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常见赤潮藻r f l p 特征性图谱的建立 常见赤潮藻r f l p 特征性图谱的建立及应用 摘要 赤潮对近海环境造成了极大的危害，对赤潮的防治工作越来越重要，而对赤 潮藻种的鉴定工作是一项重要的基础性工作。分子生物学的发展，分子生物学技 术在分类学的运用也越来越多并日渐成熟。其基于核糖体序列的多样性对赤潮藻 种进行分类鉴别的方法，由于其具有操作简便和快速的特征，越来越受到国内外 的广泛关注。 本研究运用限制性片断长度多态性技术( r e s 仃i c t i o nf r a 肿e ml e n g t l l p o l y m o r p l l i s m ，r f l p ) 的衍生技术p c r - i 江l p ，构建我国主要赤潮藻种的特征酶 切图谱，在此基础上，初步建立了一套高效快捷的、基于r f l p 的赤潮藻的鉴定 方法。主要内容包括两部分：( 1 ) 运用p c r 扩增出了二十种赤潮藻的1 8 sr d i n a 片段，并对p c r 条件进行了优化；( 2 ) 对二十种赤潮藻的核糖体1 8 s 进行r f l p 分析，r f l p 结果显示，对二十种赤潮藻区分明显。 本研究通过构建我国常见赤潮藻的特征酶切图谱，初步建立了基于l 心l p 的 赤潮藻种的鉴定方法。该方法具有高效快捷的优点，可对赤潮藻种进行有效鉴定， 为赤潮预警、预测和防治工作提供了新的手段，也为海洋浮游植物多态性研究提 供了新的有效技术。 关键词：赤潮、核糖体基因、r f l p 常见赤潮藻r f l p 特征性图谱的建立 e s 切b h m e n tt h ec h a n c t e r i s t i cm a c m r 鹤埘c t i o nm a po f mm o n 他d t i d ea l g a eb yr f l p a b s t i 翟c t t h er e dt i d ec a u s e ss 耐o u sd a m a g et 0m ei 1 1 s h o r e 锄v 的衄e n to fo u rc o 啪仃v t h e r e f o r e ，i tb e c o m e sm o r ea i l di i l o r ei l n p o r t 锄tt 0p r e v e n t 锄dc o i l 缸o lt l l er e dt i d e n i sac r i t i c a l 锄df h n d a m e m a lj o bt 0i d e n t i 匆t 1 1 er e dt i d ea j g 、斩t 1 1t 1 1 e d e v e i o p m e n t o fm o l e c u l a rb i o l o g y ，m o l e c u l a rb i o l o 百c a lt e c h n o l o g y 印p l i e dt 0t a x o n o i n yb e c 啪e s m o r e 锄dm o r ep o p u l 盯a j l dn 劬玳d t km e t l l o df o rc l 器s i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n o ft l l er e dt i d ea l g b yi t sr i b o s o m ed n a s e q u e n c eb a s e dd i v e r s 时a t 仃a c t sm o r ea n d m o r e 删0 nb o t ha th o m ea n da b r o a dd u et 0i t s e a s y 叩a t i o na n d 蠡l s t c h 龇a 咖s t i c s i n l i sp a p e r p c r - r f l pw 舔u s e dt 0c o n s m l c t l ec t e r i s t i cm a c r o r e 蛐r i c t i o n m a po fm a i l ls p e c i e so fr e dt i d ea l g 勰，锄db 笛e do n 也i s ，锄e 伍c i e n ti d e 面f i c a t i o n m e 血o db a s e do nr f l pw 硒e s t a _ b l i s h e d t h e 托s u l tc o m 研s e s 觚。