（环境科学专业论文）诱导表达细胞camcambp对烟草超氧化物歧化酶及其同工酶的调控效应.pdf

至直堕薹- 大兰堡土堑塑生兰些丝苎一 缩写表 缩写英 文名称中文名称 云南师范大学烦士研究生学位论文 p d e p g e p m s f p o d s o d s v t c a t e t ( t c ) t f p t r i s p h o s p h o d i e s t e r a s e p l o y a c r y l a m i d eg e le l e c t m p h o r e s i s p h e n y l m e t h a n s u l f o n y l f l u o f i d p e r o x i d a s e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e s n a k ev e n o m t r i c h l o r o a c e t i ca c i d t e t r a c y c l i n e t r i f l u o p e r a z i n e t r i s 一( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m et h a n e 2 磷酸二酯酶 聚丙烯酰胺凝胶 电泳 苯甲基磺酰氟 过氧化物酶 超氧化物歧化酶 蛇毒 三氯乙酸 四环素 三氟啦嗪 三( 羟甲基) 氨基 乙烷 量黧塑篷查主篓圭堑! i 兰耋燕篷茎一 摘要 奉文以诱导性表达细胞鹱c a m c a m b p 两个转麓围烟草株系势实骏材料，研究了 诱导上灞秘下溪c a m 活注对s o i ) 及其三粪嚣工簿瀵注稳影礁。 实验内容共分两部分： 第一部分测定了l o 个诱导表达细胞核c a m 的转基因烟草株系的活性，从 中筛选出3 个能良好诱导表达的株系( 5 c 、5 l 、1 3 ) ：进步深入硪究了烟草幼苗 经豇诱甏碡8 小鼓，以及潮孳藤傣时窭片经诱器嚣小辩遘程中c a m 活缝鲍动 态变纯。 第二部分利用已经检测出的诱导表达细胞质c a m 的转基因烟草h 1 2 c ，以 及诱导裁达细胞质c a m b p 的转基因烟草h 3 1 9 ，进行s o d 及其同工懿的研究。结 果表暇：缀t c 诱导筑转基因炳擎h i - 2 c ，s 总涵幢、鞋及三种丽王酶的活往明 显裹予对麓h 0 2 0 2 0 及未经髓诱导戆；穗爰，经k 诱导鲮转基嚣涵辇 i 3 + 1 9 ，s o d 总活性、以及三类同工酶的活能明显低于对照h 0 2 0 2 0 及未经t c 诱导的。最后通过 聚丙烯酰胺凝胶电泳、活性定位染色鉴别了转基因烟草叶片中s o d 周工酶类型。 关键词：转基因烟草、钙调素、超氧化物歧化酶、同工酶、叶圆片 墨壅些苎查兰堡翌! 窒兰兰竺笙茎 一 a b s t r a c t u s i n gt w os e r i e s o ft h et r a n s g e n i ct o b a c c oe x p r e s s i n gc y t o s o l i cc a m c a m b pa s e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s ，w es t u d i e d t h e i m p a c t o fc a ma c t i v i t yo ns o da n di t s i s o e n z y r n e s t h ed i s s e r t a t i o ni sd i v i d e di n t ot w op a r t s ： p a r tiw em e a s u r e dt h ec a ma c t i v i t yo f10v a n s g e n i ct o b a c c ol i n e se x p r e s s i n g n u c l e a rc a ma n ds e l e c t e dt h r e eg o o dt r a n s g e n i ct o b a c c ol i n e s ( 5 c ，5 la n d l 3 ) i nt h i sp a r t ， t h em a t e f i a l sf o rt h en e x te x p e r i m e n tw e r es c r e e n