（动物学专业论文）日本弓背蚁脑中gaba和5ht免疫阳性神经元分布的比较研究.pdf

摘要 本实验采用树脂石蜡( c p ) 组织包埋切片技术( 国家发明专利 z l 9 8 1 2 5 7 0 9 7 ) 和链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶 ( s t r e p t a v i d i n p e r o x i d a s e ，s p ) 免疫组织化学方法，对日本弓背蚁 ( c a m p o n o t u sj a p o n i c u s ) 雄蚁和雌蚁成虫脑中的g a b a 和5 - h t 能神经 元的分布进行了详细的研究，比较了雄蚁和雌蚁的异同，并对可能造 成这些差异的行为学联系进行了初步的探讨。 结果发现，雌、雄蚁脑中的g a b a 和5 - h t 免疫阳性神经元对称 分布于左右脑半球中，其聚集成群，在雄蚁中的数目比雌蚁略少。 g a b a 和5 - h t 抗原系统在雌、雄蚁整个脑髓区的分布都很广泛。前 脑呈现明显的g a b a 和5 h t 免疫阳性反应。视叶的三个视觉纤维网 都被染成褐色，并且呈现分层现象。整个视叶共包含三种类型的神经 元：无长突神经元、柱状神经元和切向神经元，它们中均有部分被 g a b a 标记，而只有少数的切向神经元被5 - h t 标记。蕈形体的侧冠 和中冠都呈现g a b a 和5 一h t 阳性反应，与其它前脑髓区相比，后者 阳性反应较弱。两种递质在a 叶的分布均比1 3 叶丰富。k e n y o n 细胞不 呈任何免疫阳性反应。中央上体和中央下体的g a b a 分布差异显著， 上体染色浅，下体染色深；而中央上体和中央下体的5 - h t 染色都很深， 没有明显的差别。嗅叶中嗅觉纤维球的g a b a 染色最明显，而5 - h t 染色较弱。背叶中g a b a 免疫染色比嗅叶弱，而5 - h t 染色比嗅叶强。 后脑和咽下神经节髓质区均呈现明显的g a b a 和5 - h t 阳性反应。总 体来说，g a b a 分布比较集中，它主要抑制局部脑区的神经活动，对 远距离的调节较弱；而5 h t 则主要在大面积神经丛区域参与远距离的 调节。 关键词：日本弓背蚁脑g a b a5 一h t 免疫细胞化学 a b s t r a c t u s i n gc p ( c o l o p h o n y - p a r a f f i n ) e m b e d d i n gt i s s u es e c t i o nt e c h n i q u ea n d i m m u n o c y t o c h e m i c a im e t h o d ( s t r e p t a v i d i n - p e r o x i d a s e ，s p ) ，w eh a v e i n v e s t i g a t e dt h ed i s t r i b u t i o no fg a b a a n d5 - h ti m m u n o r e a c t i v en e u r o n s i nt h eb r a i no ff e m a l ea n dm a l ea n t s ，c a m p o n o t u sj a p o n i c u s s p e c i a l a t t e n t i o nh a sb e e np a i dt ot h e c o m p a r a t i v er e s e a r c h o nt h ed i f f e r e n c e s b e t w e e nf e m a l ea n dm a l ea n t s w ea l s ot r yt og i v ep o s s i b l ei n t e r p r e t a t i o n s l e a d i n gt ot h e s e d i f f e r e n c e si nt h eb e h a v i o r a la s p e c t s h e r ew es h o wt h a ti nt h eb r a i no ff e m a l ea n dm a l ec d a p o n i c u s ，a l lt h e g a b aa n d5 - h ti m m u n o r e a c t i v en e u r o n sa r ed i s t r i b u t e ds y m m e t r i c a l l y o nt h el e f ta n dr i g h th e m i s p h e r ea n dg r o u p e di n t oc l u s t e r s t h eg a b aa n d 5 - h t p o s i t i v en e u r o n si nt h em a l ea r el e s st h a nt h a ti nt h ef e m a l ea n t a l l m a i nn e u r o p i lr e g i o n so fb r a i ni nt h et w