（环境科学专业论文）运用热带爪蟾xenopus+tropicalis胚胎检测污染物的发育毒性.pdf

s c h o o la n dd e p a r t m e n t ： s c h o o lo fr e s o u r c e sa n de n v i r o n m e n ts c i e n c e s p e c i a l i z a t i o n m a j o r i n s u p e r v i s o r e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e 壁q ! q 蚤i 堡q ! q g y p o s t g r a d u a t e 曼ij 坠垒旦q i 垒堕 m a y , 2 0 1 0 华东师范大学学位论文原创性声明 郑重声明：本人呈交的学位论文龆取慷i 枷咿5t 竹泐幺) 砖繇弛灿旧绰墉硇簋鸯挝 是在华东师范大学攻读恧孟博士( 请勾选) 学位期间，在导师的指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或 撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说 明并表示谢意。 作者签名：继殛邋日期：函7 p 年岁月弓d 日 华东师范大学学位论文著作权使用声明 础：孵维o 纬呼晒t 功p 协脚脚# 磊驯污溯伤拉嫡丕悝系本人在华东师范大学攻读 学位期间在导师指导下完成的硕博士( 请勾选) 学位论文，本论文的研究成果归华东 师范大学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此学位论文，并向主管 部门和相关机构如国家图书馆、中信所和“知网”送交学位论文的印刷版和电子版；允 许学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅、借阅；同意学校将学位论文加入 全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版， 采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) () 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部”或“涉密”学位论文幸， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( 力2 不保密，适用上述授权。 导师签名 本人签名廖聋面姻 年岁月弓秒同 “涉密”学位论文应是已经华东师范大学学位评定委员会办公室或保密委员会审定过的学位 论文( 需附获批的华东师范大学研究生申请学位论文“涉密”审批表方为有效) ，未经上 述部门审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用 上述授权) 。j 答辩日期：2 0 1 0 5 2 3 垡匦妲硕士学位论文答辩委员会成员名单 摘要 胚胎致畸实验是检测污染物发育毒性的有效方法，用胚胎实验代替个体实验 也是今后毒性检测和毒理学研究的趋势。爪蟾胚胎致畸实验( f e t a x ) 已被广泛应 用于污染物和环境样品毒性效应的检测。本论文将利用爪蟾胚胎模型，建立基于 污染物作用模式的发育毒性检测方法。 首先，用硫酸铜和氯化镉对热带爪蟾( x e n o p u st r o p i c a l i s ) 胚胎进行4 8h 暴露。 结果显示，0 0 2 5 4 ) 8m g l - 1 c u 2 + 和0 0 5 6m g - l - 1 c d 2 + 能导致胚胎眼睛、嘴巴、肠 道和尾巴等多个部位产生多种畸形，热带爪蟾对污染物的灵敏性与非洲爪蟾胚胎 相当。 其次，用典型的脱碘酶抑制剂碘番酸( 1 0 p ) 对热带爪蟾胚胎分别进行2 4h 暴 露。结果显示，0 5 5m g l 1 i o p 能引起爪蟾胚胎眼睛色素的减少、眼睛变形、甚 至消失等现象。尽管甲状腺激素t 3 对热带爪蟾胚胎的发育没有影响，但t 3 的加 入使i o p 对胚胎的致畸作用增强，这表明i o p 对爪蟾胚胎眼睛的致畸作用可能 与甲状腺激素信号介导有关。 再次，用已知的甲状腺激素干扰物四溴双酚a ( t b b p a ) 对热带爪蟾胚胎进行 4 8h 的暴露。结果显示，o 0 1 1m g l - 1t b b p a 能引起胚胎眼睛畸形、围心腔水 肿、泄殖腔拉长和尾鳍变窄等多种畸形现象。与i o p 类似，加入t 3 能增加t b b p a 对胚胎的致畸作用。 最后，将热带爪蟾胚胎暴露于典型的胚胎致畸剂全反式视磺酸( 凡吣中4 8h 。 结果显示，2 5 0 肛g l - 1 r a 能引起爪蟾胚胎眼睛畸形、脑缩小、头尾轴蜷曲和卵 黄囊吸收不完全等现象，其表型特征与i o p 或t b b p a 有较大差异。 由此可见，新的模式动物热带爪蟾在胚胎致畸实验中可以取代非洲爪蟾，不 同污染物引起的胚胎畸形特征不同，这为污染物致畸机制的解析提供了形态学依 据。