硒p e c t s ：( 1 ) w e a c q u 砌1 8 sr d s e g m e n t so f2 0s 1 ) e c i e so f 口e dt i d ea l g a ew i t ht h ep c r t i h n o l o g 蜘 a n do p t 砌z e d 也ee x p e 曲e n t a lc o n d i t i o n0 f p c r( 2 ) 1 8 sr n as e 舯e n t so f 2 0 s p e c i e so fr e dt i d ea l g a ew e r e 趾a l y s e db y 刚p l p ，a i l dt 1 1 er e s u hs h o 、s 廿l a to l v i o u s d i 如n c t i o n 耐s t si i l2 0s p e c i e so f 川t i d e m g a e w e tu pm ec h a r a c t e r i s t i cm a c r o r e 嘶c t i o nm a pf o rm 血s p e c i e so fr e dt i d ea l g a n dd e v e l 9 p e dam 列吣d1 o re 题c j e n ta n dq u i c kj d e n t i 6 c a t j o no fr e dt j d ea l g 勰b 觞e d 0 nr f l p b ye 彘c t i v e l yi d e n t i 匆i i l g 恤r e dt i d ea l g ，an e wm 鼬o dw a se s t a b l i 幽d f o rp f e w l n l i n g ，p r e v e n t i o n 锄dc o n 廿0 l ，a n da s s e s s m e mo f t l l er e dt i d e m e a n w l l i l e i t p r o v i d ean e wt e c h n 0 i o g ) ，f o rt l l es 砌y0 nb i o d i v e r s 时o ft l l e0 c e a i l i cp h ”o p l a l l i n k e yw o r d s ：r e dt i d e ，r d n a ，r f l p 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含耒获得 ! 注；垫遗直 墓丝霆蔓挂别童明的! 奎拦亘窒或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者签名：嘴 l 叫年多月g 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授 权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众 提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：鳓 签字日期浒g 月g 日 签字日期沙年( 月。日 导师签字： 签字日哪年歹月多日 常见赤潮藻r f l p 特征性图谱的建立 第一章文献综述 1 1 海洋浮游藻类和赤潮 1 1 1 浮游藻 在富饶的海洋世界里，有着许许多多的海洋生物，除了有形式各样的海洋鱼 类等海洋动物，还有着为海洋提供基础生产力的海洋植物。它们分布于海洋的各 个层面，而作为海洋植物主要组成部分的海洋藻类，是人类的一大宝贵的自然财 富，它们可以作为食物，也可以做成保健药品。人们根据海洋藻类的不同的生活 习惯，把它们分为底栖藻和浮游藻两大类型。 浮游藻藻体仅由一个细胞组成，又称为单细胞藻类，是一类具有色素或色素 体( c h r o m a c o p h o r e ) ，能进行光合作用，并制造有机物的自养型单细胞浮游生物 ( 跏t 0 臼o p h i cp l a i l k t o n ) 。它们是海洋中最重要的初级生产者，也是海洋生态系统中 食物链中最基础的一环。 浮游藻能漂浮或悬浮在有光的水面上做极其微弱的浮动，与其适应漂浮生活 的各种体型是分不开的。有的浮游藻为了增大与水面接触的表面积，其细胞周围 生出一圈刺毛、长长的刺或突起物，还有的成群结队的积在一块，以扩大表面积 来利于漂浮。 浮游藻植物形状各有特色，有纺锤形、扇形、星形等。它们多数是单细胞的， 也有许多是由单细胞结合起来的群体。既包括真核生物恸咖f 驯中的单细胞 藻类，如硅藻( d 砌d 册只肋c 刀肠，鲫哟棚) 、甲藻酬印砂舰d 加撕砌纪) 、绿藻 ( c 办，d 印细功、金藻( c 伽声9 砌砌) 、黄藻丹历印协亿) 等，又包括原核细胞型生 物妒m 忌口叼阳抛s ) ，如蓝藻( o 咖叩砂脚、聚球藻( s 朋p c 幻c c 螂) 等。绝大多数浮游 植物的个体都非常微小，只有几个至几百微米，只能在显微镜下才能看清楚其形 态结构，但其数量极多，代谢活动强烈。目前已在中国海记录到浮游藻1 8 1 7 种 【1 1 o 虽然浮游藻形体微小，运动能力较弱，但它的存在对整个地球生态系统来说 是极其重要的。首先，浮游藻处于有光的水体表面，它们在水面进行光合作用， 固定无机碳，使之转化为碳水化合物。据估计，全球约5 0 的初级生物力源于海 洋，而海洋浮游植物又是海洋初级生产力的最主要来源，仅硅藻一类就贡献了海 洋初级生产力的6 0 【2 1 。其次，浮游藻类是为地球提供化合氮的重要生物，如蓝 中国海洋大学硕士研究生学位论文 藻。最后，海洋浮游植物位于海洋食物链的最底层，它们是小型海洋动物，尤其 是海洋动物幼体的直接或间接饵料。