（环境科学专业论文）过亚硝酸盐羟化脱氧鸟苷反应的抑制剂的研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t s i n c ei tw a sf o u n dt h a th y d r o x y lr a d i c a la n dn i t r o g e nd i o x i d ec o m b i n et of o r m p e r o x y n i t r o u sa c i di ns t r a t o s p h e r e ，p e r o x y n i t r i t eh a sc o m et ot h ew i d ea t t e n t i o ni nt h e f i e l do fe n v i r o n m e n ts c i e n c e p e r o x y n i t r i t e ，a sas t r o n go x i d a n t ，c a u s e sn i t r a t i o no f p r o t e i n ，o x i d a t i o no fl i p i da n dd a n l a g eo fd n a p e r o x y n i t r i t ei sa u t o m a t i c a l l yf o r m e d i nn e r v e ，m a c r o p h a g ea n de n d o t h e l i u mc e l l s ，a n di ti sa l s op r o d u c e di nav a r i e t yo f p a t h o p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n ss u c ha sa c u t e ，c h r o n i ci n f l a m m a t i o n ，a r t e r i o s c l e r o s i s a n dr e p e r f u s i o no fi s c h e m i co r g a n s d n ad a m a g ei n d u c e db yp e r o x y n i t r i t eh a db e e n o b s e r v e da tc e r t a i nc o n d i t i o n s ，t w of o r m so fd n ad a m a g ec a u s e db yp e r o x y n i t r i t e a r ed n ab a s em o d i f i c a t i o na n dd n a s i n g l es t r a n db r e a k a g e d e o x y g u a n o s i n er e a c t s r 4 p i d l yw i t hp e r o x y n i t r i t et of o r mt h em o d i f i e dp r o d u c t8 - h y d r o x y 一2 - d e o x y g u a n o s i n e f 8 一o h d g ) 8 - o h d gc a n i n d u c e b a s e m i s p a i r i n g a n d g e n em u t a t i o n t h a ti s c a r c i n o g e n i c s o m ei n h i b i t o r sc a ud e c r e a s ed n ad a m a g ei n d u c e db yp e r o x y n i t r i t e t h e r e f o r e ，i ti si m p o r t a n tt os t u d yt h e s ei n h i b i t o r sw h i c hd e c r e a s e dd i s e a s e sc a u s e db y p e r o x y n i t r i t e d u et ot h ei n s t a b i l i t yo fp e r o x y n i t r i t e ，i ti s n ts o l d a f t e rc o m p a r i n gw i t hm a n y s y n t h e t i cm e t h o d sa n ds t o r a g et e s t ，t h i sp a p e ra d o p tt h em e t h o dw h i c hs y n t h e s i z e s p e r o x y n i t r i t ei nat w o p h a s es y s t e mu s i n gi s o a m y ln i t r i t ea n dh y d r o g e np e r o x i d e ，a n d i m p r o v e so nt h ed