因此，本研究表明通过对现有f e t a x 实验方案的改进，可以将热带爪蟾胚 胎发展为基于作用模式分析的污染物发育毒性检测模型。 关键词：爪蟾胚胎致畸实验；热带爪蟾( x e n o p u st r o p i c a l i s ) ；发育毒性；碘番酸 ( i o p ) ；四溴双酚一a ( t b b p a ) , 全反式视磺酸( r a ) a b s t r a c t t h ee m b r ) r ot e r a t o g e n e s i sa s s a yi sav a l i dm e t h o dt od e t e c tt h ed e v e l o p m e n t a lt o x i c i t yo f c o n t a m i n a n t s i ti sat r e n dt ou s ee m b r y o st ot a k ei n s t e a do fi n d i v i d u a l si nt h et e s to ft o x i c i t ya n d r e s e a r c ho ft o x i c o l o g yi nt h ef u t u r e t h ef o r ge m b r y ot e r a t o g e n e s i sa s s a y - x e n o p u s ( f e t a x ) h a s b e e nw i d e l yu s e di nt h ed e v e l o p m e n t a lt o x i c i t yt e s to f c o n t a m i n a n t sa n de n v i r o n m e n t a ls a m p l e s i nt h i sp a p e r , am o d eo fa c t i o n - b a s e dd e t e c t i o nm e t h o dw o u l db eb u i l tu s i n gx e n o p u st r o p i c a l i s e m b r y o s f i r s t l y , x e n o p u st r o p i c a l i se m b r y o sw e ee x p o s e dt o 0 0 2 5 - - 0 8m g l - 1c u 2 + a n d0 0 5 - 6 m g l 1c d “f o r4 8h o u r s m a l f o r a m t i o n sw e r ef o u n di nm u l t i p l eo r g a n s ，i n c l u d i n ge y e s ，m o u t h s ， g u t sa n dt a i l s t h es e n s i t i v i t yo f x t r o p i c a l i st ot h ec o n t a m i n a n t si ss i m i l a rt ot h a to f x 1 a e v i s s e c o n d l y , 丑t r o p i c a l i se m b r y o sw e r ee x p o s e dt oat y p i c a ld e i o d i n a s ei n h i b i t o r , i o p a n o i ca c i d ( i o p ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a t0 5 5m g l 1i o ps i g n i f i c a n t l yi n d u c e dh y p o p i g m e n t a t i o ni ne y e s ， a b n o r m a ls i z ea n de v e na b s e n c eo fe y e s t 3s h o w e dn oe f f e c to nt h ed e v e l o p m e n to fe m b r y o s ，b u t i ts i g n i f i c a n t l ye n h a n c e di o p - i n d u c e dt e r a t o g e n i ce f f e c t s t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h y r o i d h o r m o n es i g n a lm i g h tb ei n v o l v e di nt h ei o p - i n d u c e dt e r a t o g e n s i s t h i r d l y xt r o p i c a l i se m b r y o sw e r ee x p o s e dt ot e t r a b r o m o b i s p h e n o l - a ( t b b p a ) f o r4 8h t h er e s u l t ss h o w e dt h a t0 0 1 1m g l - 1t b b p ai n d u c e da b n o r m a le y e s ，s k i nh y p o p i g m e n t a t i o n ， e n l a r g e dp r o c t o d a e u m ，n a r r o wf i n sa n dp e f i c a r d i a le d e m a s s i m i l a r i l y , t 3s i g n i f i c a n t l ye n h a n c e d t b b p a i n d u c e dt e r a t o g e n i ce f f e c t s f i n a l l y ，xt r o p i c a l i se m b r y o sw e r ee x p o s e dt o2 5 0 【g l 1a l l t a n sr e t i n o i ca c i d ( r a ) f o r 4 8 h r ai n d u c e da b n o r m a le y e s ，r e d u c t i o ni nb r a i na n db e n tn o t c h o r d t h e s em a l f o r m a t i o sw e r e g r e a t y ld i f f e r e n tf r o mt h o s ei n d u c e db yi o p o rt b b p a i nb r i e f , n e wa n i m a lm o d e lx t r o p i c a l i sc a nt a k ei n s t e a do f 盖l a e v i si nf e t a x d i f f e r e n t c o n t a m i n a n t si n d c u e dd i f f e r e n tm a l f o r m a t i o n s ，w h i c hp r o v i d st h ec l u e st or e v e a lt h em e c h a n i s m s o ft e r a t o g e n s t h e r e f o r e 疋t r o p i c a l i se m b r y o sc a nb ed e v e l o p e da sam o d ea c t i o n - b a s e dd e t e c t i o n m e t h o do fd e v l o p m e n t a lt o x i c i t yi ff e t a xi sf u r t h e rm o d i f i e d k e yw o r d s ：f e t a x ；x e n o p u st r o p i c a l i s ；d e v e l o p m e n t a lt o x i c i t y ；i o p a n o i ca c i d ( 1 0 p ) ； t e t r a b r o m o b i s p h e n o l - a ( t b b p a ) ；a l l t a n sr e t i n o i ca c i d ( 黜q 目录 摘要i a b s t r a c t i i 缩略词3 第一章绪论4 第一节污染物的发育毒性及其作用机制4 第二节检测污染物发育毒性的方法5 第三节污染物对两栖类的影响1 0 第四节环境甲状腺激素干扰物1 1 第五节甲状腺激素在两栖类胚胎中的作用1 5 第六节本论文的研究目的、内容和意义1 6 第二章铜和镉对热带爪蟾胚胎的发育毒性1 8 第一节前言1 8 第二节材料与方法1 9 第三节结果2 2 第四节讨论2 5 第三章碘番酸( i o p ) 对热带爪蟾胚胎的发育毒性2 7 第一节前言2 7 第二节材料与方法2 8 第三节结果2 9 第四节讨论3 4 第四章四溴双酚a ( t b b p a ) 对热带爪蟾胚胎的发育毒性3 6 第一节前言3 6 第二节材料与方法3 7 第三节结果。3 8 第四节讨论4 5 1 第五章视磺酸( r a ) 对热带爪蟾胚胎的发育毒性4 7 第一节前言4 7 第二节材料与方法4 7 第三节结果4 9 第四节讨论5 4 第六章运用热带爪蟾研究污染物的发育毒性及其作用机制5 6 第一节热带爪蟾胚胎在检测污染物发育毒性中的应用5 6 第二节污染物影响爪蟾胚胎发育的作用机制6 1 第三节基于作用模式分析的污染物发育毒性检测模型6 4 第四节展望6 7 参考文献6 8 硕士在读期间发表的论文8 1 硕士在读期间发表的会议报告8 1 硕士在读期间参与的主要科研项目8 2 致谢8 3 2 缩略词 3 第一节污染物的发育毒性及其作用机制 1 1 污染物的发育毒性 外源化学物质对胚胎发育、胎仔发育以及出生幼仔发育的有害作用，即为发 育毒性( d e v e l o p m e n t a lt o x i c i t y ) 。