e da n dt h eo p t i m u mt c i n d u c i b l et i m e w a sc o n f i r m e d p a r ti i u s i n gt h et w ot c i n d u c i b l ee x p r e s s i n gc y t o p l a s m i cc a m c a m b pt r a n s g e n i c t o b a c c ol i n e s ( h 1 2 c ，h 3 - 1 9 ) l e a fd i s k sa s e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s ，w em e a s u r e dt h e a c t i v i t yo fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) a n dt h e i ri s o e n z y m e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t s o da n di s o e n z y m ea c t i v i t i e so f t c i n d u c i b l et r a n s g e n i ct o b a c c o ( 2 c ) w e r eh i g h e rt h a n t h o s ew i t h o u tt c i n d u c i b l e ，a n dt h et r a n s g e n i ct o b a c c o ( 2 c ) w i t h o u tt c i n d u c i b l ew a s h i 【g h e rt h a nt h ec o n t r o l ( h 0 2 0 2 0 ) o nt h ec o n t r a r y ，s o da n di s o e n z y m ea c t i v i t i e so f t c i n d u c i b l et r a n s g e n i ct o b a c c o ( 1 9 ) w e r el o w e rt h a nt h o s ew i t h o u tt c i n d u c i b l e ，a n dt h e t r a n s g e n i ct o b a c c o ( 1 9 ) w i t h o u tt c i n d u c i b l ew a sl o w e rt h a nt h ec o n t r o l ( h 0 2 0 2 0 ) 。t h e s e r e s u l t sw e r ec o n f i r m e db yp l o y a c r y l a m i d eg e le l c c t r o p h o r e s i s ( p g e ) t h er e s u l t sa b o v e i m p l i e dt h a tc a mm i g h tp l a ya ni m p o r t a n tr o l e i n r e g u l a t i n gs o da n di s o e n z y m e a c t i v i t i s eo ft r a n s g e n i ct o b a c c o k e yw o r d s ：t r a n s g e n i ct o b a c c o ，e a l o m o d u l i n ( c a m ) ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ， i s o e n z y m e s ，l e a fd i s k 4 五南师舡大学硕士研究生学位论文 i 引言 1 9 3 8 年，m a n n 和k e i l i n 首次从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白质 ( h e m o c u p r e i n ) ，但是由于当时对它的功能尚不清楚所以称之为血铜蛋白( m a n n t 等，1 9 3 8 ) 。