（有机化学专业论文）若干种类化学与生物传感器的研究及应用.pdf

浙江大学博i ：学位论义 摘要 本论文共包括四个部分。 第一部分综述了普鲁士蓝在化学与生物传感器中的应用，并在总结现有的各 种电化学型胆固醇传感器的基础上，将普鲁士蓝修饰电极与胆固醇氧化酶相结 合，分别利用溶胶一凝胶、过氧化聚毗咯和聚苯胺三种方法固定c h o x 于p b 电极 上，制备了新型高灵敏和高选择性的胆固醇生物传感器。三种胆固醇传感器的共 同特点是具有高的灵敏度和选择性。根据过氧化氢对0v 附近普鲁士蓝的还原峰 的电催化，来间接测定胆固醇的含量，有效地避免了生物体液样品中大量存在的 易还原性物质，特别是抗坏血酸的干扰。文中详细地研究了三种胆固醇传感器的 分析性能，并测定了血清中游离胆固醇的含量。 第二部分是将叶绿体破碎提取类囊体后，用聚乙烯醇一苯乙烯吡啶 ( p v a s b q ) 光聚合膜进行固定，得到固定化类囊体膜。研究了p v a - s b q 固定 化类囊体膜的性质。类囊体膜束缚酶能催化过氧化氢的降解产生氧，而除草剂对 该指示反应有拮抗作用。因此，将p v a s b q 固定化类囊体膜覆盖在铂电极的表 面，制成了检测除草剂的新型生物传感器，根据加入除草剂时类囊体膜束缚酶分 解过氧化氢活性的变化，对除草剂进行测定；同时，将p v a - s b q 固定化类囊体 膜与氧电极相结合，根据加入除草剂时类囊体膜束缚酶分解过氧化氢产生氧的浓 度变化，建立了测定除草剂的安培法。最后，根据除草剂对固定化类囊体膜光合 作用p s i i 的拮抗作用所导致的活性中间物过氧化氢浓度的变化，结合普鲁士蓝 对过氧化氢电还原的高灵敏催化作用，制成了p v a s b q 固定化类囊体膜p b 固 体石蜡碳糊电极，实现了低还原电位下除草剂的测定，既提高t n 定灵敏度，又 避免了生物样品分析中，易氧化的物质带来的干扰。 第三部分是研究了新型的丝网印制型溶胶凝胶固定技术在化学传感器中的 应用。该法制作离子选择性电极包括三个步骤：制作电极的基片、配制离子选择 性敏感膜的浆液和印制电极敏感膜。研究了固态粉末型物质的溶胶- 凝胶法固定 的条件和方法。首先利用溶胶一凝胶法对沸石进行固定，结合丝网印制技术，制 作了沸石作为敏感材料的电位型p h 传感器，电极对溶液的p h 响应范重) b p hi 浙江大学博t i 学位论文 1 2 ( 斜率6 0 m v p h ) 。提出了一种新的关于强酸处理的沸石对质子的响应机理。 其次，以石墨粉和硫化铜作为掺杂材料，用溶胶一凝胶丝网印刷法制作了复合陶 瓷碳敏感膜的硫离子选择性电极，硫离子响应范围1 x 1 0 1 0 m o l l 。探讨了该 化学修饰电极对硫离子的响应机理。 第四部分是附加的部分，包括两个课题。一是研究了用铋膜电极替代汞膜电 极测定痕量重金属元素铅、镉和锌的电位溶出法。试验了同位镀铋膜及测定重金 属特别是痕量铅的条件。使用铋膜电极可避免使用汞电极带来的环境污染，并用 该法测定了水样及血样中痕量铅的含量。二是基于在铂电极上电位溶出法对溶液 酸碱性产生响应，提出了一个广谱的测定强酸一强碱溶液浓度的方法。检测溶液 酸、碱的浓度范围为5 0 m o f l h + 1 0 m o l lo h 。研究了不同测定范围的实验条 件。提出了溶出过程的响应机理，即在不同酸碱性溶液中电沉积产生的氢吸附于 电极表面，溶出过程中被溶液中的氧氧化成氢离子，从而产生电位平台。 浙江大学博十学位论文 a b s t r a c t f o u rs e c t i o n sw e r em e n t i o n e di nt h ep a p e r i nt h ef i r s t s e c t i o n ，e l e c t r o c h e m i c a l c h o l e s t e r o lb i o s e n s o r sf a b r i c a t e d b y i n m a o b i l i z a t i o no fc h o l e s t e r o lo x i d a s e ( c h o x ) o np r u s s i a nb l u e m o d i f i e d 百a s s y c a r b o ne l e c t r o d e sh a v eb e e nf i r s t l yp r e p a r e d c h o l e s t e r o lo x i d a s ew a si m m o b i l i z e di n as i l i c as o l - g e lm a t r i x ，o v e r - o x i d i z e dp o l y p y r r o l e ( o p p y ) f i l ma n dp o l y a n i l i n e ( p a n ) c o n d u c t i v el a y e rr e s p e c t i v e l y i ti sb a s e do nt h ed e t e