临床肿瘤放射生物学.ppt

李莉苏州大学附属第一医院放疗科,临床肿瘤放射生物学,提纲,第一节肿瘤放射治疗的生物学基础放射杀伤细胞的直接和间接作用；细胞存活曲线第二节氧效应细胞放射敏感性和氧效应的关系；氧增强比；低氧放疗的原理第三节正常组织放射效应早反应和晚反应组织第四节放射生物学中的“4R”概念Repair，Repopulation，Reoxygenation，Redistribution第五节低剂量和低剂量率照射辐射耐受性；低剂量超敏反应；第六节放射化学修饰剂放射增敏剂；放射保护剂第七节三维立体定向放射治疗中的放射生物学问题第八节肿瘤放射治疗的基本原则第九节提高肿瘤放射敏感性的措施第十节临床因素与肿瘤放射敏感性的关系第十一节肿瘤放射敏感性的实验室预测第十二节基因治疗联合放射治疗第一节细胞存活的测定方法离体培养细胞的照射第二节实验肿瘤模型及其分析方法实体瘤乏氧照射，生长延缓，再生长延缓第三节肿瘤的离体模型,第五章肿瘤临床放射生物学概论,第六章临床放射生物学研究的主要方法,第五章肿瘤临床放射生物学概论,第一节肿瘤放射治疗的生物学基础,一、电离辐射对细胞的作用1.直接作用电离辐射直接将能量传递给生物分子，引起电离和激发，导致分子结构的改变和生物活性的丧失。这个作用是随机的，生物分子的损伤局限于分子的一定部位或较弱的化学键上。2.间接作用射线通过与细胞中的非靶原子或分子（特别是水分子）作用，产生自由基，后者可以扩散一定距离达到一个关键的靶并造成靶分子损伤。,第一节肿瘤放射治疗的生物学基础,二、机体受放射后的变化过程物理学过程光电效应、康普顿效应和电子对效应，重复多次，产生大量正负离子化学过程形成自由基生物反应过程不能依据机体吸收的能量来衡量,第一节肿瘤放射治疗的生物学基础,三、细胞的辐射效应1.细胞杀灭的随机性2.放射后细胞的结局：凋亡，流产分裂，子代细胞畸变，形态上无任何变化，有限的分裂后死亡，生存。3.细胞死亡：增殖性细胞死亡(reproductivecelldeath)：指细胞受照射后一段时间内,仍继续保持形态的完整,甚至还保持代谢的功能,直至几个细胞周期以后才死亡。间期性细胞死亡(interphasedeathapoptosis)其一般发生在照射后几小时内，在临床上，最典型的间期性死亡的细胞是淋巴细胞。大多数情况下，它以细胞凋亡的形式出现。,第一节肿瘤放射治疗的生物学基础,四、细胞存活曲线1.细胞存活的定义细胞存活：细胞具有无限增殖的能力。死亡”细胞：细胞失去增殖能力，即使照射后细胞的形态仍然保持完整，有能力制造蛋白质，有能力合成DNA，甚至还能再经过一次或两次有丝分裂，产生一些子细胞，但最后不能继续传代者称为“死亡”细胞。克隆（集落）：在离体培养的细胞中，一个存活的细胞可分裂增殖成一个细胞群体。具有生成克隆能力的原始存活细胞，称为“克隆源性细胞”。,第一节肿瘤放射治疗的生物学基础,四、细胞存活曲线细胞存活曲线的绘制,第一节肿瘤放射治疗的生物学基础,四、细胞存活曲线3、指数性存活曲线是指细胞存活率与照射剂量成指数性反比关系。以同一剂量照射放射敏感与放射抗拒的细胞，其存活率也不同。N/N0=e-KD，将纵坐标存活率改为对数坐标lnN/N0=-KD。其与剂量D及K值便成直线关系。按照靶学说，指数性存活曲线是单靶单击的结果。,第一节肿瘤放射治疗的生物学基础,四、细胞存活曲线4、非指数性存活曲线。照射后，细胞不是立即出现指数性死亡，而是在存活曲线上先出现一个“肩段”，对辐射表现一定的抗拒。以后随剂量增加，才呈指数性死亡。这种现象可用多靶单击说或单靶多击说解释。以多靶单击说为例，存活曲线中“肩段”的出现便是群体细胞对照射所表现出的效应。假定每一个细胞内有n个靶。