（生态学专业论文）防晒化妆品防晒功效研究.pdf

摘要 近年来，随着人们对紫外线过量照射危害的认识逐渐加强，越来 越多的防晒类化妆品得以开发并投入使用。迅速、有效的防晒功效评 价与测试方法受到了越来越高的关注。本论文以s c g e 技术为基础，试 图建立一种有别于传统s p f 、p a 值化妆品防晒效果评测的新体系；通 过对所选化妆品防晒效果评测，验证评测体系的可靠性；进而研究了 防晒化妆品对空气中的常见有机污染物的隔离作用。研究内容包括三 个部分：首先，本论文以哺乳动物全血淋巴细胞为材料，以紫外光为 诱变条件，优选了用于建立化妆品防晒效果评测新体系的指标，包括： 光照时间，裂解时间、电泳条件和彗星分析指标；其次，在上述所建 体系的基础上，对所选防晒化妆品进行功效测定，选择了适合的光照 时间和化妆品使用量，并将所得的各项彗星指标与防晒品所标识的 s p f 值以及化妆品的价格进行比较，发现覆盖防晒化妆品后，细胞的 存活率有明显的提升，由各项彗星指标所体现的细胞受损程度均有所 降低，反映了防晒化妆品对于紫外光照( 亦可推定为普通日光) 条件 下的动物细胞有着保护作用。在同等照射条件下，相同品牌的防晒化 妆品s p f 越高，对于细胞的保护作用越明显，但其作用并非与其价格 呈正相关关系。论文第三部分研究了防晒化妆品对空气中的常见有机 污染物的隔离作用，发现在一定浓度范围内，防晒化妆品对于空气中 的常见污染物( 9 一硝基蒽) 有一定的隔离作用。此种评测方法是对 传统s p f 、u v 标称测评体系的补充和提升。 论文的创新之处在于，以碱性s c g e 技术为基础、以紫外光照射、 动物细胞模拟为条件、以计算机软件辅助分析为重要手段，结合多学 科的先进方法，对化妆品防晒效果这一课题进行了深入量化的研究， 初步建立了一种高效、高准确度、低成本并具有一定实用价值的评测 体系。 关键词防晒化妆品，彗星分析，紫外线，防晒效果 中央民族火学硕士研究生论文 a b s t r a c t r e c e n t l y , m o r ea n dm o r es u n s c r e e nc o s m e t i c sa r ed e v e l o p e d a n dp u t i n t oc o m m e r c i a lu s ed u et ot h er e c o g n i t i o no fh a r mb ye x c e s s i v eu v a c c o r d i n g l y , d e v e l o p i n ga na s s e s s m e n tm e t h o dw i t hh i g he f f i c i e n c ya n d a c c u r a c yi sn e c e s s a r ya n di m p o r t a n t t h i sa r t i c l ea i m e d a te s t a b l i s h i n ga l l a s s e s s m e n ts y s t e mb a s e do na l k a l i n es c g et e c h n o l o g yt o t e s tt h e s u n s c r e e ne f f i c i e n c yo fc o s m e t i c sw h i c hi ss e p a r a t e df r o ml e g a c ys p f a n du v s y s t e m s f i r s to fa 1 1 w ee s t a b l i s h e dt h es c g es y s t e mt r i g g e r e db yu vt o d e t e r m i n et h ep r o p e rp a r a m e t e rf o rt h i sr e s e a r c hs u c ha si l l u m i n a t i o nt i m e ， d e g r a d a t i o nt i m ea n de l e c t r o p h o r e s i sc o n d i t i o n ，a n da l s ot h ep a r a m e t e r f o rc o m e ta n a l y s i s s e c o n d l y , b a s e do nt h ea b o v es y s t e m ，t oa s s e s st h e f u n c t i o n a l i t y o fs e l e c t e ds u n s c r e e nc o s m e t i c s ，w ec h o s et h ep r o p e r i l l u m i n a t i o nt i m ea n dt e s tv o l u m e ，a n dc o m p a r e dt h o s ep a r a m e t e r sw i t h s p fv a l u ea n dp r i c eo fs e l e c t e dc o s