（生物医学工程专业论文）Gnb2l1基因表达的近日节律.pdf

四川大学硕_ 上学何论文g n b 2 1 1 摹冈震达的近日节律 g n b 2 1 1 基因表达的近日节律 生物医学工程专业 研究生：薛建新指导教师：王正荣教授 中文摘要 目的： 前期研究发现g n b 2 l l 基因编码的蛋白能够与近日节律系统的核心元件 p e r i o d l 蛋白相互作用。本文研究g n b 2 l l 基因及其蛋白在大鼠体内外的近 日节律特征。包括二部分：l 、体外研究：研究大鼠c 6 细胞中g n b 2 l l 基因是 否存在节律性表达，并观察g n b 2 l l 是否与p e r l 一样对刺激产生立早反应。2 、 体内研究：观察g n b 2 l l 基因及其蛋白在大鼠体内是否存在节律性表达。 方法： 实验一：体外研究分别采用p m a ( p h o r b o l1 2 m y r i s t a t e1 3 a c e t a t e ，1 2 十四酸佛波酯1 3 乙酸盐) 及马血清刺激体外培养的小鼠n i h 3 t 3 细胞， r t p c r 检测不同时间点m p e r lm r n a 的表达水平，比较两者的诱导效率： p m a 刺激体外培养的大鼠c 6 神经胶质瘤细胞，r t p c r 检测不同时间点 肌r j ，r d b p m r n a 的表达水平。在确定c 6 细胞具有近日节律特征后，r t p c r 检测不同时间点r g n b 2 l lm r n a 的变化规律。 实验二：体内研究1 2 d 1 2 l 光暗循环下，采用半定量l i t p c r 的方法 观察大鼠脑组织及肝脏组织的g n b 2 l l ，p e r lm r n a 的变化规律：采用w e s t e r n b l o t 方法检测大鼠脑组织及肝脏组织中g 胛6 2 ，j 编码蛋白、p e r l 蛋白在不同 时间点的变化。 结果： 实验一：体外研究p m a 及5 0 的马血清均能诱导n i h 3 t 3 细胞m p e r l 四川大学硕l 学位论文g n b 2 l l 基冈表达的近日节律 的近日节律表达且诱导效率近似；c 6 细胞的以r ，巾印基因表达呈近日节 律，同时p m a 刺激的c 6 细胞的r g n b 2 1 1 的表达也呈近日节荡，并且与心r j 一样对刺激产生立早反应。 实验二：体内研究1 2 d 1 2 l 光暗循环下，大鼠脑组织及肝脏组织中 g n b 2 1 1m r n a 和节律基因n r ，m r n a 及其蛋白产物均呈近日节律。 结论： p m a 是一种有效的体外节律诱导剂；经p m a 诱导后，c 6 细胞表现出近 日节律特征，g n b 2 l l 的m r n a 存在着近日节律，并且是一种立早基因。在大 鼠体内，g n b 2 1 1 基因及其编码的蛋白也存在着近日振荡。通过体内外实验， 可以看出g n b 2 l l 存在着广泛的近日节律性振荡，其相位总在节律基因 ， 之前。由于g n b 2 1 1 基因编码的蛋白r a c k i 是一种重要的接头分子，参与了 p k c 信号通路，而户钉基因的启动子又可以被p k c 通路激活，因此r a c k l 蛋白很可能是甩r 的上游调控分子，参与激活了尸订j 基因的启动子。 关键词：时间生物学：近日节律：g n b 2 l l ；p e r i o d l ：p m a ：c 6 神经胶质 瘤细胞。 四川大学硕l 学位论文g n b 2 l l 蕈冈表达的近日节律 t h ec i r c a d i a ne x p r e s s i o no fg n b 2 1 1 b i o e n g i n e e r i n g g r a d u a t e ：x u ej i a n x i n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rw a n gz h e n g r o n g a b s t r a c t o b j e c t s o nt h eb a s i so fo u rf o r m e re x p e r i m e n t s ，t h ep r o t e i ne n c o d e db yg n b 2 l lg e n ec a n i n t e r a c tw i t hp e r i o d lp r o t e i n ，ac r u c i a l p r o t e i n i nc i r c a d i a nc l o c k s ow e i n v e s t i g a t et h ec i r c a d i a nr h y t h mo fg n b 2 l lg e n ea n di t sp r o t e i ni nv i t r oa n d 折 v i v oi nr a t t h e r ea r et w op a r t si nt h er e s e a r c h ：( 1 ) i n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o