（发酵工程专业论文）螺旋藻对小鼠肠道菌群的影响研究.pdf

摘要 螺旋藻被誉为“生命的营养库，具有参与合成多种维生素、调节物质代谢、 刺激体内免疫系统、提高免疫力等功能，为了全面评价螺旋藻对小鼠肠道细菌菌 群的影响，实验以腹泻小鼠和正常小鼠为研究对象，采用灌胃和自然摄食的方式， 研究高、中、低剂量螺旋藻对小鼠粪便、空回肠、盲肠和结肠等部位可培养细菌 数量和细菌菌群多样性的影响，以阐述螺旋藻与肠道微生物之间的相互关系。 以腹泻小鼠粪便为研究对象的结果表明，生理盐水在一定程度上能够使被扰 乱的肠道菌群微生态平衡得以恢复，在灌胃处理8 d 后，粪便样品中细菌种类的 多样性指数由1 2 3 6 9 逐渐增大到1 3 8 1 2 ，与阳性对照小鼠肠道细菌菌群的相似 性由2 6 升高到5 2 。但是，螺旋藻的这种肠道菌群调整作用更为明显，当用 低剂量灌胃小鼠8 d 后，与灌胃生理盐水小鼠相比，粪便中有益菌双歧杆菌核乳 杆菌数量明显增高( p 0 0 1 ) ，而有害菌产气荚膜梭菌数量则明显降低( p 0 0 1 ) ， 菌群多样性指数由1 3 2 1 4 增大到1 5 1 1 3 ，与阳性对照小鼠肠道细菌菌群的相似 性达5 8 ；当用中剂量螺旋藻灌胃小鼠8 d 后，粪便样品中双歧杆菌、乳杆菌、 肠球菌、肠杆菌、拟杆菌和产气荚膜梭菌的数量接近正常小鼠，分别达到 7 4 8 1 07 c f u g ，7 3 0 1 07 c f u g ，5 0 2 x 1 0 c f u g ，7 0 9 x 1 0 7 c f u g 6 9 2 x 1 0 0 c f u g ， 5 8 l 1 0 5 c f u g ，菌群多样性由1 3 2 1 2 提高到1 5 1 2 1 ，与阳性对照小鼠肠道细菌菌 群的相似性达6 3 ；当用高剂量螺旋藻灌胃小鼠8 d 后，粪便样品中细菌菌群的 多样性指数最高，达到1 5 4 5 5 ，与阳性对照小鼠粪便样品中细菌菌群的相似性高 达8 0 。 以腹泻小鼠空回肠、盲肠和结肠为研究对象的结果表明，虽然空回肠可培养 细菌的数量明显低于盲肠、结肠，但各部位样品菌群的变化趋势均与粪便样品一 致，即任何剂量的螺旋藻处理，均能够促进腹泻小鼠肠道双歧杆菌和乳杆菌的增 值，而抑制产气荚膜梭菌的生长，由此看来当考察可培养细菌类群的变化时，粪 便样品能够反映肠道菌群的变化状况，只是不能真实的反映各菌群的准确数量。 另外，小鼠盲肠、结肠内容物的s s c p 条带与粪便样品的扩增条带相比，条带数 量约增加1 0 以上，说明小鼠盲肠、结肠内肠道菌群的种类要多于粪便样品，肠 道内容物总d n a 能为研究提供更多的信息。 以自然摄食螺旋藻的小鼠为研究对象的结果表明，虽然螺旋藻对可培养细菌 数量的影响不随时间呈现逐渐增高或降低的规律性变化，但不同处理剂量之间各 种生理类群细菌的变化趋势相同，当喂食螺旋藻的时间达到2 个月时，与正常摄 食饲料的小鼠相比，灌胃高、中、低剂量螺旋藻小鼠粪便中细菌的多样性指数分 别增高1 0 ，8 4 ，3 4 ，相似性系数分别降低1 2 8 ，7 6 ，5 3 ，灌胃高、 中、低剂量螺旋藻小鼠空回肠、盲肠和结肠内容物中细菌的变化与正常小鼠无显 著差异，说明螺旋藻明显影响了肠道细菌菌群的构成，但这种影响与螺旋藻生理 功能之间的关系还有待于进一步研究。 关键词：螺旋藻，腹泻模型，肠道菌群，e r i c - p c r ，单链构象多态性 a b s t r a e t s p i r u l i n aa st h e l i f en u t r i t i o nb a n k ”h a sm a n yf u n c t i o n si n c l u d i n gp a r t i c i p a t i n gi ns y n t h e s i z eav a r i e t yo fv i t a m i n s ，r e g u l a t em e t a b o l i s m ，s t i m u l a t et h eb o d y 。si m m u n es y s t e ma n di m p r o v e i m m u n e i no r d e rt oe v a l u a t et h ee f f e c t i o no fs p i r u l i n ao ni n t e s t i n a lb a c t e r i a lf l o r ai nm i c e ，t h e e x p e r i m e n tm a d ed i a r r h e am i c ea n dn o r m a lm i c ea st h eo b j e c t ，t os t u d yt h ee f f e c to fh i g h ，m i d d - l e ，l o wd o s es p i r u l i n ao nt h en u m b e ro fc u l t u r a b l eb a c t e r i aa n dt h ed i v e r s t yo fi n t e s t i n a lm i c r o f l o 。