（微生物与生化药学专业论文）橘青霉中全局性调控基因pcivea的克隆鉴定及其特性的初步研究.pdf

l 、；、 目录 摘! 要i a b s t r a c t i i i 第l 章文献综述1 1 1 丝状真菌研究进展1 1 1 1 丝状真菌物种多样性和次级代谢产物多样性。1 1 1 2 丝状真菌次级代谢产物分类情况。2 1 2 丝状真菌调控因子研究3 1 2 1 丝状真菌调控因子类别3 1 2 2 丝状真菌中全局性调控因子l a e a 的研究进展4 1 2 3 丝状真菌中全局性调控因子v e a 的研究进展4 第2 章绪论1 1 2 1 他汀类药物的研究意义1 1 2 2 本实验的研究目的和意义11 第3 章橘青霉全局调控基因p c i v e a 的克隆与鉴定1 3 3 1 实验材料1 3 3 1 1 菌株与载体1 3 3 1 2 培养基1 3 3 1 3 主要试剂13 3 1 4 酶、试剂盒、引物1 3 3 1 5 主要使用仪器1 4 3 2 实验方法1 4 3 2 1 菌种保藏1 4 3 2 2 菌种液体种子培养和摇瓶发酵培养方法15 3 2 3 总r n a 及基因组d n a 的提取1 5 3 2 4 紫外分光光度法检测总r n a 含量l5 3 2 5p c i y e a 中间片段的扩增1 5 3 2 6p c i y e a3 端快速扩增( r a c e 技术) 15 3 2 7 快速扩增p c v e a5 端序列( 1 m l p c r ) 1 6 3 2 8 克隆p c i y e a 基因全长。1 7 3 2 9 橘青霉p c i y e a 的生物信息学分析18 3 3 结果与分析1 8 3 3 1m 2r n a 的提取情况18 3 3 2 橘青霉p c i - v e a 的核心序列克隆1 8 3 3 3p c i y e a3 端的扩增1 9 3 3 4p c i y e a5 端的扩增。2 0 3 3 5p c i y e a 的全长扩增2 1 3 3 6 橘青霉p e i y e a 的基因序列分析、蛋白特性和同源性分析。2 l 第4 章p c i v e a 在橘青霉不同生长阶段表达情况研究2 3 4 1 实验材料2 3 4 1 1 菌株2 3 4 1 2 培养基。2 3 4 1 3 主要试剂2 3 4 1 4 酶、试剂盒、引物2 3 4 1 5 主要使用仪器2 4 4 2 实验方法2 4 4 2 1 菌种保藏2 4 4 2 2 菌种液体种子培养和摇瓶发酵培养方法2 4 4 3 3m 2 光照与黑暗下形态变化2 4 4 2 4m 2 菌体量的变化检测2 5 4 2 5m 2 美伐他汀产量变化检测2 5 4 2 6p c i y e a 的表达量变化2 5 4 3 实验结果与分析2 6 4 3 1 光照与黑暗情况下形态变化情况：2 6 4 3 2 菌体干重变化。2 8 4 3 3 美伐他汀产量变化2 8 4 3 4p c i - y e a 的表达量变化情况3 0 第5 章讨论3 3 5 1 橘青霉全局性调控因子p c i v e a 的结构特征分析3 3 5 2p c v e a 与菌丝及孢子形态发育3 4 5 3p c v e a 表达量变化情况与美伐他汀产量变化。3 4 5 4 展望3 5 参考文献3 7 硕士期间撰写及发表论文情况4 3 致谢4 5 摘要 橘青霉全局性调控基因p c i y e a 的克隆鉴定 及其特性的初步研究 微生物与生化药学专业硕士研究生冯慧云 导师：胡昌华教授 摘要 背景：丝状真菌是一类重要的微生物，一些工业菌株能够产生抗生素、有机 酸、降胆固醇物质、抗病毒物质、抗癌物质和免疫抑制剂等对人类有益的物质， 也会产生一些对人类有害的次级代谢产物，如柄曲霉素、黄曲霉毒素等真菌毒素。 在人类生产和生活上起着十分重要的作用。 真菌次级代谢生物合成途径主要包括p k s 和n r p s 两个途径，次级代谢生物 合成基因总是成簇存在的，其调控体系是一个复杂的网络。调控真菌次级代谢产 物的调控因子主要包括：位于生物合成基因簇上的途径特异性调控因子、与生物 合成基因簇没有直接关联的信号途径调控性因子、近些年来发现并被提出的全局 性调控因子v e a 和l a e a 。 全局性的调控因子v e a ，是e k f e r 等人于1 9 6 5 年第一次在构巢曲霉中发现 的一个能够影响构巢曲霉有性繁殖和无性繁殖比例的调控因子，进一步研究发现， 它不仅对形态发育有着一定程度的影响，同时也调控着丝状真菌有益物质以及真 菌毒素等次级代谢产物的产生，是一个十分重要的丝状真菌的全局性调控因子。 它对次级代谢产物生物合成基因簇的调控作用，为真菌理性遗传改造提供了一条 重要的全新途径；它对未知次级代谢产物基因簇的调控作用和对沉默基因的转录 激活，使基于全局性调控因子的遗传操作成为寻找新型天然产物的新思路。迄今 为止，y e a 的同源基因已经分别在烟曲霉( a s p e r g i l l u sf u m i g a t u s ) 、寄生曲霉 ( a s p e r g i l l u sp a r a s i t i c u s ) 、产黄青霉( p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m ) 和粗糙脉孢菌 ( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 被克隆得到。 他汀类药物由于其它药物所无法比拟的降胆固醇效果，是降血脂药物中的首 要选择。