（细胞生物学专业论文）牛白细胞介素2在毕赤酵母中的表达.pdf

学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 r 6 4 2 69 l 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名： 日 期： 学位论文使用授权声明 豫考 二即平4 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：豫芳 日 期：玉卯丰牟 南京师范大学硕上掌位论文 牛白细胞介素2 在毕赤酵母中的表达 摘要 白细胞介素2 ( i n t e r l e u k i n - 2 ，i 【。一2 ) 主要是由激活的t 淋巴细胞产生的一类 细胞因子，在机体免疫应答中起重要作用。其最重要的功能是诱导t 淋巴细胞 增殖( 从g o 期到s 期) 和分化，并且具有刺激t 辅助细胞和自然杀伤细胞分泌 细胞因子等功能。采用重组d n a 技术生产牛白细胞介素2 ( b o v i n e i n t e r l e u k i n 一2 ， b o i l 2 ) 作为免疫增强剂和免疫治疗剂无疑具有重要意义。本文成功实现了b o i l 2 在巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 中的表达。 p i c h i a p a s t o r i s 表达系统是近年来得到迅速发展的一种真核表达系统。p i c h i a p a s t o r i s 是一种甲醇酵母，可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长。在 表达真核细胞外源蛋白时，不仅具有原核生物生长快、操作简便、成本低的特点， 又具备哺乳类动物细胞的翻译后加工和修饰的功能，从而表达有生物活性的蛋 白。 本研究将b o i l 2 基因成熟肽编码序列c d n a 定向克隆到p i c h i a p a s t o r i s 表达 载体p p i c z b 中，构建出含b o i l 2 基因的重组质粒p p i c z b b o i l 2 ，将经s a ci 酶 切后线- 陛化的p p i c z b b o i l 2 电转化到巴斯德毕赤酵母x 3 3 中，经z e o c i l l 抗 性浓度梯度筛选出高拷贝重组菌株，用1 甲醇诱导目的蛋白表达。经s d s p a g e 及w e s t e r nb l o t t i n g 检测，表明b o i l 2 基因在酵母细胞质中获得了可溶性表达； 通过金属螯合亲和层析( m c a c ) 获得纯化的c 端带有h i s t a g 的重组蛋白；培 养i l 2 依赖的小鼠c t l l 一2 细胞进行活性检测，证实所表达的重组b o i l 2 具有 促淋巴细胞增殖的生物学活性。 关键词牛白细胞介素2 ：毕赤酵母；胞内表达 南京师范大学硕士学位论文 e x p r e s s i o n o fb o v i n ei n t e r l e u k i n - 2g e n ei np i c h i a p a s t o r i s a b s t r a c t i n t e r l e u k i n - 2 ( i l 一2 ) i sac y t o k i n es e c r e t e db ya c t i v a t e dt l y m p h o c y t e sa n dh a sa l l i m p o r t a n tr o l ei nan u m b e ro fi nv i v oi m m u n er e s p o n s e s t h ei m p o r t a n tf u n c t i o no f i l 2i st oi n d u c etc e l lp r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o na n dt op r o m o t e h e l p e rt c e l l s a n dn kc e l l st o p r o d u c tc y t o k i n e s t h e r e f o r e ，r e c o m b i n a n tb o i l 2i s d e s i r a b l ea s i m m u n e a a j u v a n ta n di m m u n o t h e r a p ya g e n t i nt h i ss t u d y ，r e c o m b i n a n tb o i l 2w a s e x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi np i c h i ap a s t o r i s t h em e t h y l o t r o p h i c y e a s tp i c h i ap a s t o r i sh a s b e e nd e v e l o p e da sa ne f f i c i e n t e x p