r ai nf e c a l , j e j u n u ma n di l e u m ，c a e c u m ，c o l o n ，t oe x p o u n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns p i r u l i n aa n i n t e s t i n a lm i c r o f l o r a t h er e s u l to fs t u d i n gt h ed i a r r h e am i c es h o w st h a t ，s a l i n ec a nr e c o v e rt h ei m b a l a n c e i n t e s t i n a lm i c r o f l o r at oac e r t a i ne x t e n t ，a f e rg a v a g es p i r u l i n af o r8 d ，t h ed i v e r s i t yi n d e xo ff e c a l s a m p l ei n c r e a s ef r o m1 2 36 9t o1 38 21 ，a n dt h es i m i l a r i t yw i t hi n t e s t i n a lm i c r o f l o r ai np o s i t i v e c o n t r o li n c r e a s ef r o m2 6 t o5 2 b u ts p i r u l i n ah a sam o r ee v i d e n te f f e c to na d j u s t i n gt h e i n t e s t i n a lm i c r o f l o r a a f t e rg a v a g el o wd o s es p i r u l i n af o r8 d ，t h en u m b e ro fb i f i d o b a c e r i u ma n d l a c t o b a c i l l u si nf e c a ls a m p l eh a v eas i g n i f i c a n ti n c r e s e ( p 0 01 ) ，a n dt h en u m b e ro fh a r m f u l c l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n si nf e c a ls a m p l eh a sd r o p e d ，t h ed i v e r s i t yi n d e xo fm i c r o f l o r ai n c r e a s e f r o m1 3 2 1 4t o1 5 1 1 3 ，t h es i m i l a r i t yw i t hi n t e s t i n a lm i c r o f l o r ai np o s i t i v ec o n t r o lw a s5 8 ： a f t e rg a v a g em i d d l ed o s es p i r u l i n af o r8 d ，t h en u m b e ro fb i f i d o b a c e r i u m ，l a c t o b a c i l l u s ， e n t e r o c o c c le n t e r o b a c t e r i a c e a e ，b a c t e r o i d e sa n dc l o s t r i d i u mp e ，步i n g e n sc l o s et on o r m a lm i c e ， a n dt h en u m b e rw a s 7 4 8 1 0 7 c f u g ，7 3 0 1 0 7 c f u g ，5 0 2 1 0 5 c f u g ，6 9 2 1 0 6 c f u g ，5 8 1 x 1 0 5 c f u g r e s p e c t i v e l y , t h ed i v e r s i t yi n d e xo fm i c r o f l o r ai n c r e a s ef r o m1 3 212t o1 5121 ，t h es i m i l a r i t yw i t h i n t e s t i n a lm i c r o f l o r ai np o s i t i v ec o n t r o lw a s8 0 t h er e s u l t so fs t u d i n gt h ej e j u n u ma n di l e u m ，c a e c u m ，c o l o ni nd i a r r h e am i c es h o wt h a t ，t h e n u m b e ro fc u l t u r a b l ef l o r ai nj e j u n u ma n di l e u mi ss i g n i f i c a n tl o w e rt h a nt h a ti nc a e c u ma n d c o l o n ，b u tt h ec h a n g et r e n di nv a r i o u sp a r t sa r