c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e p r o d u c e db yc h o x a ta b o u t0v - t h e ya r et h em o s ts e n s i t i v es e n s o r sf o rc h o l e s t e r o l d e t e r m i n a t i o n i na d d i t i o n ，t h ee f f e c t so fe a s i l yo x i d i z a b l es u b s t a n c e sp r e s e n t e di n s a m p l e s s u c ha sa s c o r b i ca c i da n du r i c a c i dc a l lb em i n i m i z e d t h ee x c e l l e n t p r o p e r t i e sw e r ea t t r i b u t e dt o e f f e c t i v ee l e c t r o - c a t a l y t i cr e d u c t i o n so fp r u s s i a nb l u e m o d i f i e ri nt h ec o m p o s i t el a y e ro ne l e c t r o d es u r f a c e t h ep r o p e r t i e so f t h eb i o s e n s o r s w e r ei n v e s t i g a t e da n dt h em e a s u r e m e n tc o n d i t i o n sf o rc h o l e s t e r o lw e r eo p t i m i z e d c o n c e n t r a t i o n so ff r e ec h o l e s t e r o li n s e r u l n s a m p l e sw e r e d e t e r m i n e d u s i n gt h e b i o s e n s o r s i nt h es e c o n ds e c t i o n ，d e t a i l sw e r ed i s c u s s e df o rt h ep r e p a r i n go f p o l y v i n y l a l c o h o l b e a r i n gs t y r y l p y r i d i n i u m 毋0 u p s ( p v a - s b q ) e n c a p s u l a t i n g t h y l a k o i d m e m b r a n e t h y l a k o i d m e m b r a n ei s o l a t e df r o ms p i n a c hl e a v e sw a si m m o b i l i z e db ye n t r a p m e n ti n p h o t o p o l y m e r o f p v a - s b q a n d t h e p v a - s b q f i l m sw e r eu t i l i z e dt o e l e c t r o c h e m i c a l l yd e t e r m i n a t i o no fh e r b i c i d e s f o rt h e o n eu s a g eo ft h ef i l m ，a l l e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r w a s p r e p a r e db yc o v e r i n g p v a s b qe n c a p s u l a t i n g t h y l a k o i d m e m b r a n eo n p l a t i n u m e l e c t r o d e ；i t i sb a s e do nt h ea n t a g o n i s mo f h e r b i c i d e s o nt h e d e c o m p o s i t i o n o f h y d r o g e np e r o x i d e c a t a l y z e d b y t h e t h y k a l o d - b o u n de n z y m e s o x i d a t i v ec u r r e n to fh y d r o g e np e r o x i d ew a sd e t e c t e db y d i f f e r e n t i a l p u l s ev o l t a m m e t r y a l s o a n a m p e r o m e t r i c m e t h