（环境科学专业论文）运用爪蟾xenopus检测全氟辛磺酸pfos的甲状腺激素和性激素干扰效应.pdf

2009 届研究生硕士学位论文 学校代码 : 10269 学号: 51060802039 季束呻移犬 李 运用爪蟾( x e。 o p u s )检测全氟辛磺酸 (pfo s ) 的 甲状腺激素和性激素干扰效应 院系: 专业 : 研 究 方向: 指导 教 师 : 硕 士研 究 生 : 2009 年 5 月完 成 master t h e sis o f z o 0 9 p o stg radu ates eh o o l 5 id : 10 2 6 9 a ead em ie id : 5 1 0 6 0 80 2 0 3 9 吕 乡添4 肠 娜l 时 s creen in g t h y ro id h o rm o n e a n d s ex h o rm o n e d isru p tin g e ff eets o f p erf luorooctanesulf o n ate (p f o s) usin g xen op u s s eh o o l a n d d ep a rtm en t: d ep artm en t o f e n v iro nm弓 n tal s cien ee ， school ofr esourees and e nvironm ent seience speciali z ation旦塑些旦 旦 坦里丝 丛 迪 些 m ajor in卫 恻 鱼 鱼 业 别 supervisor h uahong shi(a ssociate professor) p ostgraduate卫 鱼 卫 卫鱼 蛆 理 may， 2 0 0 9 学位论文独创性声 明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人 已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做 出重 要贡献的个人和集体，均 已在文中作 了明确说明并表示谢意。 作者签名:日期 学位论文授权使用声 明 本人完全 了解华东师范大学有关保 留、使用学位论文的规定，学 校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。 有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。 有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索。 有权将学位论文的标题和摘要汇编 出版。 保密的学位论文在 解密后适用本规定 。 学 位 论 文 作 者 签 名 : 例者 繁“ 师 签 名 : 日 期 :刨 玉卫 二日 期 :盆 区二 i 夕 、 、 忍 这旦 直丝-硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 徐亚 同教授华东师范大学主席 邓汉副教授华东师范大学 张勇副教授华东师范大学 摘要 摘要 全氟辛磺酸(p fo s)因其具有 防污 、疏水 、疏 油等特性作为表面活性剂被广泛 应用于工业用 品和消 费产 品。其性质稳定 ，具有生物 富集效应 ，作为新型环境污 染物 ，已经在全球多种环境介质和生物体 内被检 出。 pfo s 属于中等毒性化合物 ， 具有全 身多脏器毒性 ，且可能是一种新 的环境 内分泌干扰物 。非洲爪蟾(x e nop us laevi s)作为脊椎动物发育生物学最典型的代表 ，在检测化合物 内分泌干扰效应 中 同样具有重大优势。爪蟾作为模式动物研究环境 内分泌干扰效应逐渐得到重视 。 本文首先运用 21 天两栖类变态(a m a )实验 ，将 哪 51 阶段非洲爪蟾蟒蚌暴 露于 0.01 、 0.05 和 0.25m g l一 的 pfo s 中直到对照组蟒蚌大部分达到 n f58 阶段 ， 按照 o ec d 标准实验方法检测 pfo s 的甲状腺激素干扰效应 。 结果显示 ， 7 天后 ， 3 个 pfo s 暴露组爪蟾蟒蚌后肢长均极显著减少 ，发育阶段显著延迟 ; 19 天后 ， 各 pfo s 暴露组爪蟾蛾蚌体长和体重均显著增加 ，0.olm g l一 ， 组后肢长极显著减 小，0.25m g l一 ， 组后肢长显著减小 ，而 0.05m g l一 ， 组后肢长则没有影响 。19 天后 ， pfo s 组 甲状腺组织结构 出现滤泡数 目减少 、上皮细胞增生 、胶质减少甚至 空泡 化等现 象 ，0.05m g l 一 暴 露组 甲状腺滤泡之 间还 出现溶通现象 。这表 明 pfo s 具 有 甲状 腺激素干扰 效应 ，并可能是 由于该化合物直接 作用于 甲状腺组织 引起 。 其次 ， 运用非洲爪蟾完全变态实验 ， 将 n f48 阶段非洲爪蟾蟒蚌暴露于 0. 01、 0.1 和 lm g l一 ， 的 pfo s 中 6 个 月，检测 pfo s 的内分泌干扰效应 。结果显示 ， 0.olm g l一 ， 的 pfo s 加快爪蟾变态 ，所有暴露组幼蛙性腺 出现 间性 、翠丸珍珠状 和先天性萎缩等畸形现象 ，造成雌雄性 比异常升 高 ，且 间性 比例 随暴 露浓度 的增 加而 降低 ; 组织学观 测显示 ，pfo s 能够造成 爪蟾 甲状 腺滤泡上皮细胞增 生 、胶 质减少甚至 空泡化 ，并且 能够 导致翠丸组织 中产 生类似雌性个体的卵巢腔 。