（环境科学专业论文）酸性嫩黄g和柠檬黄对血清白蛋白毒性作用机理及相关问题研究.pdf

原创性声明 俐7 9 16 3 2y 1 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：渔量! 垒日期： 丝鱼：羔：12 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者躲沟墨佐导师始知腑日期：砷j ：7 山东大学硕士学位论文 目录 目录i 摘要。v a b s t r a c t v i i 符号说明i x 第一章绪论l 1 前言1 2 常用的污染物质毒性评价的方法l 2 1 常用的毒性评价方法l 2 2 这些方法存在的不足3 3 蛋白质概况。3 3 1 蛋白质的功能“4 3 2 蛋白质的结构：4 3 3 血清白蛋白4 4 小分子污染物与生物大分子结合作用的研究方法6 4 1 荧光光谱法6 4 2 紫外可见吸收光谱法1o 4 3 圆二色性光谱法1 1 4 4 红外光谱法。1 1 4 5 核磁共振法12 4 6 质谱法1 2 5 论文研究的背景及研究内容1 3 5 1 研究背景1 3 5 2 研究内容1 4 第二章酸性嫩黄g 与b s a 毒性作用机理的光谱学研究1 7 l 前言17 2 实验部分1 7 2 1 实验试剂17 2 2 实验仪器。l8 2 3 实验过程。18 3 结果与讨论1 9 3 1a y l l 对b s a 的荧光猝灭光谱与猝灭机制1 9 3 2a y l l 与b s a 作用的热力学参数及类型2 3 3 3 结合位点的计算2 4 3 4 能量转移2 4 3 5a y l1 对b s a 结构的分析2 5 4 结论2 9 第三章柠檬黄与白蛋白作用的研究3 0 1 前言3 0 2 实验部分3 0 2 1 实验试剂3 0 2 2 荧光光谱测定3 0 山东大学硕士学位论文 2 3 紫外吸收光谱和圆二色谱测定3 1 3 结果与讨论3 1 3 1a y 2 3 作用过程的荧光猝灭机理3 1 3 2 作用过程的热力学性质及相互作用力。3 5 3 3a y 2 3 与蛋白结合位点的计算3 6 3 5a y 2 3 对b s a 结构影响的分析3 7 4 结论4 3 第四章荧光的内滤效应4 4 1 前言4 4 2 实验部分4 5 2 1 实验试剂4 5 2 2 实验仪器。4 5 2 3 改进装置及测试方法4 5 3 结果与讨论4 7 4 结j 沦5l 第五章蛋白质特征光谱的研究5 2 1 前言5 2 2 实验部分5 2 2 1 实验试剂5 2 2 2 实验仪器5 3 2 3 三维荧光光谱测定5 3 2 4 紫外吸收光谱和圆二色谱测定5 3 3 结果与讨论5 4 3 。1 原理5 4 3 2 紫外可见吸收光谱的研究5 5 3 3 三维荧光光谱的研究6 0 4 结 念6 8 第六章主要结论和研究展望6 9 参考文献7 1 致谢8 0 参加的科研项目8 1 发表的科研论文和专利8 2 山东大学硕士学位论文 c o n t e n t s c o n t e n t s i c h i n e s ea b s t r a c t v e n g l i s ha b s t r a c t v i i s y m b o ld i s c r i p t i o n i x c h a p t e rli n t r o d u c t i o n 1 lp r e f a c e 1 2i n t r o d u c t i o nt ot h em e t h o d sf o r t h ee v a l u a t i o no ft h ep o l l u t a n t s 1 2 1m e t h o d sd e s c r i p t i o n 1 2 ：! d i s a d v a n t a g e sf o rt h e s em e t h o d s 3 3p r o t e i n 3 3 1f u n c t i o n 4 ：；2s t r u c t u r e ：l ：；3s e r u ma l b u m i n 4 4r e s e a r c ht e c h n i q u e sf o r t h et o x i c i t yo f p o l l u t a n t st ot h eb i o m a c r o m o l e c u l e s 6 4 1f l u o r e s c e n c e 6 4 2u v - v i sa b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y 10 4 3c i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) lo 4 4f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( f t i r ) 1 l 4 5n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ( n m r ) 1 l 4 6m a s sa n a l y s i s 1 ：1 5r e s e a r c hb a c k g r o u n da n dc o n t e n t s 1 2 5 1b a c k g r o u n d 12 1 ；2c o n t e n t s 1 ：； c h a p t e r2s p e c t r o s c o p i cs t u d yo nt h ei n t e r a c t i o no fa c i dy e l l o ww i t l lb s a l 6 li n t r o d u c t i o n 16 2m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 16 2 1r e a g e n t s l6 2 2a p p a r a t u s 17 2 3m e t h o d s 17 3r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n l8 3 1t h em e c h a n i s mq u e n c h i n go fb s ab ya y 。