具体表现可分：( 1 ) 生长迟缓，即胚胎与胎仔的发 育过程在外来化合物影响下，较正常的发育过程缓慢；( 2 ) 致畸作用，由于外来 化合物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常；( 3 ) 功能不全 或异常，即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常；( 4 ) 胚胎或胎仔致死作用，某些外来化合物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育 期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。在一般情况下，引起胚胎或胎仔 死亡的剂量较致畸作用的剂量为高，而造成发育迟缓的剂量往往低于胚胎毒性作 用剂量，但高于致畸作用的剂量。 动物的发育不良、发育畸形等现象都是由于环境污染物的毒害作用引起的。 重金属、有机农药、有机试剂等污染物对胚胎都有一定的致畸作用，高浓度下可 导致生物死亡。杨宵霖等( 1 9 9 7 ) 等对铅污染区和对照区的产妇作随机抽样的调查 发现，污染区胎儿的成活率、成活婴儿的出生体重及其孕周等，均明显低于对照 区。这表明，铅污染已对污染区的产妇及其子代造成了严重的危害。污染区产妇 的自然流产率较高，说明高度流产率是铅胚胎毒性的一个重要特点。靳洪涛等 ( 2 0 0 8 ) 研究表明，二嗯英类化合物对斑马鱼的胚胎具有发育毒性，能引起斑马鱼 胚胎下颌发育短小、神经元缺失、抑制总主静脉退化、抑制红细胞生成、心脏形 态和功能缺陷、血液循环障碍和水肿，最终致死。而高浓度的四溴双酚一a ( t b b p a ) 可引起斑马鱼胚胎发育畸形，并导致胚胎死亡率显著升高。 1 2 污染物致畸作用机制 胚胎发育的分子基础是亲代全套遗传基因在时空上的有序选择性激活、转录 和翻译。在基因表达过程中，某些环节如受内外环境的影响而发生改变超过胚胎 本身生理耐受阈值时就可导致其整体性调控失衡，最终导致某些组织器官发育异 常。d u a n 等( 2 0 0 8 ) 研究表明，五氯酚可造成斑马鱼胚胎心脏水肿、孵化延迟及 4 尾部畸形。其作用机制可能是五氯酚影响斑马鱼胚胎发育b m p 信号，e r k 通路、 f g f 信号、n o d a l 信号等信号通路中一些关键基因的表达。吴兆毅等( 2 0 0 9 ) 研究 表明，五氯酚可能通过s m a d 蛋白( s m a d 5 和s m a d 2 ) 影响了b m p 和n o d a l 信号 通路，或通过生长因子关键基因f g 8 影响e r k 通路及其下游转录因子的表达， 从而导致发育毒性。t s u t s u i 等( 2 0 0 0 ) 研究表明，双酚a ( b p a ) 可诱导叙利亚地鼠 ( s y r i a nh 锄s t e r ) 胚胎细胞的转化和非整倍体的形成，从而影响胚胎的发育。 环境中有很多化合物能干扰生物体内维持白稳及调节发育过程中激素的产 生、释放、代谢、结合、排泄等过程，这类化合物称为环境内分泌干扰物( e d c s ) 。 目前对e d c s 研究比较多的是环境雌激素和甲状腺激素干扰物，污染物有可能是 由于干扰了母体内性激素和甲状腺激素等内分泌激素的分泌、合成和代谢等过 程，从而影响胚胎的发育，导致胚胎发育畸形。卞倩等( 2 0 0 4 ) 研究表明，烷基酚 类化合物具有内分泌干扰活性的环境信号，对哺乳动物与水生生物的生殖与发育 造成了不同程度的影响。辛基酚在大鼠体内的连续暴露，结果表明可引起性分化 异常、生殖激素分泌失调、生殖器官重量改变、生殖道发育抑制、妊娠丢失等广 泛的生殖毒效应和发育毒效应。 第二节检测污染物发育毒性的方法 2 1 污染物发育毒性的检测方法 发育毒性试验方法很多，总的来说可以分为体内实验和体外实验，体内实验 的方法主要有饮水染毒法、腹腔注射法以及气态吸入法。体外实验根据方法复杂 性的增加可大致分为3 种类型：细胞培养、器官培养和胚胎培养( d a s t o n ，1 9 9 6 ) 。 ( 1 ) 细胞培养就是指从体内组织取出细胞模拟体内出现环境，在无菌、适当温度 及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养。 根据化学物是否有抑制集落形成( 与细胞分化、转移、迁徙、粘附、通讯等有关) 检测有无致畸作用这一原理，先后建立了小鼠、大鼠肢芽细胞和中脑细胞微团等 培养方法，从目前的应用情况看，大鼠肢芽细胞和中脑细胞微团培养可用于潜在 的致畸性研究，可作为发育毒性的选择项目之- - ( d a s t o n ，1 9 9 6 ) ；( 2 ) 器官培养是 指将活体器官或一部分器官取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结 5 构和功能特征的培养，其特点是培养的器官在合适的条件下能生长和分化。