nl e v e l o fc i r c a d i a ng e n ei nc 6g l i o m ac e l l sb ys e a r c h i n gf o ran o v e lr h y t h m i n d u c t o r n v i t r o ；t h e no b s e r v ew h e t h e rg n b 2 l lg e n eo s c i l l a t e si nac i r c a d i a nm a n n e ra n d s h o w sa ni m m e d i a t e l ye a r l ye x p r e s s i o nu n d e rt h es t i m u l a t i o ni nc 6g l i o m ac e l l s ( 2 ) i n v e s t i g a t et h ec i r c a d i a nr h y t h mo fg n b 2 1 1g e n ea n di t sp r o t e i ni nr a t m e t h o d e x p e r i m e n t1 ：t oc o m p a r et h ei n d u c t i o ne f f i c i e n c yo f p m a w i t hh o r s es e r u m t h e c u l t u r e dn i h - 3 t 3c e l l sw e r es t i m u l a t e db yp m a ( p h o r b o l1 2 - m y r i s t a t e1 3 一a c e t a t e ， 】0 0 r i m ) a n d5 0 h o r s e s e i 2 1 mr e s p e c t i v e l ya n dp e r f o r m e dr t - p c rt oe x a m i n et h e e x p r e s s i o no fm p e r lm r n a s a tt h ei n d i c a t e dt i m e s t h ec u l t u r e dc 6g l i o m ac e i l s w e r ea l s os t i m u l a t e db yp m aa n de x a m i n e dt h ee x p r e s s i o no f ，只盯i r d b p m r n a sa tt h ei n d i c a t e dt i m e sb vr t - p c t h e nw ee x a m i n e de x p r e s s i o nl e v e lo f r g n b 2 l lm r n a si nc 6 一i o m ac e l l sa tt h ed i f f e r e n tt i m e s e x p e r i m e n t2 ：d e t e c t i n gg n b 2 l lm r n al e v e lw i t ht h er a tb r a i na n dl i v e rs a m p l e s b yr t - p c ru n d e rc o n d i t i o n o f1 2 d 1 2 l o b s e r v i n gt h e e x p r e s s s i o nl e v e l o f - 3 四川大学硕j 二学位论文 g n b 2 l l 基因表达的近日节律 r a c k lp r o t e i n ，w h i c hw a se n c o d e db yg n b 2 1 1g e n e ，w i t ht h er a tb r a i na n dl i v e r s a m p l e sb yw e s t e r nb l o tu n d e rt h es a n l ec o n d i t i o n r e s u l t e x p e r i m e n tl ：b o t hp m a a n dh o r s es c l a l mc o u l di n d u c et h ec i r c a d i a ng e n e e x p r e s s i o no fm p e r li nn m - 3 t 3c e l l sa n da c h i e v e ds i m i l a ri n d u c t i o ne f f i c i e n c y , a n di tw a sc o n f i r m e dt h a tt h ec i r c a d i a no s c i l l a t i o no fr p e r l ，r d b pe x i s t e di nc 6 g l i o m ac e l l s b a s e do nf o r m e re x p e r i m e n t , w ep e r f o r m e dt h