r e s s i o ns y s t e mf o rf o r e i g np r o t e i n s i tc a r lg r o w o nm e t h a n o la sas o l ec a r b o na n d e n e r g y s o u r c ea sa e u k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m ，p i c h i ap a s t o r i s h a s m a n y a d v a n t a g e so v e rp r o k a r y o t e sa n do t h e rh i g h e re u k a r y o t e s i ti sa se a s yt om a n i p u l a t e a n dc u l t u r ea sp r o k a r y o t e sa n di sa b l et op r o c e s sp o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n sa s o t h e r h i g h e re u k a r y o t e s i nt h i s s t u d y ，t h e b o i l 2 g e n e c d n aw a sc l o n e di n t ot h ep i c h i ap a s t o r i s e x p r e s s i o nv e c t o ro fp p i c z b ，w h i c hi s u n d e rt h ec o n t r o lo ft h ea l c o h o lo x i d a s e p r o m o t e ra o x l t h el i n e a m i z e dr e c o m b i n a n tp l a s m i do fp p i c z b b o i l 2 ，d i g e s t e d b y s a ci ，w a st r a n s f o r m e di n t ox - 3 3s t r a i n sb y e l e c t r o p o r a t i o n t h em u l t i c o p yi n s e r t t r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e db yz e o c i n r e s i s t a n c e s c r e e n i n ga n di n d u c e db y 1 m e t h a n 0 1 t h ei n t r a c e l l u l a rs o l u b l ee x p r e s s i o np r o d u c t sw e r ed e t e c t e db ys d s - p a g e a n a l y s i s a n dw e s t e mb l o t t i n g a n a l y s i s ，p u r i f i e d r e c o m b i n a n tb o i l 2p r o t e i nw i t h h i s t a gw a so b t a i n e db ym e t a l c h e l a t i n ga f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ( m c a c ) a s s a y w i t hm u r i n ec t l l 一2c e l l ss h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tb o i l 2e x h i b i t e dt h e b i o l o g i c a la c t i v i t yt oi n d u c et c e l lp r o l i f e r a t i o n k e y w o r d sb o v i n ei n t e r l e u k i n - 2 ，p i c h i a p a s t o r i s ，i n t r a c e l l u l a re x p r e s s i o n 4 南京师范丈学硕士学位论文 第一部分综述 一、白细胞介素2 概述 1 ，白细胞介素概述 白细胞介素( i n t e r l e u k i n ，i l ) 的名称是1 9 7 9 年在第二届国际淋巴因子研 讨会上提出的，意指由各种白细胞产生的、介导细胞间相互作用的细胞因子，在 细胞的活化、增殖和分化中起调节作用。至今得到公认的白介素有1 8 个，分别命 名为i l l i l 一1 8 。除了i l 一4 和i l - 1 3 以及i l 一2 和i l 1 5 等以外，i l 家族中的 大多数成员在氨基酸序列、结构、理化特点和生物学活性等方面均不相同。“。 2 白细胞介素2 的理化性质和特点 白细胞介素2 ( i l 一2 ) 是一种最早发现的具有广泛生物活性的细胞因子，1 9 7 5 年m o r g a n 和r u s c e t t i 等。