某个海域浮游植物的生物量和多样性直接影 响该区域其它高级动物的多样性和分布。 1 1 2 赤潮 赤潮是海水中某些单细胞藻类，原生动物或细菌在一定的环境条件下爆发性 增殖或聚集在一起而引起水体变色的一种生态异常现象。一般称藻类大量繁殖的 现象为藻华，赤潮也被称为有害藻华( 地蛆) 。赤潮是一种自然生态现象，也是一 种人为因素引起的有害生态现象【3 】。 赤潮一般可分为有毒赤潮与无毒赤潮两类。有毒赤潮是指赤潮生物体内含有 某种毒素或能分泌出毒素的生物形成的赤潮。有毒赤潮一旦形成，可对赤潮区的 生态系统、海洋渔业、海洋环境、以及人体健康造成不同程度的损害。无毒赤潮 是指生物体内不含毒素，又不分泌毒素的生物体为主形成的赤潮。无毒赤潮对海 洋生态、海洋环境、海洋渔业也会产生不同程度的损害。 除了根据毒素的有无对赤潮进行划分外，赤潮还可以根据不同的标准有以下 不同的分类方法。首先，根据赤潮爆发的地点，可分为外海性赤潮和近岸、内湾 性赤潮。由于大洋上升流区或水团交汇处营养物质比较丰富，容易爆发外海性赤 潮。在中国主要分布于东海以南水域。近岸、内湾、河口性赤潮，指发生于近岸 区、内湾区或河口区等水城的赤潮。 其次，根据赤潮的来源可分为外来型和原发型赤潮。所谓外来型赤潮，是指 不是在原海域形成的赤潮，而是在其他水域形成后，由于风、浪、流等外力作用 被带到该海域的。其特点表现在持续时间比较短，有时候会把同一起赤潮的迁移 误认为两起发生在不同地方的赤潮。原发性赤潮是指原海域自身发生的赤潮，其 特点是持续时间较长，而且会反复出现。一般而言在内湾发生的赤潮大多是属于 原发性赤潮。 最后，根据引发的赤潮的生物种类的多少，可分为单相型、双相型和复合型 赤潮。单相型赤潮是指赤潮爆发时，只有一个赤潮生物种占绝对优势。同理，双 相型即指两种赤潮生物共存并同时占优势而形成的赤潮。复合型赤潮由三种以及 三种以上赤潮生物所引起，且每种的数量都占有总数的2 0 以上【4 1 。 2 0 0 8 年，中国沿海海域共发生赤潮6 8 次，累计面积1 3 7 3 8 平方公里。东海 仍为我国赤潮的高发区，其赤潮发生次数和累计面积分别占全海域的6 9 和8 8 2 常见赤潮藻r r l p 特征性图谱的建立 ( 表1 ) 。赤潮监控区及毗邻海域发生赤潮2 5 次，累计面积约5 9 0 0 平方公里 分别占牟海域赤潮发生次数和累计面秘的3 7 和4 3 。 表l2 0 0 8 年我国海域赤潮发生次数及面积表 ( 数据来自于中国海洋环境质量公报2 0 0 8 ) 海域名称南海东海黄海渤海 次数 8 4 74 21 面积( 平方公里) 6 01 2 0 7 01 5 7 83 0 藻、海洋卡盾藻等：还有无毒性的东海原甲藻、中肋骨条藻和角毛藻等( 图1 ) 。 在引发我国海域赤潮的主要藻种中，由东海原甲藻作为第一优势种引发的赤 潮2 2 次，累计面积8 3 3 0 平方公里；由中肋骨条藻作为第一优势种引发的赤潮 1 0 次，累计面积1 3 7 2 平方公里；由夜光藻作为第一优势种引发的赤潮5 次，累 计面积6 9 5 平方公里。这三种优势种引发的赤潮分别占赤潮总次数的5 44 和累 计面积的7 57 n 图1 引发我国海域赤潮的主要藻种( 2 0 0 8 ) ( 引自中国海洋环境质量公报2 0 0 8 ) 赤潮的危害主要表现在：首先，大量的二氧化碳被赤潮所消耗，使水体酸碱 度发生较大变化，从而影响海洋生物的群落结构；在赤潮发生过程中，由于大量 赤潮生物的疯长，阻挡了阳光到达水体的深度，降低了水体的透明度，导致生长 干水体深层的水草和海洋动物大量死亡，底层生物量锐减。其次，在赤潮生物疯 长过程中，不但竞争性消耗水中的营养物质，而且分泌一些抑制其他生物，七长的 物质，如赤潮藻毒素。结果导致水体中赤潮生物占绝对优势，而其他生物种类减 少，严重破坏水体的生物多样性。再次，赤潮生物的缺氧或造成水体累积大量硫 中国海洋大学硕士研究生学位论文 化氢和甲烷，隔绝了海水与大气圈的气体交换，使很多海洋生物窒息或者中毒而 死。最后，一些赤潮生物( 如某些甲藻) 产生的粘液附着在海洋动物的鳃上，妨 碍呼吸作用，使大型水生动物窒息而死，给近海养殖业造成巨大损失。许多赤潮 生物含有毒素，该毒素可使海洋动物因赤潮生物毒素的积累和食物链传递作用而 中毒死亡或生长繁殖受到影响【6 】。赤潮对人体健康的影响也很大，直接接触会引 起皮肤的不适，而一些挥发性毒素还可能能对眼睛和呼吸道产生影响，更主要的 是由于食物链的传递作用，有害赤潮产生的赤潮生物毒素会导致人类的中毒甚至 死亡。 由赤潮生物分泌产生或分解产生的危害性较大的几种毒素，根据中毒症状及 毒素传递媒介的类型，分为麻痹性贝毒( p a r a l ”i cs h e l l f i s hp o i s o n i i l g ，p s p ) 7 】、腹 泻性贝毒( d i a n 瞳l e t i cs h e l l f i s hp o i s o l l i n g ，d s p ) 、神经性贝毒( n e u r o l o g i cs h e l l f i s h p o i s o 血g ，n s p ) 、记忆缺失性贝毒( m s i cs h e l l f i s hp o i s o i l i n g ，a s p ) 、西加鱼毒 ( c i 舒塌由e r a f i s hp o i s o n n g ，c f p ) 和蓝细菌毒素( c y 锄o b a c t e r i at o x i i lp o i s o i 血g ，c t p ) 等。