ef u r t h e rr e s e a r c ha n d f o u n dt h a tg n b 2 l im r n a d i s p l a y e dc i r c a d i a no s c i l l a t i o ni nc 6g l i o m ac e l l sw h i c h w a ss t i m u l a t e db yp m a ，a n dd i s p l a y e da ni m m e d i a t e l ye a r l ye x p r e s s i o na sp e r l d i d e x p e r i m e n t2 ：g n b 2 l lm r n a l e v e l ss h o w e dc i r c a d i a no s c i l l a t i n gi nr a tb r a i na n d l i v e ru n d e rc o n d i t i o no f1 2 d 1 2 l t h ep r o t e i n ，w h i c hw a se n c o d e db yg n b 2 l lg e n e ， a l s ot o o ko nac i r c a d i a np r o f i l e c o n c l u s i o n p m ai sa ne f f e c t i v er h y t h mi n d u c t o r nv i t r o ，a n de l i c i t st h ec i r c a d i a no s c i l l a t i o no f c l o c kg e n e si nc 6g l i o m ac e l l s g n b 2 l lg e n eo s c i l l a t e si nac i r c a d i a nm a n n e ri nc 6 c e l l s ，a n du n d o u b t e d e l yi sa ni m p o r t a n ti m m e d i a t ee a r l yg e n e g n b 2 l lg e n ea n d i t s p r o t e i na l s ot a k eo nac i r c a d i a np r o f i l ei nr a t s o ，g n b 2 l lg e n ei n v o l v e si nt h e c i r c a d i a nm o l e c u l a rl o o p ，a n dm a y p l a ya c r u c i a lr o l ei ni t k e yw o r d s ：c h r o n o b i o l o g y ；c i r c a d i a n ；g n b 2 l lg e n e ；p e r i o d l ；p m a ；c 6 g j i i o m ac e l l s 4 - 四川大学硕l 学位论文 g n b 2 1 1 蓼冈表达的近日节律 第一章前言 在自然界中，从单细胞到高等动植物以及人类的几乎所有生命活动均存 在着按照一定规律运行的、周期性的生命活动现象，称为生物节律。生物节 律广泛存在于大自然中生物的生命活动中，是上亿年生物在其发生和进化过 程中，为了与环境影响和环境变化相适应，而逐渐形成的内源性的与自然环 境周期性变化相近似的节律性的生命活动。这些生物节律既存在于整个机体 之中，亦存在于器官、乃至于游离的单个细胞之中，因此生物节律是生命活 动的基本特征之一【。根据其周期的长短，生物节律被分为亚日节律( i n f r a d i a n r h y t h m ) 、近日节律( c i r c a d i a nr h y t h m ) ，超日节律( u l t r a d i a nr h y t h m ) 。其中， 周期在2 0 一2 8 小时之间的近日节律在生物体内最为常见。人体的许多生理、 生化参数均有近日节律的特点，如睡眠一觉醒、体温、血压、心率等均表现 出明显的近日节律。 近日节律具有以下特点：1 ) 广泛性：从简单的单细胞生物到复杂的哺乳 动物均存在近日节律。而且在高级生物，近日节律在整体、系统、器官、细 胞和分子水平均存在近日节律。2 ) 内源性：近日节律是机体内在固有的，在 外界环境条件恒定的条件下( 如持续的黑暗状况下) ，或在不受环境周期性变 化影响的情况下( 如致盲动物) ，近日节律仍然存在。3 ) 可调性：外界环境， 如：光暗循环等，能够影响内在的近日节律，机体通过近日节律的重置效应， 使内在的近日节律与外界环境同步。4 ) 遗传性：生物节律成为生物机体由 遗传决定的、与生俱有的一种属性，即生物节律具有遗传性。 l 近日节律系统 近日节律的破坏会造成多种生理功能的失调，对生物体的健康产生极其 严重的影响。虽然对近日节律的研究已有5 0 多年的历史，但随着1 9 9 7 年克 隆出第一个哺乳类动物节律基因，该方面的研究才取得突破性进展，并己成 为生物科学研究中的一个热点。