i s p o s eo fh y d r o g e np e r o x i d e 、v i t l lp o w e rm n 0 2 i td i s c u s s e dt h e e f f e c t so fe x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ss u c ha s t e m p e r a t u r ea n dr e a c t i o nt i m e o n p e r o x y n i t r i t e c o n c e n t r a t i o n t h ee x p e r i m e n ts u g g e s t e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no f p e r o x y n i t r i t ew a sa b o u to 3 4 m o l lu n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s a n dt h ed e c o m p o s i t i o n r a t i oo f h y d r o g e np e r o x i d ew a s9 5 4 9 ， t h i sp a p e rs i m u l a t e dp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n ( p h = 7 4 ，3 7 1t o s t u d yt h e r e a c t i o no fd e o x y g u a n o s i n ea n dp e r o x y n i t r i t e 8 - n i t r o g u a n o s i n ea n d8 一o h d ga r e f o r m e df r o mt h i sr e a c t i o n ，a n d8 - o h d gi sab i o m a r k e ro fd n ao x i d a t i v ed a m a g e t h eo b s e r v a t i o n ss h o w e dt h ed e p e n d e n c eo fd e o x y g u a n o s i n em o d i f i c a t i o nu p o nt h e c o n c e r t r a t i o no fp e r o x y n i t r i t e e x p o s u r et o0 - 2 5 i m n o y lo fp e r o x y n i t r i t er e s u l t e di n as i g n i f i c a n ti n c r e a s ei nt h em o d i f l e dp r o d u c to fd e o x y g u a n o s i n e8 - o h d g f i n a l l y ，t h i sp a p e ra s s e s s e d t h ei n h i b i t o r ye f f e c t so fq u e r c e t i n ，f l a v o n e ， a - n a p h t h o f l a v o n e ，c a f f e i ca c i d ，v i t a m i nc ，l g l u t a t h i o n e ，l i p o i ca c i d t h e s er e s u l t s - l i l a b s l r a c l s u g g e s t e dt h a tt h ei n h i b i t o r yp o t e n t i a lo ft h e s ec o m p o u n d sc l o s e l yd e p e n d e do nt h e f r e el a y d r o x y lg r o u p so nt h ef l a v o n o i ds k e l e t o n 。q u e r c e t i na n dc a f f e i ca c i di n h i b i t e d m o r ee f f e c t i v e l yt h a nf l a v o n ea n dg - n a p h t h o f l a v o n e ；t h ec o m p o u n d sw i t h - s ha l s o i n h i b i t e dt h i sd a m a g e ( e g l - g l u t a t h i o n e ，l i p o i ca c i d ) k e y w o r d s ：p e r o x y n i t r i t ed e o x y g u a n o s i n e8 二h y d r o x y 一2 - d e o x y g u a n o s i n e i n h i b j t o r s i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：查玺日期：皇堕墨丝 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部 分内容。