m e t i c s a c c o r d i n gt ot h i s ，w e d i s c o v e r e dt h a tt h ed a m a g el e v e lp r e s e n t e db yt h a tc o m e tp a r a m e t e r d e c r e a s e da f t e ru s i n gt h es u n s c r e e nc o s m e t i c s i ts h o w st h ep r o t e c t i o n e f f e c tt oa n i m a lc e l l su n d e ru vw i t ht h es a m ec o n d i t i o n t h eh i g h e ro f t h es p f , t h es t r o n g e ro ft h ee f f e c t h o w e v e r , t h i se f f e c ti sn o tp r o p o r t i o n a l t ot h ep r i c e w i t h i nt h ea r t i c l e ，t h es u n s c r e e nc o s m e t i c sh a si s o l a t i o n e f f e c tt on o r m a lp o l l u t i o nm a t e r i a ls u c ha s9 - n i t r o a n t h r a c e n e t h ev a l u eo ft h i sr e s e a r c hi st h a tac o m p l e m e n tm e t h o df o rl e g a c y s p f u vs y s t e mc a nb ee s t a b l i s h e d t h ei n n o v a t i o no ft h i sr e s e a r c hi sa s f o l l o w i n g ：b yt a k i n ga l k a l i n es c g et e c h n o l o g ya sf u n d a m e n t a la n a l y s i s m e t h o d ，u ve n v i r o n m e n t m a m m a lc e l l ss i m u l a t i o n a s c o n d i t i o n ， c o m p u t e rs o f t w a r ea n a l y s i sa sa s s i s t a n tw a y , a m u l t i s c i e n c ea s s e s s m e n t s y s t e mc a nb ee s t a b l i s h e dw i t ht h o s ea d v a n c ef e a t u r e s ，w h i c hi so fh i g h 3 中央民族大学硕士研究生论文 e f f i c i e n c y , a c c u r a c y , p r a c t i c a lv a l u ea n d w i t hr e l a t i v el o wc o s t k e yw o r d ss u n s c r e e nc o s m e t i c ，c o m e ta s s a y , u vs u n s c r e e ne f f e c t 4 中央民族大学硕士研究生论文 第一章综述 第一节防晒类化妆品的发展概况 众所周知，适量的紫外线照射能够消毒杀菌，提供人体所需的维生素d ，增 强抵抗力，促进新陈代谢，对人体的发育与健康都十分有益。但过量的紫外线照 射就会对皮肤造成光损伤。从遗传学的角度来说1 1 l ，紫外线可使两个相邻的嘧啶 相互交联形成嘧啶二聚体，从而使d n a 的立体构象发生明显变化，阻断受损部 位d n a 的复制和转录。宏观来看1 2 1 ，长波紫外线( u v a3 2 0 4 0 0 n m ) 能加速 黑色素细胞由酪氨酸转变为黑色素的过程、诱发光致敏作用、多形光斑疹、慢性 光化皮炎、荨麻疹、红斑狼疮、皮肤光变性和光毒性反应。u v a 已被认定为皮 肤老化的主要原因之一。中波紫外线( u v b2 8 0 3 2 0 n m ) 可使皮肤表皮细胞内 的核酸或蛋白质变性，发生急性皮炎，皮肤出现红肿、水疱及脱皮现象，即起红 斑作用。 随着人们物质生活水平的提高以及对紫外线过量照射危害的认识逐渐加强， 越来越多的人们开始使用防晒类化妆品以防止紫外线对人体的伤害。防晒类化妆 品的研发也成了化妆品研发的热点之一 一、主要成分及其作用机理 防晒化妆品主要成分为防晒剂。防晒剂有两种类型1 3 l ： ( 一) 紫外线吸收剂 一般的紫外线吸收剂是含有1 个羰基、形成共轭结构的芳香化合物。这类构 型的化合物利用分子中单双键的转化吸收有伤害作用的短波( 高能量) 的u v 射 线( 2 5 0 3 4 0 n m ) ，并将所吸收的高能量转变成无害的较长波( 低能量) 的辐射 ( 一般在3 8 0n m 以上) 或热能释放出来。