1 首次发现i l - 2 ，1 9 7 9 年在第二届国际淋巴因子研讨 会上正式命名。 i l 2 具有种属特异性，一般呈下行性，即进化程度高的动物i l 一2 可以作用 于进化程度低的动物，在进化程度相当的动物中也显示明显的种属特异性，哺乳 动物i l 一2 之间有交叉性，这与其受体结合部位氨基酸序列的保守性有关，而且 与氨基酸排列顺序和形成的空间构型也有很大关系。人和其他哺乳动物的i l 一2 不作用于家禽，原因是禽与哺乳动物种间隔离较大。 i l 一2 对热较稳定，5 6 。c 1 h 、3 7 。c 1 2 h 或7 5 1 5 m i n 处理均可保留活性，4 。c 可保存1 年以上，其活性在p h2 - 9 范围内保持稳定。i l 一2 对蛋白酶敏感，对d n a 酶、r n a 酶和神经氨酸酶不敏感。i l 一2 有明显的疏水性，糖基化与否并不影响其 功能，但糖基化的差异与i l 一2 不同分子量和等电点有关。“1 3 白细胞介素2 与受体作用的机制 白细胞介素2 必须和i l 一2 受体结合后才能发挥生物学效应。i l 2 受体 ( i l 一2 r ) 是异多聚体糖蛋白，分子量约1 4 0k d ，其中链5 5 k d ，0 链7 0 7 5 k d ， y 链6 5 k d 。细胞上约有2 0 0 1 0 0 0 0 0 个i l 一2 结合位点，i l - 2 r 能以高中低三种亲 和力与i l 2 结合，解离常数分别为1 0 。1 m 、1 0 9 m 、1 0 8 m 。i l 2 与受体的结合模 式可能是单核细胞表达大量y 和小量b ，n k 细胞表达大量b 和小量y ，分别形 成by 受体，by 与高浓度i l 一2 结合呈中等亲和力结合形成三聚体后，激活单 南京师范大学硕士学位论文 核细胞或n k 细胞。i l 一2 与其受体结合后激活胞质内的多种非受体型蛋白质酪氨 酸激酶( p t k ) ，进一步启动3 种主要信号传导途径：控制基因转录的j a k s t a t 途径：导致细胞增殖和基因转录的r a s m a p k 途径以及与抗凋亡和细胞骨架布 局有关的p 1 3 k 途径。”1 4 白细胞介素2 的生物学功能 i l 一2 是t 细胞和n k 细胞产生的l j 5 k d 糖蛋白，在机体免疫应答中起重要 作用。在体外i l 一2 能长时间地维持t 淋巴细胞的生长，能诱导自然杀伤细胞( n k 细胞) 增殖，增强其活性，也能诱导已活化的b 细胞增殖。在体内它能促进t 、b 细胞及n k 细胞的增殖与分化，刺激活化t 细胞分泌i f n 、c s f 等细胞因子产生， 增强t i c 、n k 、m 由细胞毒活性，诱导肿瘤浸润性淋巴细胞( t i l ) 及淋巴因子激活 的杀伤细胞( l a k ) 的产生。另外，i l 一2 具有重要的中枢调控作用，能够影响神经元 和神经胶质细胞的存活和生长，具有中枢镇痛功能“。高剂量的i l 一2 能引起单核 巨噬细胞增殖和分化，并增强单核巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的作用。 i l 2 诱导t 细胞增殖的作用机理为，由组织相容性复合物分子和抗原肽组 成的复合物与t 细胞受体相互作用，引发t 细胞上信号转导反应，从而表达i l 一2 。j 和其受体“：。成熟外周血中t 细胞上，i l 2 与高亲和力的受体结合后，会导致运 铁蛋白受体的表达，使t 细胞摄入离子。核苷酸还原酶合成嘌呤和嘧啶时需以 离子为必须的辅因子，有了足够的嘌呤和嘧啶的生物合成，细胞才能在s 期完成 d n a 复制”3 。 二、白细胞介素2 研究进展 1 动物白细胞介素2 基因克隆和表达的研究进展 天然i l 一2 的产生仅局限于某一区域，存在于相互作用的细胞因子之间，并 受到抗原浓度的影响和严格调控，因此体内的活性检测较难，另外制备i l 一2 常用 的方法操作费时、繁琐。因此重组i l - 2 为其实验研究和应用提供了新的途径。 自1 9 8 3 年由t a n i g u c h i 等首先将人的白细胞介素2 克隆成功以来，多种动 物的i l 一2 先后被克隆成功。1 9 8 5 年鼠i l 一2c d n a 首先克隆成功，建立了活化的 鼠t 细胞系c d n a 文库，建库所用的载体含有s v 4 0 早期启动子，转染c o s 一7 细胞 后，使插入片段高效表达，表达后检测细胞培养上清液的活性，筛选出3 个具有 i l 一2 活性的c d n a 克隆。 南京师范大学硕士学位论文 1 9 8 6 年r e e v e s 等。1 在猴细胞中成功表达牛i l 一2 的c d n a 克隆。他们的研究 表明，牛i l 一2 由1 5 5 个a a 组成，预测分子量为1 9 ，5 5 5 d a ，前2 0 个a a 为信号 肽，成熟肽为1 3 5 个a a ，分子量为1 5 ，4 5 2 d a 。经序列同源性比较发现，牛i l 一2 和人i l 一2 及小鼠i l 一2 的同源性分别为6 5 与5 0 。同年，c e r r e t t i 等。9 。