自从1 9 8 7 年洛伐他汀获得f d a 批准用于临床，成为第一个投入市场的 他汀类药物以来，相继开发了许多半合成和全合成的他汀类药物，并且其中许多 获得批准上市的药物在市场上都长期占有极大的份额。除常用的最重要的降脂功 能外，他汀类药物还开拓了许多新的治疗领域。美伐他汀是最早被发现的他汀类 化合物，目前主要作为转化前体受到广泛关注。因此，对其生物来源的寻求和通 两南大学硕十学位论文 过菌种改良的方式来进一步提高其产量在工业上有着十分重要的意义。 目的：本实验选取一株美伐他汀产生菌m 2 ，从m 2 中克隆得到y e a 的同源基 因p c i y e a ，并对其进行生物信息学分析。比较它在不同阶段的表达情况、菌体生 物量的变化情况和美伐他汀的比生长率变化情况，同时观察光照及黑暗条件对其 生长形态上的影响，进而推断它们之间可能存在的调控关系。 方法：本实验中根据同源基因序列设计简并引物，r t - p c r 克p c i y e a 隆核心 序列，分别设计随机引物和嵌套引物，采用t a i l p c r 和r a c e 技术，克隆3 端 和5 端序列，根据拼接得到的全长设计上下游引物克隆得到d n a 和e d n a 序列， 利用生物信息学和生理指标对其特性进行初步分析。 结果：从美伐他汀产生茵橘青霉中克隆得到y e a 的同源基因p c i y e a ，它的 c d n a 序列为1 7 0 4 个b p ，d n a 序列为1 7 7 4 b p ，编码5 6 7 个氨基酸，该基因与产 黄青霉中发现的y e a 同源性为9 1 ，和棒状曲霉中的y e a 相似性为6 1 。它编码 的蛋白质分子量为6 2 7 6 2 5 道尔顿，等电点为9 1 0 。序列比对在p c i v e a 的n 一末 端查找到了该基因的保守功能序列n l s 区域( b i p a r t i t en u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l m o t i f ) ，和另外一个在构巢曲霉中也存在的p a t 7 区域。表达情况的研究表明该基 因的表达伴随橘青霉生长的整个阶段中，是一个组成型表达，而黑暗条件抑制其 分生孢子的产生，光照条件上调并且提前分生孢子的产生。 结论：本文成功从美伐他汀产生菌橘青霉中克隆得到v 鲥的同源基因p c i - y e a ， 推断橘青霉p c i v e a 可能正调控美伐他汀的生物合成，并参与光照条件下分生孢子 的形成。该基因的成功克隆以及在美伐他汀产生过程中的表达情况的初步研究， 为下一步的功能研究和菌种改良提供了依据和平台。 关键词：橘青霉全局性调控因子y e a 基因克隆特征分析次级代谢形态发育 i i a b s t r a c t m o l e c u l a r c l o n i n ga n d c h a r a c t e rd e s c r i p t i o no f t h eg l o b a lr e g u l a t eg e n ep c i - - y e ai np e ni c i l l i u m c i t r i n u m m i c r o b i a la n db i o c h e m i c a l - p h a r m a c e u t i c a l s p o s t g r a d u a t e ：h u i y u nf e n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rc h a n g h u ah u a bs t r a c t b a c k g r o u n d ：f i l a m e n t o u sf u n g ii sa ni m p o r t a n tc l a s so fm i c r o o r g a n i s m s ，s o m e i n d u s t r i a ls t r a i n sc a np r o d u c eal o to fa n t i b i o t i c sf o rh u m a nb e n e f i ts u c h 舔，o r g a n i c a c i d s ， c h o l e s t e r o l l o w e r i n gs u b s t a n c e s ， a n t i v i r a l s u b s t a n c e s ， i m m u n o s u p p r e s s a n t s a n t i c a n c e rs u b s t a n c e sa n ds u b s t a n c e s ，i tw i l la l s op r o d u c es o m es e c o n d a r ym e t a b o l i t e s h a r m f u lt oh u m a n s ，s u c ha sh a n d l em u s i ca d r i a m y c i n ，a f l a t o x i n sa n do t h e rm y c o t o x i n s f u n g a ls e c o n d a r ym e t a b o l i t eb i o s y n t h e t i cp a t h w a y sm a i n l yi n c l u d e dt h ep k sa n d n r p st h i st w ow a y s s e c o n d a r ym e t