1 9 9 9 年、2 0 0 2 年等连续几年，s c i e n c e 将近 日节律的研究评为“最有可能取得突破的领域”和“十大成果之一”。n a t u r e ， s c i e n c e 和c e l l 等顶尖级杂志每年均有大量的这方面研究报道。因此开展这方 四川大学硕l 学位论文g h 6 2 ，基冈表达的近日节律 面研究的重要性不言而喻。基因是近日节律产生的物质基础，这己在多个物 种上得到了证实。近日节律是由一组称之为近日节律基因及其基因产物相互 作用构成的一个闭环震荡系统产生的，其由三个基本组成成分构成( f i g1 1 ) 。 f i g1 1c i r c a d i a n | y s t e m ：a no s c i l l a t o ri nr e g u i n t e db yi n p u ts y n c h r o n i z i n gs i g n a l s ( z e i t g e b e r ) a n dp r o v i d ed a t af o rs y n c h r o n i z i n go t h e re l e m e n 臼o ft h es y s t e m ( o u t p u t ) s u c ha no s c i l l a t o ri nt h es u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u s 首先是信号输入，对哺乳动物来讲，是从视网膜到传入神经到视交叉上 核的神经通路；第二是振荡器，亦可以称为生物钟，主要是视交叉上核的神 经细胞中的一组生物节律基因在表达调控过程中形成的周期大约2 4 小时的周 期性变化过程：第三是信号输出，即振荡器产生的近日节律变化通过相关蛋 白传出途径到达相应的效应器。 1 1 近日节律系统中枢 1 1 1 哺乳动物近日节律中枢s c n 近年来，国外学者研究发现哺乳动物的主控钟位于下丘脑前部的视交叉 上核( s u p r a c h i a s m a t i c n u c l e u ss c n ) 1 2 2 1 。其核团内神经元小而密集，小鼠约 含1 0 0 0 0 个；大鼠约含1 6 0 0 0 个 4 1 。s c n 神经元分两群：视交叉上核腹侧区 ( v e n t r o l a t e r a ls c n ，v l s c n ) 和视交叉上核背中区( d o r s o m e d i a is c n ，d m s c n ) 。 一般说来，v l s c n 为v i p 能神经元，负责接受近日节律的输入信号，而 四川大学硕士学位论文 g n b 2 h 基冈表达的近日节律 d m s c n w e iv p 能神经元，在近日节律的输出中占有重要地位p 】。 1 1 2 近日节律基因及其分子振荡 通过对s c n 部位的研究，许多节律基因( 如甩，j 3 ，c l o c k , c r y l 一2 ，b m a l l ， t i m ，r e v 等) 以及钟控基因( c c g ) ( 如p 船，e 4 b p 4 ，d b p ，r e f 等 被发现， 人们对生物节律系统才有了一个较为清楚的认识【御】。不同种属生物的近日节 律产生的分子基础类似，其产生是由一系列时节律基因的转录和转录后调控 所引起的分子振荡实现的。 节律基因的节律性表达是通过细胞内转录翻译反馈环路来实现的。关于 生物钟的学说和解释很多，目前比较简明扼要说明问题的学说如图f i g u r e 2 2 所示。生物节律( 主要指近日节律) 产生是由一组生物节律基因自身表达调 控形成的。 f i g 2 2 m o l e c u l a rf e e db a c kl o o po f c i r c a d i a ns y s t e m 节律基因c l o c k 和b m a l l 的蛋白产物形成异二聚体，为节律基因户切， p e r 2 ，凡门以及铆和c 秒2 的转录因子，激活这些基因表达相应蛋白，这些 蛋白通过磷酸化后入核可抑制胞核内的c l o c u b m a l l 异二聚体的活性，从 四川大学硕1 二学位论文g n b 2 1 1 基囡表达的近日节律 而导致上述基因表达的降低。如此形成n r ，肋2 ，凡一以及c r y l 和c r y 2 的 表达成周期性变化，完成这一周期需要的时间大约为2 4 d * 时。因此该节律成 为近日节律p 。”。 与s c n q b 近日节律中枢相对应的，外周组织也存在节律1 2 4 - 2 叼，它们有其 自身的节律，其时相较s c n 慢3 9 小时。s c n 的生物节律系统通过神经和内分 泌通路对其进行调控，使其节律与s c n 的节律同步 2 9 - 3 2 1 ，从而使生物体的多 种生理生化过程保持协调一致。最近还发现规律进食也牵涉其中3 2 1 。外周 组织的生物节律系统，其组成与s c n 钟控系统有相似之处，但也有很大的不 同。利用基因芯片技术比较s c n 与外周组织的节律基因种类，发现在心脏与 肝脏，s c n 与肝脏节律表达的基因中，两种组织均表达的只占其总数的 1 0 3 3 3 4 】。