et h es a m e ，t h a ti ss p i r u l i n ao fe a c hd o s ec a n p r o m o t et h ep r o l i f e r a t i o nb i f i d o b a c e r i u m ，l a c t o b a c i l l u si nd i a r r h e am i c ea n di n h i b i tt h eg r o w i n g o fc l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n s i ts a y st h a tw h e nt h i sm e t h o dw a su s e dt od e t e c tt h e c h a n g eo f c u l t u r a b l ef l o r a ，f e c a ls a m p l ec a nr e f l e c tt h ec h a n g et r e n do fi n t e s t i n a lm i c r o f l o r a ，b u tc a nn o t r e f l e c tt h en u m b e ro ff l o r aa c c u r a t l y b e s a i d e sc o m p a r et h ea m p l i e db a n d so ff e c a ls a m p l ew i t h c o n t e n t ss a m p l ef r o mc a e c u m ，c o l o n ，t h en u m b e ro fb a n d sh a si n c r e a s e d10 ，t h i ss h o w st h a tt h e k i n so fi n t e s t i n a lf l o r ai nc o n t e n t so fc a e c u ma n dc o l o ni sm o r et h a nt h a ti n f e c a l t h et o t a ld n a o fi n t e s t i n a lc o n t e n t sc a ns u p p l ym o r ei n f o r m a t i o n t h er e s u r so fs t u d y i n gm i c ef e ds p i r u l i n an o r m a l l ys h o wt h a t ，a l t h r o u g ht h ee f f e c to f s p i r u l i n ao nc u l t u r a b l ef l o r ad i d n th a v ear e g u l a t ei n c r e a s ec h a n g eo rd e c r e a s ec h a n g ea st i m e e x t e n d e d ，t h ec h a n g et r e n do fc u l t u r a b l ef l o r ai nv a r i o u sd o s et r e a t m e n t w h e nm i c ew e r er e d e d s p i r u l i n af o r2m o n t h s ，c o m p a r ew i t hm i c eg r o u pf e dn o r m a l l y ，t h ed i v e r s i t yo fi n t e s t i n a lf o r ai n f e c a lf r o mh i g h ，m i d d l e ，l o wd o s eg r o u ph a si n c r e a s e d1 0 ，8 4 ，3 4 r e p r e t i v e l y , a n ds i m i l a r i t y c o e f f i c e n th a sd e c r e a s e d12 8 ，7 6 ，5 3 ，t h ec h a n g eo ff l o r ai nj e j u n u ma n di l e u m ，c a e c u m ， c o l o nf r o mh i g h ，m i d d l e ，l o wg r o u pm i c eh a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sw i t hn o r m a lm i c e t h o s e s h o wt h a ts p i r u l i n ac a ne f f e c tt h ec o n s t r u c t i o no fi n t e s t i n a lm i c r o f l o r a b u tt h er e l a t o n s h i p b e t w e e nt h i se f f e c ta n dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n so f s p i