建立活 化牛淋巴细胞c d n a 文库，用人i l 一2 作探针筛选出了牛i l 一2 ，并在大肠杆菌中 成功表达。 1 9 9 4 年r a y m o n db u j d o s o 等“”1 运用p c r 的方法获得了编码绵羊( o v i n e ) i l 一2 的成熟肽基因序列。经序列同源性比较发现，绵羊i l 一2 与牛i l 一2 的同源性最高 有9 8 ，而与人的i l 一2 有6 0 的同源性。他们采用酵母表达载体p o g s 4 0 表达出 p 1 i l 一2 融合蛋白，经活性测定证实能够维持由c o n a 激活的t 细胞生长。 1 9 9 5 年e u a nl o c k h a r t 等1 用r t p c r 的方法以牛i l 一2 为引物克隆得到 鹿( c e r v i n e ) 的i l 一2c d n a 全序列。鹿的i l 一2 的c d n a 与牛、羊的同源性有9 4 ， 而与人的同源性有5 0 ，与鼠的同源性为5 3 。推测其蛋白序列为1 6 2 个a a ，有 2 0 个a a 为信号肽，成熟肽预测分子量为i 6 ，2 7 3 d a 。他们采用p t r x h i s 载体与 硫氧还蛋白共表达鹿的白细胞介素2 ，并且用多聚h i s t a g 来纯化蛋白。这为表 达有生物活性的细胞因子提供了一个较好的表达系统。 1 9 9 6 年g i s e l a “2 1 等人利用重组牛疱疹病毒成功分泌表达牛白介素2 ，结果 获得了有生物活性的糖蛋白。 1 9 9 7 年，s u n d i c k 等“3 1 用c o n a 刺激鸡脾淋巴细胞构建了一个c d n a 文库，转 染c o s 一7 细胞，通过瞬时表达，首次克隆了鸡( c h i c k e n ) 的i l 一2 基因。他们所克 隆的鸡i l - 2m r n a 全长7 4 7 个b p ，结构基因长3 4 3 个b p ，推测蛋白出1 4 3 个a a 组成，其中含有一个长为2 2 个a a 的信号肽。序列分析表明，该分子类似于哺乳 动物i l 一2 和i 【。一1 5 ，同源性分别为2 4 5 和2 3 8 。为了进一步鉴定该基因，k a i s e 等“”根据已发表的序列设计引物，应用r t - p c r 技术克隆到该基因，并与人类和 鼠的i l 一2 结构进行比较研究。确定了该基因是鸡类似于哺乳动物的i l 一2 基因。 2 白细胞介素2 应用研究进展 2 1i l 一2 作为免疫佐剂 i l 一2 在特异性免疫应答反应中的重要作用是其作为佐剂应用的理论依据， 各国学者对此作了许多深入的研究。多项研究结果表明i l 一2 可进一步提高腺体 南京师范大学硕士学位论文 对疫苗的免疫应答及控制疾病的发生。据国外学者报道，r b o i l - 2 在多种牛病防 治中具有良好的免疫佐剂作用，如牛支气管炎病毒“”、牛疱疹病毒“、牛白血 病和乳房炎。“”此外，将r b o i l 一2 作为佐剂使用，明显提高了狂犬病毒灭活苗的 免疫效果。“”1w e i n b e r g 等发现i l 一2 可提高单纯疱疹病毒粗提物或其糖蛋白亚 单位苗的免疫效果。”叫b l e c h a 等报道在提高猪对链球菌攻击的耐受性方面， r b o i t 一2 具良好的免疫佐剂作用。“ 传统疫苗应用的许多佐剂是简单化合物形式，如：油佐剂或简单铝盐等。许 多佐荆由于引起剧烈的局部反应或全身毒性反应丽受限制应用。而i l 一2 等细胞 因子作为新型免疫佐剂，可能是解决传统免疫佐剂不良影响的有效途径之一，是 被人们普遍看好并有着广阔应用前景的新型佐剂。 2 2i l 一2 作为免疫治疗剂 用i l 一2 来处理感染动物，可以增强动物的免疫功能，起免疫治疗作用。如： 可明显降低豚鼠生殖系统单纯疱疹病毒感染的复发率、鸡肠炎沙门氏菌器官侵入 率”“、细菌性乳腺炎的发病率。 2 3 构建新型基因工程疫苗 在基因工程疫苗研制中，常把细胞因子基因( 如i l 2 、i l 一1 、g m c s f 等) 和保护抗原基因连接在一起，构成融合蛋白，以增强疫苗的抗体产生和细胞免疫 水平。r a m s h a w 等。“、f l e x n e r 等。”先后报道将小鼠或人i l 2c d n a 与含禽流 感血凝素( h a ) 基因的痘病毒重组，证明插入细胞因子可以大大提高活病毒载 体的安全性。f l e x n e r 等在啮齿动物和猴中证明，用重组病毒表达i l 一2 可明显 降低病毒毒力并且不丧失免疫原性。h a z a m a “”等将i l 一2 基因与牛单纯性疱疹病 毒糖蛋白k 基因融合，真核细胞内表达融合蛋白，免疫小鼠后攻毒，结果该融 合蛋白可以完全保护小鼠免受病毒攻击。而以氢氧化铝为佐剂但不含i l 一2 的重 组糖蛋白只产生部分保护作用，i l 2 在体内的半衰期也因此而延长了大约四倍。 结果表明采用此种方式获得i l 2 抗原重组蛋白，是研制新一代基因工程疫苗的 另一有效途径。 此外，应用基因工程技术己研制出多种免疫毒素。i l 2 免疫毒素是最成功的 例子，在治疗移植排斥反应、自身免疫性疾病、t 细胞淋巴瘤等疾病防治上已展 示出诱认的前景，已有人源化的i l 一2 免疫毒素研制出来。”