18 3 2t h e r m o d y n a m i cp r o p e r t i e sb e t w e e na ya n db s a 2 2 ：；3a n a l y s i so f b i n d i n gs i t e s 2 3 3 4e n e r g yt r a n s f e r ：! ： ： ! ；c o n f o r m a t i o n a li n v e s t i g a t i o n s 2 4 4c o n c l u s i o n 2 8 c h a p t e r3r e a r c ho nt h et a r t r a z i n ea n dt w os e r u ma l b u m i n s 2 9 1i n t r o d u c t i o n ：1 9 ：! m a t e r i a l sa n dm e t h o d s ：1 9 2 1r e a g e n t s ：1 9 2 2f l u o r e s c e n c em e a s u r e m e n t s ： ( ) 2 3u va n dc dm e a s u r e m e n t s 3 0 i i i 山东大学硕士学位论文 3r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n ：；( ) 3 1t h eq u e n c h i n gm e c h a n i s m 3 0 3 2t h e r m o d y n a m i cp r o p e r t i e sa n dt y p e so f i n t e r a c t i o n 3 4 3 3a n a l y s i so fb i n d i n gs i t e s 3 5 3 4c o n f o r m a t i o n a li n v e s t i g a t i o n s 3 6 4 c o n c l u s i o n 4 2 c h a p t e r4i n n e rf i l t e re f 五e c t 4 3 1i n t r o d u c i o n 4 3 2m a t e r i a l sa n dm e t h o d s z l 4 2 1r e a g e n t s z i z i 2 2a p p a r a t u s z l z 2 3m e t h o d s z l 。l ：；r e s u i t sa n dd i s c u s s i o n 4 6 4c o n c l u s i o n 5 0 c h a p t e r5a n a l y s i so f t h es p e c i f i cp r o t e i ns p e c t r a 5 1 1i n t r o d u c t i o n 5l ：! m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 51 2 1r e a g e n t s 5 l 2 2a p p a r a t u s ! ；：1 2 3t h l e ed i m e n s i o n a lf l u o r e c e n c em e a s u r e m e n t 5 2 2 4u va n dc dm e a s u r e m e n t s 5 2 3r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n 5 3 ：；1p r i n c i p l e s 5 3 3 2a n a l y s i so f t h eu vs p e c t r a ! ；z i ：；3a n a l y s i so f t h et h r e ed i m e n s i o n a ls p e c t r a 5 9 4c o n c l u s i o n 6 7 c h a p t e r6m a i nc o n c l u s i o n sa n dr e s e a r c hp r o s p e c t s 6 r e f e r e n c e s 7 0 a c k n o w l e d g e m e n t s 。7 9 r e s e a r c hp r o j e c t so fp a r t i c i p a t i o n 8 ( ) p u b l i s h e dr e s e a r c hp a p e r sa n dp a t e n t s 81 i v 山东大学硕士学位论文 摘要 随着人类社会的发展，人们的生活水平得到了很大的提高，但同时环境污 染对人类的生存和发展造成了严重威胁。环境问题虽越来越受到重视，但依然 是目前最重要的全球性问题之一。人们通过空气、水、食物等接触到的潜在危 险物越来越多。这些潜在的危险物质能通过消化道、呼吸道以及皮肤接触等渠 道进入生物体内，通过各种方式与体内的大分子生命物质( 如蛋白质、核酸、 酶等) 直接或间接地发生作用，影响或者破坏了这些分子的生物功能，对各个 器官造成不同程度的损伤，从而对机体产生毒性效应，诱发各种疾病。因此， 研究这些具有潜在威胁的环境污染物对生物大分子的毒性作用机理是非常必要 的，这有助于对这些物质的毒性做出全面的评价，为制订合理的标准来保障人 身体健康和安全提供参考和技术支持。 现在最常用的污染物毒性评价方式主要有动物实验和流行病学调查两种， ：， 但却都无法从分子水平上解释污染物的毒性作用机理，不能从根本上阐明毒性 效应。为了弥补这一缺点，本论文从分子水平出发，在体外条件下采用光谱学 手段探讨了小分子污染物与蛋白质功能大分子的毒性相互作用，有助于增强人 们对该类化学污染物在血液传输过程与血清白蛋白结合后对白蛋白毒性作用的 认识，为此类污染物的毒性作用的阐明提供了新的视角。 本论文选用了生物体内最普遍的蛋白质一血清白蛋白( s a ) 为靶分子，在体 外条件下分子水平上，通过荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱、紫外 可见吸收光谱、圆二色性光谱等技术手段研究了其与两种常见的水溶性偶氮染 料的毒性作用机理，建立了一种评价污染物生命体毒性的新方法。另外，在实 验的进行过程中发现并解决了内滤效应对荧光测定的影响，以及蛋白质特征光 谱的解读等相关问题。 本论文共分六章内容，其中主要实验内容包括四部分： 第一部分：选用了酸性嫩黄g ( a y l l ) 作为研究对象，以牛血清白蛋白( b s a ) 为靶，利用荧光光谱、紫外可见光谱、圆二色谱等光谱学手段，从分子水平上 研究了a y l l 对蛋白质分子的影响。