1 9 6 9 年，m c c o r d 和f r i d o v i c h 重新发现了这种蛋白，因其能催化超氧阴离 子( 0 ：一) 的歧化反应而将其命名为超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ，e c 1 1 j 1 1 ) ，并阐明了超氧阴离子自由基( s u p e r o x i d er a d i c a l ) 的生物学意义 ( m c c o r d 和f r i d o v i c h ，1 9 9 6 ) 。超氧化物歧化酶广泛存在于生物界及生物体内。其主 要作用是专一的清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基，是生物体抵御活性 氧毒害的关键性防线，在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用。 根据s o d 所结合金属辅基的不同，般可将其分为c u 、z n s o d 、m n s o d 、f e s o d 三种类型( b o w l e rc ，v a nm o n t a g um ， i n z ed ，1 9 9 2 ) 。此外，1 9 9 2 年在人的血 清里分离到一种独特的具有s o d 活性的因子，简称e c s o d ，即胞步b s o d ( 0 u r y 等，1 9 9 2 ) ， 这种s o d 在多种哺乳动物的体内也有发现；1 9 9 6 年有研究报道发现了一种新型s o d ， 即n i s o d ( y o u ne t a 7 ，1 9 9 6 ) ；另外在牛肝中还存在- - * 十c o 、z n n o d ( 陈来同和 徐德昌，1 9 9 7 ；k i me t 盆，1 9 9 6 ) 。同工酶中c u 、7 n s o d 分布最广，主要存在于 真核细胞的细胞质，以及植物细胞叶绿体的基质中( a s a d a ，1 9 9 4 ) 。而m n s o d 、f e s o d 是原核生物酶，m n s o d 主要存在于原核绌胞、真核细胞线粒体的基质中； f es o d 主要存在于原核细胞及少数植物叶绿体中( 方允中和李文杰，1 9 8 9 ) 。一一般认为， m ns o d 、f e s 0 d 出现在生命进化的早期，而c u ，z n s o d 是在以后的发展中单独进化 而成的( k w i a t o w s k i 等，1 9 9 1 ) 。不同种类的n o d 对于不同抑制剂的敏感程度不同： c u 、z n s o d 活力不受氯仿一乙醇溶液抑制，而受k c n 、h 二o ：抑制；b l n s o d 活力不受k e n 、 h ：o ! 的抑制，受氯仿一乙醇溶液、s d s 抑制；f e s o d $ 舌力不受k c n 抑制，而受也0 j 、氯仿 一乙醇和s d s 的抑制( 叶d , n 等，1 9 9 9 ：张尔贤等，1 9 9 1 ) 。在研究中通常利用他们 列不同抑制剂的敏感程度。作为晟初分类的生化依据。 各种逆境胁迫都可诱发纽胞内活性氧浓度的增加而导致氧化胁造，植物抗逆性 的最终形成常常与抗氧化系统活性的增强密切相关( f o y e r 等，1 9 9 7 ；s c a n d a l i o s ， 1 9 9 7 ；s m i m o f f ，1 9 9 5 ；a l s c h e r 等，1 9 9 7 ) 。植物抗氧化系统由多种非酶性的抗氧化 分了( 如a s a ，g s h ，v i t e 等) 及分解活性氧的抗氧化酶( s o d ，c a t , a p x ，g p x 和 s 石南师范人学硕j ：研究生学位论文 g r 等) 两部分组成( 刘家忠和龚明，1 9 9 9 ) ，它们在植物适应各种逆境过程中起着 核一t l , 作用( s m i r n o f f ，1 9 9 5 ；s c a n d a l i o s ，1 9 9 7 ；n o c t o ra n df o y e r ，1 9 9 8 ) 。s o d 作为 抗氧化系统的第一道防线，在植物抵御各种逆境胁迫过程中充当重要角色。对烟草、 番茄、玉米等的s o d 基因表达进行深入研究发现：在不同的发育阶段用不同的胁追 处理该基因表达呈现出不同特征。例如：烟草胞质c u 、z n s o d 在热激、低温及百 草枯处理后活性增加最为明显；光照加百草枯处理可同时诱导番茄叶绿体c u 、 z n s o d 和胞质c u 、z n s o d 基因的表达；但干旱只能诱导细胞质c u 、z n g o d 基因 的转录( p e r l - t r e v e s 和g a l u n ，1 9 9 1 ) 。