如将 非洲爪蟾蝌蚪的尾巴取出进行培养；( 3 ) 胚胎培养，就是将胚胎从受精卵到器官 形成期不同阶段在体外进行培养，如斑马鱼胚胎和爪蟾胚胎培养。 传统的发育毒性体内实验方法耗时费力，且需要消耗大量的实验动物，因此 建立设计科学、简便易行的体外发育毒性筛选实验模型成为研究的热点，通过早 期对受试物进行高通量的筛选，可以大幅度提高化学物的研发效率。近年来，经 过广泛的应用和研究，欧洲替代方法研究中，l , ( e c v a m ) 推荐了有效性较高的3 个体外发育毒性筛选实验，即体外全胚胎培养试验、胚胎细胞微团培养试验和胚 胎干细胞试验作为体外筛选的首选方法。除了作为体外筛选试验外，上述方法还 可应用于发育毒性发生机制的研究，通过与整体动物试验相结合，提供有价值的 毒性作用资料，并间接减少了所用动物的数量( f l i c ka n dk l u g ，2 0 0 6 ) 。 生命的早期发育阶段对污染物的反应往往比较敏感，如污染物能引起胚胎的 畸形发育，而胚胎致畸实验也被广泛地应用于污染物发育毒性的检测。其中，在 淡水动物中，斑马鱼胚胎致畸实验是国内外普遍采用的方法，在两栖类动物中， f e t a x 实验已被广泛应用于检测污染物的发育毒性。 2 2 斑马鱼胚胎实验模型的应用 斑马鱼( b r a c h y d a n i or e r i o 或d a n i or e r i o ) 是常见的暖水性( 2 1 , - - - - 3 2 。c ) 观赏 鱼，鲤科，个体d , ( 4 - - - 5 c m ) ，常年产卵，鱼卵易收集，而且小规模饲养技术简单。 主要根据s c h u l t e 等( 1 9 9 4 ) 的研究来设计试验，选用2 4 孔细胞培养板作为染毒 试验容器，倒置显微镜观察。胚胎发育直至孵化的7 2h 内可以观察到近2 0 种 不同表现的反应指标( 表1 ) ( s t r m a ca n db r a u n b e c k ，1 9 9 9 ) 。 经济合作与发展组织( o e c d ) 在1 9 9 8 年将此方法列入测定单一化学品毒性 的标准方法之一，并制定了详细的操作指南( o e c d ，1 9 9 8 ) 。此后，该项技术广泛 应用于环境科学研究，尤其用于对生态环境乃至人类安全影响深远的化学物质的 毒性和致畸性的测定( l e e u w e ne ta 1 ，1 9 9 0 ) 。d a v e 等( 1 9 8 7 ，1 9 9 1 ) 用斑马鱼胚胎致 畸实验检测了c d 、p b 、c u 等重金属的发育毒性，除此之外，此实验还可广泛用 于有机农药、有机试剂、多元混合物等污染物的发育毒性( 朱琳，2 0 0 2 ) 。 6 表l 斑马鱼胚胎致畸试验中可以观察的毒理学终点( 引自s t r m a ca n db r a u n b e c k , 1 9 9 9 ) t a b l e1 t o x i c o l o g i c a le n d p o i n t so b s e r v e di nz e b r a f i s he m b r y o st e r a t o g e n i ct e s t 染毒时间( h )毒理学终点( t o x i c o l o g i c a le n d p o i n t s ) 卵凝结( c o a g u l a t e de g g s ) 囊胚发育( d e v e l o p m e n to fb l a s t u l a ) 外包活动阶段( s t a g eo fe p i b o l i em o v e m e n t ) 原肠胚停止( t e r m i n a t i o no fg a s t r u l a t i o n ) 胚孔关闭( c l o s i n go fb l a s t o p o r u s ) 体节数( n u m b e ro fs o m i t e s l 尾部延展( e x t e n s i o no ft a i l l 2 0 s 内主动活动( s p o n t a n e o u sm o v e m e n t s w i t h i n2 0s e e ) 眼点发育( d e v e l o p m e n to ft h ee y e ) 心跳、血液循环( s t a r t i n go fh e a r t b e a ta n dc i r c u l a t i o n ) 黑素细胞、耳石的发育( d e v e l o p m e n to fm e l a n o c y t e sa n do t o l i t h ) 心律( r a t eo fh e a r t b e a t ) 孵化率和畸形率( r a t eo fh a t c h e da n dm a l f o r m e de g g ) 2 3 爪蟾胚胎致畸实验( f e 吖) 简介 2 0 世纪8 0 年代早期，d u m o n t 等建立了f e t a x ( t h ef r o ge m b r y o t e r a t o g e n e s i sa s s a y - x e n o p u s ) 实验方法( d u m o n te ta 1 ，1 9 8 3 ) ，后来经过美国试验 和材料协会( a s t m ) 标准化，作为一个可供选择的发育毒性筛选试验，用来确定 一些化学物质的相关发育毒性影响。 