实验发现，a y l l 能够与b s a 发生中等强 度的结合，会与b s a 生理过程中与正常结合的内源与外源化合物相竞争，改变 v 山东大学硕士学位论文 了蛋白质的结构，从而影响蛋白分子正常的运输作用，产生毒性作用。另外， 通过实验证明了a y 本身的吸收对荧光的测定结果影响很小，可以忽略。 第二部分：选用了柠檬黄( a y 2 3 ) 作为研究对象，选用了两种血清白蛋白( s a ) 牛血清白蛋白( b s a ) 和人血清白蛋i 刍( h s a ) 为靶，利用上一章的荧光光谱、紫外 可见光谱、圆二色谱等光谱学手段，并引入了更加直观的三维荧光光谱法，从 分子水平上研究了a y 2 3 对蛋白分子的毒性作用影响。实验结果表明，柠檬黄 对两种蛋白均具有毒性作用，使蛋白的结构均发生了不同程度的改变。 通过这两部分的研究，发现在光谱法研究蛋白质体系中存在的一系列问题， 如荧光测定过程中的内滤效应对测定的影响，以及蛋白质光谱特征解释不够明 确或存在偏差。因而在以下两部分部中进行了相关的研究。 第三部分：由于前两部分都采用了有颜色的偶氮染料作为污染物，而染料 本身的颜色，会导致其对特定波长的光有吸收作用，这将有可能会干扰蛋白质 荧光光谱的测定。为了确定这种吸收作用会不会对实验产生干扰，以及如何消 除这种干扰，本部分进行了一系列的相关实验，确定了在前两部分的实验中这 种干扰对实验的影响很小。但是在其他污染物与蛋白的体系研究中发现，这种 干扰还是会对实验结果产生比较严重的影响，为此设计了一种装置和配套的方 法来消除这种干扰对实验结果的影响，相关成果已经申请专利。 第四部分：在第二部分的试验中引入了三维荧光光谱技术，但是在图谱的 解析过程中发现，现有的理论并不完善，甚至有些还存在偏差。因此，在本部 分中，通过三维荧光光谱及紫外可见吸收光谱技术，利用用氨基酸来模拟蛋白 质的方法研究了蛋白质的特定光谱，对蛋白质各个特征峰的产生机理做了详细 的解释，为以后的分子水平研究提供了详细的参考。 关键词： 血清白蛋白；酸性嫩黄g ；柠檬黄；荧光内滤效应；三维荧光光谱；毒性评价 v i 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h er a p i dd e v e l o p m e n to fs o c i e t yh a sn o to n l yi m p r o v e dt h el i v i n gs t a n d a r do f h u m a n s ，b u ta l s op o s e sg r e a tt h r e a tt ot h eh u m a n h e a l t h i nr e c e n ty e a r s ，c o n s i d e r a b l e a t t e n t i o nh a sb e e np a i dt ot h eg l o b a l l ye n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n h o w e v e r , h u m a n s a r es t i l le x p o s e dt ot h e s ep e r s i s t e n tp o l l u t a n t sv i aa i r , w a t e r , f o o d sa n do t h e rw a y s ， w h i c hw o u l dt r a n s p o r td i r e c t l yt h r o u g ht h ed i g e s t i v et r a c t ，r e s p i r a t o r yt r a c ta n ds k i n c o n t a c tc h a n n e l si n t ot h eb i o l o g i c a lb o d ya n dp r o d u c et h et o x i c i t yt oh u m a n sb yt h e d i r e c to ri n d i r e c ti n t e r a c t i o n s 、析t hb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e si nv i v o ，s u c ha s p r o t e i n s ，n u c l e i ca c i d s ，a n de n z y m e s t h e r e f o r e ，i ti so fg r e a ti m p o r t a n c et or e s e a r c h o nt h ep o t e n t i a lt o x i c i t yo fp o l l u t a n t st ot h eb i m o l e c u l a r , w h i c hw i l lh e l pm o r et o c o m p l e m e n ts t u d i e so nt h ee n v i r o n m e n t a lr i s ka s s e s s m e n to fp o l l u t i o n , a n dp r o v i d e s o m er e f e r e n c ea n dt e c h n i c a ls u p p o r tf o rt h er e l e v a n ts t a n d a r do fp r o t e c t i n gh u m a n h e a l t ha n ds a f e t y t h e r ea r el o r so ft o x i c i t ye v a l u a t i o n sf o rp o l l u t a n t s ，o fw h i c ht h em o s tc o m m o n l y t w oa r ea n i m a le x p e r i m e n t sa n de p i d e m i o l o g i c a li n v e s t i g a t i o n s ，b u tt h e s em e t h o d s c a nn o te x p l a i nt h et o x i c i t ym e c h a n i s mf r o mt h em o l e c u l a r l e v e l i no r d e rt o c o m p e n s a t ef o rt h i s ，w ea