总之，在胁迫条件下，s o d 基因转录水 平的大幅度提高与s o d 酶活性的适度增加是相关的。胁迫因子很可能加速了s o d 的 代谢，迫使基因提高转录活性来维持正常水平的蛋白浓度。不同种类的胁迫因子是通 过何种信号诱导特异s o d 表达的呢? v a nc a m p 等( 1 9 9 6 ) 提出假说认为：由于不同 胁迫因子使各个亚细胞遭受不同程度的氧化胁迫，而不同的亚细胞器又存在种类特 异的s o d 作为抗氧化保护剂，所以胁迫的种类以及程度的不同导致了s o d 表达的差 异。 自从确定c a 2 + - c a m 是植物体内信使系统以来，人们对其参与的生理生化功能 进行了大量研究。已经发现以c a 2 + 、c a m 为核心的钙信使系统参与数十种植物生理 生化过程的调控，如植物对环境刺激的响应、激素作用、逆境胁迫、基因表达和蛋 白合成等( b r a a m 和d a v i s ，1 9 9 0 ：o h 等，1 9 9 6 ；b r a a m ，1 9 9 2 ：李卫等，1 9 9 7 ：龚 明等，1 9 9 0 ：龚明等，1 9 9 6 ) 。c a 2 + - c a m 影响许多酶的活性，并在某种程度上对酶 有操纵和调控作用。现已有初步证据显示植物c a 2 + c a m 信使系统与抗氧化酶系统 之间有着联系。我们实验室用c a m 亲和层析法发现植物抗氧化系统的核心酶s o d 是 一种c 甜结合蛋白，表明s o d 是c a 一c a m 依赖的酶( g o n g 和l i ，1 9 9 5 ) 。并且实验 室其他人的实验结果也证实了c a m 对s o d 具有调控作用，使用c a m 抑制剂c p z 和t f p 后s o d 酶活性都有不同程度的下降( 黄号栋，2 0 0 2 ) ：c a m 抑制剂c p z 、t f p 等明 显地抑制了玉米s o d 的部分活性( 吴晓岚，2 0 0 1 ) ：外源c a - * + 处理可提高玉米c a m 活性和各种抗氧化酶系统的活性( g o n g 等，1 9 9 7 ) ：上调或下调c a m 活性，转基因 烟草s o d 活性随之变化( 杨静，2 0 0 3 ；罗时萍，2 0 0 4 ) 。此外其他人的研究结果同样 表明s o d 活性受c a m 影响，如黄瓜子叶s o d 活力表达与c a m 抑制剂氯丙嗪呈显著负 相关( 杨成德等，1 9 9 0 ) ，外源c a m 对小麦和黄瓜s o d 有激活作用，三氟啦嗪对其 正：南师衽大学颀上研究生学侄论文 有抑制作用( 黄国存等，1 9 9 5 ；李晓东和张廷芳，1 9 9 3 ) ，外源钙对低温胁迫下的烟 草幼苗的s o d 活性有影响( 张燕等，2 0 0 2 ) ，用h z 处理烟草幼苗时发现：胞质中 自由c a ”浓度的增加与s o d 酶活性呈现出一定的相关性( p r i c e 等，1 9 9 4 ) 。另外， 表达外源c a m 的转基因烟草在遭受逆境时，表现出比对照有更强更快的a o s 爆发 ( h a r d i n g 等，1 9 9 7 ) ，从而导致抗氧化酶活性上升。如上所述，各种胁迫不仅会造 成植物中c a m 活性或转录物上升( b r a a ma n dd a v i s1 9 9 0 ；b r a a m ，1 9 9 2 ) ，而且会 造成超氧化物歧化酶活性或转录物的上升( k o c s y 等，2 0 0 1 ：s c a n d a l i o s ，1 9 9 3 ；y u a n d r e n g e l ，1 9 9 9 a 、b ) ，甚至新的同工酶出现( s c a n d a d a l i o s ，1 9 9 7 ；f o y e r 等，1 9 9 4 a 、 b ：s m i m o f f ，1 9 9 5 ；a l s c h e r 等，1 9 9 7 ) 。这些现象似乎暗示着c a m 对s o d 具有一 定的调控作用。 如前所述，s o d 主要分为三类同工酶，并且三类同工酶都表现出各自特有的性 质、功能以及调控方式。那么c a l d 是对三类同工酶都有影响，还是仅对其中的一类 或两类具有调控作用? 如果对三类同工酶都有影响，那么影响效果是同样的还是各 有差别? 甚至c a m 是否对s o d 基因表达有所影响? 