r u l i n an e e df u t h e rs t u d y k e yw o r d s ：s p i r u l i n a ，d i a r r h e am o d e l ，i n t e s t i n a lm i c r o f l o r a ，e r i c p c r ，s s c p 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权说明 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 一、发表论文 1 李景，王素英，师德强螺旋藻对腹泻模型小鼠的影响 j 】微生物学通报，2 0 0 9 ，2 ( 2 7 ) ： 7 7 2 7 7 7 2 李景，王素英，周鑫分子生物学技术在肠道微生态中的应用【j 】黑龙江畜牧兽医( 已接收) 二、参加科研情况 研究生期间参与天津市重大科技攻关项目( n o 0 6 y f g z n c 0 4 2 0 0 ) “天津滨海地区适生 螺旋藻藻种选育中试研究及其生理活性物质研发”。 三、学位论文使用授权声明 学位论文作者同意授权天津商业大学将学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据 库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅或借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 7 l 前言 1肠道菌群 l j 刖吾 1 1肠道菌群分布 在动物消化道中栖息着一群微生物，在动物处于健康状态时，其种类和数量相对稳定 和平衡，被称为j 下常菌群或固有菌群或原籍菌群( n o r m a lb a c t e r i af l o r a ) ，他们是动物机体内 环境中不可缺少的组成部分，对动物是有益无害的。人和动物的胃肠道栖息的细菌大约3 0 个属5 0 0 多种，主要由厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成，专性厌氧菌占9 9 以上，其中 类杆菌占最大比例，其次为双歧杆菌( 见表1 ) 。 表1 胃肠道菌群分布 t a b l e ld i s t r i b u t i o no fg a s t r o i n t e s t i n a if l o r a 菌群胃空肠i 司肠粪便 需氧菌与兼性厌氧菌 肠杆菌o 1 0 2o 1 0 31 0 2 1 0 61 0 4 1 0 1 0 链球菌 o 1 0 2o 1 0 3 1 0 2 1 0 61 0 4 1 0 1 0 葡萄球菌0 1 0 2o 1 0 31 0 2 1 0 51 0 4 1 0 7 乳酸杆菌o 1 0 3o 1 0 4 1 0 2l o s 1 0 4 1 0 1 0 霉菌0 1 0 20 1 0 21 0 2 1 0 31 0 2 1 0 5 厌氧菌 拟杆菌 双歧杆菌 革兰氏刚性球菌 梭状芽孢杆凶 真杆菌 罕见 罕见 罕见 罕见 罕见 0 1 0 2 0 1 0 3 o 1 0 3 罕见 罕见 1 0 3 1 0 7 1 0 3 1 0 5 1 0 2 1 0 s 1 0 2 1 0 4 罕见 1 0 1 0 1 0 1 2 1 0 5 1 0 1 2 l o s 1 0 1 0 6 1 0 i l 1 0 9 1 0 1 2 注：1 数字的单位为：每l m l 或每l g 肠内容物所含菌数。 2 革兰氏阳性球菌包括消化链球菌和消化球菌属。 肠道中的细菌可分为三个部分：( 1 ) 生理性细菌为专性厌氧菌，是肠道的优势菌群，如 双歧杆菌、类杆菌、优杆菌和消化球菌等，具有营养及免疫调节作用；( 2 ) 条件致病菌以兼 性需氧菌为主，是肠道非优势菌群，如肠球菌、肠杆菌，在肠道微生态平衡时是无害的， 在特定的条件下具有侵袭性；( 3 ) 病原菌多为过路菌，长期定植机会少，生态平衡时，这些 前言 菌数量少，不会致病，如果数量超出正常水平，则可引起机体发病，如变形杆菌、假单胞 菌和产气荚膜梭菌等倥1 。胃的酸性环境极大地抑制了微生物的繁殖，由胃进入小肠的微生 物数量很少。胃内除了幽门螺杆菌或相关的菌种外，大多数是革兰氏阳性的需氧菌，如链 球菌、葡萄球菌、奈瑟菌、乳酸菌和念珠菌，细菌浓度通常小于1 0 3c f u m l ：在无酸的胃 中细菌数会明显增多。幽门螺杆菌是真正的胃内细菌，它是引起胃炎的主要致病因子，是溃 疡病的重要致病因子。 小肠是个过渡区，肠液流量大，足以将细菌在繁殖前冲洗到远端回肠和结肠，十二指 肠和空肠相对无菌，含菌浓度为0 1 0 5 c f u m l ，主要菌种是革兰氏阳性的需氧菌，包括链 球菌、葡萄球菌和乳酸杆菌。在回肠中，革兰氏阴性菌的数量开始超过革兰氏阳性菌，含 菌浓度为1 0 3 1 07 c f u m l 。 盲肠中的细菌浓度达1 0 1 0 1 0 眩c f u m l ，厌氧菌超过需氧菌1 0 2 1 0 4 倍，主要以拟杆 菌、真杆菌和双歧杆菌以及厌氧的革兰氏阳性球菌为主，这些肠道固有菌群在维持肠道功 能方面具有举足轻重的作用1 。 1 2肠道菌群对动物免疫的影响 肠道菌群的重要生理意义包括抵御病原体侵袭、刺激机体免疫器官的成熟、激活免疫 系统及参与合成多种维生素、调节物质代谢等。 