o dw a sp r o p o s e d b y d e t e c t e do x y g e nr e l e a s ef r o mt h ed e c o m p o s i t i o n r e a c t i o no f h y d r o g e np e r o x i d eu s i n g c l a r k e l e c t r o d e h e r b i c i d e s i n c l u d i n ga t r a z i n e ，p a r a q u a t ，d i u r o n ，a m e t r y n e ， 浙江大学博= e 学位论文 p r o m e t r y n e ，s i m a z i n e a n d c y a n a z i n e c a nb ed e t e r m i n e d t h e k e ye n z y m e s i n t h y l a k o i df o rs c a v e n g i n go fh y d r o g e np e r o x i d ew e r ed i s c u s s e d f o ra n o t h e ru s a g eo f p v a - s b qe n c a p s u l a t i n gt h y l a k o i dm e m b r a n e ，t h ef i l mw a sf i x e do nt h ep r u s s i a nb l u e m o d i f i e de l e c t r o d et of a b r i c a t ea p h o t o s y s t e mi i b a s e db i o s e n s o r t h i ss e n s o ri sb a s e d o nt h ep h o t o s y n t h e s i s - i n h i b i t i o no fh e r b i c i d e s a st h er e s u l to ft h ep h o t o s y s t e mi i i n h i b i t i o n ，t h e c o n c e n t r a t i o n c h a n g e s o f h y d r o g e np e r o x i d e w h i c hi st h e s e m i p r o d u c t i o no fp h o t o s y n t h e s i sw e r ed e t e c t e d t h ei n h i b i t o rh e r b i c i d eo fd i u r o n a n da t r a z i n ew e r ed e t e r m i n e d t h em e t h o dt oi m m o b i l i z et h y l a k o i di n p v a - s b q m e m b r a n ew a sf o u n dt ob e p r o m i s e t om a k e e n z y m e s s t a b l ef o rs e v e r a lm o n t h sa t 一2 0 i nt h et h i r ds e c t i o n ，t h em e t h o df o rt h ep r e p a r i n go fs c r e e n - p r i n t a b l ec h e m i c a l m o d i f i e de l e c t r o d eb ys o l g e l t e c h n i q u ew a si n v e s t i g a t e d t h e f a b r i c a t i o no ft h i s c e r a m i cc a r b o ns e n s o ri n c l u d e st h r e es t e p s ：p r e p a r i n ge l e c t r o d es l i d e s ，m a k i n ga n i o n - s e n s i n gc o m p o s i t ei n ka n ds c r e e n - p r i n t i n gt h ei n ko ne l e c t r o d es l i d e s d e t a i l e d e x p e r i m e n t sh a v eb e e nc a r r i e do u tt od e f i n et h ef o r m a t i o nc o n d i t i o n so fs o l g e la n d c o m p o s i t i o no ft h ei n k t h ep h s e n s i n gm e m b r a n eo ft h es e n s o rw