oa n tc a s t e sa r ei n n e r v a t e db y e x t e n s i v ea r b o r i z a t i o n so fg a b aa n d5 - h ti m m u n o r e a c t i v ef i b e r s t h e p r o t o c e r e b r u ms h o w s o b v i o u si m m u n o r e a c t i v i t y t h et h r e eo p t i cn e u r o p i l s i nt h eo p t i cl o b e sa r el a y e r e da n ds t a i n e db r o w n t h e r ea r et o t a l l yt h r e e k i n do fn e u r o n si nt h eo p t i cl o b e s ：a m a e r i n en e u r o n s ，c o l u m n a rn e u r o n s a n dt a n g e n t i a ln e u r o n s ，p a r to fw h i c ha r eg a b ai m m u n o r e a c t i v ea n do n l y s e v e r a l t a n g e n t i a l n e u r o n sa r e5 - h ti m m u n o r e a c t i v e t h el a t e r a la n d m e d i a n c a l y c e s o fm u s h r o o mb o d i e ss h o wg a b aa n d 5 一h t i m m u n o r e a c t i v i t y t h es t a i n i n gi n a l o b ei ss t r o n g e rt h a nt h a ti nb l o b e k e n y o nc e l l s a r ed e v o i do fb o t hi m m u n o r e a c t i v i t i e s t h eu p p e rc e n t r a l b o d ys h o w ss t r o n g e r g a b ai m m u n o r e a c t i v i t yt h a nt h a t i nt h el o w e r c e n t r a l b o d y h o w e v e r ，5 - h ti m m u n o r e a c t i v i t yi n b o t hu n i t ss h o w sn o o b v i o u sd i f f e r e n c e i nt h ea n t e n n a ll o b e s ，o l f a c t o r yg l o m e r u l is h o wi n t e n s e g a b a s t a i n i n ga n df a i n t e r5 - h ts t a i n i n g t h ed o r s a ll o b e ss h o w f a i n t e r g a b a s t a i n i n ga n ds t r o n g e r5 - h ts t a i n i n gt h a n t h a ti nt h ea n t e n n a ll o b e s t h et r i t o c e r e b r u ma n ds u b o e s o p h a g e a lg a n g l i o ns h o w o b v i o u sg a b aa n d 5 h ti m m u n o r e a c t i v i t y i ng e n e r a l ，g a b ad e n s e l ye x i s t si nt h eb r a i na n d i ti sm o r e i m p o r t a n t i nm e d i a t i n gl o c a ln e u r a li n t e r a c t i o n s ，w h i l e5 - h t p l a y r o l e si nm e d i a t i n gd i s t a n tn e u r a li n t e r a c t i o n s k e y w o r d ： c a m p o n o t u sj a p o n i c u s ，b r a i n ，g a b a ， 5 - h t ， i m m u n o c y t o c h e m i s t r y 1 i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东 北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 学位论文作者签名：碴二籀8日期：迎雏。