其中p e r l ，尸台r 2 ，p e r 3 ，b m a l l ，c l o c k 等节律基因在多数组织中均有表 达1 3 4 3 5 - 3 8 1 。 1 2 信号输入途径 1 2 1 光信号接受元件 近年的研究发现，视网膜视杆和视锥细胞并非哺乳动物光导引所必需， 它具有一个独立于视觉成像系统以外的非成像感光系统昼夜光感受系 统，该系统负责感受外界环境的明暗周期光信号变化，其感光分子即是近日 钟输入途径的信号接受元件。 1 ) 隐花色素( c r y p t o e h r o m e ) e r y p t o c h r o m e ( e r y ) 是一种存在于哺乳动物体内的光色素，可以与假视黄 素( p u t a t i v ef l a v i n ) 结合，参与蓝光和u v a 的接受。这种光色素最初实在植 物中发现的，昆虫中c r y 已证实是近日节律光感受器分子。而哺乳动物，c r y 的作用尚不清楚。但已证实c r y 是一个近日节律基因，参与节律振荡。 2 ) 黑视素( m e l a n o p s i n ) 1 9 9 8 年，p r o v e n e i o 等0 9 1 在非洲爪蟾感光性皮肤的黑素细胞的蛋白提取物 中发现一种具有视蛋白抗体免疫反应阳性的新蛋白，将其命名为黑视素 ( m e l a n o p s i n ) 。其e d n a 序列含一个1 6 k b 的开放读码框架( o r f ) 编码5 3 4 个氨基酸残基，其氨基酸序列与头足类动物的视蛋白有高度的同源性。 四川大学硕上学位论文g n b 2 l l 基因表达的近日节律 h a n n i b a l 等1 4 0 j 运用原位杂交和免疫组织化学的方法发现黑视素分布于大鼠视 网膜节细胞层和内核细胞层的部分节细胞和无长突细胞中。该分布与垂体腺 苷酸环化酶激活肽( p a c a p ) m r n a 表达节细胞的分布密度一致。h a t t a r 等一l j 研究发现大鼠视网膜小部分的r g c s ，其胞体、树突和近端轴突均有黑视素的 表达。因该r g c s 具有光敏感性，因此将其称为光敏感性r g c s ( i p r g c s ) ， 大鼠和小鼠的光敏感性r g c s 分别各占总数的2 5 和1 。 目前，普遍认为黑视素阳性的i p r g c s 对光具有直接感光性、广谱感光性 和相对稳定性。黑视素基因缺失小鼠模_ 型j ( o p n 4 4 - ) 1 4 z , 节细胞发育缺陷的基因 缺失小鼠模型( m a t h ) 4 3 1 ，视杆、视锥细胞的基因突变小鼠模型( r d r d ) 4 4 , 4 5 1 ， 双侧眼球摘除小鼠模型及复合模型( r d r d ；o p n 4 + ) 1 4 6 1 等的对比及联合使用， 有效地证实了在哺乳动物的非视觉光反应中，包括近日节律的光引导并非由 只由黑视素单独完成。黑视素缺陷小鼠和视杆、视锥细胞缺陷小鼠均保持了 近日节律的光导引作用，而双缺陷小鼠( r d r d ：o p n 4 + ) 的光的非视觉反应则 减弱或消失。在一定程度上说明了视杆、视锥细胞同黑视素阳性i p r g c s - - 起 共同参与了非视觉昼夜光感受功能。另外有文献报道，大约有1 4 的光敏感性 r g c s 接受视杆、视锥细胞的传人；s c n 也接受来自视杆、视锥细胞的纤维传 人，这也补充证明了这一观点。虽然，在非视觉反应中，黑视素和视杆、视 锥细胞的功能存在重复，但它使哺乳动物更易适应外界环境的光变化。 另外，研究发现，哺乳动物的昼夜光感受器细胞神经纤维除主要投射到 s c n 外，光敏感性r g c s 的部分纤维还可投射到其他脑区。利用逆行标记法和 原位杂交法发现，i p r g c s 轴突可经视束到达腹外侧膝状体( v l g ) ，并最终 止于膝间小叶( i g l ) ；另外，少部分i p r g c s 轴突也可投射到下丘脑的亚室 旁带( s p z ) 、腹外侧视前核以及中脑的橄榄顶盖前核( o p n ) 。 1 2 2 传入途径 目前，研究认为s c n 主要接受6 个区域的输入，包括：视网膜、边缘系 统、下丘脑、缝核、丘脑室周和视网膜外的视觉系统( 丘脑结节区、前项盖) 【4 7 。基于v l s c n 的传入途径主要有通过视网膜下丘脑束( r h t ) 来源于视 网膜的谷氨酸能输入、通过膝状体下丘脑束( g h t ) 来源于外侧膝状体核 ( l g n ) 的神经肽y 输入和缝核的5 一羟色胺能输入。而d m s c n 接受一定量 的非光输入，如：来源于皮质、基底前脑和下丘脑。 四川大学硕士学位i 仑文 g n b 2 1 1 基冈表达的近日节律 光信号到s c n 的输入途径中的不同水平存在近日节律。例如：视网膜的 神经细胞在体外培养时，分泌褪黑素存在近日节律。这种节律独立于s c n 的 控制，可能通过调节视网膜的输入，而调节s c n 的导引。另外，在s c n 的 r h t 突触的数量及脑源性神经营养因子( b r a i n d c r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r , b d n f ) 的轴突前受体也存在近日节律。 