7 1 南京师范大学硕：卜学位论文 3 白细胞介素2 应用前景展望 近年来重组d n a 技术迅速发展，已广泛应用于各种生物制品的生产，基因工 程重组人白介素2 就是应用重组d n a 技术生产的最早的蛋白药品之一，也是当今我 国能自主生产的少数基因工程药物之一。如能将牛白介素2 基因克隆入毕赤酵母 表达载体，实现高表达，则采用大规模发酵技术可获得大量相对廉价的i l 一2 ，因 而有巨大的应用前景。 三、巴斯德毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r f s ) 表达系统概述 1 p i c h i ap a s t o r i s 的生物学和遗传学特点 甲醇营养型酵母主要包括念珠酵母属( c a n d i d a ) 、球拟酵母属 ( 乃r “l o p s i s ) 、汉逊酵母属( h a n s e n 口l a ) 、毕赤酵母属( pp a s t o r i s ) 四个 属。用作表达宿主菌的主要是h a h s e nl a 和p i c h i a ，特别是丘p o t f m o r p h a 和 p p a s t o r i s 两个种。它们同其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存 在；当环境营养限制时，常诱导两个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融 合成双倍体。营养受限时也可诱导产生孢子，形成含有四个孢子的子囊，这些 子囊孢子可用作四分子分析或随机分析。对其孢子的分析发现，特异突变表型的 基因常非随机聚集在一起，这提示几个功能相关基因常排列在同一染色体上，类 似原核生物的操纵子类型。 v e e h u ism z o l 研究表明甲醇营养型酵母的重要特性是能利用甲醇作为唯一的 碳源和能源，原因在于甲醇能诱导其表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶 ( a 1 c o b o lo x i d a s e ，a o x ) ，二羟丙酮合成酶( d i h y d r o x y a c e t o n es y n t h a s e ，d h a s ) 和过氧化氢酶( c a t a l a s e ) ，表达的a o x 和d h a s 的含量甚至可达到总细胞蛋白的 6 0 一8 0 。在p i c h i ap a s t o r is 染色体中有两个基因编码乙醇氧化酶：a o x i 矛h a o x 2 ， i o x 2 编码的蛋白质与a o x i 编码的蛋白质有9 7 的同源性和几乎相同的特异催化活 性，但a o x l 基因的启动子( p a o x l ) 受甲醇强烈诱导，而p a o x 2 则很弱。当细胞以 葡萄糖、甘油和乙醇为碳源时，不能检测到a o x l 的表达，而在以甲醇为唯一碳 源时，该酶可达到细胞可溶性蛋白的3 0 以上。 1 9 9 2 年h o o pm j “”等指出p p a s t o r i s 的另一个生物学特点是，甲醇代谢所需 的醇氧化酶被分拣到过氧化物酶体( p e r o x i s o m e ) 中，形成区域化 ( c o m d a r t m e n t a l i z a t i o n ) 。在以葡萄糖为碳源时，菌体中只有一个或少数几个 南京师范大学硕士学位论文 很小的过氧化物酶体，而以甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积 的8 0 ，a o x 增至细胞总蛋白的3 5 一4 0 。因此，当在a o x 基因前利用同源重组方式 插入外源蛋白基因时，可获得大量表达。1 9 9 3 年g r e g gj m 。州等报道，根据甲醇酵 母这种可以形成过氧化物酶体的特性，既可利用该系统表达一些毒性蛋白和易被 降解的酶类，也可用以研究细胞特异区域化的生物发生及其机制和功能，为高等 动物类似的研究提供启示。现己鉴定出两种分拣进入过氧化物酶体所需的靶信号 ( p e r o x i s o m a lt a r g e t i n gs i g a l s ，p t s s ) ，即p t s l 和p t s 2 。前者存在于蛋白质c 一 末端，含s e r l y s l e u ( s k l c o o h ) 肽序列，后者存在于n 一末端，含一r l x j h l 序列。最近，n i c a n djm 证实包装在过氧化物酶体中的外源蛋白比在胞浆中稳 定得多，如一种富含甲硫氨酸的蛋白质通过p t sj 信号转运入过氧化物酶体后，半 衰期由胞浆中的2 0 分钟提高到1 4 0 分钟。 2 毕赤酵母表达体系的特点及优点 巴斯德毕赤酵母在表达真核细胞外源蛋白时，不仅具有原核生物生长快、 操作简便、成本低的特点，又具备哺乳类动物细胞的翻译后加工和修饰的功能， 从而表达有生物活性的蛋白。”