赤潮毒素具有毒性大、反应快、治疗困难等特点，1 9 8 3 1 9 9 2 年因麻痹性贝 毒引起的中毒人数达1 1 2 7 人，死亡3 4 人，世界各地也发生多起因食用受污海产 品而引起大范围中毒的事件【引。 1 2 核糖体基因 1 2 1 核糖体的生物学特性 核糖体是最小的细胞器，为椭球形的粒状小体，它的主要功能是合成蛋白质。 由于在光学显微镜镜下见不到其结构，在很长一段时间都不为人所知。直到1 9 5 3 年由黜b 血o n 和b r 0 吼用电镜观察植物细胞时才第一次发现。两年后，p a l a d 在 动物细胞中发现了核糖体，并进一步研究了它的化学成份和结构。1 9 5 8 年r o b e n s 根据化学成份命名为核糖核蛋白体，简称核糖体( 硒b o s 0 m e ) 。 核糖体存在于除哺乳类红细胞外的一切活细胞( 真核细胞、原核细胞) 中， 尤其在快速增值、分泌功能旺盛的细胞中比较多。 核糖体是合成蛋白质的细胞器，其功能是按照r 1 1 】刚a 的指令高效且精确由 氨基酸地合成多肽链，实现蛋白质的合成。核糖体无膜结构，主要由核糖体蛋白 质和核糖体r n a ( r r n a ) 构成，核糖体蛋白质存在于核糖体表面，占整个核糖 体4 0 左右，而核糖体i 矾a 几乎存在于核糖体的内部，占整个核糖体的6 0 左 4 常见赤潮藻r f l p 特征性图谱的建立 右。 核糖体可以按照不同的方式进行分类，根据其存在细胞中的部位，可分为细 胞质核糖体、线粒体核糖体和叶绿体核糖体。根据其生物类型可分为真核生物核 糖体和原核生物核糖体。根据沉降系数，可分为7 0 s 和8 0 s 的核糖体，s 为大分 子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位，可间接反应分子量的大小。前者存 在于线粒体，叶绿体以及细菌中，后者存在于真核细胞的细胞质中，有的漂浮在 细胞内，有的结集在一起。 在核糖体中，其基本功能都依赖于枞，的主要作用有：为t 时峪、 删阶渔以及多种蛋白合成因子提供结合位点：具有肽酰转移酶的活性，能够催化 肽键的合成；r r n a 还与核糖体大小亚基单位的结合、校正阅读、无意义链或框 架漂移的校正、以及抗菌素的作用有关。 虽然起主要作用的是r r n a ，但核糖体蛋白( r 蛋白质) 的作用也不能忽视， 当洲折叠成三维结构时，它的很多功能才能体现出来，而r 蛋白质对于r l a 折叠成三维结构的过程和维持其三维结构都是必不可少的：在蛋白质合成中，某 些核糖体蛋白可能对核糖体的构象起微调作用，使一些蛋白因子更易于结合于核 糖体上。 表2 桃在核糖体中的组成 r i a亚基类型 原核生物 2 3 s ，5 s大亚基 1 6 s 小亚基 真核生物2 8 s ，5 8 s ，5 s大亚基 1 8 s 小亚基 原核生物和真核生物的核糖体均由大、小两种亚基组成，r 鼢蛆和核糖体蛋 白结合于大亚基和小亚基上。原核生物的r r n a 分为三个区域：5 sr i 矾a 、1 6s r r n a 和2 3 sr r n a 。真核生物的r i a 分四个区域：5 sr r n a 、5 8 sr r n a 、18 s 涨和2 8 sr r n a 。其中大亚基具有一个或两个r i 矾a 分子，多数原核生物为 2 3 s “a 和5 sr r n a ，而多数真核生物为2 8 sr r n a 和5 8 sr r n a 。原核生物在 小亚基上具有一个r n a 分子，为1 6 sr i a ，而真核生物在小亚基上也只具有一 个分子，为1 8 sr r n a 。核糖体r n a 在各种生物中都有其特性，因此可以从不同 中国海洋大学硕 研究生学位论文 生物的r r n a 的序列的对比中得出关于生物进化历程的结论【9 l 。 r r n a 分子是由一个大的前体物( 口r e r r n a s ) 经过剪切等一系列转录后加 工的过程而成。原核生物r r n a 转录后加工如下：r r n a 前体被r n a 聚合酶i i i 等切成一定长度的r r n a 分于，然后在修饰酶的催化下进行相关的碱基修饰。最 后，与核糖体上的蛋白质结合，形成核糖体的大小亚基。转录产物主要包括：1 6 s r r n a 、2 3 sr r n a 和5 s r r n a 。两端是5 和3 外转录间隔区( 5 一e t s 和3 e t s ) ， 中间为内转录间隔区所分隔( i t s ) 。在1 6 sr r n a 和2 3 sr r n a 基因问的内转 录间隔区中，一般含有一个转运r n a ( t r n a ) 基因，在5 sr r n a 基因的3 端， 也可能含有一个或多个t r n a 基因叫。而真核生物的转录过程如下：首先，切除 5 端的前导序列( 外部的转录间隔序列) 。