a b o l i t eb i o s y n t h e s i sr e g u l a t eg e n e sa r ec l u s t e r e d e x i s t , t h ec o n t r o ls y s t e mo ff u n g a ls e c o n d a r ym e t a b o l i t ei s ac o m p l e xn e t w o r k r e g u l a t i o no ff u n g a ls e c o n d a r ym e t a b o l i t e so fr e g u l a t o r yf a c t o r sc o n s i s to f s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o nf a c t o r sw h i c hi sl o c a t e do nt h ew a yt ob i o s y n t h e s i sg e n ec l u s t e r , a n dt h e s i g n a l i n gp a t h w a y sr e g u l a t o r yf a c t o r s t h a tn o td i r e c t l yr e l a t e dt ot h eb i o s y n t h e t i cg e n e c l u s t e r ，t h el a s to n ei st h eg l o b a lr e g u l a t i v ef a c t o rv e aa n dl a e ad i s c o v e r e da n d r e s e a r c h e si nr e c e n ty e a r s g l o b a lr e g u l a t o r yf a c t o rv e a ，w a sf i r s t l yf o u n db ye k f e re ta ii n19 6 5i n a s p e r g i l l u s n i d u l a n sw i t ht h ee f f e c t so ft h e p r o p o r t i o no fs e x u a la n da s e x u a l r e p r o d u c t i o n , af u t 1 1 e rs t u d yi nr e c e n ty e a r sr e v e a l e dt h a ti t n o to n l ye f f e c t e dt h e m i c r o b em o r p h o l o g i c a ld e v e l o p m e n to ff i l a m e n t o u sf u n g i ，b u ta l s oc o n t r o li nt h e p r o d u c t i o no fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e ss u c h 嬲a n t i b i o t i c sa n dm y c o t o x i n sa sav e r y i m p o r t a n tg l o b a lr e g u l a t o ri nf i l a m e n t o u sf u n g i i t sp o s i t i v er e g u l a t o r yr o l eo fs e c o n d a r y m e t a b o l i t ea n dr e l a t i v er e l a t o r ss o m ee x t e n tp r o v i d sai m p o r t a n tn e wc h a n n e lt o r a t i o n a lg e n e t i cr e c o n s t r u c t i o no ff u n g i ；i ta l s oc o n t r i b u t e dt oa c t i v a t et h ee x p r e s s i o no f c r y p t i cg e n ec l u s t e r sa n dr e s u l t e di ng e n e r a t i n gn o v e lp r o d u c t s i tm a k e st h eg e n e t i c m a n i p u l a t i o nb a s e do ng l o b a lr e g u l a t o r yf a c t o r ss e a r c h i n gf o rn e wn a t u r a lp r o d u c t s i i i 两南大学硕士学位论文 b e c o m ean e wd i r e c t i o n s of a r ，y e ah o m o l o g o u sg e n e sh a v e b e e nr e s p e c t i v e l yc l o n e di n a s p e r g i l l u sf u m i g a t u s ，a s p e r g i l l u sp a r a s i t i c u s ，p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m