只有击中n个靶时才能造成细胞死亡，但即使n1个靶被击中，也不会造成细胞死亡，剂量加大时，逐渐使n个靶均被击中的细胞跟着增多，使存活曲线肩段下降，当每一个未死亡细胞均被击中n1个靶时，“肩段”结束，以后，每击中一个靶，便使一个细胞死亡，存活率即与剂量呈指数性关系，存活曲线肩段之后即为直线状下降。,第一节肿瘤放射治疗的生物学基础,四、细胞存活曲线5.放射损伤的修复亚致死损伤(sublethaldamage，SLD)修复或称Elkind修复：照射后有的细胞失去无限增殖的能力而死亡，有的能从损伤中逐渐修复，并可保持无限增殖的能力。组织修复动力学研究表明SLD的修复与照射后的时间呈指数性关系，常用半修复时间T1/2(细胞损伤修复50%所需时间)来表示。一般来说，分割剂量增大，修复能力减弱。,潜在致死损伤(potentiallethaldamage，PLD)修复：指在正常状态下，应当在照射后死亡的细胞，若置于适当的条件下，由于损伤的修复，又可存活(保持无限增殖能力)的现象。实验证明与PLD修复有关的细胞几乎均为乏氧细胞，并主要存在于G0期及相当不活跃的G1期细胞内。,第一节肿瘤放射治疗的生物学基础,6细胞存活曲线有关参数的含义Do(平均致死剂量，meanlethaldoes)：为存活曲线直线部分斜率k的倒数(Do=1/k)，表示细胞的放射敏感性，即照射后余下37细胞所需的放射量。D0值越小，即杀灭63细胞所需的剂量就越小，曲线下降迅速(斜率大)。N值(外推数，extrapolationnumber)：细胞内所含的放射敏感区域数，即靶数，表示细胞内固有的与放射敏感性相关的参数，是存活曲线直线部分的延长线与纵轴相交处的数值。Dq值(准阈剂量，quasithresholddose)：代表存活曲线的肩段宽度，细胞表现为亚致死损伤的修复(全部细胞进入n-1状态之前)。Dq值越大，说明造成细胞指数性死亡的所需剂量越大。经存活率为100的点作与横轴平行的直线，再延长存活曲线直线部分与之相交即可得出Dq值。Ds：意义同Dq，更好地表示了肩段的宽度，即存活曲线呈直线下降前所受到的剂量，但在存活曲线上是肩段的实际宽度。D-2：即细胞数下降到10-2时(S=0.01)所受到的剂量值。,第一节肿瘤放射治疗的生物学基础,五、与放射生物效应有关的几个指标线性能量转换(linearenergythansfer,LET)：是指次级粒子径迹单位长度上的能量转换，表明物质对具有一定电荷和一定速度的带电粒子的阻止本领。即带电粒子传给其径迹上的能量。氧增强比(oxygenenhancementratio，OER)：是用来说明乏氧细胞对射线的敏感性，是在产生相同生物效应的基础上，细胞乏氧及富氧时所需的剂量之比。乏氧细胞辐射致死量/富氧细胞辐射致死量。治疗比(therapeuticratio，TR)：是指靶区内正常组织辐射耐受量与肿瘤组织辐射致死量的比值，TR1的肿瘤，用放疗有可能获得局部控制，TR1。真正的放射增敏剂。拮抗效应(antagonistic)：0+11。放射保护剂。,第六节放射化学修饰剂,二、放射增敏剂1放射增敏剂定义：是一种化学或药物制剂，当与放射治疗同时应用时可以改变肿瘤细胞对放疗的反应性，从而增加对肿瘤细胞的杀伤效应。2理想放射增敏剂应具备的条件：性质稳定，不易和其他物质起反应；有效剂量没有毒性或毒性很低；易溶于水，便于给药；专对肿瘤细胞，特别是对肿瘤乏氧细胞有较强的放射增敏作用；较长的生物半排出期，在体内能保持其药物特性，足以渗入整个肿瘤；在常规分次放疗中，较低的药物剂量即可有放射增敏效果。3.增敏比(SER)：单纯照射达到特定生物效应所需照射剂量/照射并用放射增敏剂后达到同样生物效应所需照射剂量。