可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 同期：垒丛：蛰 第一章绪论 i i i iii i 1 1 过亚硝酸根的产生 第一章绪论 1 9 2 9 年，g l e u l 与r o e l l 1 1 发现当臭氧通入叠氮化物水溶液时，有过亚硝酸根 ( p e r o x y n i t r i t e ，o n 0 0 一，在生物学和医学中又常称为过氧亚硝酸基阴离子) 的生成。 1 9 3 5 年他们【2 1 又发现在亚硝酸与过氧化氢作用形成硝酸的过程中也有o n o o 的 生成。在一个细胞中，超氧阴离子( 0 2 ) 和n o 往往同时产生，于是在1 9 9 0 年 b 6 e k m a n 等人【卸在研究n o 与0 2 - 对内皮细胞损伤的过程中提出：在许多病理条件 下，n o 可与o z 生成具有细胞毒性的物质o n o o 一。 n o + 0 2 。_ o n o o 。 随后的几年中，人们发现在内皮细胞、巨噬细胞、神经细胞、嗜中性粒细胞 中4 - 9 都有o n 0 0 的生成。有许多病理环境下，如灌注性损伤、急性炎症、动脉 硬化、风湿性关节炎及神经坏死症 1 0 - 1 4 j 也有o n 0 0 一的生成。 在平流层中，羟自由基与二氧化氮反应生成硝酸是大气化学的重要反应之一。 2 0 0 2 年，s e r g e r a n 等人”1 提出此过程中也有过亚硝酸的存在后来c o l l e nm r 与b r a i n d b 旧等小组分别模拟大气反应准确地检钡6 到气相过亚硝酸的存在。 ，o = n - - o - - o h 过亚硝酸 o h + n 0 ， 嚣 糯 而且大气中的过亚硝酸可光分解再生成o h 与n 0 2 ，对于维持大气中氮化物 的稳定起到关键性的作用。 o h + n 0 2 卞h o o n o 1 2 过亚硝酸根的生理作用 在水溶液中，过亚硝酸根o n 0 0 一与其共轭酸o n o o h 存在着酸碱质子平衡， 两者都是很强的生物氧化剂。o n o o h 在水溶液中不稳定，极易异构化重排为硝 酸。在3 7 和p h7 4 的条件下，o n o o h 的半衰期约为0 9 秒。o n 0 0 。在碱性溶 液中则是较稳定的，但在中性和酸性条件下，易质子化为o n o o h 而迅速重排为 硝酸踟。 。n 一。一h 三。一n 渊 o 在生物体内，o n 0 0 。直接或通过其共轭酸分解生成的自由基作用于不同种类 的生物分子。细胞内形成的o n 0 0 一，它不仅能破坏细胞本身，而且能渗透到附 近的细胞并对其造成损伤；同样，细胞外形成的o n o o 也能扩散并损伤内细胞。 在分子水平上o n o o 。的毒性表现为：引发脂质体过氧化反应【1 9 1 、抑制线粒体呼 吸链中的酶的活性、钝化甘油醛3 磷酸脱氧酶n 1 、抑制细胞膜n a + k + a t p 酶 的活性m i 、钝化细胞膜中的钠离子通道【2 2 1 、硝化或氧化酪氨酸及其它氨基酸或氨 基酸残基 1 9 】、修饰d n a 碱基【2 3 1 等，在亚细胞水平上过亚硝酸根的毒性表现为： 线粒体功能紊乱【2 0 1 、n a d 衰竭【2 4 1 、d n a 断裂1 2 ”、钙失调 5 _ 7 1 ，在细胞水平上过 亚硝酸的毒性表现为：细胞坏死、细胞凋亡f 2 3 1 。 由于过亚硝酸根具有强氧化性，并引发氧化、硝化反应，这使得o n 0 0 有 可能成为多种疾病的引发因子。大量的研究已经表明脂蛋白过氧化和心血管内皮 细胞膜受损是导致冠心病和动脉硬化的主要原因 1 3 】，而内皮细胞产生的o n o o 正是使脂蛋白过氧化和内皮细胞膜受损的主要物质 3 , 1 9 1 。0 n 0 0 使d n a 断裂可 导致基因突变，使酪氧酸硝化可影响酪氨酸磷酸化 1 9 这一调控细胞生长、增殖、 分化等有关过程的关键步骤，这些都可能导致恶性肿瘤等严重疾病的发生。 1 3 过亚硝酸根对d n a 的损伤 在生物体内，当巨噬细胞、神经细胞、内皮细胞1 中有n o 与0 2 - m 日司t 产生 时，它们可迅速结合生成过亚硝酸根o n 0 0 1 3 1 。众所周知，超氧歧化酶酶( s o d ) 2 第一章绪论 可以还原0 2 。，然而，n o 与0 2 。生成过亚硝酸根比s o d 还原0 2 的速度更快。过 亚硝酸根是一种重要的生物氧化剂，具有细胞毒性，其中o n o o - x i jd n a 的损伤 被认为是o n o o 导致病变的主要原因之一。研究发现，在急性炎症、动脉硬化、 神经坏死症等病理环境中存在过量的o n o o 。，并观察到由过亚硝酸根引发的 d n a 损伤4 1 9 j ，如进行d n a 碱基修饰、使d n a 单链断裂等f 2 3 i 。