a n d n e u r o s p o r ac r a s s a s t a t i nd r u g sc a l ln o tb ec o m p a r e db e c a u s eo ft h ec h o l e s t e r o l l o w e r i n ge f f e c t ，i st h e f i r s tc h o i c eo fl i p i d l o w e r i n gd r u g s s i n c e19 8 7 ，l o v a s t a t i nw a sa p p r o v e df o rc l i n i c a lb y f d a ，a n db e c a m et h ef i r s tm a r k e tu s i n gs t a t i n s ，an u m b e ro fs e m i - s y n t h e t i ca n df u l l y s y n t h e t i cs t a t i n sw a sd e v e l o p e d ，a n dm a n yo ft h e mw a sa p p r o v e db yf d a i na d d i t i o n t o c o m m o n l yu s e df u n c t i o n s ，t h em o s ti m p o r t a n tl i p i d l o w e r i n g s t a t i nd r u g sa l s o d i s c o v e r e di nm a n yn e wt h e r a p e u t i ca r e a s m e v a s t a t i nw a st h ef i r s ts t a t i na n dw a s c o n c e r n e da st h em a i np r e m i s eo fo t h e rs t a t i n s a i m ：i n0 1 1 1 s t u d y ，am e v a s t a t i np r o d u c i n gs t r a i nm 2 ，w a sc l o n e dy e ah o m o l o g u e p c i - v e au s i n gt e l l p c ra n dr a c e t e c h n o l o g y ，d e s i g nd i f f e r e n tf r a g m e n t so ft h es i z e o ft h ep r i m e r ，a n dt h e na n a l y s i si t sb i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i so fi t se x p r e s s i o na td i f f e r e n t s t a g e s ，t h ec h a n g e si nb i o m a s s 、g r o w t hr a t ec h a n g e s ，w h i l eo b s e r v i n gt h el i g h ta n dd a r k c o n d i t i o n s ，t h ei m p a c to ni t sm o r p h o l o g y ，a n dt h e ni n f e rt h er e g u l a t i o no ft h e i r r e l a t i o n s h i pm a ye x i s tb e t w e e n t h e m m e t h o d s ：b a s e do nh i g h l yc o n s e r v e ds e q u e n c er e g i o n s ，s y n t h e s i z e dd e g e n e r a t e p r i m e r st oa m p l i f yt h es p e c i f i cf r a g m e n to fy e aw i n lt e m p l a t ef i r s t s t r a n d e dc d n a f r o m 旦c i t r i n u mm y c e l i a is a m p l e s u s i n g “r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ”( r a c e l t e c h n i q u ea m p l i f i c a t i o no ft h ey e a3 e d n ae n d sa n di s o l a t et h e5 - e n do ft h ev e ag e n e f r a g e m e n tb yt a i l p c r ( t h e r m a la s y m m e t r i c i n t e r l a c e d p c r ) t e c h n i q u e t h e n a m p l i f i c a t i o no ft h ef u l l - l e n g t hg e n e a n a l y z et h es e q u e n c ec h a r a c t e ra n di t sp h