a sp r e p a r e db y s o l g e l ，g r a p h i t ep o w d e r a n dz e o l i t e ，i nw h i c hz e o l i t ei su s e da sar e c e p t o ro f p r o t o n t h en e r n s tr e s p o n s et op ho f t h es e n s o ri si nt h er a n g eo f p h1 1 2w i t has l o p eo f 6 0m v p ht h es e l e c t i v er e s p o n s eo fz e o l i t et oh + i si n f e r r e dd o o nd i f f u s i o na n d i o n e x c h a n g eo fp r o t o no c c u r r e db e t w e e n s o l u t i o na n dt h es p e c i a ls l r u c t u r eo fz e o l i t e c r y s t a ll a t t i c ed e s t r o y e db ys t r o n ga c i di np r i m a r yp r e p a r i n g a l s o t h es c r e e n p r i n t a b l e c o m p o s i t e c e r a m i cc a r b o ns u l f i d ei o n i cs e l e c t i v ee l e c t r o d ew a sf a b r i c a t e d ，t h en e r n s t r e s p o n s e st ot h ec o n c e n t r a t i o n s u l f i d ei si nt h er a n g eo flxl o 曲1 o m o l l a n dd e t e c t l i m i ti s6 7 x 1 0 。m o l l t h er e s p o n s i b l em e c h a n i s mw a s p r o p o s e d i nt h el a s ts e c t i o n ，t w ot o p i c sc o n c e r n e dw i t hp o t e n t i o m e t f i cs t r i p i n ga n a l y s i s ( p s a ) w e r ed e s c r i b e d i no n eo ft h e m ，an o v e lm e r c u r y f l e ep s am e t h o du s i n g b i s m u t h f i l md e p o s i t e do i lt h eg l a s sc a r b o ne l e c t r o d es u r f a c et od e t e r m i n eh e a v y m e t a li o no fp b 2 + ，c d 2 + a n dz n 2 + w a sp r o p o s e d t h ec o n d i t i o n sf o re l e c t r od e p o s i t i o n o f b i s m u t hf i mi ns i t ua n do p e r a t i o nw e r eo p t i m i z e d 。t r a c el e a di nw a t e rs a m p l e sa n d b l o o ds a m p l e sw e r ed e t e r m i n e db yt h em e t h o d s i m i l a rs t r i p i n gp e a kf o r m a n d 浙江大学博i ：学位论文 s e n s i t i v i t y w e r eo b t a i n e d c o m p a r e d w i t hw h i c ho b t a i n e d u s i n gm e r c u r y f i l m e l e c t r o d e s a sf o ra n o t h e r t o p i c ，am e t h o dw a sp r o p o s e dt od e t e r m i n et h ea c i d i t ya n d b a s i c i t yo fs o l u t i o n sb yp s au s i n gaw o r k i n ge l e c t r o d eo fp td i s ce l e c t r o d e t h e s o l u t i o n sr a n g ef r o m5 0m o l lh + t