这表 明，pfo s 对爪蟾 的变态过程 具有小剂量刺激 效应 ，能 引起 甲状腺组织结构 的损 伤 ，导致 翠丸组织 的雌 性化 ，具有 甲状腺激 素和 性激 素 干扰 效应 。实验 同时表 明 非洲爪蟾可 以用于两种环境 内分泌干扰 效应 的 同时检测 。 再 次 ，运用 非洲爪蟾 完全变 态 延长 实验 ，将 n f48 阶段 非洲爪蟾 蜡 蚌暴 露 于 0.01 和 1 m g l 一 ， 的 pfo s 中直 至爪蟾变 态后 1 个 月 ，检 测 pfo s 的 内分 泌干扰 效 应 。结 果显示 ，pfo s 抑制 蛾蚌 发育 ，延长爪 蟾变态 时 间 ，造成爪蟾 甲状 腺滤 泡 上皮细 胞增 生 、胶 质 减少甚至 空泡化 ; lm g l 的 pfo s 造成刚变态爪 蟾 体 长 和 摘要 体重显著增加; pfo s 能够造成卵巢发育不对称，对翠丸影响较大，能够导致翠 丸分段 、萎缩 、变细变长 、损伤和不对称等 ，其 中皋丸分段现象最严重 ，组织学 表 明，暴露组翠丸中卵巢腔现象非常普遍 。对照组和暴露组中雄性个体 比例变化 不大 ，但性腺异常 比例随暴露浓度 的增加而 降低 。这表 明，pfo s 能够抑制爪蟾 变态 ，具有 甲状腺激素和性激 素干扰效应 。 另外 ，运用非洲爪蟾幼蛙 实验 ，将变态后 1 个月的幼蛙暴露于 lm g l一 ，的 pfo s 中 6 个 月，检测 pfo s 对爪蟾肇丸发育的影响 。组织学观测显示 ，pfo s 没有对爪蟾肇丸显微结构造成显著影响; 透射 电镜观测表 明，pfo s 能够导致爪 蟾翠丸精子边缘和 内部空泡化 ，线粒体 内部空泡化 ，细胞核轮廓不规则 以及脂滴 边缘硬化等现象 。 这表 明， pfo s 虽不能在显微结构上对爪蟾辜丸发育造成影响 ， 但能够造成翠丸超微结构损伤 。 最后 ，用热带爪蟾蟒蚌进行环境 内分泌干扰物 的筛选进行 了初步研究 。第一 部分食物筛选 实验 ，通过蟒蚌存活率 、变态率 、体长体重和发育阶段等指标进行 评价 ，结果显示 10 号食物(sera 观赏鱼薄片饲料)最适合热带爪蟾蟒蚌生长发育 。 第二部分运用热带爪蟾蛾 蚌开展环境 内分泌干扰物筛选 实验 ， 为运用 热带爪蟾作 为模式动物检测环境污染物 的 内分泌干扰效应进行 了有益 的探索 。 综上所述 ，通过对爪蟾不 同阶段不 同周期的多种暴露实验表 明，pfo s 能够 抑制爪蟾蛾蚌变态发育，导致其 甲状腺组织结构损伤 ，能够造成爪蟾性腺产 生多 种畸形现象，导致其辜丸组织结构和超微结构的损伤 。pfo s 对两栖类 的 甲状腺 系统和生殖系统具有干扰效应 ，既是 甲状腺激素干扰物 ，又是性激素干扰物 ，可 以被确 定为环境 内分泌干扰物 。 本文为证 明 pfo s 的 甲状腺激素干扰效应和雌激 素效应提供 了形态学和组织学上 的证据 。 同时也表 明爪蟾作为模式动物可 以很好 地用来检测化合物 的内分泌干扰效应 。 关键 词 : 全 氟辛磺酸(p fo s)，两栖 类变态 实验(a m a )，甲状 腺激 素干扰 效应 ，性 激 素 干 扰 效 应 ， 内分 泌 干 扰 物 (e d c s)， 非 洲 爪 蟾 (x e nop us laevls ) ， 热 带 爪 蟾 (x e nop us t九 )picall s) a b stra et p e川uorooetane sulfonate (pfo s)has been w idel y used as surf a etants in v丽 ous industr y and eon s um er p ro du cts， b eeau se o f its u n iqu e p rop er t ies as 哪ellen ts o f d irt ， w ater an d o ils.p f o s is verypersistentin the environm entand has bioaceum ulation eff e et.a s one ofem erg i ng ehem ieals， p fo s h as b een d iseo v ered as g lo b al p o llu tan ts in v ari o u s en viron m en tal m ed iu m s and b io lo gy . 仆 e acute tox icity of p f o s 15 m oder a te， ith as diff e rent toxieity for vari ous intem alorgans， and m ay b e an em erg ing env iro n m en tal endo eri n e d isrup ting eh em ineal.方 兔” op us iaevis ， as the m o st ty p ieal m odel anim al of vert eb rate developm ental biology ， h as also trem endou s adv antage in testi n g en d o eri n e d isrup ting eff e cts.