其次在中间产物中切下1 8 sr r n a 的 片段，这分别有两种途径，一种切点在1 8 s 删a 和58 sr r n a 之间的i t s 区， 产物分别2 0 sr r n a ( 含1 8 s r r n a 的片段) 和3 2 s r r n a ：后者的切点在1 8 sr r n a 序列和r r s 区的交界处，这样切出的的1 8 sr r n a 称为先成熟，无需再进行修整。 再次，两种途径中的3 2 sr r n a 和3 6 s 洲a 中间产物的58 sr r n a 和2 8 sr r n a 进行退火，5 8 sr r n a 弯曲和2 8 sr r n a 形成发夹结构。最后，通过外切酶的修 饰作用将前一途径中2 0 sr r n a 残余的i t s 切掉。而后一途径的1 8 sr r n a 无需 修整，1 8 sr r n a 形成。而外切酶也会将3 2 sr r n a 和3 6 s 埘q a 中发夹结构的弯 曲部分切开，形成5 8 s 删a 和2 8 s r r n a ( 图2 ) 。 在原棱生物中，含有一个或多个r d n a 操纵子散布于整个基因组中( 如大肠 杆菌中含有7 个操纵子) 。而在真核生物中，含有更多r d n a 拷贝，以6 u 后串 联重复的形式组织( 图3 ) 。 瀚1 # 常见赤潮藻r f l p 特征性图谱的建立 图2 真核细胞中核糖体r n a 的转录、转录后加工和组装 ( 引自l a f o n t 越n ee ta 1 ，2 0 0 6 ) 多。 寄 茎2 3 ss 萋 吨匿= = a _ 卜e = = = = 肿 一动g t 吣l 弧c h e d c h i oc o i 事 墨 16 s 鲁2 3 ss 晷16 s 弓2 3 ss 嚣 叫匠= = 叫卜= = = = 盈吃昏 一一， 3 0 s p o iip o ! i 。r lb s5 8 s2 s s5 s 。? l 1 8 s5 8 52 5 s5 s _ ：e = = = 】吨= 卜c = = = = = = ) 囫卜吨= = = = 卜e ) 1 = = = = = = 一- 固p ： - - - - - - - - - - 弓5 s l 3 s s i t b ) y e a s t p o i | i ip o i 8 s5 h 5z ，5i b 3，器sz j 5 ，二雹互= = 豳- 1 = 】_ 嚯婴窆= = 互互囹哆雹= = z 蛩吨= 卜电墨z = = 2 翌蛩一 一 4 5 5 。 ” - 4 5 s 一一 卜 5 sf c i u t p r )5 s 哆叫日呕扣d 屯) _ 囱+ 叫卜 c ) m a n w l a i i a n 图3 核糖体砌悄基因( r d n a ) 在不同生物中的结构 ( 引自l 舶n t 撕n ee t 甜。2 0 0 6 ) 1 2 2r d m 在分子生物学研究中的进展 在不同生物之间，核糖体d l 妊基因序列既有很高的保守性，又存在一定的 序列变异性。其保守性和变异性和生物的进化史相关，所以可以成为生物进化或 分类的分子指标。 真核生物中核糖体砌妣基因( r i ) n a ) 有4 种：5 8 sr d i n a ，、1 8 sr d n a 、2 8 s r d i n a 和5 sr d n a 。其中5 8 sr d n a 、1 8 sr d n a 、2 8 sr d n a 的基因组成一个转 其录单元，在基因组中是高度重复的序列。在其内部，转录单元内部之间存在一 些长度变化的序列，称为i t s ( i i l t e n l a l 仃a n s 嘶b e ds p a c e r ) 区序列间隔。转录单 元外部间也存在一些序列，称为e t s ( e x t e m a l1 m i l s c r i b c ds p a c e r ) 区序列间隔， 5 8 sr d i n a 在i t s l 和i t s 2 两个片段中间。1 8 s 、2 8 sr d n a 转录单元在植物中拷 贝数高达5 0 0 - 4 0 0 0 0 个。i t s l 、i t s 2 的转录产物在r r n a 转录后加工的过程中被 切掉，但是它们在r r n a 转录后加工的过程中，对维持r i 矾a 成熟前的构象起了 相当重要的作用【1 3 】。 i t s 序列是转录单元内部基因间隔区序列，其变异速率较快，适宜属级及种 级、甚至种下水平差异的比较。i t s 区长度虽然有一定的变化，但总体来说比较 7 中国海洋大学硕士研究生学位论文 稳定，i t s l 和i t s 2 之间包括5 8 s ，其总长度一般在5 0 0 b p 7 0 0 b p 之间，而i t s 附近的转录单元：5 8 sr d l n a 、1 8 sr d n a 、2 8 s 肼i a 序列相对来说都比较保守， 对p c r 条件来说，长度5 0 0 7 0 0 b p 扩增难度不大，而附近的序列保守更易于设 计通用引物对其序列进行扩增。所以，i t s 本身的特点导致它可以作为一个比较 显著的指标。 因此，近几年i t s 序列分析越来越多地用于物种的鉴定以及系统与进化的研 究。