4常用放射增敏剂的分类乏氧细胞增敏剂：甘氨双唑钠(CMNa)、NIMO、沙纳唑(AK-2123)等。生物还原性药物：2-硝基咪唑、丝裂霉素C(MMC)及以DNA为靶的药物等。其他放射增敏剂：卤化吡啶(HP)类的5-碘脱氧尿嘧啶(IdU)、5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)；来源于中药的制剂如马蔺子素、泰素和植物多糖提取物(枸杞多糖、云芝多糖等)。,第六节放射化学修饰剂,三、放射保护剂1.放射保护剂定义：是指能保护正常组织不受或少受射线的影响,但又不降低放射对肿瘤的杀伤效应，从而可增加射线的剂量以达到杀伤更多肿瘤细胞的目的的药物。2.保护系数(protectionfactor，PF)或剂量减少系数(dosereductionfactor，DRF)=照射合并放射保护剂后达到单纯照射同样生物效应所需照射剂量/单纯照射产生同样特定生物效应所需照射剂量3.主要的放射保护剂药物主要集中在清除自由基方面。维生素类：如维生素E和维生素C。含巰基化合物：如氨基脲、硫脲等能清除羟自由基OH.。超氧化物歧化酶(SOD)：能清除超氧阴离子自由基。半胱氨酸衍生物：WR-2721。另外，阿咪福汀（氨磷汀）、羟基丁酸等也有放射保护作用。,第七节三维立体定向放射治疗中的放射生物学问题,1.不同分割剂量引起的不同放射生物效应；2靶区内早反应与晚反应正常组织和不同的肿瘤组织需要不同的分割方式；3肿块内部不同成分的生物学行为；4靶区定位概念的改变功能显像及乏氧/分子/基因显像（细胞特性显像）；5GTV/PTV/CTV外低剂量区内遗漏肿瘤细胞的辐射耐受性；6低剂量超敏反应。,第八节肿瘤放射治疗的基本原则,一、照射范围应包括肿瘤二、要达到基本消灭肿瘤的目的三、保护邻近正常组织和器官四、保护全身情况及精神状态良好,第九节提高肿瘤放射敏感性的措施,一、放射源的选择选择一个理想的放射源，主要要达到既能杀灭肿瘤，又有保护正常组织的剂量分布，并能杀灭对放射抗拒的乏氧细胞和非增殖期(G0期)细胞。二、利用时间-剂量-分割关系三、使肿瘤细胞再分布四、利用氧效应,第九节提高肿瘤放射敏感性的措施,二、利用时间-剂量-分割关系,1.选择适宜的剂量；2适宜的疗程时间；3.采用分割照射法,第九节提高肿瘤放射敏感性的措施,选择适宜的剂量的放射生物学依据主要有以下几点。：主要依据是肿瘤大小。同时考虑组织来源和组织学分化程度(即放射敏感性与分化程度成反比，与分裂成正比的Borgonis-Tribondean氏定律）。可采用不断缩野的技术。,肿瘤控制和正常组织并发症的剂量-效应曲线均有一个陡峭的斜坡，陡峭的斜坡后又有一个较为平坦的“坪区”，呈S状曲线。因此应从临床生物学角度来衡量生物意义。在疗程中间若肿瘤消退不显著时，不能轻易放弃治疗，突破一个剂量点时，可能肿瘤即出现明显效应，而另一方面，一旦用到相当大的剂量，已缩小的肿瘤不再继续缩小时可能已达到“坪区”，此时禁用无限增加剂量来提高局控率。,第九节提高肿瘤放射敏感性的措施,适宜的疗程时间不要在放疗疗程中随意停顿间歇，其理由为：根据各种数学模式，在总剂量不变的情况下，增加分割次数和（或）延长总疗程时间将降低放射生物效应；在肿瘤控制-剂量效应关系的S形曲线上，一旦在达到陡坡前的剂量点上暂停治疗将直接影响疗效；在疗程开始后的第2-3周后，肿瘤可发生再增殖，3-5周内可发生加速再增殖，此时更不宜中断疗程。用对穿平行的双侧野或多野照射时，应尽量采取双野或多野同天照射（剂量平均分配），用隔天轮照一野的方法将使肿瘤与外周组织的生物效应不一致，使外周正常组织的损伤加重，特别当有重要组织（如脊髓）时更应注意。