其优点概括起来主要有以下几个方面： 1 ) 有醇氧化酶的强启动子，可严格调控外源基因的表达； 2 ) 毕赤酵母基因操作技术和酿酒酵母非常相似，而后者是现代分子生物学中研 究得透彻和应用很广的酵母表达体系； 3 ) 作为真核表达系统，可对表达后的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表 达后的蛋白具有生物活性： 4 ) 毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内，又可分泌至胞外，其自身分泌到培 养基中的蛋白很少，高分泌的异源蛋白易从无蛋白的培养基中分离； 5 ) 外源基因通过质粒整合到毕赤酵母基因组后，结构稳定，不易丢失； 6 ) 外源基因能通过体内或体外方法以不同拷贝数装入毕赤酵母基因组d n a 中， 以利于筛选到合适基因剂量的高表达菌株； 7 ) 毕赤酵母对需氧生长有强大的偏好，这一生理学特性使得它既能高密度发酵 生长，亦有利于工业放大生产； 8 ) 外源蛋白的表达量较高； 9 ) 蛋白糖基化程度低。毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链 南京师范大学硕士掌位论文 8 1 4 个甘露糖残基，而酿酒酵母平均为5 0 一1 0 0 个，而且酿酒酵母核心多糖 末端存在a 一1 ，3 糖苷键，但毕赤酵母没有。一般认为酿酒酵母中糖蛋白的a l ，3 糖苷键使得这些蛋白具有高度的抗原性，因而不适合治疗用途； 1 0 ) 毕赤酵母能分拣外源蛋白进入过氧化物酶体，使之区域化，这样使蛋白免 受蛋白酶降解，增加其稳定性，还可减少外源蛋白对宿主的毒害作用。” 3 外源蛋白在毕赤酵母中的成功表达 毕赤酵母表达系统的诸多优势使近年来其应用范围大大加宽，表达产物除了 人畜药用制品外，还包括来自植物、动物、细菌、真菌和病毒的各种酶、膜受体 蛋白、含辅基的蛋白以及可用于研究晶体结构的蛋白等。“1 用该系统已成功表达 了几百种酶、药用及疫苗用蛋白。由于毕赤酵母表达载体上醇氧化酶强启动子的 作用，许多外源蛋白的表达量很高。如s r e e k r i s h n a 等人在1 9 8 9 年曾报道利用 毕赤酵母在胞内表达t u m o rn e e r o s i sf a c t o r ( t n f ) ，产量高达l o g l 。c l a r e 等人 在1 9 9 1 年用毕赤酵母在胞内表达t e t a n u st o x i nf r a g m e n tc ，产量达到1 2 9 l 。 1 9 9 7 年h a s s l a c h e r 等人在胞内表达h e r e ab r a s i l i e n s i sh y d t o x y n i t r i l e l y a s e 获得了2 2g l 的表达量。i ”g d a y i s 等人采用分泌表达人i l 一2 ，产量为4 g l ，而g v e l i e e e b i 等人采用分泌表达人i l 一2 ，产量为l g l 。 目前，运用毕赤酵母系统表达外源蛋白虽然在国内才刚刚起步，但也取得了 可喜的成果，2 0 0 3 年马兴元1 等报道总结用此体系分别成功地表达出胰岛素、 乙肝表面抗原、降钙素、人血清白蛋白、重组人干扰素、重组人肿瘤坏死因子、 人组织性纤溶酶原激活剂等多种基因工程活性蛋自。 4 p i c h i a p a s t o r i s 表达系统的应用前景与展望 p i c h i a 口娜幻r 括表达系统的诸多优势使得近十年来人们越来越多地应用它作 为外源基因的表达系统，当然，p i c h i a p a s t o r i s 表达体系和其它表达体系一样，也 有其不足之处，如蛋白降解，产物失活，胞外表达的分泌问题等。但随着对p i c h i a p a s t o r i s 分子遗传学研究和认识的进一步深入和实践经验的不断积累，必将使这 一表达系统更加完善，更多的外源蛋白会在此系统得到高效表达。我们相信， p i c h i a p a s t o r 括表达系统必将在我国2 1 世纪基因工程真核表达产品产业化、商品化 的进程中，发挥越来越大的作用。 四、研究目的和方法 南京师范大学硕士学位论文 1 研究目的 i l 2 在动物疾病治疗及预防方面的价值已得到了肯定。我国一些人所共知的 传染病，如猪瘟、5 号病等仍不时发生，造成巨大的经济损失。而有时疫苗的免 疫效果不理想。研究表明，一些病原所引起的免疫抑制与i l 一2 等细胞因子分泌 水平降低或表达不正常有关。因此，重组i l 2 作为免疫增强剂，不仅可以加强 传统及新型基因工程疫苗的免疫效果，而且可以直接用于这些流行疾病治疗。但 天然i l 一2 的产生仅局限于某一区域，存在于相互作用的细胞因子之间，并受到 抗原浓度的影响和严格调控，因此体内的活性检测较难，另外制备白介素常用的 方法操作费时、繁琐。n 止l 重组i l 一2 为其实验研究和应用提供了新的途径。近 些年来国外及国内非常重视重组动物i l 2 的研制，先后克隆并表达了牛、猪、 猫、鸡的i l 一2 基因，获得了有生物学活性的重组i l 一2 ，鉴于现在国内外研究者 是在大肠杆菌中表达b o i l 2 。“3 或利用重组杆状病毒在昆虫细胞内表达b o i l 2 。“或 在酿酒酵母中分泌表达b o l l 2 。“，各有其局限性，所以为了提高重组b o i l 2 的 表达产量及活性，我们尝试采用在巴斯德毕赤酵母中进行胞内表达b o i l 2 。