常用的紫外线吸收剂有对氨基苯甲酸 衍生物、肉桂酸酯衍生物、水杨酸衍生物、邻氨基苯甲酸酯衍生物、二苯甲酮衍 生物等。 ( 二) 紫外线散射剂 中央民族大学硬一l 研究生论文 这类物质主要是通过反射和散射作用以减少紫外线与皮肤的接触，从而防止 紫外线对皮肤的伤害。它们大多为无机粉体，常用的有二氧化钛、氧化锌、氧化 亚铁、云母、高岭土、滑石粉、碳酸钙等。 就使用效果而言，紫外线散射剂在一定用量上不如紫外线吸收剂显著，但紫 外线散射剂相对安全性高、稳定性高。 二、防晒功效的评价指标s p f 值和p a 值 目前，对防晒化妆品的防晒能力大小主要使用防晒系数( s p f 值和p a 值) 来表示。 s p f ( s u np r o t e c t i o nf a c t o r ) 值是指人体在涂有防晒产品的皮肤上产生最小 红斑所需光能量与未涂防晒产品的皮肤上产生相同红斑所需光能量之比。s p f 值 越大，防晒能力越好。一般皮肤可使用s p f 值为8 1 2 范围较为适宜，如敏感 皮肤和较长时间暴露在日光中的，可选择商s p f 值的防晒产品。 p a ( p r o t e c t i o n g r a d e o f u v a ) 值是衡量防晒产品对u v a 防御能力的标准， 其强度用“+ ”表示，一般亚洲人多适用两个到三个“+ ”的防晒化妆品。( p a + 表示有效防护约4 小时，e a + + 表示有效防护8 小时，p a + + + 表示强度防护) 三、化妆品防晒功效评价方法 随着防晒化妆品市场的不断繁荣，对其功效性及安全性的评价成为人们关注 的热点。对于防晒化妆品防晒效果的评价，目前一般使用测定s p f 值的方法1 4 】 和测定紫外光谱的方法【5 j 。 s p f 值是通过人体或动物斑贴实验的方法测出来的，直接表示防晒化妆品防 护u v b 区紫外线损伤即防晒伤能力的防晒指数，由于斑贴实验中的测试对象存 在着显著的个体差异，一般的测试结果的平行性都不太好，将1 0 2 0 个受试对 象的测试结果经数理统计处理后的结果定为s p f 值，用s p f 值的偏差来表示。 这说明s p f 值表示的是防晒性能的高、中、低范围和等级，而不是一个准确数 值，测试时有误差是正常的。 紫外光谱法是根据光学原理、通过光学仪器进行测定的方法，具有测试成本 低、速度快的特点，重现性也高于斑贴实验的方法，适用于大批量样品的测试 使用仪器应为普通紫外分光光度计、双单色器、双光束，其线性范围较宽，直接 2 中央民族大学硕l - 研究生论文 测定防晒化妆品样品，得到紫外线的透过率或吸收值，再与相应的防晒效果比较 对产品进行评价。国外有的国家使用此方法评价防晒化妆品的防晒效果，我国在 1 9 9 9 年6 月1 日开始实施的轻工行业标准也是使用的此方法。在此标准中直接 测得样品的紫外吸光度值a ，根据达到的防晒效果进行评价。当吸光度a 0 5 1 0 时，有最小防护紫外线的效果；当吸光度a i 1 1 5 时，有中等防护紫外线 的效果；当吸光度a 1 6 2 0 时，可高效防护紫外线的照射；当吸光度a 2 1 时， 可完全防护紫外线照射。吸光度a 值也是通过多次测定后计算出来的，表示的 也是防晒性能的高、中、低范围和等级，而不应当只看作是一个准确数值。紫外 光谱法与斑贴实验测定法虽然定义不同，但基本的分类范围是一致的。8 0 年代 末美国开发了s p f 仪，现在有许多国家的化妆品生产厂家用来进行产品开发， 因为价格昂贵我国目前只进口了几台。它将早期美国做的欧美人体测试的s p f 数据储存在计算机内，防晒化妆品样品经光谱测定后自动转换为s p f 值输出， 这样测试的s p f 值与斑贴实验测定的结果也是有差异的。这种测定方法虽然很 方便，但有专家认为按s p f 值的定义规定用光学仪器不能直接测定s p f 值，这 样测试就混淆了s p f 值的概念，因而存在一定争议。 综上所述，建立一个更加安全有效的防晒品评价体系势在必行。 中央民族人学硕士研究生论文 第二节单细胞凝胶电泳概述 一，发展历程 单细胞凝胶电泳( s i n g l ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i sa s s a y ，s c g e ) 又称彗星试验 ( c o m e ta s s a y ) ，由0 s u i n g 等t 6 q ：1 9 8 4 年首次提出。他们将细胞包理于琼脂糖凝 胶中，置于显微镜载玻片上，用高浓度的去污剂和盐裂解，然后在中性条件下短 时间电泳，d n a 断片从细胞核向阳极移动，从而形成了类似于彗星尾巴的形状， 指向阳极。如果细胞中d n a 损伤越大，断片移行的距离也就越长，d n a 的移行 可用溴化乙锭( e b ) 染色后用显微光度计测定。o l i v e r 等改良了上述中性s c g e ，采 用更严格的溶解条件，使9 5 以上的细胞蛋白质被除去。在中性条件下，d n a 链仍保持双螺旋结构，偶然的单链断裂( s i n g l e s t r a n d e db r c a k s ，s s b s ) 并不影响 d n a 双螺旋大分子的连续性。