/公式的提出，更应在临床上强调重视早反应和晚反应组织的不同生物学特性。正常早期反应组织具有较高的/值(10Gy左右)，正常晚期反应组织的/值较低（约3Gy），表明直接杀伤要比早反应组织少，可修复损伤累积引起的杀伤相对较多。,第九节提高肿瘤放射敏感性的措施,L-Q公式：S=e-(D+D2)S=SS=e-D+e-D2S：存活比例e：自然对数D：分次照射的剂量、：系数,细胞杀伤可由直接致死效应（型）和间接致死效应（型）组成：公式中e-D产生的生物效应与剂量成正比，表示DNA单击双键断裂，在细胞存活曲线上与剂量表现为线性关系。公式中e-D2产生的生物效应与剂量平方成正比，表示DNA多击单键断裂，与可修复的损伤累积有关，存活曲线表现为连续弯曲。/值即为两种效应相等时的剂量。,2019/12/12,35,可编辑,第九节提高肿瘤放射敏感性的措施,采用分割照射的目的主要是利用“4R”理论。常规分割（CF）：每天照射一次，每次DT1.8-2.0Gy,每周照射5次。超分割（HF）：不改变总疗程时间，每天照射2次，每次量较常规分割量小，但每天剂量较常规分割量大，这样，总剂量得到提高。其目的是更好保护正常组织特别是晚反应组织，并增加肿瘤组织再氧合和再分布的机会。常用方法为每天2次，每次1.2Gy。加速分割（AF）：不改变原计划的总剂量，每天照射2次（间隔6小时以上），每次量同常规分割剂量。适用于细胞增殖快的肿瘤。缺点是靶区内正常组织急性反应较重。后程加速超分割：其理论根据是在常规分割时，正常组织在治疗后2周开始有代偿性增殖，此时用常规剂量有利于正常组织修复，而肿瘤组织是在4周后开始加速再增殖，此时用大剂量有利于抑制肿瘤增殖。低分割：每周照射2-3次，周剂量约等于常规分割，每次剂量加大（故又称大分割），但总照射次数减少，适用于亚致死损伤修复能力强的肿瘤（如黑色素瘤）。不均等分割：将常规分割时的周剂量，在5天内分成不均等的剂量给予。快速超分割（AHF）：为减轻急性反应，采用折中的快速超分割的方法,第九节提高肿瘤放射敏感性的措施,采用分割照射的目的主要是利用“4R”理论。常规分割（CF）：每天照射一次，每次DT1.8-2.0Gy,每周照射5次。超分割（HF）：不改变总疗程时间，每天照射2次，每次量较常规分割量小，但每天剂量较常规分割量大，这样，总剂量得到提高。其目的是更好保护正常组织特别是晚反应组织，并增加肿瘤组织再氧合和再分布的机会。常用方法为每天2次，每次1.2Gy。加速分割（AF）：不改变原计划的总剂量，每天照射2次（间隔6小时以上），每次量同常规分割剂量。适用于细胞增殖快的肿瘤。缺点是靶区内正常组织急性反应较重。后程加速超分割：其理论根据是在常规分割时，正常组织在治疗后2周开始有代偿性增殖，此时用常规剂量有利于正常组织修复，而肿瘤组织是在4周后开始加速再增殖，此时用大剂量有利于抑制肿瘤增殖。低分割：每周照射2-3次，周剂量约等于常规分割，每次剂量加大（故又称大分割），但总照射次数减少，适用于亚致死损伤修复能力强的肿瘤（如黑色素瘤）。不均等分割：将常规分割时的周剂量，在5天内分成不均等的剂量给予。快速超分割（AHF）：为减轻急性反应，采用折中的快速超分割的方法,第九节提高肿瘤放射敏感性的措施,三、使肿瘤细胞再分布按细胞死亡为标准，则放疗最敏感的是增殖周期中的M期，G1后期，抗拒的是S期。而按分裂延迟为标准，则G2期为最敏感，非增殖期细胞(G0)最不敏感。,第九节提高肿瘤放射敏感性的措施,三、使肿瘤细胞再分布方法：分割放射；药物增敏；加热治疗。