压 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的 规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话； 邮编： 1 引言 诺贝尔医学生理学奖获得者e c c l e s 曾预言：“在3 0 年内，世界上 大多数最伟大的科学家将都是在研究脑”，而神经科学( n e u r o s c i e n c e ) 的 重点即在于脑，所以神经科学又被称之为脑科学( b r a i ns c i e n c e ) 。神经 生物学是其中的主干，处于生命科学发展前沿的重要地位，同时它也 是一门新兴的学科，出现神经生物学这个术语，仅有3 0 多年的历史( j 】。 对经典神经递质的研究一直是细胞神经生物学的热点课题，但是高等 动物尤其是哺乳类动物的神经系统非常复杂，研究起来比较困难，以 至于到目前为止还有许多基础性的理论问题没有得到很好的解决。昆 虫和u 国乳类动物神经系统的活动原理相似，但昆虫神经系统相对比较 集中，神经结构比较简单，且材料易得，目前已成为研究神经系统中 各种递质能神经元的形态、分布、生理功能及其各种活性物质在信号 传导中的分子机理和生理机制的优良实验模型，备受神经科学家们的 关注。 人们对昆虫脑中神经递质的研究是从二十世纪六十年代开始的。 1 9 6 0 年，w e l s h 等人发表了对5 羟色胺在无脊椎动物中定量分布的研 究 2 1 。之后人们相继对昆虫中一些神经递质及代谢酶做了初步的探讨 1 3 】【4 1 。他们当时主要采用生物化学、药物学方法和放射自显影技术。虽 然许多神经元已被谚 别，但它们的递质类型和分布还不清楚。后来， 在免疫学、生物化学和显微镜技术进展的基础上，免疫组织化学技术 发展起来。它分为免疫荧光技术和免疫酶标技术，基本原理是利用荧 光素或辣根过氧化物酶对一抗或二抗进行标记，再用标记的抗体作为 探针检测细胞或组织的相应抗原，从而对抗原进行定位和定性。这种 技术敏感性高、特异性强并能将形态、代谢和生理机能密切集合在一 起，大大推动了昆虫神经递质的研究。免疫荧光技术是c o o n s 等在1 9 4 2 年首先建立的，到1 9 8 2 年这种技术发展成熟，可以进行双重荧光标记， 这为神经递质共存现象的研究提供了条件。免疫酶标技术又称过氧化 物酶标技术，是由n a k a n e ( 1 9 6 6 ) 发展起了的，该技术所采用的酶是辣 根过氧化物酶( h r p ) ，经过酶标的抗体极易与抗原形成复合物，该复合 物在辣根过氧化物酶的底物过氧化氢( h 2 0 2 ) 和供电子体3 ，3 - 二氨基联 苯胺( d a b ) 的共同作用下能发生反应，生成棕褐色的沉淀物，这样便 可以在普通的光学显微镜下对抗原的分布进行观察。该技术的发展经 历了直接法、间接法和双重标记法，现在最常用的是间接法。免疫酶 标技术最初的适用范围只是冰冻切片。1 9 7 7 年s t e m b e r g 等又用桥抗过 氧化物酶抗体复合物，建立了p a p 技术，从而大大提高了免疫组织化 学的特异性和敏感性，把这一技术推广到石蜡切片。1 9 8 1 年许世明等 将b a b 法加以改进，建立了a b c 技术，该技术被认为是免疫组织方 法学的一次重大突破。近几年来人们又从链霉菌中分离出链霉菌抗生 物索蛋白( s a ) ，穿透力比a b c 和p a p 复合物大，反应迅速，形成一 种新的方法，即链霉菌抗生物蛋白一过氧化物酶( s p ) 法，其灵敏度高， 适合于石蜡包埋组织中低含量的抗原检测。单克隆抗体技术的出现使 免疫酶标技术得到了更广泛的应用。由于免疫组化技术的发展，人们 在8 0 年代和9 0 年代对昆虫神经递质作了大量的研究工作，涉及各种 递质和许多昆虫的不同脑区【5 1 16 】【7 l 【引。 g a b a ( y 氨基丁酸) 是一种中性氨基酸，属于抑制性神经递质， 它的合成由谷氨酸脱羧酶( g a d ) 控制，在g a d 的催化下，谷氨酸转化 为g a b a 1 1 。现己证实g a b a 是昆虫中央神经系统和外周神经系统的 一种重要抑制性递质。1 9 8 3 年，s t o r m 等人用免疫组化方法首次观察 到了谷氨酸和g a b a 能神经元【9 l ，随后人们对g a b a 在各种昆虫脑中 的分布作了大量的研究工作，尤其到八十年代末期，免疫细胞化学技 术的出现实现了对单个神经元中神经递质的分布进行研究i l 。后来随 着分子生物学的发展，膜片钳技术和d n a 重组技术的应用。人们开始 对g a b a 的受体和离子通道进行研究【l “。近几年人们发现昆虫g a b a 受体与脊椎动物g a b a 的a 型受体非常相似【l 2 1 ，把昆虫神经递质的研 究推向了分子水平。 5 - h t ( 5 ，羟色胺) 也是昆虫中枢神经系统中一种重要的神经递质，由 哼l 哚和乙胺两部分合成，属吲哚胺，于1 9 4 8 年首次被r a p p o r t 等人从 血清中分离出柬。