过亚硝酸根损伤 d n a 后会引发碱基错配、d n a 片段化，使含此类d n a 的基因具有致突性、致 癌性，从而引发细胞癌变【2 孔。 过亚硝酸对d n a 的损伤主要有两种形式：碱基修饰( b a s em o d i f i c a t i o n ) 和 单链断裂( s i n g l es t r a n db r e a k a g e ) 。 1 3 i 碱基修饰 核酸分为脱氧核糖核酸( d n a ) 和核糖核酸( r n a ) 。核酸是遗传的物质基础， d n a 是遗传信息的贮存者和携带者。核酸的基本构成单位是核苷酸，其在核酸 水解后产生，核苷酸水解产生核苷及磷酸，核苷若进一步水解可产生戊糖和碱基。 d n a 中的碱基主要是：腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、胸腺嘧啶( t ) 、胞嘧啶( c ) 。 碱基相互配对( 碱基互补) ，即a 与t 配对，形成两个氢键；g 与c 配对，形成三 个氢键( 见图1 - 1 ) 。 双螺旋结构是核酸的二级结构。双螺旋的骨架由戊糖和磷酸基构成，两股链 之间的碱基互补配对，是遗传信息可靠传递、d n a 半保留复制的基础。而遗传 信息就保存在核酸的核苷酸序列中。如果碱基发生变异或者脱嘌呤，则d n a 的 遗传信息将会发生改变，那么r n a 在转录过程中就会发生错误，使转录后的基 因发生变异，可能导致细胞的癌变。 d n a 的四种碱基一腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 、胸腺嘧啶( t ) 均可被过亚硝酸根修饰，但鸟瞟呤( g ) 最易被修饰1 2 5 0 6 1 。s a r n a rb 等人1 2 5 】研究过亚 硝酸根对脱氧核苷修饰作用时，发现脱氧核苷中2 7 的脱氧鸟苷被修饰，而其它 三种碱基只有3 被修饰。 y e r m i l o vv 等人1 2 州发现过亚硝酸根与脱氧鸟苷快速反应形成几种产物，使用 色谱分析鉴定其中产物之一是8 一硝基脱氧鸟苷，并发现8 硝基脱氧鸟苷的生成量 随着过亚硝酸根浓度增加而增加，即使过亚硝酸根浓度极低的情况下( 5 m ) 也有 第一章绪论 8 - 硝基脱氧鸟苷的生成；而且它在3 76 c 、p h7 4 的条件下可以快速地从d n a 上 脱嘌呤( t i ，2 ：4 h ) ，产生脱嘌呤位点。 h h k h 一 。、 h g ：c c h 2 a ：t 图1 - i 碱基目b 对原则 f i g u r e1 1b a s e p a i r i n gr u l e s 另一种修饰产物是8 一羟基脱氧鸟苷( 8 一o h d g ) ，8 - o h d g 是一种反映d n a 氧 化损伤程度的既灵敏又稳定的指标，又是一种与肿瘤的发生发展有关的生物标记 物。l n o u e 等人与s p e n c e r 等人 2 8 的课题组都发现牛胸腺d n a 与不同浓度的过 亚硝酸根溶液反应时，8 - o h d g 的生成量随着过亚硝酸根的浓度的增加而增加。 过亚硝酸根对脱氧鸟苷修饰的产物主要是8 、羟基脱氧鸟苷与8 ，硝基脱氧鸟 苷( 图1 - 2 ) 。8 - 硝基脱氧鸟苷产生的脱嘌呤位点与8 羟基脱氧鸟苷都会引发鸟嘌 呤：胞嘧啶碱基对向胸腺嘧啶：腺嘌呤碱基对( g ：c t ：a ) 的碱基颠换1 1 0 1 。 j u e d e sm j 与w o g a ngn 【2 9 1 研究过亚硝酸根对d n a 变异的影响时，发现d n a 变异发生的位置大部分在g ：c 碱基对f 细菌变异中9 8 5 ，人体细胞中9 3 4 ) ， 其中主要是g ：c t ：a 的碱基颠换( 细菌变异中6 5 人体细胞中6 3 ) 。j e o n g j k 等人1 3 0 j 发现过亚硝酸根与人体细胞a d 2 9 3 作用后，细胞中的线粒体在复制的 4 第一章绪论 过程中有7 5 发生g ：c t ：a 颠换( 见图1 3 ) 。这些配对颠换如果发生在d n a 复制时，就会造成子代d n a 序列与亲代d n a 不同的错误性损伤，使生物的突 变率大大提高，其结果可能是影响生物细胞的功能和遗传特性。 脱氧鸟苷 8 一羟基脱氧鸟苷 o 8 一硝基脱氧乌苷 图1 - 2 脱氧鸟苷的修饰产物 f i g u r e l - 2m o d i f i e dp r o d u c t so f d e o x y g u a n o s i n e l _ 3 2d n a 单链断裂 1 9 9 2 年，k i n g 等人发现o n 0 0 k 能导致d n a 的断裂。随后的五年里，几 个课题组用琼脂电泳技术分别在线粒体d n a 如p b r 3 2 2 ，p m 2 ，c m v , p u c l 9 中分 别得到由过亚硝酸根导致的d n a 单链断裂1 4 1 。1 9 9 2 年，k i n g 等人首次发现 o n o o k 能导致d n a 的断裂3 1 1 。m a f i ag s 等人1 3 2 , 3 3 1 在研究过亚硝酸根对线粒体 p b r 3 2 2 中的超螺旋d n a 及小鼠胸腺细胞的d n a 损伤情况时，也发现过亚硝酸 根可造成d n a 单链断裂。