y s i o l o g i c a l f u n c t i o i l si np e n i c i l l i u mc i t r i n u m r e s u l t ：t h i sa r t i c l es u c c e s s f u l l yc l o n e dag l o b a lr e g u l a t o r yy e ah o m o l o g u e p c i - v e af r o mp e n i c i l l i u mc i t r i n u m ，t h ep r o d u c e ro fe x t r e m e l ys u c c e s s f u ld r u gf o rt h e t r e a t m e n to fh y p e r c h o l e s t e r o l e m i am e v a s t a t i n t h ef u l l l e n g t hp c i - y e ad n a s e q u e n c ei s 1 , 7 7 4b pi ns i z e ，w h i c hc o n t a i n sa l lo p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) o f17 0 4b pe n c o d i n ga p e p t i d eo f5 6 7r e s i d u e sa n dt h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo fp c i v e a s h o w s91 i d e n t i t yw i t ht h a to fp e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u ma n d6 1 、j l ，i mt h a to f a s p e r g i l l u sc l a v a t u s r e s p e c t i v e l y n l ep r e d i c t e d m o l e c u l a rm a s so fp e i y e ai s6 2 7 6 2 5d a l t o n sa n d t h e o r e t i c a li s o e l e c t r i cp o 缸i s9 10 1 1 1 en t e r m i n a lr e g i o no ft h ep c i v e aa l s oc o n t a i n sa p u t a t i v ec l a s s i c a lb i p a r t i t en u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i 郐i a l ( n l s ) m o t i f , n l s ia n dap a t 7 m o t i fa sw e l la sa s p e r g i l l u sn i d u l a n s s t u d i e sh a v es h o w nt h a tt h ee x p r e s s i o no ft h e g e n ei nt h eg r o w t ho fp e n i c i l l i u mc i t r i n u me x p r e s s e di nt h ee n t i r ep e r i o d , a n di n h i b i ti t s i v a b s t r a c t c o n i d i a lp r o d u c t i o ni nl i g h ew h i c hc o n t r a s tt oi nt h ed a r k n e s sc o n d i t i o n s c o n c l u s i o n ：t h i sa r t i c l es u c c e s s f u l l yc l o n e dag l o b a lr e g u l a t o r yy e ah o m o l o g u e p c i - v e af r o mp e n i c i l l i u mc i t r i n u m ，w h i c hm a yp o s s i b l ep o s i t i v er e g u l a t em e v a s t a t i n b i o s y n t h e s i s a n de f f e c e st h e g r o w t hm o r p h o l o g y o fp e n i c i h i u mc i t r i n u m f u r t h e r c h a r a c t e r i z ea n df u c n c t i o na n a l y s i so fp c i v e aw i l lb eu s e f u lf o ru n d e r s t a n d i n go f m o l e c u l a rr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fm e v a s t a t i nb i o s y n t h e s i s k e y w o r d s ：p e n i c i l l i u