而在海洋浮游藻的领域中，g i r e su s u p 等以r i 斟a 基因为鉴定指标，首次对 彳沱加疗咖f 姗l 幼”o 切甩记j l l 豇与彳蛔鲫砌f “册其它种的亲缘关系进行了研究。对核 糖体序列进行分析后，通过构建系统进化树表明，彳f 鲫2 咖砌f f 更加倾向与 来自泰国的分离株彳绷胱瑚p 聚在一起。并且，该种与么棚伽，雠，彳叩纪刀p 砌 和a 廊甩加瑚p 聚为一支【1 4 1 。陈月琴等通过g e n b 锄k 中的序列信息设计引物，通 过p c r 扩增出亚历山大藻属( 彳，绷砌f 驯共5 种1 2 个株系的i t s 区片段，并 进行了测序，并对序列分析后构建了进化树。结果表明，亚历山大藻属在种间的 水平序列差异明显，而在种内的水平上i t s 区序列的十分保守，差异不大。证明 了i t s 区用于亚历山大藻属的种间分类鉴定是一个较稳定的指标【1 5 】。z e c l n 趾 等人通过p c r 获得了盘冠藻属内几个种的i t s 片段并测序，对比并分析了盘冠 藻属内几个种的i t s 序列，发现其中两个种的t i s 序列相似性高达9 9 5 以上， 建议将这两个种合并为一个种，而合其它种差异显著，并可用于属内不同种之间 的亲缘关系分析【1 6 1 。 在基因组中，1 8 sr i 矾a 基因为高度重复序列，约8 0 0 1 0 0 0 0 拷贝，在细胞 内连续排列。1 8 sr i 矾a 基因长度在2 0 0 0 b p 左右，由于进化过程相对缓慢，其基 因序列十分保守，所以如果1 8 sr r n a 基因存在变异，就可以成为一个比较宝贵 和稳定的分子标记，用于鉴定物种。在1 8 sr r n a 基因两端的保守区序列可以用 于设计引物，对1 8 sr i a 基因进行了扩增。随着的1 8 sr r n a 基因序列信息的 不断增多，为1 8 sr r n a 基因在物种鉴定中奠定了基础。 近年来，在赤潮藻种的分类鉴定领域，已开展了一些利用1 8 sr i a 基因进 行分子分类鉴定的研究。陈月琴等设计对我国东南海域赤潮原因种p 砌p d 声，如印及相关种类p g 肠6 d 阳和印d “c 厅p 疗f1 8 sr i a 基因引物扩增1 8 s r r n a 基因片段并进行测定构建了分子系统发育树进行系统发育分析。结果表明， 该赤潮原因种与球形棕囊藻p 咖6 口1 8 sr e i n a 序列完全相同，从分子水平鉴定 8 常见赤潮藻r f l p 特征性图谱的建立 了该赤潮原因种为尸咖6 d 期【1 7 1 。王波等曾对五种株赤潮原甲藻1 8 sr r n a 基因 全长序列进行扩增、克隆和序列测定并从g e i l b a n k 上下载1 3 个原甲藻1 8 s r r n a 基因接近全长的序列，构建原甲藻属的系统树进行了分析【1 8 】。苟万里等测 定了l 株分离自青岛胶州湾海水样品、从形态上初步确定为裸甲藻属 ( o 册聆d 枷f ”肌s p ，编号为g y n 1 5 ) 的核糖体基因( r d n a ) 和转录单元内间隔区 ( i n t e m a lt r 趾s c 曲e ds p a c e r ，i t s ) 序列，并利用该序列对该藻进行了初步鉴定【例。 晚e b y kd 等对9 种株原甲藻的1 8 sr n a 基因片段进行了扩增，并进行了分析 【2 0 】 o 1 3 基于核糖体序列对赤潮藻种的分子多态性研究 在很长一段时间里，对于赤潮藻种的分类识别主要依靠传统的显微观测方 法。对赤潮藻进行光学显微镜、电子扫描镜观察，根据其藻种的外部形态特征进 行分类，如鞭毛、壳面的花纹等。这种方法运用时间长，可靠性强，在藻类的鉴 定中一直起着不可替代的作用【2 l 】。但是，这个方法的缺点也是明显的，主要是操 作复杂，对相关操作人员的鉴别技术和经验要求较高。并且由于不同分类学家之 间的分类依据不同，形态学研究方法有一定的主观性，在微藻的种名界定上常有 分歧，为赤潮藻的分类鉴定的相关研究带来困难。 免疫技术作为初步从分子水平上对赤潮藻进行鉴定分类的技术，对显微观测 方法是一种有效的辅助手段。免疫技术的原理是把目标藻种注射到动物体中，产 生的抗体特异结合藻类细胞壁上的蛋白质，从而识别该目标藻种，但是由于容易 发生交叉反应，即标识了非靶细胞，并且不同学者的研究结果有时并不一致，该 方法也未能在微藻分类研究中得以广泛应用2 2 1 。 近年来，分子生物学技术被广泛地应用于微生物多样性的研究，其中以d n a 指纹图谱为基础的分子多态性技术使得微生物的分类更精确。这些技术主要包 括：限制性片段长度多态性分析( i 心l p ) 【2 3 2 5 1 、变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 【2 6 1 、温 度梯度凝胶电泳( t g g e ) 【2 7 。2 8 1 、单链构象多态性分析( s s c p ) 口9 。o 】、扩增片段长度 多态性分析( a f l p ) 【3 1 。3 3 1 、末端限制性片段长度多态性分析( t r f l p ) 【3 4 1 、随机 扩增d n a 多态性分析( m d ) 【3 5 。6 】等。 