s z a b oc 等”3 4 1 发现过亚硝酸根同样可以使j 7 7 4 巨噬 nnnh h o 蠹 n氐nlh 的 血稳 细胞、小鼠大动脉平滑肌细胞的d n a 单链断裂，而且断裂的程度随过亚硝酸根 的浓度增加丽加深。z i n g a r e l l i1 3 等人通过实验发现过亚硝酸根可直接与完整细 胞( 巨噬细胞) 作用造成d n a 损伤，进而提出细胞外的过亚硝酸根能通过细胞 膜与细胞核作用。 h o h 0 h d g d e o x y p e n t o s e a ：t 图1 3 碱基颠换 f i g u r ei 一3b a s et r a n s v c r t i o n 虽然目前对d n a 单链断裂的机理并不十分的明确。但d n a 单链断裂能够 激活p o l y ( a d p - r i b o s e ) s y n m e t a s e ( p a r s ) 的活性【3 ”，p a r s 是一种在细胞核中广泛 存在的酶，它的作用是调节基因的表达、细胞差异性、转化、分类，并在环境变 化，减缓细胞的代谢。p a r s 明显的活性是快速的降低其底物- n a d + 的浓度，减 缓糖原酵解、电子转移，因此在些过程中如果有过多形成a t p 产生将会引起急性 的细胞功能紊乱及细胞死亡。这种机理称为“p a r ss u i c i d eh y p o t h e s i s ”( p a r s 自 杀假说) ”。在巨噬细胞、平滑肌细、上皮细胞与过亚硝酸作用的情况下，都观察 到了这种断裂及它所激活的p a r s 以及一系列影响( 如图1 - 4 ) 。 6 d n as i n g l es t r a n db r e a k s + p a r s ， 弋 n i c o t i n a m i d e n a d + a d p 。r i b o s y l a t e d 。n h i b i t i 。n 。fn i ，6 0 d r i a l a n dc e l l u l a re n e r g e t i c s 幽l - 4p a r s 自杀假说 f i g u r el 一4p a r ss u i c i d eh y p o t h e s i s 1 。4 天然抑制剂的研究进展 l n j u r y 活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 或活性氮( r e a c t i v en i t r o g e ns p e c i e s ， r n s ) 包括氧或氮自由基和某些具有氧化功能或极易转化成自由基的物质【3 6 1 。自 由基是指那些最外层电子轨道上含有不配对电子的原子、离子或分子的总称1 3 7 ， 在人体内，自由基主要指活性氧或活性氮。d e n l 姐mh 3 8 于1 9 5 2 年提出衰老的自 由基机理以来，人们对自由基在生物体内的作用已进行了半个多世纪的研究，但 仍未取得统一的结论。然而，越来越多的研究 3 9 q 1 表明，人体内的自由基，在疾 病以及衰老的产生上，起着至关重要的作用。在生物体内，自由基与抗氧化剂的 平衡是决定细胞生存状态的重要因素，但这种平衡一旦被毒丁破，氧应激就会发生， 较敏感的生物分子如脂质体、蛋白质和d n a 将会受到损伤。 当生物体内有过量的活性氧( 如超氧根阴离子0 2 ) 或活性氮( 如一氧化氮 n o ) 存在时，可能会造成不可修复的d n a 损失 2 9 , 3 0 , 4 2 1 ，继而引起d n a 变异，可 能导致癌变。一些细胞可同时产生n o 与0 2 ，两者就可迅速结合生成过另外一 种活性氮过亚硝酸根( 0 n 0 0 。) ，o n o o 具有比n o 或0 2 更大的细胞毒性。过亚 硝酸根是强氧化剂，可损伤蛋白质、核酸、脂质等多种生物大分子，与许多疾病 如癌症、心血管病有关。因此，研究过亚硝酸根的抑制剂，减少其对生物大分子 的损伤将有重要的意义。 许多天然抑制剂可有效地抑制有毒物质对生物大分子的损伤，从而达至保护 生物体的目的，常见的有：酚类化合物、类胡萝h 素、肽类化合物( 如谷胱甘肽、 第一苹绪论 肌肽) 、辅酶( 如硫辛酸) 、维生素类。 i 4 1 酚类化合物 已被发现的酚类化合物包括单酚类如酚本身和复杂的多聚酚如鞣酸，共有 8 0 0 0 多种，包括1 3 个亚类如：黄酮类、酚酸类、羟基肉桂酸、香豆素类等。目 前在草本植物、水果、蔬菜中发现了4 0 0 0 多种酚类化合物，许多食物酚类化合 物能预防人类疾病如心血管病、癌症【4 3 1 ，而且由于具有安全无毒等特点而日益受 到人们的关注。 ( 1 ) 槲皮素、黄酮、1 3 , 萘基黄酮 槲皮素( q u e r c e t i n ；c 1 5 h 1 0 0 7 ) 属植物黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜和水 果如山楂、苹果、洋葱、茶叶、蜂蜜和葡萄之中，多种中草药，如柏叶、高良姜、 款冬花、桑寄生、三七和银杏等也含此成分，而且多以甙的形式存在，如芦丁( 芸 香甙) 、槲皮甙、金桃甙等，甙经酸水解可得到槲皮素。