类似的问题还未见详细报道，同 时由于研究c a m 本身的技术困难，至今国内外尚未见到c a m 对s o d 及其同工酶调 控作用的直接报道。因此根据国内外的研究进展，我们实验室利用g a t z 等开发的一 套c a m v3 5 s 启动子基因表达诱导系统，构建了含抗生素和编码c a l v l c a m b p 的目 的基因片断将二者结合起来，形成一整套我们所需的目的基因构件，此工作已由 龚明教授实验室完成( 陈勃，2 0 0 1 ) ，将其导入不同品系的烟草，获得了四套诱导性 表达细胞质和细胞核c a m c a m b p 的转基因烟草体系，这一套系统使c a m c a m b p 的基因表达置于人工控制之下，通过诱导表达细胞质和细胞核定位的c a m c a m b p ， 来上调和下调绌胞质及细胞核c a m 的活性。我们以诱导表达细胞质c a m c a m b p 的转基因烟草h 1 2 c 、h 3 1 9 以及空白对照h 0 2 0 2 0 为实验材料，结合两个株系t c 诱导过程中c a m 活性的动力学曲线，研究了s o d 及其三种同工酶活性的动态变化， 以期对上述问题有初步的了解。 石南师范大学顾j ：研究生学位论文 材料与方法 一、植物材料 诱导表达细胞核c a m 的转基因烟草h 2 系列，诱导表达细胞质c a m c a m b p 的 转基因烟草h 1 2 c 、h 3 1 9 以及未转化的空白对照h 0 2 0 2 0 。首先将上述材料种子 置于1 的n a c i o 中，消毒2 5 m i n ，再用无菌水漂洗5 次，然后用0 2 m g l 4 的赤 霉素( g a a ) 浸泡，4 。c 下过夜。此后，对照h 0 2 0 2 0 种子播种于含5 0 m g l 。的卡 那霉素( k m ) 的m s 培养基中，被检测烟草( h 2 系列) 及h 1 - 2 c 播种于含5 0 m g l 。1 的卡那霉索( k m ) 、5 m g l d b a s t a 的m s 培养基中，h 3 1 9 则播种于含5 0 m g l 。的卡那霉素( k m ) 、5 0m g l h m 的m s 培养基中1 6 小时光照培养( 2 4 1 2 6 夜，昼) 2 - 3 周后，选择未黄化的幼苗于不含抗生素的m s 培养基中继续生长2 周左 右。幼苗备用，或者转入盆栽继续生长1 2 月，叶片备用。 二、处理方法 将培养了四周左右的幼苗或者是生长1 - 2 月的烟草离体叶圆片分成重复的两 组，a 组( 诱导状态) 加入含1 m g l 1 四环素( t c ) 的m s 培养基b 组( 非诱导 状态) 加入不含t c 的m s 培养基，2 4 1 2 下光照诱导1 至2 天，或根据具体情况选 择时间点进行诱导。 三、测定方法 l 、c a l 的提取 按黄号栋等( 2 0 0 3 ) 方法：取诱导后的烟草幼苗或叶圆片o 1g ，液氮冰冻。加入 0 5 m l 提取液( 5 0 m m o l l t r i s h c i ，1 m m o l l e g t a ，1 m m o l l p m s f 。 2 0m m o l l n a h s 0 3 ，o 1 5m m o l l n a c i ，p h7 5 ) 进行研磨，在4 1 2 7 ：2 0 , 0 0 0 g 离心3 0 m i n ，取上清液重复离心一次。将上清液分装，液氮冰冻后，于一8 4 1 2 下 保存备用。 墨糍爨箍夫学疆圭繇究生学稼谂交 2 、c 酬的测定 按黄号栋等( 2 0 0 3 ) 方法：在冰浴中，在含0 0 0 5up d e ( 相当于约l o - 1 5 山的 p d e 提取物) 斡0 5m l 反应缓冲液( 4 0 m m o l u 1t r i s - h c i ，4 0 m m o i l 矗睬唑，5 m m o l 扩m g c l 2 ，0 5 m m o l + c a c l 2 ，p h z s ) 审，麓入檬准c a m 躐2 0 溜矮孳 c a m 提取液，再加入2 0m m o | l 1 的c a m p1 0 0 棚以启动反应，然瘸子3 0 ( 2 水浴 下反应3 0r a i n 。之后将试管转移至沸水浴4r a i n 以终止反应，迅速冰浴冷却，充分 冷却后加入1 m g m l 。1 的蛇毒1 0 0 山，于3 0 水浴中反应2 0 m i n ，加入5 5 的t c a 7 0 啦潋终止反应。