1 3 1 随机扩增多态性( 凡廿d ) 凡廿d ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o 印1 1 i s mo f d n a ) 技术是在p c r 技术基础 之上发展起来的一种分子水平的多态性分析手段。其原理是设计一系列的引物， 9 中国海洋大学硕士研究生学位论文 引物的碱基序列随机排列，然后对所研究基因组进行p c r 扩增，电泳分析，根 据扩增的条带来检测d n a 片段的多态性。由于引物之间的差异，使不同的引物 会扩增出不同的d n a 片段，所以，每一对引物即反映了其扩增的对应区域的 d n a 多态性。同一引物扩增的产物在电泳中的迁移率如果一致，可以认为其区 域的d n a 具有同源性。由于凡廿d 设计的引物数量可以很多，一系列引物的扩 增区域几乎可以覆盖整个基因组。因此，从这个角度来说，m 廿d 是可以对整个 基因组进行检测的【3 7 1 。李晋楠等应用凡”d 分子标记技术对7 株螺旋藻( 印护甜，切口) 进行分类学研究，为在d n a 水平建立分类与新品种鉴定的技术体系提供理论和 技术依据【3 引。韩笑天等应用凡廿d 技术对两地理株中肋骨条藻进行鉴别，以其 全d n a 及小亚基片段为模板进行黜心d 扩增，两不同地理株的中肋骨条藻表现 不同的d n a 多态性，从而认为两株中肋骨条藻应为种下的不同变种或亚种【3 9 j 。 凡神d 技术处于探索的阶段，其技术也存在一定的局限性：首先，其实验 的基因组来源不明，可能来自细胞核或细胞器，对其精确定位的难度较大。其次， 虽然心d 的实验操作步骤容易掌握，但是在p c r 反应中的条件控制难度较大， 对扩增产物的稳定性和质量难以控制。最后，有时候并非同源的电泳条带迁移率 也会一样，对整个基因组的多态性分析容易造成干扰。 1 3 2 变性梯度凝胶电泳( d g g e ) d g g e ( d e n a ：t i l n gq a d i e n tg e le l e c r o p h o r e s i s ) 是在凝胶电泳的基础上发展 起来的一项分子多态性的检测手段。其原理是，在化学变性剂的作用下，d n a 双链由于发生解链而在凝胶电泳中会停止，由于不同的d n a 碱基的差别，会导 致d n a 在不同的变性剂浓度中解链并停止，由其停留在凝胶中的不同位置，体 现所研究d n a 的多态性。 d g g e 是一项基于变性凝胶电泳的技术，其优点十分明显。首先，由于化学 变性剂的灵敏作用，其几乎可以对d n a 的全部突变进行检测，是一项比较灵敏 的多态性分析技术。其次，电泳前的操作是一个制备大量d n a 片段的过程，相 对来说，比较简单。最后，对一些特殊的d n a 修饰，如甲基化等，也能够检测 得到。但是它也具有一些缺点，如变性剂本身毒性较大，有一定的危险性。d g g e 进行凝胶电泳时时间较长，比较难以控制等。d g g e 对分离的片段有一定的限制 竺【删 寸 。 近年来，p c r - d g g e 技术越来越多地被用来对海洋微藻进行研究，其中包 l o 常见赤潮藻r f l p 特征性图谱的建立 括对海洋中微藻多样性的研究和藻种的鉴定。鲍磊等应用变性梯度凝胶电泳 ( d g g e ) 方法对厦门西海域超微型真核浮游生物的遗传多样性进行周年变化特 征研究分析。结果表明，厦门西海域典型测站的超微型真核浮游生物群落具有丰 富的多样性组成，厦门西海域超微型真核浮游生物群落遗传结构和主要类群组成 季节性变化显著【4 l 】。宋铁英运用对蓝细菌和硅藻1 6 sr i 矾a 特异的引物对，将稻 田土壤中提取的总d n a 进行p c r 扩增后，通过d g g e 技术对p c r 产物进行分 析。结果表明，在水稻生长的不同时期，稻田蓝细菌及硅藻种群也在变化，田间 不同位置蓝细菌及硅藻种类也有所不同，并且每一时期都有其优势的蓝细菌及硅 藻种群4 2 】。 1 3 3 扩增片段长度多态性( a f l p ) a f l p ( a n l p l i f i e df r 呵i l e ml e n g t l lp o b ，l o r p l l i s m ) 是凡廿d 技术和i 心l p 技 术相结合的一种方法。其原理是先将d n a 进行双酶切，对酶切的d n a 两端接 上已知d n a 序列的特定接头。这样，d n a 片段就具有了酶切位点和已知序列的 接头的双重特异性，根据双重特异性的相关信息设计引物，将特定的限制性酶切 d n a 片段分离开来。 a f l p 作为一种新兴的分子多态性的研究手段，其优点是相当明显的。首 先，由于a f l p 中也有p c r 的技术手段，所以其对d n a 要求的量相对较少。其 次，由于对特异性比较强的两端进行的引物设计，使引物特异性较强，对目标扩 增效率高。再次，a f l p 由于其标定的特异性较强，其结果的稳定性、可靠性以 及可重复性较强。a f l p 技术具有的优点，使其在生物的遗传多样性分析、标记 辅助育种、种质鉴定、基因定位、遗传图谱的构建、基因表达与调控以及分类进 化研究等领域得到了广泛的应用。潘洁通过对栉孔扇贝性状较好的两个人工选育 群体和野生群体的a f l p 标记分析，发现选育群体的杂合度明显的低于野生群 体，同时在遗传位点的频率上也有一些变化，揭示了人工选择压力对选育群体的 遗传结构产生的明显影响【4 3 1 。 