e a t 孵化率和畸形率r a t eo f h a t c h e da n dm a l f o r m e de g g 6 东北师范大学硕士学位论文 表1 7 不同类型的指标【7 4 】 i 类指标 e n d p o i n t si ne c s oi i i 类指标 e n d p o i n t si ne c s oi i 卵凝结 c o a g u l a t i o no fe m b r y o 不开始原肠胚作用 g a s t r u l a t i o nd o e sn o ts t a r t 原肠作用不终止 g a s t r u l a t i o ni sn o tf i n i s h e d 无体节 n os o m i t e s 尾部无延伸 n oe x t e n s i o no ft a i l 无心跳 n oh e a r t b e a t 4 8 h 后无主动运动 n os p o n t a n e o u sm o v e m e n t sa f t e r4 8h 不孵化 e m b r y od o e sn o th a t c h 体1 7 数显著减少 n u m b e ro fs o m i t e ss i g n i f i c a n tr e d u c e d 无血液循环 n ob l o o d 2 c i r c u l a t i o n 眼点不发育 n od e v e l o p m e n to fe y e 2 4 h 后无主动运动 n os p o n t a n e o u sm o v e m e n t sa f t e r2 4h 心律显著减少 r a t eo fh e a r t b e a ti ss i g n i f i c a n tr e d u c e d 耳石不发育 n o d e v e l o p m e n to fo t o l i t h 黑素细胞不发育 n od e v e l o p m e n to fm e l a n o c y t e s 各种畸形m a l f o r m a t i o n 孵化延迟d e l a y e dh a t c h 根据实验需要，斑马鱼胚胎实验可持续4 8 h 、9 6 h 或可延长至1 2 0 h ，以得到更多的 亚致死指标，如连续孵化率、幼鱼畸形率等。 鱼类急性毒性实验能够很好地分析化合物的毒性，但是近年来引起了极大的道德关 注。因为实验所用幼鱼或成鱼在实验过程中会感到疼痛和折磨，这和当前的动物权利保 护立法相抵触，而且l c 5 0 值的环境毒理价值不高，胚胎发育技术很好的弥补了这些缺 陷。 胚胎发育的各个阶段对致毒因素的敏感性不同，如在胚胎发育早期，细胞强烈分化、 器官原基形成至成型前，此阶段若受到致毒因素的作用，胚胎极易出现发育异常，器官 发育障碍而产生各种各样的畸形。端正花【7 4 】在双酚a ( b p a ) 对斑马鱼胚胎发育阶段的 毒性及生物蓄积研究中发现斑马鱼胚胎在发育早期( 受精后到原肠胚期) x 寸x 2 酚a 污染更 为敏感。 郑敏等1 75 j 报道，将处于囊胚期的斑马鱼胚胎用多氯联苯( p c b s ) 暴露4h 后，部分 卵出现卵黄混浊或卵黄细胞被分解成透明细胞，最终导致胚胎死亡。内分泌扰乱化学物 质能导致原肠胚期的斑马鱼胚胎发育畸形【7 6 1 ，可能是扰乱了胚层外包运动的正常进行， 阻碍前后体轴的形成，造成卵黄外突和原肠外凸，从而产生畸形胚胎，严重的会导致发 育停滞甚至胚胎死亡1 7 7 1 。 m a r k 等1 78 j 发现，乙醇暴露会引起胚胎的心包水肿、卵黄囊水肿，叔丁基苯酚等内 分泌扰乱化学物质还会引起斑马鱼胚胎色素含量减少。虽然胚胎可以在色素含量不足情 况下正常孵化，但孵化后仔稚鱼畸形率明显增高，直接影响存活。 7 东北师范大学硕士学位论文 研究【7 9 , 8 0 】发现二氢叶酸还原酶功能异常会导致斑马鱼胚胎心脏发育明显异常，斑马鱼胚 胎胰岛素样生长因子结合蛋2 ( i g f b p 2m o ) 基因下调使心率下降、心室收缩无力、房室 环化障碍等心脏发育异常表型系原发性改变，而并非继发于伴随的心包水肿【1 1 u j 。 j o h np 等【8 l 】将斑马鱼胚胎暴露于7 种非烷基化p a h s q 丁，包括萘、芴( f l u o r e n e ) 、硫芴 ( d i b e n z o t h i o p h e n e ) 、菲( p h e n a n t h r e n e ) 、葸( a n t h r a c e n e ) 、芘( p y r e n e ) 、苯并【a 】菲( c h r y s e n e ) ， 结果显示，5 、1 0m g l ( 3 9 、7 8 i t m ) 的萘溶液导致轻微的心动过缓( 降低5 - 6 ) ；菲( 5 6 1 t m ) 和硫芴( 5 4 州) 处理的仔鱼会出现心脏线形外观以及心跳过缓、心率不齐等心房阻塞 的典型特征。研究表明，三环芳烃可能导致心脏机能障碍及其后遗症，芘可引起外周血 管缺陷、贫血及神经细胞死亡等症状；多数或所有由三环p a h s 诱导的形态缺陷都是心 脏机能障碍的结果；p a h s 、a h r 配位体如二嗯英通过共同路径对鱼早期生活史阶段起 作用，而不同p a h s 子系在硬骨鱼的胚胎期和仔鱼期通过不同的毒性机理起作用。 p r a s a d 等的研究认为，莠去津通过降低鱼的红细胞携氧能力，导致斑马鱼胚胎的心 包囊肿和脊柱弯1 8 2 , 8 3 1 。吴玲玲【5 2 1 探讨了长江1 2 水环境中多环芳烃菲对斑马鱼胚胎发育 毒性、组织病理学影响。崔志鸿等【8 4 】的研究说明荧葸，菲类、芘类化合物及苯衍生物等 污染物可导致斑马鱼胚胎孵化率降低及仔鱼畸形率增加，其毒性呈现出时间和剂量依赖 性。 目前，国内有关多环芳烃对斑马鱼胚胎发育毒性的研究主要集中于葸类、菲类、芘 类等稠环芳烃方面【5 8 , 8 1 , 8 4 】，简单多环芳烃的代表物萘对斑马鱼胚胎的生态毒理效应( 包括 组织病理学、胚胎发育毒性) 研究的报道较少。 1 7石蜡切片技术