方 奄刀 op us laevis h as b een 脚d u ally g o tt en reeo gn itio n in stud尹ng environm ental endocri ne disrupt ing eff e ets as a m odel anim al. in pr e sent paper ， fi r s tly w e used a l nphibian m et am orphosis a ssay (a m a )to reveal thyroid h o rm o n e d isrup ti n g eff e cts o f p f o s aecordin g to the eri ter i o n o f oe c d ， 尤 lae vls tad pe les we r e ex训 sed to p f o s at 由e eon eentr a tion s o r o . o l， 0 .0 5 an d o . 2 5 m g l-l 加 mn f 5 l to n f s s ro r一 9 day s .th e results show ed that eom par e d with the eontr o l， the hind li m b lengths (h l l ) in 0. 0 1， 0 . 0 5 an d o . 2 5 m g l treatm en t 妙up s w er e d ecreased b y 17 % ，1 1%an d 18 %at 7 d ay aft er exposure， resp ectively， and d ev e lopm ent stages w er e sign ifi eantly p o stponed :wh en test w as ter m i nated， the body w eights ( b w )in al l tr eatment groups we re inereased by 17% ， 10% and 20% ， snout to vent lengths (sv l)w er e iner e ased by s% ， 4% and 6% ， resp e etivel叭and hi n d lim b l engt h s (h ll )in o， 0 1 and o. 25m g l ， tr eatment脚 ups w er e aeereased by 12% and 130，0， respe etively . p f o s d ecreased the n u m ber o f folliele， an d in d u ced thyr o id folliele cell h yp er p lasia ， the dep letio n o f eo llo id and ev en v acu o latio n . in ad d itio n ， am alg am atio n o f tw o o r m or efollieles occu r r ed in 0 .0 5 m g fl tr eatm en t 脚即 .ou r resu lts su g g est记that p 阳5 in tr eatm en t d o se eo u ld aeeeler a te the gr ow th oftadpoles and postp o ne thei rm eta m orphosis dev e lopm ent.pfo s eould h ave anti一 th 皿 o id h orm o n e d isrup ting eff e ets. secondly， w e used xe nopus eomp leted m etam orphosis assay (x c m a ) to reveal endocr i ne disr u pting eff e ets of p fo s.x laevis ta d卯 les (n f4 8) we r e exposed to p fo s at the eoneentr a tions o r o ， 0 1， 0 . 1 an d lm g li ror 6 m o n 由5.仆 e resu lts sh o w 记th at p f o s eo u 一 d aeceler l ate 由e m etam orp h osis 。 ftadpoles at o. o lm g l一 ， ， m al几rm ations 。 f gonad 硒由 访ter s ex， pear l谊g and segl n en tal ap lasia w er e fou n d in all tt e atm en t gro u p s， in du ee the abn o rm al eleva tio n o f sex ratio (企nlale/m ale)， and t he rati o ofabnorm al gonad deel i ned with me r easing the eoneentr at ions of p fo s .th e h isto lo g ieal structures o f thyro ld g lan d an d g on ad w ere o b served .p f o s in du eed thyr o id folliele cell h yp er p lasia， th e d ep letio n o f eo llo id and ev en v aeu o latio n .an d the g o n ad w ith inte r sex sh o w ed a testis tissu e w ith