但是a f l p 也有其缺点，如由于其中涉及p c r 、限制性酶切、d n a 连接等 多种实验过程，相对来说，过程比较复杂，比较难于掌握等。同时，a f l p 成本 相对其他分子多态性手段来说，成本较高。 1 3 4 单链构象多态性分析( s s c p ) s s c p ( s i n g l e - s t r a n dc o n f 0 加a t i o np o l y m o 印1 1 j s m ) 是从碱基结构的角度来对 中国海洋大学硕士研究生学位论文 d n a 序列的差异性进行分析的技术。其原理是由于d n a 片段本身呈比较复杂的 空间结构，这种立体结构的维持力主要来自于d n a 内部碱基配对等内相互作用 力。一旦d n a 序列中的碱基发生改变，会使其d n a 分子的立体结构发生变化， 在聚丙烯酰胺凝胶中，空间构象有差异的d n a 分子因为在凝胶中所受的阻力不 同会被非常敏锐的察觉到。因此，通过非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常 敏锐的将构象有差异的d n a 分子分开。 建立在p c r 基础上的s s c p 技术( p c r s s c p ) 更进一步提高了其检测的灵 敏度和简便性。其基本流程为，p c r 扩增目标d n a ，将目标d n a 变性后快速 复性，时期称为具有一定空间结构的单链d n a 分子，然后对其进行非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳，最后通过放射性自显影等手段对其迁移率进行分析。若目标 d n a 与正常d n a 的迁移率有差异，可以判断其d n a 空间结构的改变，并进一 步推断d n a 片段中的碱基的改变。 s s c p 最大的优势在于其简便、快捷、灵敏和不需要特殊的仪器等。但它的 缺点也很明显，如能判断出d n a 的差异，但是不能具体确定d n a 差异的位置。 另外，如果d n a 的碱基变化对d n a 空间构象影响较小的话，其差异性就不会 灵敏的被检测到等。 杨东、刘红艳运用p c r - s s c p 技术对尼罗罗非鱼基因进行了分析m 】。连玲 丽等p c r s s c p 法初步分析这些样品中巴斯德杆菌群体的遗传多样性【4 5 j 。尚丽 勤等采用p c r - s s c p 技术分析蚯蚓粪便的微生物群落结构，结果表明，在粪便的 不同空间层次上呈现出明显的空间分布多样性，并且与纯蚯蚓粪微生物种群的多 样性有很大的差别，为进一步的蚯蚓粪生态学功能研究提供了有益的指导1 4 6 j 。 1 3 5 限制性片段长度多态性( r f l p ) 限制性核酸内切酶( r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e ) 原理是识别特定的d n a 序 列，并由此切割d n a 双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯 化出来的。是人们在对噬菌体的宿主特异性的限制修饰现象进行研究时发现 的，细菌抵御病毒的方法就是运用限制性核酸内切酶对外源的病毒d n a 精 确识别，从而达到摧毁病毒复制d n a 的目的。而细菌自身由于固有的d n a 修饰酶( 通常是一种甲基化酶) 的保护作用而免受核酸内切酶的降解。 目前已经鉴定出来的核酸内切酶有三种不同的类型，即i 型酶、i i 型酶、 型酶，划分的主要依据在于其识别位点和切割位点。i 型酶对d n a 分子的切割 1 2 常见赤潮藻r f l p 特征性图谱的建立 方式十分奇特，它结合在d n a 识别位点上，但是不进行切割，在d n a 分子以 滚环的方式进行转位，而后会在结合部位5 端数千碱基处进行随机的切割。虽然 它能识别特异性的d n a 序列，但是由于其切割的方式是随机的切割，因此i 型 酶在d n a 的研究中没有什么实际的应用。i i 型酶是迄今为止用途最为广泛的核 酸内切酶。它识别的特异性位点也是其切割的位点，而且i i 型酶识别的位点都有 一个共同的特点：它们都具有双重旋转对称的结构形式( 回文结构) ，这样，切 割出来的d n a 末端为互补的粘性末端，对后续的d n a 操作是相当有用的。 型酶虽然也能识别特异性序列，但它识别的序列不是回文结构。并且，它的酶切 位点在识别位点一侧的2 5 b p 处，比较难以控制，所以，型酶在基因操作中也 没有什么实际用处【4 7 】。在一般的基因操作中，提到的核酸内切酶即为i i 型酶。 限制性片断长度多态性技术( r e 妯c t i 叩f 哪n tl e n g t hp o l 肿。删呱 r f l p ) 是8 0 年代伴随着限制性核酸内切酶的广泛应用发展起来一种d n a 多态性 分析技术。其原理是：生物d n a 序列中存在差异，如果限制性核酸内切酶正好 对d n a 序列的差异处进行识别，酶切后的条带通过凝胶电泳等手段显示出来， 就可以体现d n a 之间的差异性，从而达到对物种的鉴定和区分。 圆固 图4i 心l p 原