首 先构建出含b o i l 2 的毕赤酵母真核表达载体，转化入毕赤酵母宿主菌中，进行 胞内表达，筛选出高效表达的稳定重组菌株，纯化有活性的功能蛋白，获得有 生物活性的重组b o i l 2 蛋白。 2 研究方法 2 1 构建含b o i l 2 基因的毕赤酵母真核表达载体并转化至m u t + 型宿主菌 将b o i l 2 基因成熟肽编码序列e d n a 定向克隆到p i c h i ap a s t o r i s 表达载体 p p i c z b 中，构建出含b o i l 2 基因的重组质粒p p i c z b b o i l 2 ，将经s a ci 酶切后 线性化的p p i c z b b o i l 2 电转化到巴斯德毕赤酵母x - 3 3 中，经z e o c i n 抗性浓度 梯度筛选出高拷贝重组菌株。 2 2 筛选高效表达的稳定菌株 高拷贝重组菌株用1 甲醇诱导目的蛋白表达。经s d s p a g e 及w e s t e r n b l o t t i n g 检测，表明b o i l 2 在酵母细胞质中获得了可溶性表达。将表达较好的重 组菌株进行传代培养，再诱导表达，直至获得较为稳定表达的基因工程重组菌株。 2 - 3 纯化表达的融合蛋白并检测其活性 通过金属螯合亲和层析( m c a c ) 获得纯化的c 端带有h i s t a g 的重组蛋白； 南京师范大学硕士学位论文 培养i l 一2 依赖的小鼠c t l l 2 细胞进行活性检测，证实所表达的重组b o i l 2 具 有促淋巴细胞增殖的生物学活性。 3 研究结果 1 ) 经z e o c i n 抗性浓度梯度筛选出3 0 个高拷贝重组菌株；经过甲醇诱导表达及 传代筛选，获得2 个稳定表达的高拷贝重组菌株。 2 1 通过金属螯合亲和层析( m c a c ) 获得了纯化的c 端带有h i s t a g 的重组融 合蛋白。 3 ) 获得了具促淋巴细胞增殖活性的重组b o i l 2 蛋白，活性单位为1 1 0 0 i u m g 。 南京师范大学烦士学位论文 第二部分b o i l 2 基因真核表达载体的构建和高抗性重组菌 株的筛选及鉴定 刖青 目前已发展和建立了几种酵母表达系统的表达载体，但以整合型载体最为重 要。整合型载体不含自主复制序列( a r s ) ，而是被整合到酵母宿主菌的染色体 上。现在常用的整合型载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒，其基本元件包括 大肠杆菌和酵母菌的一些元件。本实验选择真核表达载体p p i c z b ，它具有以下 特点：1 ) p p i c z b 含有p u c 复制起始点，保证该载体在大肠杆菌中的复制；2 ) 具有a o x l 启动子，一方面启动外源基因在毕赤酵母中受甲醇诱导高效表达， 另一方面使质粒同源重组整合进酵母基因组相应的a o x l 位点：3 ) 有一个编码 6 个组氨酸残基的序列，其表达产物形成一个金属结合位点，以利于重组蛋白的 亲合层析纯化：4 ) a o x l 转录终止序列能有效促进外源基因的转录终止及转录产 物的加工和稳定：5 ) 具有一个独特的抗生素筛选标记，对抗生素z e o c i n 具有抗 性。 根据b o i l 2 成熟肽序列( g e n e b a n k 上登录号为m 1 2 7 9 1 ) 设计引物，经过 常规p c r 扩增，获得b o i l 2 基因成熟肽c d n a ，将其定向克隆到p i c h i a p a s t o r i s 表达载体p p i c z b 中，构建出含b o i l 2 基因的毕赤酵母真核表达载体 p p i c z b b o i l 2 。s a ci 酶切p p i c z b b o i l 2 使其线性化，试验确定最佳电转参数 后，电转化至m u t + 型宿主菌x 一3 3 ，经过z e o c i n 抗性浓度梯度平扳筛选高拷贝 重组菌株，涮及m d 平板鉴定其甲醇利用表型。提取酵母基因组d n a 进行p c r 鉴 定阳性转化子。为了提高重组菌株的拷贝数，减少工作量，我们尝试采用了二次 电转化的方法来获得高拷贝重组菌株。 1 菌株与质粒 实验材料 南京师范大学硕士学位论文 毕赤酵母菌株x 一3 3 ，质粒p p i c z b 为i n v i t r o g e n 公司产品；p u c l 9 b o i l 2 重 组质粒，e c o l ij m l 0 9 均为本室保藏。 2 主要仪器 低温离心机s i g m a d n at h e r m a lc y c l e rp e 恒温循环水浴槽 f i s h e r 真空干燥机 s a v a n t 凝胶图像分析系统上海天能 温控摇床中国东联电子 恒温培养箱上海益恒 g e n ep l u s e ri ib i o r a d 核酸蛋白分析仪d u 6 4 0 型b e c k m a n 3 主要试剂 t a g d n a 聚合酶、t 4 d n a 连接酶、限制性内切酶e c o r i 、x h o i 和s a c i ， d n a 分子量标准物d l 2 0 0 0 和 h i n d i 均购自大连t a k a r a 公司。x g a l 、i p t g 购自p r o m e g a 公司。