以2 0 , 0 0 0 x g 离心1 0v a i n ，驳6 0 0 瓣上溥滚溅无嘏臻含量，以溅 定c 毽酣豹活性。 1 个活性单位的c a m 是指在p h7 5 、3 0 ( 2 和0 0 1m m o l l 1 c a “存在的条件下， 激活0 0 0 8 个单位p d e 到5 0 最大活性时所需婺的c a m 的量( s i g m a 公司的c a m 活性定义) 。在每次测定中总怒包括一组加入过爨的标准c a m ( 5 个单位) 的试管 擘为最大激活缀，魏一缝不魏c a m 懿试譬痒为p d e 激活兹零对照( p d e 莲礁活瞧) ， 以此来计簿样品中c a m 对p d e 的激活百分率，谶而用直线回归方禚来计算样品的 c a m 活性。 3 、无机磷的铡定 按照l i n d b e r g 等( 1 9 5 6 ) 的方法。取6 0 0 山样品，加入等体积的定磷试剂( 3 m o l l 1 h 2 s 0 4 、蒸馏水、2 5 钼铵酸和1 0 v i l c ，按1 ：2 ：1 ：1 的比例配制) 。 混匀后置于4 5 水浴反应2 5 m i n ，反应结束于室温下冷却，在2h 内测定6 6 0 n m 处 的吸光度。 4 、蛋白质的测定 样品蛋白质含量按b r a d f o r d ( 1 9 7 6 ) 方法测定，以牛血清蛋白为标准蛋白。 6 、超氧化物歧化酶( s o d ，e c1 1 5 1 1 ) 提取 参考李忠光等( 2 0 0 2 ) ：提取液为5 0m m o i l 1 i r i s h c i 缓冲滚，p h7 0 ，内含 2 0 甘油，1 m m o l + l e d t a ，1 m m o l + l a s a ，1 m m o l l d t t ，1n i m o l l 1 g s h ，5m m o l m g c l 2 。准确称取经上述处理的烟草离体叶圆片0 5g ，加入3m l 9 云南岬范大学硕1 研究生学位论文 预冷的提取液，充分冰预研磨后，转入离心管中，再用2m l 提取液淋洗研钵，合并 提取液，于4 下2 0 ，3 g 离心3 0m m ，将上清液分装，液氮冷冻后于8 4 保 存或直接进行酶活性测定。 6 、超氧化物歧化酶总活性测定 按照g i a n n o p o l i t i s 和r i e s ( 1 9 7 7 ) 的方法，并作如下修改：反应液a 为5 0m m o l l 1t t i s h c i 缓冲液，p h7 8 ，内含0 1m m o l l e d t a ，0 1m m o l l n b t ，1 3 3 7 m m o l l “蛋氨酸；反应液b 为5 0 m m o l l t r i s - h c i 缓冲液，p h7 8 ，内含o 1 m m o i l e d t a ，0 1 m m o l l 1 核黄素溶液。测定时，反应液a 、b 预先于2 5 水浴中预热。取2 8 5 m l 反应液a ( 最大光还原管2 9 0 h d ，不加酶液) ，加入酶液 5 0 山，再加入1 0 0 山反应液b ，终体积为3 m l ，2 5 下距离1 2 0 瓦( 3 0 瓦管) 日 光灯7 c m ( 光强约1 5 0 0 l u x ) 进行光化还原反应4 0 r a i n ，光照结束后用黑布蒙住，在 无灯光照射的室内，快速测定q d 。 酶活性单位采用抑制光化还原n b t5 0 为一个单位。 7 、超氧化物歧化酶三类同工酶测定 按照g i a n n o p o l i t i s 和r i e s ( 1 9 7 7 ) 的方法，并作如下修改：反应液a 为5 0m m o l l t r i s ，h c i 缓冲液，p h7 8 ，内含0 1m m o i l e d t a ，0 1m m o l l n b t ，1 3 3 7 m m o l l 。蛋氨酸：反应液b 为5 0m m o l 。l t r i s h c i 缓冲液，p h7 8 ，内含0 1 m m o l l e d t a ，0 1 m m o l l 1 核黄素溶液。测定时，反应液a 、b 预先于2 5 水浴中预热。