,放射,正常增殖周期,加温治疗阿糖胞苷羟基脲,VCR,第九节提高肿瘤放射敏感性的措施,采用高LET射线氧增强比（OER）相对低LET射线小采用分割照射方法给予时间清除死亡肿瘤细胞，再氧合氧气吸入CON（5%CO2+95%O2+烟酰胺）,ARCON乏氧细胞增敏剂甘氨双唑钠生物还原性制剂SR4233，乏氧时SR4233基团导致DNA断裂氧携带剂钙通道阻滞剂扩张小血管低氧放疗吸入含8%10%氧气的混合气体（普通空气含氧21%）加热治疗杀灭乏氧细胞和S期细胞，放疗后期应用血红蛋白纠正贫血,四、利用氧效应,第十节临床因素与肿瘤放射敏感性的关系,一、肿瘤种类1病理类型在临床角度上，肿瘤的放射敏感性应依照肿瘤及其所在部位正常组织对放射的相对效应为标志。这可用治疗比例(TR)来衡量：TR=正常组织耐受量/肿瘤组织致死量，TR1的肿瘤，放疗有可能治愈，TR1，则即使达到肿瘤消退，正常组织也要受到不可接受的损伤。例如恶性淋巴瘤(霍奇金病、NHL)的肿瘤致死剂量为40-50Gy，但生长在不同部位，我们可认定它有不同的放射敏感性：在颈部为高度敏感(颈部组织耐受量60-70Gy)、腹腔内为中度敏感(小肠耐受量45Gy左右)，而在肾门区则为低度敏感的了(全肾照射耐受量25Gy/3-4周)。因此，对肿瘤放射敏感性的限定以临床标准划分更为合理。,(1)高度敏感：肿瘤消灭，正常组织损伤很轻。若以结缔组织为邻近正常组织，则恶性淋巴瘤、白血病、精原细胞瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤等属此类。肿瘤致死量约20-35Gy。(2)中度敏感：肿瘤消灭，正常组织损伤较重，但可恢复或不严重影响功能，如鳞状上皮癌(约50-70Gy)。(3)低度敏感：对放射无明显效应的，如骨肉瘤、某些软组织肉瘤、大多数神经系肿瘤等。,第十节临床因素与肿瘤放射敏感性的关系,一、肿瘤种类2.病理分级(分化程度)：敏感性与细胞的繁殖力成正比，与分化程度成反比，但这定律也不是绝对的，如淋巴细胞、卵细胞不分裂，也不是未分化，但对放射敏感(因其cAMP含量低，放射敏感性高)。从细胞的分裂期相来讲，正在分裂的细胞比静止的细胞敏感性高，因分化差的细胞其增殖周期短，生长比率高，有丝分裂相多，故敏感性就高。所以有些分类为不敏感的，但分化极差者仍有较高敏感性，如未分化腺癌、骨肉瘤中的尤文氏瘤等。3.间质情况：对于同一病理类型、同一分级的肿瘤，还要看其的间质情况。如同为乳腺髓样癌，间质内含血管多的要比含纤维多的放射敏感性高。二、病期的早晚及肿瘤大小早期病变的瘤体一般较小，对放射的敏感性也就越高。肿瘤小时，使用的照射野小，正常组织容易修复原来的肿瘤区。3.早期病变对全身的影响较小，体质状况较好，血管状态和修复机能良好。4.早期病变的转移机会较小。,第十节临床因素与肿瘤放射敏感性的关系,三、以往治疗情况手术、放疗可使瘤床纤维化，乏氧细胞增多，在此基础上的复发性肿瘤放射敏感性差。四、全身及局部情况患者的健康情况与放射敏感性有密切关系。五、瘤床情况瘤床血运好的部位，肿瘤敏感性高，反之，如瘤床为脂肪组织者则敏感性差。另外，瘤床为修复能力差的组织(如肺癌、上颌窦癌)疗效也差，长度较大的食管癌可以说没有瘤床，血运和修复能力均差，故疗效极差。六、肿瘤外观形态肿瘤放射敏感性从高到低，按其形态依次为菜花外生型、结节外生型、溃疡型、浸润型和龟裂型，这也与瘤床的供血供氧有关。,第十一节肿瘤放射敏感性的实验室预测,肿瘤放射敏感性是放射治疗中第5个“R”(radiosensitivity)现代放射敏感性预测的定义为：用实验室检测方法估计肿瘤控制的可能性(肿瘤内在放射敏感性)，但此可能性必须与其它影响疗效的临床因素无关。对预测方法的要求：与肿瘤控制有特异关系；检测时间快；相对样本间的误差不敏感；对常规放疗作出放射抗拒的假预测可能性低；相对无损伤。