u n i q 一1 0 柱胶回收试剂盒购自上海生工生物工程公司，p c r 引物及核酸测序由上海生工生物工程公司完成，其它试剂均为国产或进! z 1 分析 纯。 实验方法 l ，试剂配制 1 1 l b 液体、固体培养基 蛋白胨：1 酵母浸出液：0 ，5 n a c l ：1 琼脂粉：1 j 1 2 小量抽提质粒d n a 的溶液 溶液i ：5 0 r e t o o l l 葡莓糖 2 5 m m o l lt r i s c l ( p h8 0 ) l o m m o l le d t a ( p h8 0 ) 溶液i i ：0 2 m o l ln a 0 h 1 s d s 溶液i i i ：5 m o l l 乙酸钾6 0 m 1 15 堕塞堕蔓查兰堕主兰篁堡苎 冰乙酸 1 1 5 m l 水 2 8 5 m l s t e ：l o m m o l lt r l s c 1 ( p h8 0 ) i m m o l le d t a( p h8 ，0 ) 0 ，i m m o l ln a c l t e ：l o m m o l lt r is - c 1 ( p h8 0 ) i m r a o l | le d t a 2 0 pg m l 胰r n a s e 1 3 低盐l b 液体、固体培养基 蛋白胨：1 酵母浸出液：0 5 n a c h0 5 琼脂粉：2 1 4y p d 液体、固体培养基 蛋白胨：2 酵母浸出液：1 葡萄糖：2 琼脂粉：2 15y p d s 固体培养基 蛋白胨：2 酵母浸出液：1 葡萄糖：2 山梨糖醇：i m o l l琼脂粉：2 1 6 破菌缓冲液 在9 0 0 m l 水中加入6 9n a 。p 0 4 、3 7 2 m g e d t a 、5 0 m l 甘油，特溶解后用n a o h 调节溶液的p h 值至7 4 ，然后定容至1 l ，储存于4 。 1 7p e g m g c i 。溶液 4 0 p e g s 0 0 03 0 m m o l lm f f c 2 1 81 0 d 溶解2 0 0 9d g l u c o s e 在1 0 0 0 m l h 2 0 中，过滤灭菌。 l ，9y p d s 、z e o c i n 浓度梯度平板 溶解1 9 酵母提取物、1 8 2 2 9 山梨糖醇、2 9 蛋白胨于9 0 m l h 2 0 中，溶解后向 其中加入2 9 琼脂，灭菌2 0 m i n 。然后加入l o m l l o 鬟童 i 毒 s l l篱摹 l|毒 擂 i窜 l ；专耋蔓 季 1 i卢 i 藿 ；_|委 叠 芋 。l芎 冀 6 l毒 i 2 l耄 8 i 雾 ：主 ”i 毒 ；手嚣 淫 擂 i蓬 蘸墨 ；鲁 s 疆：l 耄 s i 喜。l 毫 墨二 臂耋q4ly口f|st舌仁n工娶_鱼一i_su *ciu譬上导i=-巴a时-di曲 导=ins高主：pj曼aji乜，誉hn60一=f|百oi矗善皿 南京师范大学硕士学位论文 附录2 硕士在读期间参与的动物冠状病毒紧急课题的研究工作 多重r t p c r 检测猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病病毒 摘要 猪传染性胃肠炎病毒( t g e v ) 和猪流行性腹泻病毒( p e d v ) 是冠状病毒科、冠 状病毒属的成员，均为有囊膜的单链正股r n a 病毒。t g e v 和p e d v 均可引起猪肠 道传染病，两者在i 临床表现、病理变化、流行病学等方面都极为相似，在临床和 组织病理学上难以区分。建立快速检测区分t g e v 和p e d v 所引起肠炎的方法对猪 传染性胃肠炎( t g e ) 和猪流行性腹泻( p e d ) 的诊断，降低猪致病率和死亡率无 疑有十分重要的意义。 为了检测、区分t g e 和p e d ，本文建立了同时检测这两种病原体的多重p c r 方法：参考g e n e b a n k 登录的t g e v 和p e d v 纤突蛋白s 基因序列，经软件 1 f n k s i s t 2 0 比较分析，分别筛选出t g e v 、p e d vs 基因相对保守区。以t g e v t h 一9 8 株( g e n e b a n k 登陆号为a f 4 9 4 3 3 7 ) 和p e d vc v 7 7 7 株( g e n e b a n k 登陆号为n c 0 0 3 4 3 6 ) 为参考模板，利用软件p r i m e r3 设计合成了两对寡核苷酸引物，以s t 细胞培养 的t g e v 和p e d v 毒株核酸为模板，利用所设计的两对引物进行多重r t p c r 扩增， 结果同时得到与实验设计相符的4 9 9 b p ( t g e v ) 和1 9 9 b p ( p e d v ) 的扩增条带， 而对其它三种猪病原病毒( 伪狂犬病毒p r v ，猪繁殖呼吸道综合症病毒p r r s v ，猪 细小病毒p p v ) 的扩增结果均为阴性。敏感性实验结果表明，本实验建立的多重 r t - p c r 方法可检测出l o p gt g e vr n a 和l o o p gp e d vr n a 量。 关键词：t g e v ；p e d v ；多重r t p c r ；检测 南京