非洲爪蟾( x e n o p u sl a e v i s ) 是进行f e t a x 实验的实验动物，作为发育生物学 中最重要的模式动物，它具有饲养管理相对简单、生长周期短、产卵量大，一年 四季均可人工诱导排卵，胚胎大且易于观察等特点，近年来在生态毒理学中也被 广泛运用，主要用于早期胚胎发育和细胞生物学的研究。自上世纪9 0 年代初， 国外就开始运用非洲爪蟾胚胎开展污染物的发育毒性检测，其方法就是将发育期 处于n f 8 1 1 阶段的爪蟾胚胎置于受试液中暴露4 天，通过检测胚胎死亡率、 畸形率和致畸指数等指标来评价化学品的发育毒性这一方法被称为非洲爪蟾胚 胎致畸实验( f e t a x ) ( f o r te ta 1 ，1 9 9 6 ) ，其具体方法见表2 。 7 4 8 抱 垢 斟 弘 铝 仫 表2f e t a x 实验方法 t a b 2t h em e t h o do ft h ef o r ge m b r y ot e r a t o g e n e s i sa s s a y - x e n o p u s 参数 条件 实验类型 温度 光量 光周期 实验容器的大小 实验溶液体积 实验溶液的更新 测试生物的人小 每个处理组平行样个数 每个容器生物数量 每个处理组生物数量 随机取样的测试容器 实验时间 评价终点 实验可接受性 静态更新 2 4 5 0 5 周围实验室光照 1 2h 白天1 2h 黑夜 2 5 m l 1 0 m l 平行样 2 4h 小细胞囊胚期( 第8 和9 阶段) 空白对照4 个；测试物质2 个 2 0 个 阴性对照8 0 个；测试物质4 0 个 在培养箱中随机放置 达到4 6 阶段( 9 6h ) 存活率，畸形，生长( 体长) 对照组死亡率畸形率= 1 0 近十年来各国多个实验室的研究证实，f e t a x 试验作为一个可供选择的发 育毒性筛选试验非常具有前途，它比使用传统的哺乳动物作为发育毒性研究的受 试生物更能节约动物数量、时间和资金( f o r te ta 1 ，1 9 9 6 ；p i e t r oa n dl i n o ，2 0 0 1 ) 。 这一试验可用来研究化学物质在生物体中转化、解毒和作用机$ i j ( f o r t e la 1 ，1 9 9 8 ； d o u g l a se ta 1 ，2 0 0 1 ) ；还可作为肢体发育的模型，评价化学物质对生物的激素影 响( c a s s a n d r ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 以及评价微量必须营养元素的缺乏以及痕量元素的毒性 等( f o r te ta 1 ，1 9 9 9 a ，b ) 。 虽然f e t a x 实验具有以上一些优点，本世纪初，美国e p a 也试图将f e t a x 发展为一种发育毒性的常规检测方法，但评估的结果表明，f e t a x 实验并不比 其它水生动物和两栖类胚胎致畸实验的灵敏性高。h o k e 等( 2 0 0 5 ) 将f e t a x 实验 的死亡和畸形数据与脊椎动物和鱼类急性毒性实验数据相比，其结果表明，除了 8 对铝检测之外，对其他环境污染物的检测f e t a x 实验敏感性不高。对于铝的检 测，虽然，与其它水生生物的急性毒性实验相比，f e t a x 实验的评价终点比较 敏感，但是与其它两栖类动物相比，f e t a x 实验敏感性不高。由于其它两栖类 动物和水生无脊柱动物的敏感性高于f e t a x 实验，因此f e t a x 实验在进行生 态风险评估中受到一定的限制。研究发现，对于金属的检测两栖类的敏感性要比 鱼类的强，然而，e p a 研究表明无脊柱动物( 如典型的甲壳类) ，对于金属来说是 最敏感的。 作为非洲爪蟾的近亲，热带爪蟾陇t r o p 七a l i s ) 具有个体更小，生长周期更短 ( 3 6 个月) ，产卵量更大( 2 0 0 0 3 0 0 0 个) 和基因组结构( 2 倍体) 更简单，胚胎发 育更快等优点( 表3 ) 。因此，热带爪蟾比非洲爪蟾更适合作为模式生物进行系列 研究。尤其是随着美国对热带爪蟾基因组计划的启动，其在各学科领域的应用将 日益广泛。 表3 非洲( x e n o p u sl a e v i s ) 和热带爪蟾陇t r o p i c a l i s ) 的生物特性 t a b 3b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fx 1 a e v i sa n d x t r o p i c a l i s 非洲爪蟾热带爪蟾 发育率( 完成f e t a x 的时间) 培养温度 染色体倍数 卵幼虫大小( 培养密度) 产卵量 转基因能力 到性成熟的时间 长期发育动力学的连贯性 4 天2 天 2 3 5 - + 0 5 四倍体 更大 2 6 5 - + 0 5 二倍体 更小 3 0 0 1 0 0 0 个 只1 0 0 0 3 0 0 0 个慑 适中到好 1 5 2 年 中等 好 4 6 个月 相当紧密 建立一套更长期实验( 包括生殖和生命周低到中等 相当高 塑塑笪) 盟堑垄 9 第三节污染物对两栖类的影响 自上世纪9 0 年代以来，全球两栖类动物种群衰退现象十分严重。