1 3 输出途径 s c n 中的近日节律起搏器如何将昼夜时间信息传递给生物体的其余部 分，已经成为当前关注的研究内容。最简单的周期性输出方式是中枢振荡器 ( t h ec e n t r a lo s c i l l a t o r ) 中的顺式和反式作用元件相互作用，从而产生输出基 因的周期性转录。反过来，这些生物钟输出可调节下游输出，最终调控各种 生理生化过程。处于节律基因下游、受输出节律调控的一系列基因，称为钟 控基因( c l o c kc o n t r o l l e dg e n e s ，c c g s ) 。哺乳动物中，e b o x 元件除了引起生 物钟“齿轮”的周期性运行外，还介导一些钟控基因的周期性转录。 c l o c k b m a l l 通过e b o x 激活白蛋白d 元件结合蛋白( a l b u m i n d e l e m e n t b i n d i n g p r o t e i n ，d b p ) 的转录，而p e r 和c r y 蛋白抑制其转录。d b p 结合至l j m p e r l 启动子上的d b p 位点，加强c l o c k b m a l l 介导的m p e r l 的转 录，从而反馈作用于振荡器。丧失d b p 的小鼠表现出运动活动的近日周期变 短，而且变得不活跃。d b p 也调节一些下游过程如近日睡眠的巩固和周期性 e c g 活动。 其他的钟控基因包括神经肽精氨酸血管加压素( a ，) 、b h l i p a s 蛋白 循环因子( c l l f ) 和视黄醛有关的孤儿受体p ( r o r p ) 。s c n 中a v p 的转录、 合成和释放具有近日节律性。在外周和一些中枢神经系统功能中，a v p 涉及 水盐平衡，c l o c k b m a l l 通过其启动子上的e b o x 直接调控a v p 的转录。 c l i f 在内皮细胞和s c n 中节律表达。体外实验中，c l i f 与m c l k 形成二聚体 从而促进转录，此转录起于i 型纤溶酶原激活物抑制因子( p a i - 1 ) 基因启动 子的e - b o x 。而且，p e r 2 和c r y l 通过c l o c k c l i f 异二聚体的形成抑制p a i 1 启动子的活化。p a i 1 可涉及纤维蛋白活性的近日节律改变，并提供了心肌梗 塞清晨发作的分子基础。r o r l 3 在s c n 、视网膜、松果体、及部分与感觉传导 四川大学硕t 学位论文 g n b 2 1 1 基冈表达的近日节律 有关的中枢神经系统中节律表达，r o r j 3 缺陷小鼠在持续黑暗中出现鸭子样步 伐、短暂雄性不育、视网膜缺陷、及运动活动周期延长。 因此，就目前而言，对于近日节律系统的输入途径研究相应较清楚，而 振荡器和输出途径尚有很多问题亟待解决。特别是节律基因究竟是怎样相互 作用产生近日节律? 全身各组织的自身节律又是如何协调一致，从而构成整 个生物体的近日节律的? 这些都还有待进一步的研究。 2 p e r l 在近日节律系统中的地位及其功能 研究表明，p e r l 在生物节律系统中处于核心地位。它在s c n 中主要起维 持系统的稳定和精确，在外周组织中起控制节律周期的主导作用。利用基因 突变技术研究发现，在心r j 基因突变大鼠的s c n 部位近日节律时钟节律周期 轻度缩短，但节律的稳定性和精确性受到明显影响，p p ，j 、n ，2 双基因突变 的大鼠s c n 近日节律时钟节律则完全消失郴j 。将尸p ，突变大鼠的成纤维细胞 体外培养，节律基因的表达周期明显较正常大鼠s c n 部位处或外周组织中的短 【4 9 】。 此外，在哺乳动物，近日节律钟控系统影响着约2 一1 0 基因的表达【，。 近日节律系统的失调可能引起一系列严重疾病的发生，如：淋巴瘤、白血病、 乳腺癌、卵巢癌、抑郁症、睡眠障碍等。因此，处于核心地位的n r 可能还具 有许多其它的非生物钟功能。 研究发现，重复应用甲基苯丙胺能够引起小鼠的药物依赖，同时导致m p e r l 表达的增加【5 1 1 ；n r j 基因突变大鼠对可卡因成瘾的敏感性明显降低5 2 1 。大规模 的流行病学调查发现，n ，j 基因的多态性及启动子的甲基化程度于乳腺癌的发 生有关，提示n r 可能传递机体对肿瘤的遗传易感性哪l 。2 0 0 6 年，研究报道， n r 过表达，能增强多种细胞对丫射线的敏感性，显示出p p r j 在细胞周期与凋亡 中具有重要的调节作用【5 4 1 。另外，在一位慢性单核细胞性白血病急性髓样细胞 性变患者体内发现有e t v 6 基因与n r ，基因反义链融合。e t v 6 基因是e t s 转录因 子家族中的一员，易与其它基因发生融合，形成融合基因，此类融合基因大多 与致癌有关。e t v 6 与肋珀q 融合基因不表达蛋白，由此推测胁6 基因与n r 珀 融合造成p e r l 蛋白表达下降，这可能与白血病的发生有关i j 。 四川大学硕上学位论文g n b 2 1 1 基因表达的近日节律 由此可见p e r l 蛋白在形成近e t 节律和维持正常生理状态上均起着重要作 用。