只有当d n a 习2 链断裂( d o u b l e - s t r a n d e db r e a k s ，d s b s ) 时，才使d n a 断片进入凝胶中迁移。因此，中性条件下裂解和电泳只能检测d s b s ， 不能测定s s b s 。两许多物质诱导的d n a 单链断片数量比双链断片高5 2 0 0 0 倍， 所以，中性s c g e 检测d n a 损伤的敏感度明显不高。它的使用也仅限于研究放射 线和拟辐射化合物对d n a 的损伤作用。1 9 8 8 年，s i n 曲等1 7 l 建立了碱性单细胞凝 胶电泳技术，该技术不仅可以检测d n a 单、双链断裂，还可用来捡测碱性不稳 定位点 s l 、d n a 交联和不完全切除修复位点等。1 9 9 6 年，c o l l i n s 9 l 等对该方法 进行了进一步改进，并利用核酸内切酶i i l ( e n d o1 1 1 ) 和甲酰胺嘧啶糖基酶分别检 测了氧化嘧啶和8 一羟基鸟嘌呤的损伤。1 9 9 7 年，s a n t o s 等1 1 0 l 首次将s c g e 技术 与d n a 荧光原位杂交技术u o 嘲e n c ci ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，r a s h ) 结合起来， 为s c g e 技术的应用开辟了新的途径。我国朱志良博士率先在国内建立了彗星一 荧光原位杂交技术体系，并利用该技术体系发现a 9 号染色体是苯代谢产物的靶 染色体。2 0 0 1 年，n a d i n 掣1 1 】建立t s c g e 银染法，迸一步提高了损伤d n a 分 析的灵敏度。此后，彗星分析作为一门发展势头非常强进的方法，广泛的应用到 各研究领域之中，然而对于该实验的一些具体操作和评价指标，目前还没有一个 统一的标准，g e i s e n b r a n d a 等人与2 0 0 2 年、h a r t m a n n 等人分别于2 0 0 3 及2 0 0 4 年 发表了最新的彗星分析操作指南，对于彗星分析标准的全球统一化起到了指导作 用。2 0 0 5 年至今，全球应用彗星分析方法进行的试验在生物、医学、环境等相关 4 中央民族大学硕上研究生论文 领域更加广泛的得以应用，发表的文章数量不断增多。 二、作用原理 尽管s c g e 技术己应用近2 0 年，但其检测单个细胞d n a 损伤的确切原理还 不甚清楚。初步认为，各种因素诱发细胞d n a 损伤后会影响d n a 的高级结构， 使其超螺旋松散。这种细胞经过实验中细胞原位裂解、d n a 解链等过程后，电 泳时，损伤的d n a 从核中溢出，朝阳极方向泳动，产生一个尾状带，未损伤的 d n a 部分保持球形，二者共同形成“慧星”。在一定范围内，“慧星”的长度( 代 表d n a 迁移距离) 和经荧光染色后“慧星”荧光强度( 代表d n a 的量) 与d n a 损伤程度相关，这样就可以定量检测单个细胞中的d n a 损伤。改变相关的实验 条件，可以检测d n a 不同类型的损伤。如果在碱性溶液中溶解、解链、电泳， 可以检测d n a 单链断裂及碱不稳定损伤；如果在冷溶解液中加入高浓度盐及其 它变性剂，中性条件下溶解、解链、电泳，则可检测d n a 双链断裂。 1 2 1 1 1 3 | 1 1 4 三、实验步骤 在瞅i n g 等1 6 】的中性电泳和s i n g l l 等m 的碱性电泳基础上，现已发展了多种实 验方法，比较常用的是碱性条件下的电泳，其基本实验路线包括以下步骤： 区固日匝五固日圈畸困 b 圈扫围扫圈匀圈 ( 一) 准备细胞 根据具体情况进行染毒并将染毒细胞制成浓度适当的细胞悬液。 ( 二) 铺胶 近年来该步骤已有诸多改进，如由传统的三明治铺胶法改进为2 层或单层灌 胶法，但胶板易损坏和脱落的闯题仍没有得到很好解决，并且操作步骤多、时问 长，给该技术的规范和推广带来一定困难。目前一些国外公司研制了一些殊的载 玻片，例如t r e v i g e n 公司的t r e v i g e nc o m e t s l i d e t m ，这种载玻片提高了低熔点 琼脂糖和载玻片的附着力，并且减少了常规砖4 胶方法中既耗时又不可靠的底胶制 备方法。但其缺点是成本太高，价格昂贵。 5 中央民族大学硕士研究生论文 ( 三) 裂解 裂解的目的是破膜和去蛋白，从而使断裂的d n a 片段能够在外电场所施加 的电场力的作用下从细胞核中迁移出来。 目前去除细胞内蛋白质的方法有两种，一是用高盐溶液进行盐析，二是使用 蛋白酶消化的方法，彗星实验通常使用前者。 裂解液由高盐与去垢剂构成。这些成分能使蛋白质变性，膜脂被抽提，导致 维持膜结构稳定性的作用力丧失，细胞膜溶解，细胞内的大部分物质随即溶解， 扩散至裂解液中，与d n a 相结合的蛋白质在高盐的作用下也与d n a 分离，扩散 到裂解液中。 ( 四) 碱化处理( 解旋) 解旋的目的是将双链d n a 变成单链并且使r n a 降解。 目前彗星实验常用解旋液( 1 m me d t a + 3 0 0 m mn a o l - 1 ) 的p h 值在1 3 以上，细 胞d n a ；生此环境下，很快变性解旋，由双链变成单链，同时高碱性环境能使r n a 全部水解。 ( 五) 电泳 凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法。它有许多优点：简单，快速，灵 敏，成本低，凝胶电泳有分子筛和电泳的双重效果，所以分离效率很高。 与常规的琼脂糖凝胶电泳相比，彗星实验中d n a j 壬移则受制于更多的因素， 包括细胞裂解的程度，d n a 解旋的程度，染色体高级结构等。 s c g e 一般选用低电压( o 5 5v e r a ) 和短时间( 5 3 0m i n ) 电压过高、 电泳时问过长虽然能提高检测灵敏度，但可能会使正常的细胞形成少许拖尾而出 现假阳性结果；反之，电压过低、电泳时间过短。受损细胞不会形成拖尾而出现 假阴性结果。 ( 六) 细胞观察与图像分析 染色后的细胞在荧光显微镜下可以呈现清晰的核形图像，受到损伤的细胞呈 现出彗星形状，细胞损伤越严重，彗星的尾部就越长，通过光学采集系统以及相 应的软件对彗星的各项指标进行分析，最终对于细胞的损伤程度进行评价，得出 相应的结论。 四、评价指标 6 中央民族大学硕t 研究生论文 从后期分析角度而言，目前根据图像评价d n a 的损伤程度所使用的指标大 致有如下几种：形状指标、距离指标、强度指标、“矩”类指标。 ( 一) 形状指标这是一类比较粗略的指标。根据细胞荧光图像是否象彗星一样 头尾分明将其分为彗星一样细胞和非彗星样细胞，计数一定量细胞中彗星样细胞 所占的比例，即彗星样细胞发生率，估计d n a 的损伤程度【堋。这种指标可通 过镜下观察直接得到，方便实用。 ( - - ) 距离指标直接在显微镜下或在照片上测出彗星的一些长度数值，如尾长 1 1 6 1 1 7 1 1 埘，即沿电泳方向“彗星”尾部最远端与头部中心间接的距离；总彗星长 度l 川，即“彗星”电泳方向上的最大长度；尾长与头部直径比值等 2 0 1 ，以评价 d n a 损伤程度。这些指标描述电泳中d n a 泳动的距离，易于测量，无需复杂的 仪器设备及图像处理软件，而且在损伤因素剂量较大时，这些数值的大小与作用 剂量之间有较为良好的线性关系。【2 1 j 1 2 2 1 2 3 】【矧 ( 三) 强度指标o s t l i n g 等人最初用s c g e 技术检测射线对d n a 损伤时用“彗 星”头部中心处荧光强度与电泳方向上一定距离处荧光强度的比值来描述d n a 的损伤。p o l l e r1 2 5 j 等人用“彗星”尾部总荧光强度同“彗星”头部总荧光强度 的比值来表示d n a 的损伤程度。新近有报道根据“彗星”尾部荧光强度将细胞 分为五类，由弱到强分别计为0 、1 、2 、3 、4 ，将1 0 0 个细胞的分值加在一起 表示d n a 的损伤程度，并证明该数值与总彗星长度有较好的相关性。这些指标 都不同程度地反映了电泳中泳动d n a 的量。 ( 四) “矩”类指标为反映d n a 损伤，上述距离类指标和强度类指标均不全面， 有实验证明损伤因素作用剂量增大时，d n a 损伤程度明显增加而尾长基本不 变。为将二者结合起来，更全面反映d n a 损伤程度，o l i v e 等人于1 9 9 0 年首 次描述了“尾矩”( t a i lm o m e n t ，t l v l ) 的概念，定义为尾部d n a 占总d n a 的 百分比与头、尾部中心间距的乘积。作者用实验证实该指标比上述其它指标都优 越，很快就被广泛接受 乔琰l 硐等人经过实验比较指出，尾矩指标能够更全面地评价d n a 的损伤程 度，而单独以尾长或尾部d n a 百分比作为分析指标则往往不能真实反映致损伤 剂的剂量一效应关系。 五、s c g e 技术的应用 7 中央民族人学硕卜研究生论文 与传统的d n a 损伤检测方法相比较，从建立以来不断被改良的碱性s c g e 技术，是一种具有极高实用价值的、应用前景十分广阔的新技术，它具有明显的 优点：( 1 ) 所需样品量少，每个样品只需5 0 0 0 - - 1 0 0 0 0 个细胞；( 2 ) 从采集样品 到分析结果只需数小时，整个过程可在一个工作日内完成，这为现场人员调查和 大量样本分析研究提供了可能；( 3 ) 该方法具有高度灵敏性，每1 0 1 0 d a l t o n d n a 就可检测出一个d n a 断裂旧；( 4 ) 该方法无需复杂的仪器设备，实验条件要求 不高。与图像分析系统联合应用，可使结果更为精确，操作更为方便，且无放射 性示踪剂，降低了成本，减少了对人体的危害；( 5 ) 适用范围广，可适用于体内 外各种实验，凡能制成单细胞悬液的各种真核生物细胞均适用。 因此，碱性s c g e 技术已广泛应用于d n a 放射损伤、d n a 剪切损伤、d n a 交联的检测和研究，环境诱变剂或诱癌剂引起的d n a 损伤和修复的研究，药物 的遗传毒性评价，细胞凋亡鉴定，作为生物标记进行环境生物监测及人类流行病 学研究，衰老学研究，肿瘤治疗方案、癌症病人放、化疗方案的最佳选择及科学 愈后的研究及药物筛选，真核微生物研究等| 2 s l | 2 9 1 | 3 0 1 1 3 t 1 1 3 2 1 3 3 1 。