a fem ale o v ar i an eavity lik e str u eture.th ese resu lts sh o w ed t hat pfo s eould sti m ulate the m etam orphosis oftadpoles at l ow dose， induee t he dam age of thyr o id histology， and lead to the fem inization oftestis histology.in br i ef， pfo s had signifi cant th yr o id h orm o n e and sex h o rm on e d isrup tin g eff e ets.a dd itiona lly ， these resu lts su gg ested thatx laevis eou ld b e u sed as the m o del anim al to test sim u ltaneou sly tw o endoeri n e d isr u p ti n g eff e ets. th ir d l y， w e used prolonged 方 触 nopus eom pleted m etam orphosis assay (p rolonged一 x c m a )to reveal endoeri ne disrupting eff eets of pfo s.x iaevis tadpoles w er e exposed to pfo s at the concentr ations ofo. ol and lm g l一 ， rr o m n 科 5 to 1 m ont h postmetam orp h osis.仆 e re s ults show ed that pfo s eoul d restr ain the devel opm ent of tadpoles， delay the m etam orphosis tim e， and in du ee thyr o id folliele eell h 即 er p lasia， the d epletio n o f eo llo id an d even vaeu o lation . th e bo d y lengt h and 比dy w eight ofn f66 xe n叩us laevisw ere :i即incantl y i nereased in lm g l 一 t reatm ent 盯叨 p s.p fo s eou ld indu ee th e asym m etr y of ovary developm ent and resu lt in su bseetion， hyp op lasia， elongated and narr ow ， ap lasia and asyi n m etr of th e testes， esp ecially sub section wh ieh w as the w orst phenom enon， th e fem ale ovari an eavity i n testis w as very eom m on.th e rati o o f m ale chan ged a litt le in eo n tr o l an d tr e atm en t gr o up s， bu t the ratio o f abn orm al go n ad d eelined w ith in ereasin g the co n eentr a tio n s o f p f o s .th ese results sho w ed that p f o s cou ld 代 洛七ain the m etam o rph o sis o f xe n op us laevis an d h ave sign ifi eant th yr o id h o rm o n e and sex h on n o n e d isrup ti n g eff e ets. in addition， w e used 方 全 nopo juve n ile assay (x ja ) to te s t the sex horm one disrupting efl 七 ets of pfo s.x laevisjuv e niles (1 m onthpostmetam orphosis)w ereexposed to pfo s atthe eon een tr atio n s o f 1 m g l-l 扔 r 6 m o n 山s-仆 e testicu lar h isto lo g y struetures w ere o b served an d ther e w ere n o sign ifi ean t ch ang es in the testieu lar m ierostrueture ex p o sed b y p f o s .th e 。 