,第十一节肿瘤放射敏感性的实验室预测,一、肿瘤细胞内在放射敏感性SF2(2Gy照射时的存活曲线)2.微核定量测定微核是由细胞有丝分裂时未进入主核的染色体断片或整条染色体所形成的，内含双链结构。二、肿瘤细胞的增殖动力学及DNA含量测定1.Tpot(潜在倍增时间)用Tpot这个参数可表示肿瘤的增殖能力,可用流式细胞计数仪测定。2DNA含量人类正常细胞染色体数目为46(二倍体)，偶见非二倍体亦在46左右，大多数肿瘤细胞DNA为异倍体(四倍体或非整倍体)。3SPF(S期细胞所占比例)SPF值高，也即增殖活性高，其整体放射敏感性高，SPF在非整倍体肿瘤中较整倍体高，而Tpot较短。,第十一节肿瘤放射敏感性的实验室预测,三、氧含量测定1氧电极检测技术是唯一能直接测定肿瘤乏氧的方法，需要多道多点测定。2组织形态分析是最早应用于临床的检测方法，其原理是通过了解肿瘤的血供情况来间接反映肿瘤的乏氧状况。检测时采用的指标为肿瘤组织内毛细血管的密度及其间距、肿瘤的坏死程度等,结合冷分光光度测定检测血红蛋白的氧负荷，则结果更可靠。3DNA链断裂分析为分子水平分析，目前常用的方法是彗星分析法。4乏氧标志物测定细胞水平，其原理是利用还原硝基有选择性地结合乏氧细胞的能力达到测定肿瘤乏氧的目的,检测方法：（）用放射性核素标记的硝基咪唑类化合物，而后用PET扫描；（）用特异性抗体标记的硝基咪唑类化合物，而后用免疫组化或ELISIA检查,被认为是目前最有前途的方法。5增强CT/MRI动态扫描测定肿瘤内ROI的血液灌注量；用MRS测定；肿瘤组织乳酸水平的测定等。,第十一节肿瘤放射敏感性的实验室预测,四、“慧星”分析(Cometassay)1.单细胞凝胶电泳或“慧星”分析是以电泳后DNA的显微镜图像特征而得名，是第一次可以在肉眼水平测定样品中全部单个细胞的DNA损伤,此方法速度快,敏感性高。2.碱性条件下(pH12.3)可引起DNA双链变性从而可以检测DNA单链断裂；中性水解使DNA保持双链状态从而可以检测DNA的双链断裂。3.对“慧星”的描述包括尾的长度、尾的DNA百分数和尾的运动（平均迁移距离和尾DNA百分数两者的乘积）。4.“慧星”分析的适用范围:检测乏氧细胞；检测DNA损伤和细胞杀灭之间的关系；凋亡细胞的检测；测定肿瘤生长分数；其他应用和展望：获得关于药物耐受的进一步信息以及分析DNA杂交等。,第十一节肿瘤放射敏感性的实验室预测,五、肿瘤细胞多相性测定肿瘤内存在不同放射敏感性的细胞亚群，即肿瘤细胞多相性。用姐妹染色体单体交换分析法可测定肿瘤株的多相性。,第十二节基因治疗联合放射治疗,所谓基因治疗即是通过导入外源性目的基因(Geneofinterest)达到靶细胞,使之表达或者用反义DNA(antisenseDNA)或反义RNA抑制病变基因的表达来治疗疾病的方法。,第十二节基因治疗联合放射治疗,一、恶性脑肿瘤基因治疗策略和常用的基因治疗方案酶前体药物治疗将自杀基因胞嘧啶脱氨基酶（CD)或单纯疱疹病毒(HSV)胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-tK)，经转染的方法分别导入脑瘤细胞内，然后给予无毒的前体药物(5-FU前体药物5-FC或三磷酸核苷前体药物GCV),在肿瘤内局部的酶解作用下可使前体药物分解为细胞毒化疗药物(5-FU或三磷酸核苷)，发挥其抗肿瘤效能，5-FU和三磷酸核苷还可干扰放射后靶细胞DNA的修复，增加放射敏感性。这种方法可直接行瘤内注射，被转染的瘤细胞产生的毒素能通过细胞间隙输送到邻近的分裂期细胞，诱导邻近细胞调亡(称旁观者效应)。