1 2 1 菌群屏障作用 动物的非特异性免疫应答，主要依靠机体的屏障作用，包括正常菌群、机体的皮肤粘膜、 补体等体液因子、吞噬细胞等。其中正常菌群的屏障作用是极为重要的一个方面h 1 。1 9 7 1 年荷兰微生物学家v a nd e rw a a i j 教授提出肠道微生物定植抗力( c o l o n i z a t i o nr e s i s t a n c e ，c r ) 的观点，认为粪便中需氧革兰氏阴性杆菌、肠球菌、酵母菌的数量及双歧杆菌与肠杆菌的数 量比值( b e 值) 可作为肠道微生物定植抗力的指标。 1 2 2 肠道菌群与粘膜免疫 动物出生时的肠道是无菌的，肠道菌群定植开始于出生后，菌群的发展和肠粘膜屏障 的建立是一个渐进而互动的过程。一般认为，肠道产生免疫作用依赖于原籍菌群。肠道菌 群是肠粘膜屏障重要的组成部分，包括其参与构成机械屏障、菌群与粘膜共价结合、与机 体产生的酶和活性肽以及代谢产物共同组成化学屏障、免疫激活作用产l - - i g aj g i i g m 及其 各种免疫活性细胞和细胞因子等。g a u f f i n 等对营养不良的鼠模型喂以乳杆菌阻c a s e i ) ，测 定小肠免疫球蛋白分泌细胞、上皮层内的淋巴细胞、杆细胞和杯状细胞的结构和超微结构 2 前言 嘲，发现由营养不良导致的肠粘膜屏障和粘膜免疫功能损害，可以通过l c a s e i 的补充而恢 复。还有m a d s e n 等用益生菌治疗i l 1 0 基因缺陷鼠的大肠炎，发现益生菌对肠粘膜屏障功 能有上调作用h 3 。分泌型球蛋i 兰t ( s i g a ) 是粘膜免疫的主要效应因子，可有效中和粘膜上皮 内的病原体，捕捉粘膜内层病原体，形成免疫复合物排出体外，在局部的抗感染过程中起 着关键作用碑1 。研究发现，双歧杆菌抑制其它肠道菌的效果与s i g a 有关。短双歧杆菌能促 进小肠淋巴组织集合b 细胞增生，诱导淋巴组织集合的浆细胞产生大量的s i g a ，进而增强 机体的免疫功能。无菌动物喂服双歧杆菌后，随着双歧杆菌在体内的定植，p e y e r 结内淋 巴滤泡大量增生，产生s i g a 增多，同时肠道菌群向肠系膜淋巴结迁移的细菌数量随之减 少，肠道屏障机制趋于成熟1 ，干酪乳杆菌也能促进s i g a 的分泌n 0 1 。 1 2 3 促进免疫器官的生长发育 益生菌能促进机体免疫器官的生长、发育、成熟，增加t 、b 淋巴细胞的数量，增加 胸腺淋巴细胞免疫球蛋白含量。有关研究表明，实验组免疫器官内的淋巴细胞密集，浆细 胞的数量增多，中枢免疫器官的淋巴细胞和网状内皮细胞数量增多。张日俊等用含有乳酸 杆菌、芽孢杆菌和酵母菌的微生物饲料添加剂饲喂肉仔鸡，结果表明其能明显刺激胸腺、 脾脏和法氏囊的发育，以及增强鸡t 淋巴细胞对丝裂原c o n a 或b 淋巴细胞对丝裂原l p s 刺激的反应性，即能明显增强机体的细胞免疫和体液免疫功能n 。 1 2 4 激活免疫因子 有研究报道，肠道菌群能明显激活巨噬细胞活性、促进细胞因子介导素的分泌，增强 免疫功能，提高宿主的抗病能力。在某些情况下，这些因子可以代替免疫调节剂，刺激造 血活性，增强成熟细胞的功能，例如i l 1 、粒细胞集落刺激因子及少量的肿瘤坏死因子( t n f ) 能增强对感染的抵抗力n 铂。研究发现，双歧杆菌能刺激免疫细胞分泌i l 1 和i l 6 ，而i l 1 又 可促进t 辅助细胞分泌i l 2 和b 淋巴细胞分泌抗体，也能增强n k 细胞的杀伤功能；同时， i l 一6 可促进b 淋巴细胞的分化成熟，使之分泌抗体，又可直接诱导t 淋巴细胞的增殖并 参与t 淋巴细胞、c t l 、n k 细胞及l a k 的细胞分化“卅。双歧杆菌对t 细胞的增殖和i l 2 的产生没有直接作用，但能诱导t n f q 、i l 1 3 、i l 6 、i l 1 0 和i f n q 的m r n a 表达n 引。 1 3肠道菌群与人体健康 人一出尘后与外界环境中的微生物接触，通过演替过程，在体内和体表逐步形成正常 微生物群生态系。据统计，一个成年人体细胞大约1 0 ”个，而其体表和体内所携带的微生 物竟有1 0 1 。个，这样庞大的微生物群以一定的种类和比例存在于机体特定的部位，参与机 3 前言 体的生命活动，与宿主细胞进行物质、能量和基因的交流，对宿主的生长发育、消化吸收、 生物拮抗及免疫等方面发挥不可代替的生理作用，共同维持着生命过程n5 1 。可以说，没有 正常的微生物群对人体的保护，人类就不可能健康的生长和发育。因此，正常微生物群是 机体生命不可分割的一部分。 在人体正常微生物群中，有7 8 6 ( w w ) 栖息在肠道，包括5 0 多个菌属4 0 0 5 0 0 种微生 物“吼汀1 ，肠内主要细菌的数量和作用见图l 嵋1 。 ，类扦菌 囊tc f u l 9 1 0 9 - 1 0 ， = ：性。i 消化球菌 l 、取歧杆菌 乳杆菌 鹕t 三 肠内茁功能 ，l 、 鞑强芏作m 厂_ 、 ( 再( 向性) 肠内腐败( n i - t ，、h 】s 、 酶、胺、酚) 致瘸物 一傻避衰老 l 毒鬻 ( 致病性 f 对皮肤粘膜、脏器及 1 一自身感染l i 血行感染 图l 肠道主要细菌的数最和作用 f i g 1 。