o1 0m o l lo h c a nb em e a s u r e db ya d j u s t m e n t o fd e p o s i t i o np o t e n t i a la n dd e p o s i t i o nt i m e t h er e s p o n s em e c h a n i s mo ft h em e t h o d f o ra c i d i t ya n db a s i c i t yh a sb e e ni n v e s t i g a t e d t h es t r i p p i n gs i g n a li sr e l a t e dt ot h e o x i d a t i o no fh y d r o g e na d s o r b e do ne l e c t r o d es u r f a c e h y d r o g e n ，w h o s ea m o u n ti s d i r e c tp r o p o r t i o nt ot h ea c i d i t yo fs o l u t i o n i so x i d i z e db yt h eo x y g e ni ns o l u t i o nt o p r o d u c e s ap o t e n t i a lp l e a t u mw h i c ht h es t r i p p i n gt i m ei sd i r e c tp r o p o r t i o nt ot h e a m o u n to f h y d r o g e na d s o r b e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c e 第一部分普鲁士蓝偶联胆1 1 醇生抽传扁器的研制 第一章普鲁士蓝及其类似物在化学与生物传感器中 的研究及应用 普鲁士蓝( p r u s s i a nb l u e ，简称p b ) ，又称为六氰合铁酸铁，而普鲁士蓝的类 似物是指具有类似组成和结构的六氰合铁酸盐这一类化合物。普鲁士蓝的研究可 追溯到十八世纪，长期以来作为一种光稳定材料，应用于工业生产涂料，烘烤搪 瓷，印刷油墨着色剂和洗涤添加剂。直到n e 彤1 i 和i t a y a 2 卅等首先制成了p b 化学修饰电极，并对p b 薄膜的电化学和光谱学性质进行了研究，p b 才被广泛 应用到化学传感器的研究中。经过二十多年的发展，p b 化学传感器的研究和应 用取得了很大的进展【5 缶】。本文对p b 在化学传感器中的研究及应用情况进行总 结。 1 普鲁士蓝化学传感器敏感膜的制备 不论是电化学型还是光学型的传感器，传感器表面敏感膜的制备是制作化学 传感器的关键。对于p b 化学传感器，可用化学法、电化学法来制备p b 敏感膜。 化学法先由化学方法合成p b 粉末，再用适当的方法将p b 粉末固定在传感 器的表面。常用的固定方法有碳糊法 7 - f “、溶胶凝胶法( t 2 , 1 3 、丝网印刷法 1 4 , 1 5 等。如h a l l o r a n 等人【7 蠕k s e f e ( c n ) 6 水溶液与f e c l 3 溶液混合，加入丙酮使其结 晶。用真空抽滤分离出蓝色晶体，再在1 5 0 。c 干燥、活化1 0 小时。得到的粉末 可通过碳糊电极法固定在导电基底上。w a n g 等把石墨粉混在 f e ( c n ) 6 3 - 溶液 中，然后加入f e c l 3 ，在石墨粉表面生成p b 。此p b 覆盖的石墨粉与甲基三氧基 硅烷衍生的凝胶混合，便制成了碳糊p b 修饰电极。此外，还可将石墨电极在p b 粉末上进行研磨，由于石墨电极的表面存在许多孔隙，通过机械研磨法可使p b 的粉末固定在电极表面【l “。 电化学法在制备p b 修饰电极中被广泛使用，一般以循环伏安法 1 7 】、恒电流 法、恒电位法将p b 电沉积于电极表面。 浙江人学博士学位论文 p b 导电基底上的电化学沉积通常采用f e ”和 f e ( c n ) 6 3 的混合溶液在还原电 位下制各。i t a y a 等人用相同浓度f e 矛i i f e ( c n ) 6 3 _ 的混合溶液作计时库仑法研究， 得到的曲线上分别在o 7 v 和o 4 v ( v s s c e ) 出现两个平台。这两个平台分别对 应着f e f e ( c n ) 6 和f e ”的还原。0 7 v 的还原峰对应f e f e ( c n ) 6 】还原生成p b ， 在o 4 v 时，f e 3 + 还原为f e 2 + ，而后生成了普鲁士白。p b 也可以在开路下沉积1 9 1 ， 其反应机理可能为f e f e ( c n ) 6 氧化导电基底后，得到一个电子生成p b 。在电沉 积p b 膜的同时，若要将其它物质同时掺杂，则经常采用p b 与聚吡咯、聚苯胺 等生成复合聚合物的电沉积法 2 0 - 2 2 1 。 