世界自然 保护联盟发表的最新公报认为两栖类动物是当今世界上生存形势最为严峻的动 物群体( c o l l i n sa n ds t o r f e r , 2 0 0 3 ；s c h o f fe ta 1 ，2 0 0 3 ；s t u a r te la 1 ，2 0 0 4 ) 。化学污染 物被认为是引起两栖类种群衰退的重要原因之一。一些野外调查表明两栖类的畸 形现象的确与化学污染有关( m a n n e ta 1 ，2 0 0 9 ) 。近些年来，两栖类动物在全球范 围内急剧衰减甚至消失：3 4 种两栖类已经灭绝，8 8 种可能灭绝，至少4 3 的两 栖类物种经历了衰退( 于亚辉等，2 0 0 6 ) 。 两栖类动物数量的减少表明我们周围的环境正在恶化，这将会对人类和其他 生物造成威胁。目前认为可能引起两栖类动物种群衰退的原因有外来物种入侵、 种群的过度开发与利用、疾病传播、气候的变化、栖息地的减少等( h e r oa n d m o r r i s o n ，2 0 0 4 ；s t u a r te ta 1 ，2 0 0 4 ；周洲等，2 0 0 4 ) 。然而大量研究表明，两栖类物 种急剧下降主要与环境污染密切相关。环境污染物对两栖类动物的毒害是造成其 种群数量减少甚至灭绝的直接原因之一。已有研究表明，两栖类物种的衰减与除 草剂和杀虫剂等农药的使用有关( d a v i d s o ne ta 1 ，2 0 0 1 ；m a n ne ta 1 ，2 0 0 9 ) ，且在使 用农药和肥料的地方发现了许多畸形的两栖类动物( o u e l l e te ta 1 ，1 9 9 7 ；t a y l o re t a 1 ，2 0 0 5 ) 。西维i 园( c a r b a r y l ) 是氨基甲酸酯类农药的一种，其低浓度就能延缓两栖 类动物的变态过程，造成发育迟缓。m i z g i v e u v 等( 1 9 8 4 ) 研究发现，下水道污水 中的污染物阻碍了蟾蜍蝌蚪后肢软骨的发育，造成软骨细胞死亡，导致蝌蚪发育 畸形。调查发现美国明尼苏达地区某些池塘水和沉积物的提取液对两栖类胚胎、 幼体发育能产生不良影响，如导致非洲爪蟾肢体发育异常。 多年来对野生动物的研究表明，某些合成化合物和天然化合物能干扰内分泌 系统，如高氯酸盐、壬基酚、有机氯农药、滴滴涕( d d t ) 等污染物可以通过抑制 甲状腺激素的活性，从而阻碍蝌蚪的生长发育( f o r te la 1 ，2 0 0 4 a ；m o r t e n s e ne ta 1 ， 2 0 0 6 ；h ue ta 1 ，2 0 0 6 ) 。h a y e s 等( 2 0 0 2 ，2 0 0 6 ) 研究表明，阿特拉滓( a t r a z i n e ) 能影响 两栖类动物的性腺分化，导致生殖系统的发育异常，从而影响其后代的繁殖。 s o w e r 等( 2 0 0 0 ) 研究发现畸形组的青蛙脑内的促性腺激素释放素和雄激素含量远 远低于正常组。 综上所述，由于污染物影响了两栖类动物的生长发育、生殖系统发育、生存 1 0 环境等，从而导致其种群数量的大量减少。因此，研究污染物对两栖类的致畸作 用及其机制对揭示两栖类种群衰退的原因具有重要意义。 第四节环境甲状腺激素干扰物 越来越多的研究表明，环境中许多化学污染物可以影响生物体t h s 的合成、 分泌、运输、作用和代谢等过程，这类污染物被统称为甲状腺激素干扰物( t h y r o i d d i s r u p t i n gc h e m i c a l s ，t d c s ) ( b r o u w e r e ta 1 ，1 9 9 8 ；b o a se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。由于甲状腺 激素f i n s ) 在增强基础代谢和调节生物体生长发育等方面具有重要的作用，因此， 污染物导致的甲状腺干扰效应已引起人们的极大关注。目前，t d c s 已被认为是 继环境雌激素之后最重要的一类内分泌干扰物。 t d c s 的种类很多，如高氯酸盐、全氟磺酸化合物( p f o s ) 和三丁基锡( t b t ) 等都能导致甲状腺激素水平的失调( 刘青坡等，2 0 0 8 ；王蕾等，2 0 0 8 ) 。此外，环境 中一些与t h s 结构相似的卤代有机污染物也表现出明显的甲状腺激素干扰效应。 其中研究最多的是多氯联苯类化合物( p c b s ) ，p c b s 及其代谢产物可以干扰生物 体血清内t h s 的转运和t 3 与t r 的相互作用，并加速t h s 的代谢和排除。