l b en l h i b c r sa n de f f e c t 5o fp r e d o m i n a n ti n t e s t i n a lb a c t e r i a 4 前言 从图l 中可以看出肠道菌群对宿主产生各种各样的影响，或有益或有害。在正常情况 下，肠道菌群间保持共生与拮抗的关系，在数量和种类比例上处于一种自稳平衡状态，因 种种原因( 如食物、精神压力、老化、各种疾病、免疫失调、抗生素的使用等) 肠道正常 菌群出现数量和种类比例上的异常，就会造成平衡失调，影响宿主健康，甚至导致疾病的 发生。食物是影响肠道菌群构成的重要因素之一，肠道菌j 群的生长底物主要来自上消化道 的食物成分。因此，通过外源性食物来调节双歧杆菌等有益菌在肠道内的增殖，维持或调 整肠道微生态平衡，促进肠道菌群向更加有利于宿主健康的生理性组合状态转变，达到增 进宿主健康的目的，一直受到微生态学家的密切关注，也是微生态保健食品研究的重要组 成部分m 驯。 2胃肠菌群区系结构微生态学研究方法 传统培养分离方法是最早的认识微生物群落结构和多样性的方法，自1 8 8 0 年发明以来 一直到现在仍被广泛使用。1 9 8 7 年以前，对微生态系统中生物群落的多样性及群落结构的 分析大多是将微生物进行分离培养计数，然后通过一般生物化学性状或特定表现型来分 析。h a r t e m i n k 等人心妇于1 9 9 7 年提出了活菌定量培养记数f 向方法，可选择性地从粪便中分 离出乳杆菌。近年来，有人采用此方法对j 下常人体肠道菌群进行了调查与测定暾1 ，也有人 采用此方法对极端或特殊条件下人群的胃肠微生态分布进行了研究，从而掌握了人体在极 端或特殊的条件下肠道菌群分布的微生态学特性乜3 。引。这种方法有其计数简单、方便和实 用等优点，但只能研究比较容易培养的微生物，对于那些与宿主和其它的微生物有较强的 互惠共生关系或具体生长条件不清楚的微生物则很难分离培养及进行观察。另外，选择性 培养基和严格厌氧条件等因素，也限制了所能观察到的微生物范围瞳引，据估计在肠道中能 培养到的微生物仅占肠道微生物的1 0 - - - 5 0 t 拍 扭) 。 传统的微生物技术远远不能满足微生物生态学研究的需要，为了充分了解肠道菌群的 多样性，把握肠道内环境变化对菌群的影响，进而阐明食物、药物与肠道菌群、人类健康 之间的关系，为保健食品和药物研制提供理论依据，近年来，随着分子生物学研究的飞速 发展，人们将原位生态研究的分子生物技术应用予胃肠微生态研究，创造了以1 6 sr d n a 和 e r i c 为分析对象的多种实验技术，包括分子杂交法、s s c p 法、d g g e 法、t g g e 法、r f l p 法、e r i c p c r 法和基因芯片等，具有很高的灵敏性，与传统的培养方法或其它不依赖培 养技术的方法相比显示出明显的优越性，推动了微生物群落结构研究的快速发展。 前言 2 11 6 sr d n a 为分析对象的分子生物学技术 。 1 6 sr r n a 存在于所有的生物中，特别是其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上 具有高度的保守性，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术来较容易地得到其 序列。细菌的1 6 sr r n a 可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守，所以可以利 用恒定区序列设计引物将1 6 sr r n a 片断扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、 菌种的细菌进行分类鉴定，并可通过对其序列的分析，判定不同菌属、菌种间遗传关系的 远近，对不同细菌的1 6 sr r n a 序列进行同源性比较分析是推断细菌的系统发育及进化关 系的一个重要方法。 2 1 1 限制性片段长度多态性( r f l p ) 限制性片段长度多念性( r f l p ) 分子标记的基本原理是用限制性内切酶酶切基因组 d n a ，产生大小不等的d n a 片段，通过电泳和s o u t h e r n 印记转移到支持膜上，利用同位素 或非同位素标记的某一片段d n a 作为探针，使酶切片段与探针杂交，从而显示与探针有同 源序列的酶切片段在长度上的差异，可能是限制性内切酶识别位点的改变，也可能是部分 片段的缺失、插入、易位、倒位等，显示出丰富的多态。 在此基础上发展了末端标记限制性片段长度多态性( ，f r f l p ) ，引物的5 端用荧光物 质标记，所得到的p c r 产物一端就带有这种荧光标记，只有末端带荧光标记的片段能被检 测到，而其它没有带荧光标记的片段则检测不到。这些末端标记的片段就可以反映微生物 群落组成情况，因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的细菌，也就是说一种末端 限制性片段至少代表一种细菌。因此，选用合适的目的基因片断，t r f l p 就可用于微生物 群落结构的分析。 当前关于t - r f l p 的资料是用它来进行细菌群落结构的分析以及不同群落结构间的比 较，其中尤其以调查土壤中- 吼舯。