d o p t e dt h es p e c t r o s c o p i ct e c h n i q u e st os t u d yt h et o x i c i t y ， m e c h a n i s mi nv i t r of r o mt h ep r o t e i nl e v e l ，w h i c hw i l lh e l pt ou n d e r s t a n da n dp r e d i c t t h et o x i c i t yo ft h ec o n t a m i n a n t st ot h ep r o t e i ni nt h eb l o o d ，a n di ta l s op r o v i d ea n e w p e r s p e c t i v et oc l a r i f yt h et o x i c i t yo f c o n t a m i n a n t s i nt h i sp a p e r , t h em e c h a n i s mi n t e r a c t i o n so ft w oc o m m o ns o l u b l ea z od y e st o s e r u n la l b u m i n sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e du n d e rs i m u l a t e dp h y s i o l o c i g a lc o n d i t i o nb y m e a n so ff l u o r e s c e n c e ，s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c e ，t h r e e - d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c e ， u v - v i sa b s o r p t i o n 刑v ) ，a n dc i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) w ca l s od e s i g n e dad e v i c et o v e r i f yt h ei n n e rf i l t e re f f e c tb ye x p e r i m e n ta n dc l a r i f i e dt h er e l a t e di s s u e sa b o u t t h e s p e c t r a lc h a r a c t e r i s t i c so fp r o t e i n sf r o ma n e wp e r s p e c t i v e t h ep a p e ri sd i v i d e di n t os i xp a r t s ，o fw h i c ht h em a i ne x p e r i m e n t sc o n s i s to f f o u rp a r t s ： p a r t1 ：w cs t u d i e dt h ee f f e c to fa c i dy e l l o w ( a y11 ) e x p o s u r et ot h ec o m m o n p r o t e i nb o v i n es e r u n la l b u m i n ( b s a ) b ys e v e r a ls p e c t r o s c o p i ct e c h n i q u e si n c l u d i n g f l u o r e s c e n c e ，u va n dc d i tw a sf o u n dt h a ta y c o u l di n t e r a c tw i t hb s am o d e r a t e l y b yc o m p e t i n gw i t ht h ee n d o g e n o u sa n de x o g e n o u sc o m p o u n d st ot h ep r o t e i nb i n d i n g ， v i i 山东大学硕士学位论文 a n di tc a u s e dc o n f o r m a t i o n a lc h a n g e so fp r o t e i n , w h i c hc o u l da f f e c ti t sa c t i v i t yo r e v e nc h a n g ei t sp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n b e s i d e s ，a yw a sp r o v e dt oh a v el i t t l ei m p a c t o nt h ef l u o r e s c e n c eo fb s a b yav e r i f i c a t i o ne x p e r i m e n t p a r t2 ：w es e l e c t e dt w os e r u ma l b u m i n s ( s a ) ，h u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) a n db s a ，a st h et a r g e t st oe v a l u a t et h et o x i ce f f e c t so f t a r t r a z i n e ( a y 2 3 ) b ym e a n so f t h ea b o v e t e c h n i q u e s a n dam o r ei n t u i t i v et h r e e d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p yf r o mt h ep r o t e i nl e v e l a n dt h er e s u l t sc o n f i r m e dt h a ta y 2 3i n d e e d i m p a c tt h ec o n f o r m a t i o no f b o t hh s a a n db s a as e r i e so fp r o b l e m