i 日_ p e r l 蛋白在形成近日节律和维持正常生理状态上的作用机制还不清楚。 本实验室的前期研究首先发现g 门6 2 ，基因编码的蛋白能够与p e r i 蛋白 相互作用，提示g 6 刀可能在近日节律的分子振荡器中发挥作用。g 托6 2 ，是 一个看家基因，在正常细胞中它编码合成r a c k l ( r e c e p t o rf o ra c t i v a t e d c k i n a s e1 ) 蛋白。 r a c k l 分子量为3 6 ，0 0 0 d ，在生物体内广泛表达i 珀j ，属于w d 4 0 结构域蛋 白家族成员，含有7 个高度保守的w d - 4 0 ( t r p a s p ) 重复结构域。w d 4 0 蛋白家 族功能涉及细胞信号转导、m r n a 前体加工、细胞骨架聚集等。r a c k l 作为 框架分子、接头分子和锚定分子，介导蛋白一蛋白间相互作用，募集信号分 子形成复合物，调控多种活性分子功能。1 9 8 9 年，g u i l l e m o te ta 1 率先采用鸡 g 蛋白b 2 亚基类似物( g n b 2 ，) c d n a 为探针筛选人b 淋巴细胞c d n a 文库，克 隆出人的g 蛋白b 2 亚基类似物1 ( g n b 2 l 1 ) 瞪”。随后r o n 于1 9 9 4 年克隆出编码 g 蛋1 刍 3 2 f f _ 基类似物1 的基因，并发现其与d 。肾上腺素受体激酶的膜定位有关， 因该蛋白能与细胞内活化的p k c 结合，随即被命名为r a c k i ( r e c e p t o rf o r a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ec 1 ) 【5 引。c r o z ee ta 1 在2 0 0 0 年证实了r a c k i 与i f n a r 2 ( t y p eii n t e r f e r o nr e c e p t o r - 2 ) 的相互作用，并发现加入该受体的配体刺激时， 可以引起r a c k l 分布由散布胞浆转位于核周区域。通过不同的w d 4 0 结构域 位点，r a c k l 可以结合多种活性蛋白质，诸如：蛋白激酶c ，s r c 原癌蛋白， 整合素，磷酸二酯酶p d e 4 d 5 ，s t a t l ( s i g n a lt r a n s d u c c r sa n da c t i v a t o r so f t r a n s c r i p t i o np r o t e i n ) ，i 型胰岛素样生长因子受体( i g f 1r e c e p t o r ) 等p 9 斟】。 正是具有7 个w d 4 0 结构域位点使得r a c k l 可以发挥分子募集等中介作用。研 究中还发现r a c k l 通过下调s r c f y n 酪氨酸蛋白激酶活性，而抑制谷氨酸盐受 体卜 仍a 的活性【的】，而光诱导p e r l 的节律性表达部分正是经由谷氨酸盐受体 通路介导。上述研究表明r a c k i 参与介导细胞内分子转位、调控信号传导、 转录翻译、中枢神经递质代谢等生理过程。 3 本文的目的 本实验室的前期研究工作发现生物钟的关键蛋白p e r l 与r a c k l 能发生 四川大学硕士学位论文g n b 2 1 1 基罔表达的近h 节律 相互作用，小鼠r a c k l 和p e r l 的r n a 干扰试验提示r a c k l 可能位于p e r l 的 上游，结合r a c k l 的分子募集作用推测r a c k l 很可能参与p e r l 的入核、磷 酸化等重要生理过程，并参与生物钟产生生物节律的过程。 因此，我们拟观察g n b 2 l l 基因及其编码的r a c k l 蛋白在大鼠体内外是 否存在节律性的振荡。期望通过本研究，初步明确r a c k l 蛋白在近日节律分 子振荡器中的地位和作用，为揭示生物节律分子振荡的机制以及生物节律相 关疾病的发病机制提供新的思路。 四川大学硕上学位论文g n b 2 1 1 基冈表达的近日节律 参考文献 1 h a l b e r gf ，c o m e l i s s e ng ，o t s u k ak e t a 1 e s s a y so nc h m n o m i e ss p a w n e db y t r a n s d i s c i p l i n a r yc h r o n o b i o l o g y n e u r o e n d o e r i n o ll e t t 2 0 0 1 ，2 2 ( 3 ) ：3 5 9 3 8 4 2 d k l e i n , r y m o o r e s m r e p p e r t , s u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u s ：t h em i n d sc l o c k , o x f o r du n i v e r s i t yp r e s s ，n e wy o r k ，1 9 9 1 ，1 5 ( 2 3 ) 3 5 6 - 3 6 1 3 r y m o o r e 。