惦1 以及经济动物体内啪3 细菌群落的构成为主，l i u 等7 3 将6 种 已知菌混合在一起组成模拟的群落，然后做t r f l p 分析后，获得了6 种t r f 片段，验证 了该方法，表明该方法是目前分析细菌群落结构的强有力的工具。g o n g 等嘞1 将基于1 6 s r d n a 的t r f l p 用于分析鸡盲肠和回肠中的细菌组成。m r o e a c a n u d a s 等【3 9 1 应用r f l p 技 术，以p c r r f l p 片段数量为微生物菌群多样性指标，分析了不同类型的不易消化碳水化 合物对处于生长期的猪结肠内微生物菌群的多样性影响，发现添加了甜菜渣和粗玉米的饲 料能调节猪结肠内微生物菌群，保持其稳定。 作为一种技术，t r f l p 有其自身的缺陷。首先该技术依赖于p c r 和限制性酶切技术， 当近缘种微生物在扩增片段靠近荧光标记端的切点一样时，该技术无法区分出这些近缘 6 前言 种，所以在t r f l p 的峰值图上，一个峰代表的有可能不只是一个种。另外，对每个峰的定 量只是建立在p c r 技术的基础上，定量的结果也只是一个相对的含量，不可能真正代表该 微生物在某一生态系统中的绝对含量。样品中的总d n a 的提取和限制性内切酶的选择是影 响到分析结果的关键因素。待测片段的长度也会影响结果，这是因为随着片段长度的增加， 测序仪检测分辨率降低，测序仪检测5 0 0 b p 以上精度不够。 2 1 2 单链构象多态技术( s s c p ) 单链构象多念技术( s s c p ) 根据形成不同构象的等长的d n a 单链在中性聚丙烯酰胺 凝胶中电泳迁移率变化来检测基因组d n a 多态性。当单链d n a 链内发生单碱基插入或缺失 时，它在中性聚丙烯酰胺凝胶中的二级空间构象发生改变，导致电泳迁移率变化而产生泳 动变位，在电泳谱带上表现出多态性。 l e e 等n 叫首先将s s c p 技术应用于微生物群落组成的分析。赵阳国等心采用单链构象多 态性技术( s s c p ) 分别对稳定运行的脱氮除磷反应器( n ) ，中药废水处理反应器( p ) ，啤酒废水 处理反应器( w ) ，糖蜜废水发酵制氢反应器( h ) 以及硫酸盐还原反应器( s ) 等5 种废水处理系 统中的微生物群落结构进行了解析，这说明s s c p 指纹图谱技术能够揭示不同处理系统中 微生物群落结构的差别。s t e p h a nj o t t n 应用s s c p 技术分析粪便样品在保存期间发生的变 化，发现粪便样品在室温或4 保存8 h - 2 4 h 后，肠道菌群的多样性和数量都有显著减少。 s s c p 技术在肠道微生态的应用尚处于起步阶段，许多方法还需完善统一。s s c p 图 谱与群落实际结构符合程度有待提高，这主要是由基因组d n a 提取方法和p c r 选择性放 大造成的偏差，到目前为止还没有更好的办法消除；s s c p 图谱的重现性较差，易受凝胶 浓度及电泳温度等条件的影响，而且异源双链s s c p 图谱过于复杂，一种菌对应多个条带 的现象大大增加了后续试验的难度，在进行群落的动态分析时有一定的灵敏度限制，无法 检测到不影响序列三维构象的碱基替换；常规的双链分子质量标记无法应用于单链d n a 的s s c p 图谱中，虽然可以采用不同纯培养细菌的同一扩增位置作为分子质量标记，但纯 培养往往又很难获得，进一步对s s c p 技术进行优化，必然使其显现更强大的应用力。 2 1 3p c r d g g e t g g e 变性梯度凝胶电泳技术( d g g e ) 是由f i s c h e r 幂1 1 l e r m a n 让1 于1 9 7 9 年最先提出的用于检 j 9 1 s d n a 突变的一种电泳技术，它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高，可 以检测到一个核苷酸水平的差异。基于与d g g e 相同原理，又相继出现了用温度梯度代替化 学变性剂的温度梯度凝胶电泳( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t g g e ) 瞬时温度 梯度凝胶电泳( t e m p o r a lt e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t t g e ) 等技术。该技术很 7 前言 突出的优点是可以从凝胶中切下谱带，然后用测序分析来揭示群落成员系统发育的关系， 进一步可以用类群特异探针来同群落图谱杂交，检测出特异细菌种群的存在。 1 9 8 5 年m y e r s 等首次在d g g e 中使用“g c 夹板 和异源双链技术，使该技术日臻 完善。1 9 9 3 年m u t e r “3 3 等首次将d g g e 技术应用于分子微生物学研究领域，并证实了这种 技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。最近十年 d g g e 已经广泛应用于各种环境微生物生态的研究，如高温热泉、湖泊、江河、海洋、根 际、土壤、沙丘等，这种技术也被许多研究者( z o e t e n d a l 等，1 9 9 8 ；k o n s t a n t i n o v 等，2 0 0 3 ； k o c h er g i n s k a y a 等，2 0 0 1 ) n 4 叫8 1 用于人、非反刍动物及反刍动物胃肠道微生物的研究中。 