用于光学检测的敏感膜需要沉积在透明的支持物上，文献 2 3 在0 1 m o l l k 3 f e ( c n ) 6 和1 0 m o l l 的盐酸溶液中加入聚乙烯一苯甲酸，将洁净透明一面用硅 胶保护的聚酯薄片浸入混合溶液中，在紫外灯的照射下沉积一天。取出后分别用 l m o l l 盐酸、o 1 m o l l 磷酸盐缓冲液、蒸馏水清洗。 一般情况下，电沉积法得到的p b 膜的电催化活性比化学合成法的要高，但 耐碱性、稳定性等性能比化学合成法的要差，并且催化性能还受电沉积条件影响， 电极表面受到污染时往往需要重新电解”】。所以，实际应用中两种方法要综合 考虑。 2 普鲁士蓝在化学修饰电极中的应用 2 1 在电分析化学中的应用 化学修饰电极( c m e ) 这一概念于1 9 7 5 年由m u r r a y 等人提出，此后多种无 机聚合物被用于化学修饰电极的研究。其中多核过渡金属氰化物是很重要的一 类，p b 是多核过渡金属中的典型代表。p b 修饰电极在分析化学尤其化学传感器 中的研究做得较多，不少研究成果已应用于实际样品的分析检测。按照所检测的 对象和机理，p b 修饰电极在电化学分析中的应用可以分为以下4 类： 2 1 1 用作非电活性阳离子的检测 p b 在氧化还原过程中会伴有阳离子m + 进出晶格以维持p b 膜的电荷平衡： f e 4 ( + 3 f e ( c n k ( 4 一】3 + 甜+ 4 e m 4 f e 4 ( + 2 ) f e ( c n ) 6 4 。 3 其中m + 为一价碱金属离子或n h 4 + 等。这是p b 修饰膜作为非电活性阳离子 传感器敏感膜的基础。p b 具有独特的类似沸石的分子筛结构，对溶液中的阳离 2 囝浙江大学博士学位论文 子，特别是碱金属离子、n h 4 + 、h + 等一价离子具有选择性透过性，并且不同的阳 离子选择性不同。利用该性质可制成电位型和电流型传感器，文献f 2 4 1 在o 2 3 8 v 下沉积p b 膜，得到贮电位型传感器的斜率5 1 5 7 m v ，n a 十不产生干扰。k a h l e r t 等 2 5 】研究了用p b 修饰电极检测t 1 + 的情况。文献 2 6 报道了k + 和c s + 的检测，其 检测范围为1 0 x 1 0 。5 l m o l l 。还有可用于多种阳离子检测的传感器【2 7 - 2 9 1 ，可应 用于k + 、n a + 、r b + 、l i + 、c s + 、n i - h + ，其中选择性l i + n a + 】p r b + c s + 。 2 1 2 用于易氧化化合物的检测 p b 在电极表面进行氧化还原时，可分别于0 8 v 和0 1 v 附近产生两对可逆 的氧化、还原峰，为p b 修饰电极被用来检测各种有机和无机化合物提供了基础。 这些化合物包括一些重要的生理物质。当电极表面有易氧化和还原的物质存在 时，峰高产生相应的变化。 s u e l 、，等人把p b 修饰电极与流动注射技术结合用于抗坏血酸的检测【3 0 】，测 定范围为；5 0 1 0 缶1 0 x 1 0 刁m o l l ，检出限为2 4 9 x l f f 6 m o l f l 。k n o c k i 等也给 出了抗坏血酸的检测方法【3 ”。 文献f 3 2 使用p b 修饰铂电极用于h 2 s 2 0 8 的检测。在o 1 0m o l l k c l ( p h = 4 ) 溶液中，可以检测5 1 0 5 3 x 1 0 刁m o f l 的h 2 s 2 0 b ，该方法与传统的滴定分析 相比，分析速度快、操作简便，方法已应用于头发漂白辅助药剂的分析。 h o uw 等使用玻碳电极检测无水肼【3 3 】，检出限为0 6p - g 。儿茶酚胺的检测也 有报道3 4 】，其检出限1 0p g 。其他利用p b 修饰电极测定易氧化还原化合物还有： n o 及n 0 2 一、n 0 3 一等氮氧化物 3 5 - 3 8 】、细胞色素口9 1 、s o z 【“、半胱氨酸与谷氨酸、 抗坏血酸4 2 】等。 2 , 1 3 在生物传感器中的应用 自c l a r k 等报道了基于测量0 2 还原电流的生物传感器以来【4 3 】，这一领域得到 了广泛、深入的研究，不同类型的氧化酶结合铂电极组成的电流型生物传感器被 大量应用于实践 4 ”。这些生物传感器多是利用直接电化学法检测酶反应的物质 或产物，属于第一代生物传感器。在氧化酶的存在下，0 2 可将底物催化氧化， 并同时放出h 2 0 2 ，利用p t 电极( 或其它贵金属电极) ，在一0 6 伏电压下( w a a g c l ) 检测0 2 的消耗来间接测定底物的含量【4 5 却】。然而这种传感器不能检 测低浓度的分析物，此外由于测量氧的还原电流时，电流的大小深受p t 电极( 或 其它贵金属电极) 表面状态影响，使得测量的重现性差，因此在目前报道的生物 浙江大学博七学位论文 传感器中基于铂电极法测量h 2 0 2 氧化电流的酶传感器的应用更加广泛。但是， 这种类型的酶传感器在测量h 2 0 2 的氧化电流时，通常要加上+ o 7 v ( v s a g a g c l ) 以上的极化电压，这使得生物样品中大量存在的易氧化性的物质如抗坏血酸、尿 酸等产生严重的干扰。 