酶前体药物治疗过程中，伴有T细胞介导的TNF-2、IL-6、INF-和GM-CSF等细胞因子的聚集反应和肿瘤细胞的坏死。,第十二节基因治疗联合放射治疗,一、恶性脑肿瘤基因治疗策略和常用的基因治疗方案2.免疫基因治疗恶性脑肿瘤细胞抗原提呈能力较弱，且表达TGF-可使瘤细胞逃避免疫监视。转染同系的主要组织相容性抗原复合物(MHC)型基因可直接将肿瘤内在编码的多肽抗原呈现给CD4+T辅助细胞，激活肿瘤特异的CD4+T细胞毒反应。由此改进肿瘤细胞的抗原提呈活力，可增进瘤细胞免疫反应，从而导致肿瘤细胞死亡。,第十二节基因治疗联合放射治疗,一、恶性脑肿瘤基因治疗策略和常用的基因治疗方案3.抑癌基因和细胞周期调节基因治疗该基因治疗主要针对突变基因进行修饰,包括活化抑制癌基因和增强抑癌基因的表达。癌基因Ras、erb、ros、ret、bc1-2、sis、gli和IGF-1（类胰岛素生长因子）、端粒酶(telomerase)等均参与脑瘤的恶性表达；抑癌基因p53、NF、Rb、p16、DCC等均参与调节细胞周期过程和诱发肿瘤细胞程序性死亡（凋亡，Apoptosis），抑癌基因突变与脑瘤生长失控具有密切相关性。通过转染野生型抑癌基因而诱导脑瘤细胞凋亡。初步研究证实体外胶质瘤细胞转染抑癌基因p53、PTEN和p16可诱导脑瘤细胞凋亡。同样转染该类基因的胶质瘤细胞在荷瘤鼠体内增加了对脑瘤细胞的辐射敏感性。,第十二节基因治疗联合放射治疗,一、恶性脑肿瘤基因治疗策略和常用的基因治疗方案4.抗血管生成的基因治疗恶性脑肿瘤是富含血管的实体瘤，抑制肿瘤血管生成对脑瘤治疗是一种非常有效的策略。实验中发现胶质瘤细胞能分泌血管内皮生长因子（VEGF），促进血管内皮的分裂增殖，为脑瘤快速生长提供了新生的血管和血运。故针对VEGF等生长因子的基因治疗可十分有效地遏制肿瘤生长。Saleh等利用VEGF反义cRNA真核表达载体转染C6胶质瘤细胞，并将此类细胞移植到动物颅内后，其致瘤力下降，并且成瘤体的生长速度减慢，形成的肿瘤血管数量减少，血管壁变薄，坏死面积增多。我国学者克隆了内源性人的抗血管生成基因angiostainK（1-3）和endostatin，并进行了该基因的原核表达，获得具有抗血管生成活性的表达蛋白，且表达量较高。,第十二节基因治疗联合放射治疗,一、恶性脑肿瘤基因治疗策略和常用的基因治疗方案5.基因导入和靶向治疗技术基因导入受体细胞的方法主要有生物物理方法如基因枪、原位裸DNA注射法和病毒载体介导的自体细胞转染法。体外实验常使用腺病毒和逆转录病毒载体，并且已获得成功。然而，逆转录病毒载体只对扩增的靶细胞具有感染效力，而腺病毒载体由于不能整合到靶细胞基因组内，使其在体内表达时间明显缩短，并且由于机体产生抗腺病毒抗体，而限制了其进一步应用。载体系统靶向运送的低效性和目的基因的低表达，使其在抗恶性脑肿瘤中的效果明显降低。值得庆幸的是放射可显著提高基因靶向转移的效率和靶向调控能力，欧美的一些研究机构已进行了临床I期实验研究。,第十二节基因治疗联合放射治疗,二、基因治疗联合放射治疗的增效原理和常用方法及现状利用辐射实现对转移基因在脑瘤内表达的时空调控两种主要调控机制：一是“转录靶向调控机制”，即选择恶性脑瘤相关基因的启动因子与目的基因共同构成表达盒，插入基因转移载体，使目的基因只能在脑瘤细胞中表达，二是“转移基因表达的外源调控机制”，利用可受某因素诱导表达基因的顺式作用元件与相应的目的基因构建成表达盒，插入基因转移载体，这样转移基因在体内表达与否，直接受相应诱导因素的调控。利用电离辐射达到时空调控有以下4个特点：以适量的外照射可诱导杀瘤效应的基因活化；将三维立体照射技术的射线束准确投向目的靶，完成肿瘤靶向基因的时空调控；亲恶性脑肿瘤放射性核素亦可调控基因表达，并可用于转移性脑肿瘤；辐射诱导调控机制适宜多种恶性脑肿瘤。