mc i t r i n u m g l o b a lr e g u l a t o r y e a g e n ec l o n e s e q u e n c ea n a l y s i ss e c o n d a r ym e t a b o l i s m m o r p h o l o g i c a ld e v e l o p m e n t v 两南大学硕十学位论文 v i 第1 章文献综述 皇皇皇曼曼皇皇量皇曼喜曼皇曼曼置曼鼍曼曼曼曼曼曼曼曼蔓舅曼曼皇曼曼量鼍舅i i ii l ：l im ! , , , i 量 第1 章文献综述 1 1 丝状真菌研究进展 1 1 1 丝状真菌物种多样性和次级代谢产物多样性 自从上个世纪4 0 年代，亚历山大弗莱明发现青霉素以来，真菌次级代谢产 物就开始被广泛的研究。真菌在自然界分布广泛，高达1 5 0 万余种，到2 0 0 2 年为 止，真菌来源的活性物质总数高达8 6 0 0 多种，其中抗生素4 9 0 0 种，其余活性物 质3 7 0 0 种 1 】，其总量仅次于放线菌中发现的次级代谢产物活性物质，而真菌被研 究的比例不到总数的2 0 。另外，海洋丝状真菌由于其菌种资源的多样性，也日 益受到广泛关注。据报道，截止到1 9 9 1 年，只有3 0 0 多种海洋真菌被研究，而同 时被研究的陆生真菌高达6 9 0 0 0 种。据估计，已被开发的海洋真菌数目不到总数 的5 2 】，如此巨大的海洋生物资源，为我们研究丝状真菌及其代谢产物多样性提 供了新的平台。 随着近年来耐药性情况的泛滥、化学来源的新分子获得越来越困难以及对生 物活性分子产生的主力军放线菌的过度开发情况日益严重，科学家们逐渐把更多 的目光集中在真菌的次级代谢产物上。而真菌来源的生物活性物质也在人类健康 和疾病治疗方面发挥着十分重要的作用。 丝状真菌( f i l a m e n t o u sf u n g i ) 主要是指菌丝丰富但不产生大型子实体的真菌， 能够在营养成分简单的培养基上生长，主要分布于藻类菌纲、子囊菌纲、担子菌 纲和半知菌纲。丝状真菌是一类重要的微生物，许多工业菌株能够产生抗生素、 有机酸、降胆固醇物质、抗病毒物质、抗癌物质和免疫抑制剂等对人类有益的物 质，是真菌有益次级代谢产物的重要来源 3 】。同时也会产生一些对人类有害的致 病次级代谢产物，如柄曲霉素、黄曲霉毒素、g l i o t o x i n 等一些真菌毒素 4 】。 同时，丝状真菌在农业生产上也有着重要的影响，如丝状真菌稻瘟病毒 ( m a g n a p o r t h eg r i s e a ) 可以侵染多种植物，是一种引起水稻稻瘟病的病原性真菌 5 】。 但是也有一些丝状真菌具有防治植物病虫害的功能，如绿僵木霉菌、白僵菌、啥 氏木霉菌等。 与原核生物相比，丝状真菌还具有十分强大的表达能力和蛋白分泌和翻译后 加工能力，这一优势使得它们在酶工业生产上成为不可或缺的生产菌株。到目前 为止，丝状真菌产生的天然或重组的酶主要有黑曲霉素、木聚糖酶、淀粉酶、蛋 白酶和纤维素酶等。 、 正是由于真菌的这些特殊性和优势，对丝状真菌的进步研究有着非常重要 的意义。在功能基因组时代，从分子水平上深入研究丝状真菌，更可能为丝状真 菌的进一步开发和改良提供理论指导。 两南大学硕十学位论文 1 1 2 丝状真菌次级代谢产物分类情况 在工业生产上，丝状真菌广泛产生柠檬酸、葡萄糖酸等有机酸，淀粉酶、蛋白 酶等酶制剂，青霉素和头孢霉素等抗生素，麦角甾碱等生物碱等许多对人类生产 和生活有益的次级代谢产物 6 。这些次级代谢产物的生物合成途径主要包括聚酮 生物合成途径( p k si ，p k si i ) 、非核糖体多肽类生物合成途径( n i 冲s ) 等，这 些生物合成途径通过不同的合成单元，利用生物前体合成次级代谢产物。 丝状真菌次级代谢产物主要包括聚酮类化合物( p k s ) 、非多肽类化合物 ( n r p s ) 以及萜类化合物 7 】。1 9 世纪以来发现的许多重要次级代谢产物包括 a f l a t o x i n 、s t e r i g a m a t o c y s t i n 、p e n i c i l l i n 、c e p h a l o s p o r i n 和i n d o l e d i t e r p e n e s 等对人类 有益或有害的次级代谢产物。其中许多具有代表性的物质如下图所示( 图1 ) 。 2 一 鑫 。挂 镶洒鼢黼 耘 k 嘲o i 酝 。啊珲l 嗍毫 鼍。灼 厂k 汰 斧 。 、e 魄 o ， 镌茹 第1 章文献综述 ， 图1 丝状真菌中代表性的次级代谢产物 f i g u r e1t y p i c a ls e c o n d a r ym e t a b o l i t ei nf i l a m e n t o u sf u n g i 1 2 丝状真菌调控因子研究 1 2 1 丝状真菌调控因子类别 真菌次级代谢生物合成途径主要包括p k s 和n r p s 两个途径，次级代谢生物 合成基因总是成簇存在的【8 】，其调控体系是一个复杂的网络。调控真菌次级代谢 产物的调控因子主要有以下几类。 1 、位于生物合成基因簇上的途径特异性转录调控因子。最近的研究表明，这 些调控因子同时也能调控这些生物合成基因簇以外的一些其它基因的表达。如黄 曲霉、寄生曲霉和构巢曲霉中的转录调控因子a l f r 9 1 0 】，除了调控黄曲霉毒素和 柄曲霉毒素的基因表达外，同时还调控该次级代谢产物基因簇以外的基因表达 1 l 】。