电极表面的p b 薄膜是一种对h 2 0 2 电还原具有良好的催化性能的物质。 k a r y a k i n 等人 4 8 】的研究表明，p b 对h 2 0 2 还原的催化速率为3 1 0 3 ( m o l l ) s ， 是h 2 0 2 在铂电极表面还原速率的1 0 0 0 倍。他们还研究了h 2 0 2 在p b 薄膜表面 催化还原动力学行为【4 8 , 4 9 ，结果表明其反应速率常数依赖于p b 薄膜的量。并证 明了h 2 0 2 分子可穿透p b 膜，并且膜的内层也参与了催化反应。高自旋铁离子 在p b 膜中显示了对还原反应的催化特性，与其他金属相比，p b 更适合于在含 0 2 的溶液中催化还原h 2 0 2 1 5 0 1 。此外，i t a y a 等人【5 1 在研究了p b 对h 2 0 2 和0 2 的 电化学还原催化特性后，指出只有小分子能够穿透p b 晶格，而大分子物质，如 抗坏血酸、尿酸盐则不能透过，这又从另一方面为在大量有机生物活性物质存在 下，提高p b 电催化还原h 2 0 2 的选择性创造了条件。由于p b 对h 2 0 2 电还原的 高催化活性和选择性，以p b 为基础的电催化剂被称为“人工过氧化物酶， 4 。结 合p b 制作各种生物传感器的研究近年来大量出现。 在利用p b 作为电子中介体的酶传感器中，研究最多的是葡萄糖传感器。如 h a l l o r a n 等7 】 艮道了一种利用p b 电极对h 2 0 2 的电流响应检测葡萄糖的传感器。 h 2 0 2 检测限为0 4g m o l l ，线性范围为o 4 1 0 0i _ t m o l l ，灵敏度为1 3 7g a ， ( m m o l l c m ) 。当在p b 的外层固定葡萄糖氧化酶，用作葡萄糖传感器时，检出 限为o 2 2m m o l l ，线性范围为o 2 2 3m m o f l ，灵敏度为3 0 5 3 3 7 g a ( m m o l l 】c m 。可有效消除溶液中0 2 、抗坏血酸、尿素等的干扰。 3 礅e 5 2 1 将通过与吡咯和间苯二胺共聚的方法将葡萄糖氧化酶固定在p b 修 饰电极的表面，制成了葡萄糖传感器：文献 5 3 】将p b 葡萄糖氧化酶共沉积在碳 纤维纳米电极上，外涂n a t i o n 层，制成了纳米级的安培型葡萄糖生物传感器。 该传感器的工作电位为一0 1 v ( v s a g a g c l ) ，使用寿命超过2 星期。非常适合于 极少量的样品分析测试。 文献【5 4 刊备p b 和乳酸氧化酶固定在n a t i o n 膜上，制成了一种新的乳酸传感 器，用于流动注射分析。电极对低浓度( 2 0g m o l l ) 的乳酸仍具有较好的响应。 作者5 5 1 通过溶胶一凝胶法将胆固醇氧化酶固定在事先电沉积在玻碳电极的p b 浙江大学博士学位论文 膜表面，制成了胆固醇生物传感器，在选定的工作条件下，伏安法对胆固醇响应 的线性范围为1 1 0 8 1 0 m o l l ，响应时间小于1 分钟。对胆固醇有很好的 选择性，能有效消除抗坏血酸、尿酸的干扰。吴霞琴等( 拍j 将胆固醇氧化酶用明 胶膜固定在p t 3 膜的表面，研制了p b 修饰铂盘电极的胆固醇传感器。 在电极上固定酶有多种办法，常见的包括夹心法、吸附法、共价键合法、凝 胶聚合物包埋法、交联法等4 5 5 ”。在选择固定化技术时要着重考虑固定化方法 对不同电极表面的适用性、固定化酶的催化活性、酶电极的稳定性( 包括酶的泄 漏和寿命) 以及固定化过程对酶的催化性能的影响等。利用p b 膜制作生物传感 器时，虽然p b 膜本身具有类似沸石的分子筛结构，也能够将酶固定在膜的结构 空隙中【5 引，但由于采用电沉积法在电极表面修饰p b 膜时，必须在较强的酸性溶 液条件下电解才能得到可逆性好、催化活性高的p b 膜，而多数酶在酸性溶液中 易失活，因此酶的固定化最好在修饰p b 膜后的电极表面进行。在p b 膜表面固 定酶的方法目前较常见的是用n a t i o n 等聚合物的包埋法，这种方法简便易行 但固定化酶易流失。作者试验了用硅s o l g e l 、聚苯胺和聚吡咯聚合物包埋胆固醇 氧化酶于p b 膜修饰电极表面等方法，分别制作了胆圆醇生物传感器，在酶电极 的催化活性、稳定性、电极寿命等方面取得较好的结果5 9 , 矧。 其它的利用p b 修饰电极制作生物传感器的应用情况示例见表1 。 表1 普鲁士蓝修饰电极用于生物传感器示例 t a b l e1 t h ea p p l i c a t i o no f p bo n p r e p a r i n gb i o s e n s o r s 分析物酶线性范围，备注参考文献 葡萄糖葡萄糖氧化酶 l x l 0 5 1 0 。m 0 1 l6 1 0 1 0 m m o l l6 2 0 0 2 5 m m o 儿6 3 检测限o 1n m o l l 6 4 8 1 4 m i n o i l6 5 2 2 0 m m o l l6 6 d | 0 1 】m m o l l 6 7 浙江大学博j 一学位论文 o0 4 m m o l l6 8 5 0 x 1 0 一45 x 1 0 。