2辐射增强基因靶向转移效率3.自杀基因联合放疗治疗脑肿瘤所谓自杀基因治疗，是指应用载体将自杀基因（存在于细菌和病毒中的酶代谢基因，一般哺乳动物不存在此基因）导入到宿主细胞中，并对宿主投以低毒性的细胞毒药物，使其只对基因导入的细胞产生特异杀伤作用的方法。具有代表性的是HSV-tk基因与抗病毒药物GCV相结合的自杀基因治疗。,第十二节基因治疗联合放射治疗,二、基因治疗联合放射治疗的增效原理和常用方法及现状4.分子基因化疗联合放射治疗分子化疗基因，如细胞色素酶p450、2b1、胞嘧啶脱氨基酶（EscherichiaColideaminase,CD）通常产生一种转化酶，该酶可使无细胞毒或低毒药物前体（prodrug）转变为有细胞毒或强毒药物，从而达到杀伤瘤细胞的目的。5.抑癌基因联合放射治疗抑癌基因突变失活在脑肿瘤和恶性脑肿瘤中分别达30%和50%。p53是位于17号染色体，编码53Kda的蛋白质，该基因与细胞周期、DNA损伤应答与细胞分化及血管的再生等均密切相关。p16则与细胞周期调节相关，Rb基因系视网膜神经胶质瘤相关基因，也是一种抑癌基因，Rb基因使细胞休止在G1期，促进细胞成熟分化，使其维持于分化状态，允许细胞对正常生长和分化信号作出相应反应。抑癌基因治疗旨在提供野生型抑癌基因，达到治疗恶性脑肿瘤的目的。,第十二节基因治疗联合放射治疗,三、恶性脑肿瘤基因治疗联合放射治疗展望首先，恶性脑肿瘤基因治疗技术有待进一步完善，如基因转移靶向性困难，基因转移的效率较低，转移基因的体内表达还缺乏有效调控手段，以及机体对病毒性基因载体的免疫反应等；其次，恶性脑肿瘤的发生是多阶段、多步骤的过程，涉及多种遗传性损伤；第三，同一种脑肿瘤组织内的肿瘤细胞又常常存在显著的异质性，因而当前的恶性脑肿瘤基因治疗尚缺乏特效的目的基因。而基因治疗联合放射治疗恶性脑肿瘤，既可解决当前脑瘤基因治疗中靶向转移效率低，缺乏有效基因表达调控手段等问题，又可通过基因治疗辅助提高放疗效果，使两者之间的优势得以互补，拓宽了恶性脑肿瘤放射治疗的应用范围。,第六章临床放射生物学研究的主要方法,第一节细胞存活的测定方法,、辐射所致细胞死亡的定义死亡”细胞：细胞失去增殖能力，即使照射后细胞的形态仍然保持完整，有能力制造蛋白质，有能力合成DNA，甚至还能再经过一次或两次有丝分裂，产生一些子细胞，但最后不能继续传代者称为“死亡”细胞。克隆（集落）：在离体培养的细胞中，一个存活的细胞可分裂增殖成一个细胞群体。具有生成克隆能力的原始存活细胞，称为“克隆源性细胞”。,二、离体细胞存活实验SF=某一剂量照射实验组的克隆数/（该组细胞种植数PE）PE为未照射细胞克隆形成率，PE=（未照射细胞克隆形成数/细胞种植数）100%,第一节细胞存活的测定方法,第一节细胞存活的测定方法,二、离体细胞存活实验细胞存活曲线以剂量为横坐标（线性标度），存活率为纵坐标（对数标度），不同剂量的存活率通过特定的数学模式拟合，可得该细胞系半对数坐标的细胞存活曲线，即细胞剂量效应曲线。离体细胞的乏氧照射技术：贴壁细胞的乏氧方法；细胞悬液的乏氧方法。细胞存活曲线的实验过程一般可分为下列步骤：细胞培养、细胞照射、细胞计数、细胞稀释、细胞接种、克隆计数和数据处理绘图。三、细胞培养四、离体培养细胞的照射射线种类：对一般实验均选择X射线或射线，细胞照射剂量的设定：在低剂量区各个剂量的间距要小一些，以便更确切地反映曲线的初始形状；在高剂量区则间距可略大些。主要应根据所用细胞的放射敏感性决定照射剂量的设定。照射剂量的质量控制：必须保证照射条件