槲皮素具有祛痰、止咳、 平喘、抗炎、抗过敏、解痉、强心、降血压、扩张冠脉、降血脂、抗心肌肥厚、 抗心肌肥厚、抗心律失常、抗血小板聚集、抗氧化、抗肿瘤和抗病毒等广泛的药 理作用。它是超氧阴离子自由基、单线态、羟自由基和脂过氧基的清除剂。 由于具有上述特点，槲皮素是研究较多的一种黄酮类化合物。d u t h i es j 等 人“】研究发现槲皮素与杨梅酮能抑制由丝裂霉素c 引起的d n a 损伤。m e l i s s ak 等人【4 5 】则比较五味子酸与槲皮素对由过氧化氢引起的d n a 损伤的抑制效果，研 究发现1 0 um 的五昧子酸与槲皮素就可显著地抑制此类d n a 损伤。h i r o s h i 等 人 4 6 1 选择包括槲皮素在内的1 8 种不同黄酮类化合物，研究其对由n o 、过亚硝 酸根引起的d n a 单链断裂的抗氧化性，发现其中些高浓度( 5 0 0 um ) 的黄酮类 化合物能有效地抑制d n a 单链断裂。 o ho h o 槲皮素 0 u e r c e t i n o h o h o 黄酮 f l a v o n e o a 一萘基黄酮 a l p h a - n a p h t h o f l a v o n e x hn i n g 等人1 4 7 】发现黄酮( f 1 a v o n e ，cz 5 h 1 0 0 2 ) 通过调节细胞色素p 4 5 0 的单氧 酶来提高再灌注性心脏损伤的恢复能力。d - 萘基黄酮( a l p h a - n a p h t h o f l a v o n e ， c 1 9 hj 2 0 z ) 是合成的黄酮类，常用于细胞色素p 4 5 0 参与的新陈代谢的抑制剂， 目前的研究主要集中在对化学致癌物的抑制手几理上。 ( 2 ) 咖啡酸 咖啡酸( c a f f e i ca c i d ，c 9 h 8 0 4 ) 属于酚酸类，是苯基取代的不饱和羧酸，其 化学名称为3 , 4 二羟苯丙烯酸，普遍存在于当归、川芎等常用植物中，也可从黄 花全草和山里红果实等植物中提取出来的，具有较高的抗癌活性。咖啡酸可抑制 亚硝酸根对n a d h 的氧化作用。研究还发现它是种辐射保护剂，可有效清除 羟基自由基，并可通过电荷转移反应快速修复d n a 氧化性羟基加成自由基。 h h 咖啡酸 c a f f e i ca c i d 1 4 2 谷胱甘肽 谷胱甘肽( l g l u t a t h i o n e ，c l o h l 7 n 3 0 6 s ) 是一种具有重要生理功能的活性三 肽，它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，因其含有游离的一s h 基， 所以常用g s h 来表示。g s h 广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。 g s h 在人体内不能够合成，必须通过食物摄取，即外源性g s h 来满足人体的需 要。 9 c o o h o h l n o n c o o h c h 2 s hh 谷胱甘肽 l g l u t a t h i o n e 它参与细胞内氨基酸转运、糖代谢和d n a 合成调节，在拮抗外源性毒物、 氧自由基损伤、调节机体免疫功能、维持细胞蛋白质结构和功能、抑制细胞凋亡 等方面发挥重要作用【5 们。 1 4 3 维生素c 维生素c ( l a s c o r b i ca c i d ，c 6 h 9 0 6 ) 作为承溶性小分子抗氧化剂，具有消除 氧自由基的强大能力，能通过提供电子给羟自由基或超氧根阴离子，使之失活变 成活性低的脱氢抗坏血酸，故拥有广泛的抗氧化损伤能力1 5 们。 h o c 1 | 4 4 硫辛酸 硫辛酸( a l p h a l i p o i ca c i d ，c 8 h 1 4 0 2 s 2 ) 又称二硫辛酸，其英文化学名称为 a - l i p o i ca c i d ，t h i o c t i ca c i do r1 , 2 一d i o t h i o l a n e 一3 一v a l e r i ca c i d ；q b 文名称为5 - ( 1 ，2 - 二噻 茂烷基一37 1 戊酸，俗名硫辛酸或二硫辛酸。 c h 2 一s c 鼍：i c h 一： i ( c h 2 ) 4 j 第一章绪论 硫辛酸是1 9 3 7 年发现于土豆中的能促进细菌生长的因子，1 9 5 1 年r e a dl 从1 0 吨牛肝中分离出3 0 m g 并被命名为硫辛酸，1 9 8 9 年被确定为一种活性很强 的抗氧化剂。由于硫辛酸具有特殊的结构，使得它可以进入细胞的脂质和水质部 分，这样大大增强了它清除任何部位自由基的作用，而且它可以使维生素c 、e 、 谷胱甘肽等重生。因此，硫辛酸在细胞保护、清除自由基、抗氧化等方面具有广 泛的作用，作为一种新型抗氧化剂同益受到重视。 1 5 课题研究内容 综上所述，过亚硝酸根( o n 0 0 3 是一种在生物体内由巨噬细胞、噬中性粒细 胞和内皮细胞产生的氧化剂，o n o o 的形成是n o 和0 2 产生细胞毒性的重要机 制之一。