忱 er v atio n b y tran sm issio n eleetr o n m ierosco p e m eth o d s sh o we d th at p f o s eo u ld in d u ee vacuo lizatio n in sp erm n u elei ed g e an d in ter i o r， v aeu o lizatio n in m ito eh an d ri a in teri o r， an o m aly o f n u elear o u tlin e an d ri g id ifi eatio n in lip id dro p lets ed g e.th ese resu lts sh o w ed th at p f o s eou ld 山 m ag e the testieu lar u ltr am ier o str u eture ， bo t th e testicu lar m ierostrueture h ad o n ly a little efl 七et. f in ally， xe n op us t代少ica li s tad p o les w er e u sed to screen en vironm en tal en d o cr i n e d isrup to rs 歹 and w e m ade a prel imi nary study.food screeni ng assay w as fi r s tly tested.th e en即ointsof survival rat e， m etam orp h osis rate， body l engt h ， body w eight and dev e lopm ental stages ofxe nopus 崖 汽 矽ic ali s tadpoles w ere assessed.th e results show ed that t he n o .10 food (ser a vipan)w as the m ost suited food for xe n即us t 了 o p i calis tadpol es.screening environm ental endoeri ne disruptors assay b y xe n op us t汽少ica li s w as tested .th is ex pe ri m ent w as a g o o d exp lo re for seeeni n g endo cr i n e d isrup tin g eff e ets u sin g 方 兔n op us 介 o p ic a li s as the m od el an im al. in eon elu sion ， these resu lts o f sev eral assays in d ieated that p fo s cou ld in h ib it the m et am orp h osis developm ent ofta即oles， induee the dam age ofth帅 id histol ogy， resultinseveral m alfon n atio n s o f g o n ad and in du ee the d am ag e o f testicu lar h isto lo g y s加 etures and u ltr田n icr o str u eture. p f o s h ad en d ocri n e d isrup tin g eff e ets for the thyr o id sy stem and 代produet ive system ofam phi bian.pfo s w as a t h外oid horm one disrupti ng chem ieal， butalso sex h or mon e disrup tin g eh em ieal and eou ld be regarded as on e o f environm ental end ocr i n e d isrup ting ch侧 m ieals.th is paper provided m orphol ogieal and hist ol ogical evidenees for proving the thyroid h or mo n e and sex h o rm on e d isrup ting eff e ets o f p f o s .a d ditio n ally ， th ese resu lts su gg ested that 方 触刀 op us eo u ld b e w ell u sed as the m o d el an im al to test en d o eri n e d isrup tin g eff e ets. k ey w ords:pe川uorooetanesulfonate (pfo s); a m phi bian m etam orphosis a ssay (a m a ); thyroid honn one disrupting eff e cts: sex honn one disrupting eff e ets; endoeri ne disrupting ehem ieals (e d c s); a 州ean elaw ed fr o g (xe nopus laevis ): we stem elaw ed fr o g 口 份nopus 。 即 lc a li s) 目 录 目录 摘要 .， .， . i a b stract ， . ， . 111 目录 . 