在研究u v 对细胞 损伤方面，已有人做过大量的相关研究，很多人做过大量的研究，如a l e x a n d e r r a p p1 3 4 1 等通过碱性s c g e 技术发现u 对细胞染色体的损伤与该染色体中所含 的编码基因片断的浓度呈负相关；s h a r o ne h o o k l 3 5 i 等通过s c g e 实验发现细胞 在u v 损伤后修复很慢。因此，碱性s c g e 技术在用于研究细胞的u v 损伤是灵敏 而有效的。 8 中央民族大学硕士研究生论文 第三节选题的目的与意义 综上所述，由定义引申的检测s p f 值的方法存在固有的缺陷：首先人体或动 物贴斑实验成本高，实验周期长，并且由于个体差异，实验结果平行性不好，而 通过光学仪器测定s p f 值与s p f 的定义相违背，存在一定争议。因此，建立一种 更加准确、迅速且成本较低的防晒化妆品功效检测方式具有较强的实际意义。 本论文以哺乳动物全血淋巴细胞为材料进行实验，可模拟化妆品与哺乳动物 细胞的作用，结果真实可信；碱性s c g e 技术可对细胞损伤作出灵敏、快速、准 确的判断，实验条件要求不高，时间花费不长，具有较高的实用价值，把它用于 化妆品功效评价可快速得到使用防晒品前后紫外线对皮肤损伤的比较结果，可以 作为现行评价方式的有效补充与增强，同时也可以为未来可能的天然防晒成分提 取提供一个有效的鉴定和判别手段。 9 中央民族大学硕十研究生论文 第二章单细胞凝胶电泳紫外线诱变系统的建立 第一节实验材料与方法 一、实验材料 ( 一) 细胞：昆明鼠，雌雄不限，体重为1 8 - 2 2 克，中国科学院动物研究所动 物均为北京市动物管理委员会颁布许可证的2 级小鼠 ( 二) 阳性致突变条件：u v a ，s b - - i o o p es e p e c t r o l i n e ，3 6 5 n m ( 三) 试剂 乙醚：北京化学试剂公司分析纯相对分子量7 4 1 2 小鼠淋巴细胞分离液：中国医学科学院生物工程研究所l t s i l l 3 n a c i ：北京化工厂分析纯相对分子量5 8 4 4 k c i ：北京化工厂分析纯相对分子量7 4 5 5 n a 2 h p o 。1 2 h 2 0 ：北京世纪红星化工有限责任公司分析纯相对分子量3 5 8 1 4 k h z p 0 4 ：北京世纪红星化工有限责任公司分析纯相对分子量1 3 6 0 9 n a 2 - - e d t a ：a m e r s c o 相对分子量3 7 2 2 二甲基亚砜( d m s o ) ：a m e r s c o 相对分子量7 8 1 3 正常熔点凝胶琼脂糖( n m a ) ：s h a n g h a iy i t ob i o - i n s t r u m e n t c o m p a n y l i m i t e d r e g u l a r 低熔点凝胶琼脂糖( l m a ) ：p r o m e g a n a o h ：北京化工厂分析纯相对分子量4 0 o o t r i s ：a m e r s c o 相对分子量1 2 1 0 t r i s - - h c l ：a m e r s c o 相对分子量1 5 7 6 4 肌氨酸钠：a m e r s c o 相对分子量2 9 3 4 t r i t o n x - - 1 0 0 ：a m e r s c o 相对分子量6 4 6 8 6 台盼兰：a m e r s c o 相对分子量6 7 0 0 溴化乙锭：a m e r s c o ( 四) 溶液 1 0 中央民族大学硕士研究生论文 p b s ( p h 7 2 7 4 ) 正常熔点凝胶琼脂糖( n m a ) 溶液( 0 7 5 ) 低熔点凝胶琼脂糖( l m a ) 溶液( o 7 5 ) 裂解液( 2 5 m o l l n a c l ，i o o m o l l n a 2 - - e d t a ，l o n 蚰o l lt r i s ，p h l 0 ，1 肌氨 酸钠，用前加1 t r i t o n x - - 1 0 0 ，1 0 d m s o ) 电泳液( 1 m m n 锄- - e d t a ，3 0 0 m m n a o h ，p h l 3 或 1 3 ) 中和液( o 4 m ，p h 7 5 的t r i s 缓冲液) 染色液( o 5 溴化乙锭) ( 五) 重要仪器 载玻片c a tn o 7 0 1 型新康医疗器械有限公司 荧光显微镜o l y m p u sc x 4 1 成像系统p e n g u i n1 5 0 c l m 气流烘干机c 型河南省予华仪器有限公司 电子天平d = o 1 m g 上海精密科学仪器有限公司 冰箱b c 旷2 7 2 a y 容声 紫外灯美国s p e c t r o l i n em o d e ls b - i o o p f3 6 5 n m4 2 mw c m 2 电泳槽d y c p - 3 4 型北京六一仪器公司 离心机s i g m as a r t o r i u s 卜1 5 k 电泳仪j y c z 5 型北京君意东方电泳设备有限公司 灭菌锅t o m ya u t o c l a v