较其它自由基如羟自由基来说，过亚硝酸根的存在时间长，性质活泼且 易于扩散，因此被认为是造成氧化损伤的重要原因之一。筛选能够抑制过亚硝酸 根对d n a 损伤的有效天然产物，从而达到预防相关疾病的目的将具有重要的意 义。本论文基于以上所述，主要进行以下方面研究： ( 1 ) 过皿硝酸盐溶液的制备 由于过亚硝酸根性质活泼，无市售产品，所以在比较各种过亚硝酸根制备方 法的基础上，采用亚硝酸异戊酯与过氧化氢两相法合成过亚硝酸盐溶液，用二氧 化锰催化去除溶液中未反应的过氧化氢，并研究不同温度条件下，过亚硝酸根的 生成量与反应时间的关系，探讨了用粉末状二氧化锰处理未反应过氧化氢的最适 条件； ( 2 ) 过亚硝酸根对脱氧鸟苷的损伤 模拟生理条件( p h7 4 ，3 7 。c ) ，以脱氧鸟苷为研究对象，采用高效液相色谱 电化学检测器( h p l c e c d ) 测定过亚硝酸根对脱氧鸟苷的修饰产物8 羟基脱氧 鸟苷，研究不同浓度的过亚硝酸根对其修饰作用的规律； ( 3 ) 不同抑制剂的抑制效果 针对过亚硝酸根对脱氧鸟苷造成的损伤，选择槲皮素、黄酮、d 萘基黄酮、 咖啡酸、谷胱甘肽、维生素c 、硫辛酸七种抑制剂，通过测定8 一羟基脱氧鸟苷生 成量来研究不同浓度的抑制剂对此类脱氧鸟苷损伤的抑制效果。 第二章碱性过亚硝酸盐溶液的制备 第二章过亚硝酸盐溶液的制备 2 1 过亚硝酸盐溶液制备方法及测定方法 2 1 1 过亚硝酸盐溶液制备方法 出于过亚硝酸根性质活泼、易分解，目前尚无稳定的过亚硝酸盐产品，一般 实验所用的过亚硝酸根溶液根据需要通过不同的合成方法制备所得。因此在研究 过亚硝酸根对脱氧鸟苷的损伤实验中，准确合成稳定的过亚硝酸盐溶液是非常重 要的。 以下常见的过亚硝酸盐溶液的制备方法： ( 1 ) 亚硝酸盐和过氧化氢反应制备o n o o 。 h n 0 2 + h 2 0 2 一h o o n o + h 2 0 ( 2 1 ) 1 9 3 5 年g l e u l 与r o e l l 2 1 发现在亚硝酸与过氧化氢作用形成硝酸的过程中也有 o n o o 。的生成。o n o o 一直被认为是亚硝酸与过氧化氢作用形成硝酸的中间产 物。直到1 9 6 8 年，h u g h e sm n 等人【5 1 l 发现o n o o 。在p h = 9 1 1 的条件下可稳定存 在，并利用亚硝酸钠与过氧化氢溶液( 含氢氧化钠) 反应制备出碱性过亚硝酸盐 溶液。1 9 7 4 年，a n i c ew r e e d ，h a n s e lh 和w i l l i 锄l j o l l y 5 2 1 采用t 形管来控制亚 硝酸钠、过氧化氢、氢氧化钠三种溶液的流速，使o n o o 。的产率得到进一步的提 高。后来b a c k m a n 等人采用在淬灭流动反应器制备，淬灭流反应器与计算机控制 的注射泵相连，严格控制溶液流速，过亚硝酸盐的浓度达至r j l 7 0 1 8 5 m m 。 在过亚硝酸与生物大分子的研究中，常采用这种方法制备过亚硝酸根。但在 溶液中除含有未反应的过氧化氢外，还含有亚硝酸钠以及由过亚硝酸分解产生的 硝酸根。对大多数研究来说，硝酸根的影响不大，但亚硝酸盐常常干扰过亚硝酸 反应的研究。未反应的过氧化氢可以用二氧化锰催化法去除，亚硝酸根则难以除 去，会影响实验结果。 ( 2 ) 臭氧与叠氮化钠反应制备o n o o 。 第二苹碱性过亚硝暇盐沼顺的制备 1 9 2 9 年，g l e u l 与r o e l l 1 1 发现当臭氧通入叠氮化物水溶液时，有过亚硝酸根 的生成。1 9 9 4 年，w i l l i a m a p r y o r 等a 5 3 】对此进行了深入的研究，采用臭氧发生 器，将生成的臭氧充入预先用n a o h 调p h 值为1 2 的0 1 m o l ln a n 3 溶液，可制 备出稳定的过亚硝酸盐溶液。此溶液中含有少量过氧化氢及痕量的n a n 3 。 n 3 。+ 0 3 一n o o 。+ n 2 0 n o o + 0 3 一o n o o 。+ 0 2 ( 2 - 2 ) ( 3 ) 亚硝酸酯和过氧化氢反应制备 1 9 9 3 年j r a m 6 nl e i s 等a t 5 4 1 对亚硝酸烷基酯的亲核性进行研究时提出这种新 的制备方法。他们利用亚硝酸烷基酯亚硝基基团的强亲核性( 如2 亚硝酸乙氧乙 烷酯) 直接与过氧化氢反应生成o n 0 0 一。 r o n o + h o o ，r o h + o n o o ( 2 3 ) 1 9 9 5 年r a om u p p u 与w i l l i a m a p r y o r 5 5 j 在r a m 6 nl e i s 等人工作的基础上， 首次用两相体系来制备过亚硝酸盐，其机理过氧化氢阴离子( 水相) 在亚硝酸异 戊酯( 有机相) 上的取代反应。产物过亚硝酸盐仍留在水相中，而异戊醇和未反 应的亚硝酸异戊酯形成新的有机相。 h o o 。+ o nor + h o o n o + r o 。 h o o n o 芊= 圭o o n o + h + r o 。+ h + f 当r o h ( 2 4 ) 相对于其它制备方法，此制备方法得到的过亚硝酸盐浓度最高。 ( 4 ) 羟胺的氧化反应 1 9 6 3 年，g y a g i l - 与m a n b a r 5 6 1 将氧气通入n h 2 c l 碱性溶液后，反应大约半小 时可测到有过亚硝酸根的生成。 2 n h 2 0 h 骂n h ，+ n o - + 2 h 2 0 n o - + 0 2 _ o n o o 一 ( 2 5 ) ( 5 ) 仿生合成法制备 1 9 9 0 年，b e c k m a n 等人提出：在生物体内，n o 可与0 2 。生成o n 0 0 。根据 此原理，在1 9 9 4 年，d s c o t tb o h l e 等人5 7 1 提出过亚硝酸根的仿生制备法。在液氨 的条件下，四甲基铵过亚硝酸盐与一氧化氮反应生成深橘黄色的过亚硝酸盐溶 液。 4 第二章碱性过哑硝酸盐溶液的制各 n h 3 ( 1 ) ( m e 4 n ) ( 0 2 ) + n o 当( m e 4 n ) ( o n o o ) ( 2 6 ) 1 9 9 8 年，g m a r k 等人【5 8 】发现用频率为3 2 1 k h z 的超声波振荡充气水溶液时，有 o n o o 一生成，他们提出的反应机理是： 0 2 卜2 0 n 2 + o - 呻n o + n n o + 0 2 + o n 0 0 。( 2 - 7 、 ( 6 ) k n 0 3 的光固化分解反应 19 6 4 年，p 印e 和p e t r i c o n i 等人5 9 1 发现，过亚硝酸盐是紫外光照射n 0 3 n n # 解产物。1 9 9 1 年，r o b e r tc 等人1 6 0 1 根据前人的研究成果提出可能存在固态过亚硝 酸盐。 n 0 3 。+ hv o n 0 0 ( 2 _ 8 ) 本论文主要是研究过亚硝酸根对脱氧鸟苷的损伤及对其的抑制作用，亚硝酸 盐、臭氧及过氧化氢都可对脱氧鸟苷造成损伤，所以选择制各方法要求制各所得 的过亚硝酸溶液含杂质少、浓度高。以下是各种方法的比较： 方法比较 此方法是比较传统的过亚硝酸溶液制备方法，溶液中有 ( 1 ) 少量的亚硝酸根无法除去。 ( 2 )反应物臭氧、叠氮化钠有毒，溶液中有少量臭氧。 ( 3 )反应操作简单，但溶液中存在未反应完全的过氧化氢 ( 4 ) ( 5 ) ( 6 )这三种方法侧重研究过亚硝酸根形成，未考虑其应用。 根据以上分析，本课题选用方法( 3 ) 即亚硝酸异戊酯与碱性过氧化氢反应制 备过亚硝酸盐溶液。溶液中未反应完全的过氧化氢将采用粉末二氧化锰除去。对 粉末二氧化锰除过氧化氢的反应条件将做深入的研究，以确定最适处理条件，使 所制备的过亚硝酸盐溶液杂质含量少、过亚硝酸根损耗小。 第二章碱性过砸硝酸盐挤液的制备 2 1 2 过亚硝酸根的检测方法 在过亚硝酸盐溶液的合成实验中，通常采用紫外可见分光光度计测定过亚 硝酸根的浓度。过亚硝酸根在3 0 2 n m 附近有特征吸收峰，其摩尔吸光系数为1 6 7 0 + 5 0 m 1 啪1 ( 此系数用电位滴定法测定) 1 5 t , 5 6 , 1 。 2 2 过亚硝酸根制备的实验方案 采用亚硝酸异戊酯( 有机相) 与碱性过氧化氢( 水相) 两相法制各碱性过亚硝酸 盐溶液。本论文研究不同反应温度条件下，过亚硝酸盐的生成浓度，探求最优的 反应条件；过亚硝酸盐溶液中含有未反应的过氧化氢，利用二氧化锰催化法除去， 过亚硝酸盐的损失率、过氧化氢的除去率与二氧化锰的用量、反应时间有关，通 过正交实验得出最适反应条件。 2 2 1 实验原理 采用两相体系来制备过亚硝酸盐溶液，其反应机理是过氧化氢阴离子( 水相) 在亚硝酸异戊酯( 有机相) 上的取代反应( 见公式2 4 ) 。产物过亚硝酸盐仍留 在水相中，而异戊醇和未反应的亚硝酸异戊酯形成新的有机相，经过分液、萃取 得到含有过氧化氢的碱性过亚硝酸赫溶液；再利用二氧化锰做催化剂( 见公式 2 9 ) ，使过氧化氢分解，得到杂质含量少的碱性过亚硝酸盐溶液。 反应机理： h o o + o nor + h o o n o + r o 。 h o o n oi = 兰o o n o + h + ro+h+寻2圭roh(2-4) 过氧化氢分解原理： 2 h 2 0 2 斗h 2 0 + 0 2 ( 2 9 ) 高锰酸钾滴定法是标定过氧化氢浓度常用的方法，但其灵敏度较低，所以本 课题采用a b t s 法6 1 ，6 2 1 ( 中文名称：2 , 2 连氮基- - ( 3 苯乙噻唑啉6 磺酸) 二胺盐) ， 英文名称：2 ，2 一a z i n o b i s ( 3 一e t h y l b e n z t h i a z o l i n e 一6 一s u l f o n i c ) d i a m m o n i u ms a l t ，分子 式：c 1 8 h 1 8 n 4 0 6 s 4 ( n h 3 ) 2 ) 测定过氧化氢的浓度。在辣根过氧化物酶的催化下， 第二章碱性过亚硝酸盐溶液的制各 a b t s 可被过氧化氢氧化生成a b t s + 。用紫外一可见分光光度计测定时，a b t s + 在4 2 0 n m 有特征吸收峰，其摩尔吸光系数为3 6 8 0 0 m _ 1 c m 。 反应机理如下