烟曲霉中g l i o t o x i n 生物合成基因簇上的g l i z 1 2 、产黄青霉中调控他汀生物 合成的m e l r 1 3 都属于这一类的例子。 2 、另一类是和生物合成基因簇没有直接关联的信号途径调控性因子。它们受 到真菌许多生长环境如p h 、温度、碳源、氮源等的影响 1 4 1 ，同时也能够调控丝 状真菌生长形态和次级代谢生物合成。a r e a 就是一个在拟轮生镰刀菌( f u s a r i u m v e r t i c i l l i o i d e s ) 中受氮源影响的调控因子，并能影响其伏马毒素b 1 ( f u m o n i s i nb 1 ) 的产量 1 5 】。p a e c 和c r e a 分别在多种不同的菌种中被发现与p h 和碳源相关 【1 6 1 9 】，而青霉素的产量分别受到c r e a 的正调控和p a e c 的负调控 2 0 】。这一类 调控因子还包括一些与信号转导途径相关的蛋白激酶，如构巢曲霉中的信号蛋白 f a d a 不仅能够调控它的有性繁殖情况同时也能调控柄曲霉毒素、黄曲霉毒素等的 产生 2 1 】。另一个g 蛋白偶联的能够通过提高g t p 酶的活性从而减弱f a d a 作用 3 两南大学硕士学位论文 i i 的信号蛋白f l b a ，在柄曲霉毒素的生物合成过程中起到正调控的作用 2 2 】。 s h w a b 等发现构巢曲霉中组蛋白去乙酰化酶h a d a 的缺失能够提前并上调柄 曲霉毒素和青霉素的产量，同时还激活了一些沉默基因的表达，增加了许多其他 未知的次级代谢产物的产生 2 3 】。它的作用与全局性调控因子l a e a 恰好相反，而 组蛋白去乙酰化酶的抑制作用还能在不同的真菌中促进代谢谱的增力1 ：1 1 2 4 。全局性 调控因子l a e a 作为一个假定的甲基转移酶，与组蛋白乙酰化酶的这种作用是否有 一定的相关性，以及其具体作用机制值得进一步的思考。 3 、第三类是近些年来发现并被提出的全局性调控因子，包括能够影响丝状真 菌次级代谢产物产量和生长发育形态的核蛋白l a e a 和v e a 2 5 。它们与其它调控 因子形成一个复杂的调控体系，影响次级代谢产物的产生，在真菌调控上有着重 要的意义，下文将对它们分别进行进一步详细的阐述。简单叙述我们发现的l a e a 。 1 2 2 丝状真菌中全局性调控因子l a e a 的研究进展 l a e a 基因是b o k 等人2 0 0 4 年首次从构巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 中分离 得到的新型曲霉次级代谢全局调控因子 2 6 ，含有一个保守的与核蛋白甲基转移酶 硫腺苷甲硫氨酸( s a m ，s - a d e n o s y l m e t h i o n i n ) 结合位点相同的功能结构域 2 7 】。 随后的研究发现，a e a 这一全局性的调控基因不仅存在于构巢曲霉中，同样 也存在于许多其它的丝状真菌如烟曲霉、产黄青霉、橘青霉中 2 8 3 0 】。它们分别 与构巢曲霉中的肠鲥基因存在不同程度的相似性，本课题组已经成功克隆得到橘 青霉的全局性调控基因p c i 一a e a ，基因测序结果表明其基因序列与产黄青霉中发现 的a e a 同源基因具有9 5 的同源性 2 8 】，这些全局性调控基因都是次级代谢调控 过程中必不可少的调控基因。全局性的调控因子l a e a ，正调控丝状真菌有益抗生 素以及真菌毒素等次级代谢产物的产生，同时也对形态发育有着一定程度上的影 响，但是因为不同的菌种而有所差异。 l a e a 及其s a m 结合位点在丝状真菌中具有很高的保守性，它对次级代谢产 物基因簇的正调控作用，为真菌理性遗传改造提供了一条重要的全新的途径；它 对未知次级代谢产物基因簇的调控作用和对沉默基因的转录激活，使基于肠鲥基 因的遗传操作成为寻找新型天然产物的新思路。而其具体的作用机制和调控网络 尚未研究清楚，也有待我们进一步的研究和发现。 1 2 3 丝状真菌中全局性调控因子v e a 的研究进展 v e a 的发现则是已经有五十年的历史了。e k _ f e r 等人于1 9 6 5 年第一次发现构 巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 的y e a 的突变株y e a l 3 1 ，进而证明y e a 在构巢曲 霉的形态发育过程中能够激活有性繁殖并抑制无性繁殖，并且这一调控过程受到 光照的影响，证明v e a 是一个光敏蛋白 3 2 。随后的进一步研究表明，y e a 基因在 4 第1 章文献综述 构巢曲霉中还能够影响丝状真菌中毒性及有益次级代谢产物的产生，是一个真菌 重要的次级代谢全局性调控因子 3 3 】。迄今为止，y e a 的同源基因已经在许多真菌 中相继被报道，其功能和作用机制也成为一个研究热点。 1 2 3 1v e a 的结构特征和菌种分布 首先被报道的是构巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 中的v e a 序列 3 4 ，它是一 个含有5 7 3 个氨基酸的开放阅读框( g e n e b a n ka c c e s s i o nn o ：a f 3 3 5 4 6 5 ) ，这个 氨基酸序列与任何一个已知功能的蛋白序列都没有同源性，可以推测是一个新的 功能蛋白。它的n 末端有一个保守的区域一双组份核蛋自信号定位( n u c l e a r l o c a l i z a t i o ns i g n a l ，n l s )