3 m o l l6 9 谷胱苷肽谷胱苷肽氧化酶1 1 0 l x l 0 4 m o l l 7 0 ，7 1 维生素b维生素b 氧化酶 p h = 3 9 7 2 尿素脲酶 4m n l o l 几1 5m n - l o l ，l6 8 青霉素青霉素酶5 2 5 m m o l l6 8 l 一乳酸盐：1 0g m o l 1 3 l 乳酸盐、l l 乳酸盐、l 苹果酸盐 m n l o l ，l ；l 苹果酸盐：1 07 3 苹果酸盐脱氢酶和心肌黄酶 g m o y l i ，1m m o l l 总糖醛糖脱氢酶 11 2 2g l7 4 5 1 0 一2 x 1 0 2 m o l l 甘油甘油脱氢酶 7 5 检出限：1 1 0 6 m o l l 果糖d 果糖5 一脱氢酶 0 1 0 8l n i n o i l l7 6 水杨酸盐水杨酸盐羟化酶 2 3 1 0 一1 4 1 0 。5 m o l l7 7 0 2 m i n o l l 草酸草酸氧化酶 7 8 检出限 + o 6 v ) ，使得溶液中共存的大量还原性物质如抗坏血酸、尿酸、 胆红素和对乙酰氨基酚等产生干扰。在制作酶传感器过程中，为了在较低电位下 选择性地测定过氧化氢，人们采用了加入氧化还原中介体、偶联过氧化歧化酶和 利用酶的直接电化学等办法 2 ”。普鲁士蓝( p b ) 对于过氧化氢的电还原具有高 灵敏和高选择性的催化作用，因而被称为“人工过氧化物酶”【2 2 】。它通过测量约 + o 1 0 1v 的还原峰来对过氧化氢进行测定，避免了溶液中易氧化的物质的 干扰。近年来结合p b 膜制作化学及生物传感器引起了人们的极大兴趣【2 2 - 3 0 。用 于制作胆固醇传感器未见报道。酶传感器中酶的催化活性及寿命与所使用的包埋 材料有关p ”。表1 中给出了部分固定胆固醇酶传感器的性能。可见，常用的固 定材料有导电聚合物膜、碳糊、醋酸纤维素、碳粉一t e f l o n 混合物和明胶等。溶 胶一凝胶( s o l g e l ) 是低温下固定有机和生物活性物质的理想材料阻3 6 】，它通过形 成二氧化硅的交联网络来对酶进行物理固定。固定材料与酶之间不形成化学键， 因此能最大限度地保持固载酶的活性。本实验中结合溶胶凝胶固定技术，将胆 固醇氧化酶用s o l - g e l 进行包埋，并成功地固定在p b 膜修饰的玻碳电极表面，制 成了一种新型胆固醇生物传感器。其显著特点是灵敏度高，选择性好，寿命长， 可在低电位下利用还原电流进行测定，极大地减少了生物样品中大量存在的还原 性物质的干扰。 1 6 浙江大学博士学位论文 表1 文献中胆固醇氧化酶生物传感器的性能参数示例 t a b l e1t h e p e r m a n e n t s o f t h ec h o x d e r i v e ds e n s o r si nr e f e r e n c e s d e t e r m i n a t i o nd e t e c t s 。n 8 。船 r 趾g e l i m i t s 。i l s i t i v i t y r 。f c f c c o p o l y m e r h p r c h o x 2 1 0m l v l4 c p 咖y d r o 。y m e h y j 1 1 0 - 3 o 1 5m m f e r r o c e n e h r p ，c h o x p t n a f i o n c e l l u l o s e c h o x5 1 0 0m g l 9 5 m a m g c p p y i a p o n i t e c h o x c h e o 2 5p , m0 5g m1 3 2 m a p t p d t t b - p p o - l a p o n i t e c h o x p 优) a 1 1 c h o x p t p p y c h o x p u p p y c h o x p t 伊p y c h o x v t p o l y ( 2 - h y d r o x y e t h y l m e t h a c r y l a t e v p p y c h o x o 5 0 0u m o ，叭o 1m m 0 o 3 m m o o 3 m m 0 0 2 5 0 3 m m 0 5 1 5m m p g p o l y ( t b m p c ) h r p c h o x o 0 4 o 2 7m l v l s c p e c o p c c h o x w f e r r o e y a n i d e c h o x 00 6 5 0 m m 1 3 5 u m 5 7u m 5 7 9 m 1 2 0 u m 0 0 5 3m m 0 0 1 m m g r a p h i t e t e f l o n f c c h o x 0 2 2 5m m a u f o 。8 d 。y l “”婶利 1 5 6 0m m c h o x a “3 一“e r c 印t 。p