es s - 3 2 5 移液枪e p p e n d o r f2 5 pl 、2 0 l zl 、2 0 0 i il 、1 0 0 0 ul p h 计p h s 一3 c 型雷磁上海精密仪器有限公司 电子调温电热套9 8 1 一b 型天津市泰斯特仪器有限公司 水浴锅册s y 2 1 - - n i 6 b 型北京长风仪器有限公司 微型旋涡混合仪硼一2 型上海沪西分析仪器厂 m i l l i q 超纯水仪m i l i p o r e 磁力搅拌器上海亚荣生化仪器厂 分析软件c a s p l 2 2 彗星试验图像分析软件，由天津协和医学研究院刘强赠与 1 1 中央民族大学硕 研究生i 仑文 二、实验方法 ( 一) 小鼠淋巴细胞悬液的制备 1 小鼠采血：将浸过乙醚的脱脂棉铺在麻醉用的玻璃容器底部，小鼠置于容器内， 容器加盖。待小鼠昏迷后，将其仰卧固定在固定板上，将已加入抗凝剂的注射器， 于心尖搏动最明显处刺入心室，血液由于心脏跳动的力量自动进入注射器。取血 约l m l ，小鼠死亡。 2 淋巴细胞分离：将所取抗凝血注入1 5 m l 离心管中，20 0 0 r m i n 离心l o m i n ， 弃上清，将沉淀加入等量的小鼠淋巴细胞分离液中，20 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，离 心后，用毛细吸管插入到血浆层与淋巴细胞分离液之间的致密白色薄层，即为淋 巴细胞层，并吸取该层，放入另一试管中，以p b s 洗涤、离心，最后配制成适当 浓度的淋巴细胞悬液待用。 3 细胞计数：取一滴淋巴细胞悬液滴入计数板，计数计数板的四角大方格的淋巴 细胞数( 只计数完整的细胞，若一团按一个细胞计数；若细胞位于线上，计上不 计下，计左不计右) ，将细胞悬液浓度调至1 0 6 1 0 7 个m l 为宜。 ( 二) 诱变剂量预测 1 染毒：将细胞悬液移入2 4 孔细胞培养板中，置于紫外灯下1 5 c m 处，并使各孔 细胞均匀分别在相等强度的照射范围内，处理时间分别为5 m i n 、l o m i n 、1 5 m i n 、 2 0 m i n 、2 5 m i n 、。3 0 m i n 、4 0 m i n 、5 0 m i n 、6 0 m i n 。 2 细胞活性检测：每处理时间段分别取样，用微量移液器吸取0 5 m l o 1 台盼兰 置于各孔中，吹打均匀。染色l 2 m i n ；取一滴染色后的淋巴细胞悬液滴入细胞 计数板，按上述计数方法计数。 淋巴细胞的存活率= 染毒实验后活细胞数空白实验活细胞数x 1 0 0 ( 2 - 1 ) 以此计算不同光照剂量下的淋巴细胞存活率。 ( 三) 染毒 按上述预测实验步骤进行u v a 处理，并计算每一时间处理的细胞存活率，结 果表明细胞存活率均在9 0 以上 ( 四) 双层胶凝胶板的制备 本试验采用双层铺胶法。 1 淋巴细胞悬液的配制：将光照处理后的淋巴细胞用p b s 调浓度至l o b 1 0 7 个 m l ，低温、避光保存待用。 中央民族大学硕士研究生论文 2 普通显微镜用载玻片的预处理：用2 3 m m 的细玻璃条粘到载玻片的四周制成 专用电泳槽。 3 第一层凝胶的制备：称取0 7 5 9 正常熔点凝胶琼脂糖，加入i o m l p b s ，加热至 琼脂糖完全溶解，取2 0 0pl 平铺于预制的电泳槽上，4 下固化l o m i n 。 4 第二层凝胶的制备：称取0 7 5 9 低熔点凝胶琼脂糖，加入i o m l p b s ，加热至琼 脂糖完全溶解，放入3 7 水浴中( 以防止再次凝固) 待用，将细胞悬液与低熔 点凝胶琼脂糖按l ：2 的比例混合均匀，取1 0 0 1 1l 平铺于第一层凝胶上( 每板约 1 0 0 0 0 细胞) ，4 下固化l o m i n 。 ( 五) 裂解 将双层凝胶板浸入新配制的4 c 裂解液( 2 5 m o l l n a c l ，l o o m m o l l n a 2 - - e d t a ，l o m m o l lt r i s ，p h i o ，1 肌氨酸钠，用前加1 t r i t o n x - - i 0 0 ，1 0 d m s 0 ) 中，避光，裂解2 h 。 ( 六) 解旋和电泳 1 解旋：将双层凝胶板从裂解液中取出，用超纯水反复冲洗，晾干，置于水平凝 胶电泳槽阳极端，倒入新配制的电泳液( 1 m m n a 2 - - e d t a ，3 0 0 m 心l a o h ，p h l 3 或 1 3 ) ， 液面约高于凝胶板0 2 c m ，置于4 冷冻层析柜中解旋4 0 r a i n 。 2 电泳：4 c ，固定电压2 5 v ，调整液面高度使电流在3 0 0 m a 左右电泳2 0 r a i n 。 ( 七) 中和 取出双层凝胶板平放入盘中，缓慢注入4 x 2 中和液( o 4 m ，p h 7 5 的t r i s 缓 冲液) ，放置5 m i n ，吸去中和液；再加入新的中和液5 m i n ，反复2 3 次后将凝 胶板吸干。 ( 八) d n a 染色 分别取5 0 以0 5 溴化乙锭溶液滴于凝胶板上，染色l 2 m i n 后，用超纯 水反复冲洗，将水吸干。 ( 九) 荧光检测 在荧光显微镜下观察，拍片；每组实验做两组平行，拍摄5 0 张照片，对每 张照片进行分析后取平均值。 拍片时间不宜过长以防止荧光淬灭。 ( 十) 图像分析 本实验采用的彗星图像分析软件c a s p l 2 2 一共提供了1 3 项分析数据，即彗 中央民族大学硕士研究生论文 星头部面积：h e a d a r e a ( a r e ao ft h ec o m e th e a di np i x e l s ( s u mo fp i x e l s i nt h eh e a d ) ) 、彗尾面积：t a i1 a r e a ( a r e ao ft h ec o m e tt a ili np i x e l s ( s u m o fp i x e l si nt h eh e a d ) ) 、头部d n a 量：h e a d d n a ( a m o u n to fd n ai nt h ec o m e t h e a d ( s u mo fi n t e n s i t i e so fp i x e l si nt h eh e a d ) ) 、尾部d n a 量：t a i l d n a ( a m o u n to fd n ai nt h ec o m e tt a i l ( s u mo fi n t e n s i t i e so fp i x e l si nt h e t a i l ) ) 、头部d n a 百分比：h e a d d n a ( p e r c e n to fd n ai nt h ec o m e th e a d ) 、 尾部d n a 百分比：t a i l d n a ( p e r c e n to fd n ai nt h ec o m e tt a i l ) 、头部半径： h e a d r a d i u s ( r a d i u so ft h ec o m e th e a d ( i np i x e l s ) ) 、彗星尾长：t a i l l e n g t h ( l e n g t ho ft h ec o m e tt a i lm e a s u r e df r o mr i g h tb o r d e ro fh e a da r e at oe n d o ft a i l ( i np i x e l s ) ) 、彗星长度：c o m e t l e n g t h ( l e n g t ho ft h ee n t i r ec o m e t f r o ml e f tb o r d e ro fh e a da r e at oe n do ft a i l ( i np i x e l s ) ) 、彗星头部重 心位置；h e a d m e a n x ( c e n t e ro fg r a v i t yo fd n ai nt h eh e a d ( xc o o r d i n a t e ) ) 、 彗尾重心位置：t a i l m e a n x ( c e n t e ro fg r a v i t yo fd n ai nt h et a i l ( x c o o r d i n a t e ) ) 、尾矩：t a i l m o m e n t ( t a i l d n a xt a i l l e n g t h ( p e r c e n to fd n a i nt h et a i l x t a i ll e n g t h ) ) 、o l i v e 尾矩：o l i v e t a i l m o m e n ( t a i l d n a x ( t a i l m e a n x h e a d m e a n x ) ( p e r c e n to fd n ai nt h et a i l x d i s t a n c eb e t w e e n t h ec e n t e ro fg r a v it yo fd n ai nt h et a ila n dt h eo fc e n t e ro fg r a v i t yo f d n ai nt h eh e a di nx d i r e c t i o n ) ) ，本论文选择t a i l d n a 、t a i l l e n g t h 、 t a i l m o m e n t 、o l i v e t a i l m o m e n t 4 项指标分析各项数据，得出实验结果。 1 4 中央民族大学硕上研究生论文 第二节实验结果与分析 一、光照时间的选择 不同光照时间下的细胞存活率：结果见表2 一l 。 从表2 1 中可知，u v 处理时间在5 6 0 m i n 时，细胞存活率均在8 5 以上， 说明d n a 损伤系紫外光直接毒作用所致，而非细胞毒性，可进行彗星实验。为了 得到最优的实验结果，本实验紫外处理时间确定在0 5 0 m i n 。 表2 1o v a 处理时间在5 6 0 r a i n 时的细胞存活率 l i v a 照射时间( r a i n )细胞存活率( ) 9 9 0 0 9 9