m e iw a n g 等同时应用t - r f l p 和t t g e 分析患有特应性湿疹婴儿和健康婴儿粪便，发现患有特 应性湿疹婴儿在出生后的1 8 个月中，其粪便中的菌群多样性有减少现象 。这些试验结果 表明，d g g e 能有效地分析胃肠道微生态系统的多样性，通过指纹图谱直接再现群落结构、 监测其种群的变化，并且在研究微生物多样性时有其独特的优势，在扩增引物的5 端加 上一个g c 夹板，能分离出一个碱基( b p ) 的差异，其重复性也较好，目前已经成为肠道微 生物多样性和动态性分析的强有力工具。 2 1 4 基因芯片( d n am i g r o a t r a y ) 技术 目前一种检测生态中菌群的新方法一基因芯片技术正被广泛使用，该技术是采用光导 原位合成或微量点样等方法。将大量d n a 探针如基因、p c r 产物、人工合成的寡核苷酸等有 序地固定在载体表面。形成储存有大量信息的高密度d n a 微阵列。该微阵列与标记的核酸 样品杂交后，能快速、准确、大规模地获取样品核酸序列信息。最初该技术是用来检测生 长细胞中某些基因的表达，随后发现该技术也适合各种生态系统中菌群研究。w a n g 等建立 了人胃肠道中4 0 种主要细菌的基因芯片鉴定技术“刚，在医学方面该技术也已被广泛用于致 病菌的鉴定引。 基因芯片技术最关键的两个问题是探针的特异性和定量信号的灵敏性。为了解决这些 问题，c h a n d l e r 等构建出一个能有效克服二级、三级结构影响的双探针体系( t w op r o b e p r o x i m a lc h a p e r o n e d e t e c t i o ns y s t e m ) 唧1 ，能有效防止空间结构( 碱基堆积) 对杂交的影响。并 且显著提高单碱基错配的鉴别能力。b u s t i 等设计了种特异性的连接酶检测反应探针b ，其 中每对探针由鉴别寡核酸探和通用探针组成，该方法能有效地分辨各菌种间1 6 sr d n a 单 个碱基的差别。 由于芯片技术与传统的杂交技术相比，有检测系统微型化，对样品的需要量非常少， 效率高，能高通量检测d n a 序列，更好地解释基因之间表达的相互关系及检测基因表达变 8 前言 化的灵敏度高等优点，基因芯片的应用前景无疑是非常广阔的。但目前基因芯片还处在研 究阶段，要成为临床可以普遍采用的技术仍有一些问题急待解决。基因芯片技术的一些基 本问题，如靶分子浓度、探针浓度、杂交双方的序列组成、盐浓度及温度等对杂交的动力 学影响，探针对杂交体的稳定性影响还不是很清楚，这都需要进一步研究掌握其生物物理 学和生物化学的性质。随着研究的不断深入和技术的更加完善，基因芯片一定会在生命科 学研究领域发挥出其l i e ) 、l 的作用。 2 1 5 荧光原位杂交( f i s h ) 荧光原位杂交在本质上属于分子杂交，作为一种不依赖p c r 的分子分析技术是以上各 种分子标记技术的有益补充。它结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息，可以 在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体，同时对微生物群落进行评 价。荧光原位杂交是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶d n a 分子或r n a 分 子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交 后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的d n a 区域或r n a 分子 在染色体或其它细胞器中的定位。 e f f i ea p o s t o l o u 等钉应用荧光原位杂交法分析了健康人和牛奶敏感人在补充鼠李糖乳 杆菌( l g g ) 4 周前后的粪便中的肠道菌群变化，发现牛奶敏感人肠道中的菌群与健康人 无异，l g g 能显著增加健康人肠道中各优势菌群的数量，而对牛奶敏感人肠道中菌量则无 效果。h i r o m a s at a k a i s h i 等瞄3 1 在研究炎症性肠炎与肠道菌群失衡的关系时，应用f i s h 分析 了肠道优势菌群在肠道中的分布。s j a n e c z k o 等西1 1 应用荧光原位杂交分析患有炎症性肠病和 正常健康的猫十二指肠粘膜菌群的变化，发现患有炎症性肠病的猫的十二指肠粘膜上附着 的肠杆菌要比健康猫十二指肠粘膜的菌量多。 f i s h 技术可以作为分析胃肠道微生态的一种方法，但其存在如样品自身产生荧光、 探针特异性不足、t i 氏r r n a 含量以及杂交后荧光标记见光褪色等不足之处，并且只能用来 检测事先估计到其存在、已知其目标基因序列并为之设计好引物的类群，所以在进行微生 物群落研究时，要结合其它分子生物学的多种方法，才能得到更多的信息。 2 2e r i c 为分析对象的分子生物学技术 肠杆菌基因间重复共有序列( e n t e r o b a c t e r i a lr e p e t i t i v e n t e r g e n i cc o n s e n s u s ，e r i c ) 是在 肠道细