1 缩略词 . . . . ， .3 第一章 绪论 .5 第一节 全氟辛磺酸(p fo s)简介 5 第二节 pfo s 的迁移转化规律 .， . . . 6 第三节 pfo s 的毒理学研究进展 .8 第 四节 模式动物爪蟾介绍 .， . 13 第五节 本论文 的研 究 目的、内容和意义 ， . 19 第二章 运用 21 天两栖类变态实验(a m a) 检测 p fo s 的 甲状腺激素干扰效应 二 第 一节 前言 .， .21 第 二节 材料与方法 ， .22 第 三节 结果 .， .， .24 第 四节 讨论 .28 第三章 运用非洲爪蟾完全变态 实验检测 p fo s的 甲状腺激素和性激素干扰 效 应 .31 第一节 前言 .31 第 二节 材料 与方法 .32 第 三 节结果 .34 第 四节讨论 .41 第 四章 运用 非洲爪蟾完全变态延长 实验检测 p fo s 的 甲状 腺激素和性激 素干扰 效应 .4 4 第 一节前言 .， .44 第 二节 材料 与方法 .44 第 三 节结果 .46 第 四节讨论 .61 目 录 第五章 运用非洲爪蟾幼蛙实验检测 pfo s 的性激素干扰效应 67 第一节 前言 ， ， ， 67 第二节 材料与方法 . .67 第三节 结果 ， 70 第 四节讨论 73 第六章 运用 热带爪蟾筛选环境 内分泌干扰物 的方法初探 75 第 一节前 言 75 第二节 热带爪蟾峪蚌的食物筛选研究 76 第三节 运用热带爪蟾筛选环境 内分泌干扰物 85 第七章总 论 90 第 一节p f o s 对 非 洲爪蟾 的 甲状腺激素干扰效应 o 第 二 节p f o s 对 非洲爪蟾 的性激素干扰 效应 ， 1 第三节 运用爪蟾 同时检测两种 内分泌干扰效应方法 的探讨 3 第 四节展望 ， ， 95 参考文献 99 附录 1:非洲爪蟾 发育阶段划分标准 107 附录 2 :非洲爪 蟾 爪蟾 发育 阶段 图谱 111 附录 3:非洲爪蟾雄性 生殖细胞发育 阶段 115 附录 4:非洲爪蟾雌性 生殖细胞发育 阶段 116 附录 5:非洲爪蟾性腺畸形类型 ， ， 117 硕士在读 期 间发表 的论文 ， 119 硕士在读 期 间参与 的主要科研项 目 120 致谢 . . . ， . . . . . . . . 121 缩略词 缩 略词 缩写英文中文 b c f b mf c r f d ms o e c so e d c s e r h p h p t l ld 5o b io co n een tratio n facto rs b iom agn ifi eatio n faeto rs eo llo id co llo id d ep letio n c o rtieo tro p in 一 r eleasin g f ac to r d im ethyl sulphoxide h alf m ax im al eff e etiv e eo n een tration e n d o cr i n e d isrup ti n g c h em ieals e str o g en r ecep to r folliele ep ith elial follicle m alfon llatio n h y o id sp erm h ead s h 即 erplasia h 即 o thalam ie一 p ituitar y一 th 歼 o id a x is h 邓 ert r o p h y in elu sio n b o d y k id n ey l u m en m ed ian leth al d o se l ip id d rop lets mito eh o n d ria n atio n al in stitutes o f h e alth n u eleu s o v ary o v ar i an eav ity o rgan izatio n for e eo n o m ic c o 一 o p eratio n an d d ev elo p m en t 生物富集系数 生物放大系数 胶质 胶质减 少 促 肾上腺皮质激 素释放 因子 二 甲基亚讽 半数效应浓度 内分泌干扰物 雌激素受体 滤 泡 滤 泡变 形 舌骨 精子头 滤 泡细胞增生 下丘脑一 垂体一 甲状腺轴 . 滤泡 细胞肥 大 包涵体 肾脏 内腔 半 数致死量 脂滴 线 粒 体 美 国 国立 卫 生研 究 院 细 胞 核 卵 巢 卵 巢 腔 ht ibk 卜 | h i . 1 尸1 1引i j u c l n n n 00 o e c d经 济 合 作 和 发展 组 织 缩略词 缩写英文中文 o v丽 an l en gth oocyte lo 了、r 七口几 p c b s p f c s p g c s p f o a p f o s 卵巢长度 卵母细胞 珍珠状性腺 多氯联苯 全氟化合物 原始生殖细胞 全 氟辛酸 全 氟辛磺 酸 精母细胞 性腺部分先天性 萎缩 滑 面 内质 网 精 原细胞 精子细胞 精子 翠 丸 三碘 甲腺原氨 酸 甲状腺素 se r sg st 52 t t3t4 td c s甲状腺激 素干扰 物 t h s t s h 甲状腺激素 甲状腺 翠 丸长度 甲状腺激素受体 促 甲状 腺激 素 ;，l rtg t t i u s e p a美 国环保局 wh o p earlin g p o ly ehio ri n ated b ip h en y ls pol州 uori nated c hem icals p rem