si nt h ep r o t e i ns t u d yw e r ef o u n d e df r o mt h e s ea b o v ep a r t s ， s u c ha st h ei n n e rf i l t e re f f e c tt ot h ef l u o r e s c e n c e ，a n dt h eu n c l e a r l ye x p l a n a t i o no r d e v i a t i o no nt h ep r o t e i ns p e c t r a lc h a r a c t e r i s t i c s t h e r e f o r e ，t h e s ep r o b l e m sw e r e s t u d i e di nt h en e x tt w os e c t i o n s p a r t3 ：w i t ht h e i ro w nc o l o r s ，t h ed y e sw i l lc a u s et h el i g h ta b s o r p t i o na m o n g t h es p e c i f i cw a v e l e n g t h s ，w h i c hm a yp o s s i b l ei n t e r f e r ew i t ht h ep r o t e i nf l u o r e s c e n c e s p e c t r a t od e t e r m i n et h ei m p a c to fd y e sa b s o r p t i o n ，as e r i e so fe x p e r i m e n t sw e r e m a d ea n dt h er e s u l t sp r o v e dt h a tt h e r ew a sl i t t l ee f f e c to nt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r a b e c a u s eo ft h ea b s o r p t i o n h o w e v e r ，i no t h e rs y s t e m s ，t h ea b s o r p t i o nh a ss e r i o u s e f f e c t so nt h er e s u l t so ft h ep r o t e i nf l u o r e s c e n c e t h u sw ed e s i g n e dad e v i c et o e l i m i n a t et h ei m p a c to fa b s o r p t i o n ，a n dt h er e l e v a n tr e s u l t sh a v e b e e np a t e n t e d p a r t4 ：t h ea d o p t i o no ft h r e e d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yi nt h e s e c o n dp a r tr e v e a l e dt h a ts o m ep r o t e i ns p e c t r a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r en o te x p l a i n e d p e r f e c t l ya n ds o m ed e v i a t i o n sw e r ef o u n d e di nt h ee x p l a n a t i o n a sar e s u l t ，i nt h i s s e c t i o n ，w es i m u l a t e dt h ep r o t e i nw i t ht h et w e n t ya m i n oa c i d st oo b t a i nt h es p e c i f i c p r o t e i ns p e c t r ab ym e a n so ft h et h r e e d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ya n d u vm e t h o d s t h ei m p r o v e m e n to ft h ep r o t e i ns p e c t r ae x p l a n a t i o nw i l lp r o v i d ea d e t a i l e dr e f e r e n c et ot h ef u t u r em o l e c u l a rs t u d y k e y w o r d s ： s e r u ma l b m i n ，a c i d y e l l o w , t a r t r a z i n e ，i n n e r f i l t e r e f f e c t ， t h r e e d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c e ，t o x i ce v a l u a t i o n 山东大学硕士学位论文 s a h s a p h e t r y z e x i f c d r 血清白蛋白 人血清白蛋白 苯丙氨酸 酪氨酸 激发波长 荧光强度 圆二色性 相关系数 符号说明 b s a b u f f e r t i p z e m 九 i n ，- 、r i s i n f 牛血清白蛋白 缓冲溶液 色氨酸 发射波长 波长差 紫外可见 内滤效应 i x 山东大学硕士学位论文 1 前言 第一章绪论 当今世界每天都有大量的污染物被排入人类赖以生存的自然环境中，即使 已经停止排放的那些物质，也会存在相当长的时间，对人类的生存及健康造成 了严重的威胁。这些污染物可以通过饮食、呼吸、皮肤接触等途径进入机体， 并通过血液循环分布到全身各个组织器官，在组织及细胞内逐渐发生化学结构 和性质的变化，形成代谢物质。外源化合物进入机体后，经过短期或者长期的 作用，除了会对各系统器官造成损伤外，还能与生物体内的大分子物质如蛋白 质、酶、核酸等发生直接或者间接的作用 1 3 】，影响或者改变相应的生理功能。 因此，研究外源污染物的生物毒性，建立并完善污染物毒性评价体系将有助于 制订相关