取2 8 5 m i 反应液a ( 最大光还原管2 9 0 m l ，不加酶液) ，分别加入终 浓度为4 0 c h c l 3 - c h 书h 2 d 珏( 体积比o 1 5 ：0 2 5 ) 、5m m o l l - 1h 2 0 2 、5m m o l l k c n ，用提取液补充体积后，加入酶液5 0 山，再加入1 0 0 肛l 反应液b ，2 5 ( 2 下 距离1 2 0 瓦( 3 0 瓦管) 日光灯7 c m ( 光强约1 5 0 0 l u x ) 进行光化还原反应4 0 m i n ， 光照结束后用黑布蒙住，在无灯光照射的室内，快速测定0 d 。 酶活性单位采用抑制光化还原n b t5 0 为一个单位。 8 、s o d 的聚丙烯酰胺凝胶电泳及活性染色 参考b e a u c h a m p 和f r i d o v i c h ( 1 9 7 7 ) 以及罗广华和王爱国( 1 9 8 3 ) 的方法 1 0 云商师范人学坝七研究生学位论文 修改如下：分离胶浓度为1 0 ，浓缩胶浓度为3 1 。电泳最初电流调至1 0 m a ，待 样品进入分离胶时，将电流调至2 5 m a ，当蓝色染料迁移至琼脂l c m 左右，关闭电 源，整个电泳时间为2 3 小时。电泳结束后立即进行活性染色。酶活性染色是将凝 胶浸泡于2 4 5m m o l l 1n b t 中，暗中轻摇4 0r a i n ：再将凝胶浸入含有2 8m m o l l t e m e d 、o 0 2 8m m o l l 1 核黄素、3 6m m o l l 1 磷酸缓冲液( p h7 8 ) 的染色液 中，暗中轻摇2 0 m i n ；最后将凝胶浸在含0 1 m m o l l e d t a 、5 0 m m o l l 。1 磷酸缓 冲液( p h 7 8 ) 中，于4 1 0 0 01 下光照3 0m i n 。蓝色的凝胶背景上将出现无色透 明的s o d 活性区带。 9 、鉴别s o d 同工酶类型的染色定位法 按照罗广华( 1 9 9 6 ) 的方法，修改如下：相同的样品液4 份，分别点样在平板 凝胶的4 个齿中，电泳结束后，纵切凝胶，从而使样品条带相互分离。将纵切后的 胶条分别浸于5 0 r e t o o l 。l 4 磷酸缓冲液( p h 7 8 ) 、4 0 c h c l r c h 1 c h 2 0 h ( 体积比 o 1 5 ：o 2 5 ) 、5m m o l l 1h 2 0 2 、5m m o l l 4 k c n 中轻摇1 h ，三蒸水洗净。然后 将凝胶浸泡于2 4 5m m o l l 1n b t 中，暗中轻摇4 0m i n ；再将凝胶浸入含有2 8 m m o l 。l t e m e d 、0 0 2 8m m o l l 1 核黄素、3 6m m o l l 。1 磷酸缓冲液( p h7 8 ) 的染色液中，暗中轻摇2 0 m i n ；最后将凝胶浸在含o 1m m o l 。l e d t a 、5 0m m o l l 1 磷酸缓冲液( p h7 8 ) 中，于4 1 0 0 0w 下光照3 0m i n 。蓝色的凝胶背景上将出现 无色透明的s o d 活性区带。 根据s o d 同工酶对不同抑制剂特有的敏感性，在c h c l 3 c h 3 c h 2 0 h 的作用下 只有c u 、z n s o d 存留，在h 2 0 2 作用下仅i , l n - s o d 存留，经过k c n 处理后m a - s o d 和f e s o d 残留。通过对比，从凝胶特定位置酶带消失和存活的情况可以判断是哪 一种同工酶。 四、试剂与仪器 c a m 、e g t a 、咪唑、p m s f 、c a m p 和蛇毒等购自s i g m a 公司：p d e 为奉实 验室提取，其它试剂均采用国产分析纯。 仪器包括p h a r m a c i a 公司的u i t r o s p e c 2 0 0 0 分光光度计和德国h e r m l e 的 五南师范大学钡1 ：研究生学位论文 z 2 3 3 m k 2 高速冷冻离心机。江苏中大s h a b 水浴恒温振荡器。广东医疗器械厂 c r h 2 5 0 g s 人工气候箱。日本s a n y om d f - 3 8 2 e 超低温冰箱。北京六一仪器厂 d y y - 6 b 电泳仪。离体叶圆片打孔器直径为1 3c l n 和o 7c m 实验结果 一、诱导表达细胞核c a m 转基因烟草的筛选 1 、t c 诱导2 4 小时或4 8 小时转基因烟草的检测结果 1 0 株诱导表达细胞核c a m 转基因烟草h 2 系列和一株未转化的对照h 0 2 0 2 0 培养四周后，淘汰4 株( 1 c 、4 c 、2 l 、3 l ) 出现黄化现象的株系。