研究 发现污染物对甲状腺激素的干扰，既可以直接干扰甲状腺系统，主要包括对甲状 腺激素水平、甲状腺激素相关酶活性及甲状腺结构等的影响；同时，污染物又可 以通过干扰甲状腺系统而对甲状腺激素调节的重要生理过程如生长、繁殖和发育 等产生影响。因此必须建立相应的筛选方法，为各种化学污染物的健康风险提供 科学依据和技术手段。 4 1 污染物干扰甲状腺系统的作用机制 污染物干扰的靶位很多，对甲状腺激素合成、代谢、分泌等过程都能产生影 响。同时这些靶位包括促甲状腺素受体、碘化钠转移器的碘吸收、5 脱碘酶的 活性、转运甲状腺蛋白( t r r ) 、甲状腺受体( t r ) 等过程。c u n h a 等( 2 0 0 5 ) 和b o a s 等( 2 0 0 6 ) 6 综述7 t o c s 对哺乳动物的作用机制，b r o w n 等( 2 0 0 4 ) 的综述则介绍环 境中各类污染物对鱼类甲状腺系统产生的干扰效应。根据两栖类动物爪蟾t h s 系 统的特点和污染物对爪蟾的甲状腺激素干扰效应，结合现有的对哺乳动物和鱼类 的甲状腺激素干扰效应机制的研究，可以将污染物对爪蟾t h s 系统的干扰作用方 式归纳为以下几种主要方式。 4 1 1 干扰t h s 的合成 两栖类动物中碘的主要来源是食物和水，其幼体可以通过肠道或鳃从食物和 水中摄入碘离子，而且血清内的前血清蛋白与碘离子的结合能力较强，因此在两 栖类体内不易造成碘离子缺乏。但高氯酸盐等化合物能抑制甲状腺对碘吸收，继 而使得甲状腺激素合成减少，使得变态延缓，甲状腺肿大( t i e t g ee ta 1 ，2 0 0 5 ) 。此 外，甲状腺拮抗剂丙硫氧嘧啶( p t u ) 等污染物能通过抑制甲状腺过氧化物酶从而 阻止碘与甲状腺球蛋白( t 4 储存形式) 的结合，从而延缓非洲爪蟾幼体发育，导致 甲状腺肥大，胶质减少，上皮细胞增生和肥大( d e g i t ze ta 1 ，2 0 0 5 ) 。同时许多化学 抗氧齐t j ( g o i t r o g e n s ) ，如硫脲、硫脲嘧啶、磺胺药物等能抑制内生的甲状腺激素的 合成( d o d da n dd o d d ，1 9 7 6 ；b r o w n ，1 9 9 7 ) 。尽管它们的作用不同，但是它们都能 抑制甲状腺中甲状腺激素的合成，并且延缓变态。 4 1 2 干扰t h s 在血清中的转运过程 一些与t h s 结构相似的化合物能够与血清内运载t h s 的蛋白竞争性结合， 导致血清内游离的t h s 增多，加快t h s 的清除，血清t h s 水平下降( b r o u w e re ta 1 ， 1 9 9 8 ；i s h i h a r ae ta 1 ，2 0 0 3 ；b o a se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。此外，体外实验已经证明，部分溴 化阻燃齐i j ( b f r s ) 与t t r 有很强的结合能力( m e e r t s e ta 1 ，2 0 0 0 ) ，它们在体内可能 通过与血清中1 限的竞争性结合而干扰t h s 稳态。 4 1 3 干扰t h s 在肝脏等组织内的转化和清除 一些污染物可以通过影响t h s 代谢过程中的脱碘、硫酸化和葡萄糖苷化等 作用，干扰t h s 在体内的转化和清除过程。如金属离子c d 和p b 等能引起细胞 脂质过氧化，从而抑制肝脏组织内的脱碘酶( i d s ) 君l 硫酸基转移酶( s u l t ) i 撕性 ( g u p t aa n dk a r1 9 9 9 ；w a t a n a b ee ta 1 ，1 9 9 9 ) ；一些多卤代芳烃化合物( p 地姐s ) 能 够抑制t h s 的硫酸化过程( d u f f e le ta 1 ，1 9 8 1 ；s c h u u re ta 1 ，1 9 9 8 a ，b ) 。 4 1 4 干扰t 3 与t r 的相互作用 污染物能通过与t r 相结合、改变t r 磷酸化作用或其共调节蛋白相互作用 等方式来影响t 3 与t r 的结合和信号传递过程( b u c h h o l ze ta 1 ，2 0 0 6 ；t a b be ta 1 ， 2 0 0 6 ) 如双酚a ( b p a ) 能通过竞争性的与t r 结合，p c b s 能通过阻碍t r 视黄酸 x 受体复合物与应答因子( t r e ) 的结合，抑制t r 介导的转录过程( m o r i y a m a e t a l ， 2 0 0 2 ；k o i b u c h ie ta l ，2 0 0 6 ；m i y a z a k ie ta l ，2 0 0 4 ；) 。t b b p a 能抑制t 3 与甲状腺受 体结合( k i t a m u r ae ta l ，2 0 0 2 ) 。一直以来，污染物与t r 的作用被忽视。随着近 两年对多种污染物与t r 作用的证实，t r 介导被认为是t d c s 的一种新的作用 机制( t a b b e t a l ，2 0 0 6 ) 。 除以上提到的几类作用方式