r s i l v e r s u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u so r g a n i z a t i o n c h r o n o b i 0 1 i n t 1 9 9 8 1 5 ( 1 ) ：4 7 5 - - - 4 8 7 4 y a s u h i k ol b a t a , h i t o s h io k a m u r a , m a s a k it a n a k a , y o s h i t a k at a m a d a , s e m ih a y a s h i ， n o r i oi u i m a , t o m o y u k im a t s u d a , k a t s u h i k om u n e k a w a , t e t s u r ot a k a m a t s u , y a s u oh i s a , y a s u f u m i s h i g e y o s h i a n df u m i m a s a a m a y a f u n c t i o n a lm o r p h o l o g y o ft h e s u p r a c h i a s m a t i cn u c l e u sf r o n t i e r si nn e u r o e n d o c d n o l o g y1 9 9 9 ，2 0 ( 3 ) ：2 4 1 - 2 6 8 5 l i s e t t ek e v a ne s s e v e l d t , m i c h a e in l e h m a n g e r a r dj b o e rt h es u p r a c h i a s m a t i c n u c l e u sa n dt h ec i r c a d i a nt i m e k e e p i n gs y s t e mr e v i s i t e d b r a i nr e s e a r c hr e v i e w s2 0 0 0 ， 3 3 ( 2 ) ：3 4 7 7 ， 6 j c d u n l a p ，m o l e c u l a rb a s e sf o rc i r c a d i a nc l o c k s ，c e l l ，1 9 9 9 ，9 6 ( 1 ) ：2 7 1 - 2 9 0 7 s m r e p p e r t d rw e a v e r , m o l e c u l a ra n a l y s i so fm a m m a l i a nc i r c a d i a nr h y t h m s , a n n u r e v p h y s i 0 1 2 0 0 1 ，6 3 ( 3 ) ：6 4 7 6 7 6 8 m w y o u n g , s a k a y ，t i m ez o n e s ：ac o m p a r a t i v eg e n e t i c so fc i r c a d i a nc l o c k s n a t r e v g e n e t 2 0 0 1 ，2 ( 2 ) ：7 0 2 - 7 1 5 9 j p e t c h e g a r a y ，c l e e ，p a w a d e ，s m r e p p e r t , r h y t h m i ch i s t o n ea c o t y l a t i o nu n d e r l i e s t r a n s e r i p t i o n i n t h e m a m m a l i a nc i r c a d i a nc l o c k , n a t u r e 2 0 0 3 ，4 2 1 ( 3 ) ：1 7 7 - 1 8 2 1 0 n g e k a k i s ，d s t a k n i s ，h b n g u y e n ，f c d a v i s ，l d w i l s b a c h e r , d p k i n g ，j s t a k a h a s h i ，c j w e i t z , r o l eo ft h ec l o c kp r o t e i ni at h em a m m a l i a nc i r c a d i a n m e c h a n i s m , s c i e n c e ，1 9 9 8 ，2 8 0 ( 2 ) ：1 5 6 4 - 1 5 6 9 1 1 j b h o g e n e s e h ，y z g u ，s j a i n , c a b r a d f i e l d , 1 1 1 eb a s i c - h e l i x - l o o p h e l i x p a so r p h a n m o p 3f o r m st r a n s e r i p t i