其余株系经过 t c 诱导一天或两天，利用磷酸二酯酶法测定c a m 的活性。根据图1 和表1 的分析 可以看出，h 2 系列转基因烟草的c a m 活性的高低分为三种情况：第一，有良好诱 导上调c a m 活性的，包括i 2 c 、5 c 、5 l 和1 3 f ；第二，没有明显的诱导效果的， 包括2 ( 7 和3 c ：第三：在经过两天的诱导后，表现出下调c a m 活性的现象，如l l 。 云南师范大学硕士研究生学位论文 1 0 0 o 三 8 0 面 琶 = 三8 0 ) x 善 节 王 2 0 0 图1 转基因烟草幼苗t c 诱导2 4 小时和4 8 小时后c a m 活性 f i g i c a ma c t i v i t yo ft r a n s g e n i ct o b a c c os e e d i n g sa f t e rt ci n d u c t i o nf o r2 4a n d4 8h o u r s e a c h d a t ab a rr e p r e s e n t st h em e a n4 - _ s eo fa tl e a s ts i xm e a s u r e m e n t si nt h r e ei n d e p e n d e n te x p e r i m e n t s 1 3 鲫 曲 柏 如 一点m节jd：口n】hj一苍柙王mu 五商帅范大学硕士研究生学位论文 表1 检测结果显著性分析表 注：p ；o毋oo 云南师范大学硕j ：研究生学位论文 图1 2 为不同浓度的过氧化氢溶液对s o d 活性的抑制情况。s o d 活性随抑制剂浓 度的增加而下降，变化趋势与氯仿一乙醇溶液抑制的基本相似，其中浓度在4 5 - 5 5 m m o l l d 基本无变化，即抑制剂浓度在4 5 - 5 5m m o l l 4 之间时，所表现的s o d 活性基本为m n s o d 。这里我们选择过氧化氢终浓度为5m m o l l 1 进行后续实验。 h 2 0 2 ( m m o l - l - 1 ) 图1 2 不同终浓度h 2 0 2 处理后s o d 活性 f i g 1 2 t h ec h a n g eo fs o d a c t i v i t yu n d e rd i f f e r e n tf i n a lc o n c e n t r a t i o nh 2 0 2 e a c hp o i n tr e p r e s e n 拓 m e a n s s eo fa tl e a s ts i xm e a s u r e m e n t si nt h r e ei n d e p e n d e n te x p e r i m e n t s 图1 3 为经过氰化钾溶液处理，并且不计m n s o d 那部分，余下的s o d 活性( 每 一点的活性值为减去m n s o d 活性后的值) 。s o d 活性随抑制剂浓度的增加而下降， 一la3-=；u吁oo 云南师范大学硕士研究生学位论文 其中浓度在0 2m m o l l 1 急速下降，之后趋势平缓。根据曲线图，这里选择5m m o l l _ 1 浓度进行测定。 止 功 3 、- ， ； ：= o 母 o o k c n ( m m 0 1 l 。1 ) 图1 3 不同终浓度k c n 处理后s o d 活性 f i g 1 3 t h ec h a n g eo fs o da c t i v i t yu n d e rd i f f e r e n tf i n a lc o n c e n t r a u o nk c n e a c hp o i n tr e p r e s e n t s m e a n s s eo fa tl e a s ts i xm e a s u r e m e n t si nt h r e ei n d e p e n d e n te x p e n m e n l s 2 2 t c 诱导过程中转基因烟草离体叶圆片c u 、z n s o d 的活 生变化 图1 4 中，诱导表达细胞质c a m 的株系h i - 2 c 的c u 、z n s o d 活性变化分为两 个阶段：t c 诱导过程中，o 4 小时快速上升，8 2 4 小时缓慢上升，并在2 4 小时达到 最大值，最大增幅为2 6 2 6 。诱导表达细胞质c a m b p 的株系h 3 - 1