其生物合成是以色氨酸( t r y p t o p h a n ，t p ) 为前体，在 色氨酸羟化酶( t r y p t o p h a nh y d r o x y l a s e ，t p h ) i 拘作用下生成5 羟色氨酸 ( 5 一h y d r o x yt r y p t o p h a n ，5 - h t p ) ，然后在5 - h t p 脱羧酶 ( 5 - h t p d e c a r b o x y l a s e ，5 - h t p d c ) 的作用下，脱羧基而生成5 一h t t ”。 对于5 - h t 在昆虫脑中的分布，人们已经做了大量的研究【1 3 1 1 4 】【1 5 j 【。 现已证实5 一h t 在昆虫中与学习、唾腺分泌和控制昼夜节律有关【1 6 i 。 然而，以上他们采用的材料多是体形较大的昆虫，如蜜蜂、烟草 蛾、蝗虫和蟑螂等，而对被有坚硬的外骨骼且体形较小的蚂蚁的研究 仍较少，且多局限在脑容量、蕈形体以及视通路的比较上，尤其是在 对视叶的研究中，因为解剖所限，仅能得到内髓和外髓的完整数据， 而无法考虑神经节层【1 8 1 。1 9 9 9 年，暴学祥等发明的c p 包埋技术使 只本弓背蚁脑的显微结构得以清晰的体现【1 9 1 2 0 】【2 l 】，也为各种昆虫的神 经递质的研究提供了条件【2 2 j 吲。 蚂蚁属节肢动物门，昆虫纲，膜翅目，蚁科。蚂蚁是一种社会性 昆虫，主要营群居生活并存在多态现象，其不同蚁型( 雌蚁、雄蚁、大 工蚁、小工蚁和兵蚊) 形成一个群落居住在一个巢穴里，像蜜蜂一样分 工明确，蚂蚁内部各负其责，互相依存1 2 4 j 。具有生殖能力的雌蚁( f e m a l e ) 在从处女蚁( v i r g i n ) 蚁后( q u e e n ) 转变的过程中会发生很大的行为变化 以及明显的脑结构的改变【2 5 1 。处女蚁带翅，通常呆在其出生的巢穴里 面，对光线的明暗没有特殊的反应；然而到了婚飞的当天，它们会来 到巢的上面，并且表现出很强的趋光性：当雌蚁完成了婚飞交配，会 脱去翅膀，丌始产卵，建立一个新的蚁群。这时它们成为蚁后并履行 所有的责任直至抚育出第一批后代来负责种群内所有的工作。另外雌 蚁在生殖季节会分泌一种雌性激素，雄蚁根据这种激素就能准确地寻 觅到雌蚁并和它完成交配工作。雄蚁( m a l e ) 又称蚁王，一般来说，其很 少出窝，也不担任种群内的任何职责，它们的主要任务是繁衍后代， 在婚飞期会离开巢穴与雌蚁完成交配。然后死亡。虽然在寻找配偶时， 激素起到一定作用，但视觉指导的行为却更为重要。这样，雄蚁一般 具有比雌蚁更大的眼睛，与没有生殖能力的工蚁相比则更为明显。工 蚁( w o r k e r ) 和兵蚁( s o l d i e r ) 不带翅，与雌、雄蚁相比，一般较少的依靠 视觉，主要生活在一种依靠触觉和嗅觉的世界中。工蚁是生殖系统发 育不完全的雌蚁，是群落中的主要劳力，其任务相当繁重，包括觅食、 养育幼蚁、筑巢和清洁巢房等，数量最多【1 7 1 ；兵蚁由大工蚁特化而成， 其上颚发达，力主攻击以及负责保卫家族安全，防御外敌侵入，数量 较少。 在蚂蚁中，单眼系统为雌、雄蚁所特有。单跟看物体形态的能力 低，其不能成像，功能只是辨别光线的明暗与物体的远近。单眼会随 着光强度的变化而做出反应，刺激昆虫加快或减慢活动，是对明暗反 应影响中枢兴奋状态的一种激发器官。关于单眼系统人们研究的相对 较少，且多集中于蝗虫中，讨论l 型神经元的功能及其突触联系并通 过细胞化学研究推测乙酰胆碱可能是l 型神经元释放的神经递质 2 6 1 2 ”。关于单眼及l 型神经元的功能在其它昆虫中也有少量研究 2 8 1 1 2 引。本文首次描述并比较了日本弓背蚁中雌、雄蚁的单眼系统及差 异分析，试图为进一步探求单眼系统的生理机制提供基础研究。 蚂蚁的多态现象以及明确的社会分工，表明其神经系统在昆虫甚 至无脊椎动物中是比较高级的。此外，蚂蚁还有一套完善的感觉信息 接受、传递和处理机制。它们主要通过振动触角( 触角上有触觉和嗅觉 器官1 和辨别独特气味这两种方式进行沟通。它们的嗅觉系统非常发 达，个体之间通过嗅觉信号就能准确无误地进行交流，完成觅食、通 告敌情和定位归巢等各种行为。有的蚂蚁能根据天空中的偏振光辨别 方向【2 8 】，有的蚂蚁能预测天气的变化和地震。最新研究表明，工蚁能 够根据同伴表皮的烃物质来决定自己的即时行为及任务口。这些复杂 的行为与它们相对发达的脑神经结构是分不开的。日本弓背蚁是一种 体形较大的蚂蚁，各种蚁型在形态上有较大的差别，分布广泛，取材 方便，其分类地位比较高等，神经系统结构相对集中，易于操作和观 察，并可直接进行活体生理行为的研究，因此日本弓背蚁是研究昆虫 整个神经系统结构和功能的优良实验材料。 本文以同本弓背蚁( c j a p o n i c u s ) 为研究对象，结合了c p ( c o l o p h o n y d a r a f f i n ) 包埋连续切片、连续制片技术和免疫细胞化学酶标 s p ( s t r e p t a v i d i n p e r o x i d 粥e 1 法进行组织学制片和染色。我们所用的包埋 剂一树脂石蜡( c p ) 是我们实验室自己研制的，已获国家发明专利 f z l 9 8 1 2 5 7 0 9 7 1 。其具有支持强度高、适用范围广、包埋温度低、连续 切片薄、包埋剂易置换、不必进行抗原修复等优点，最适合生物组织 免疫细胞化学和分子生物学的定位研究。另外，s p 法使用链霉菌抗生 物素蛋白一过氧化酶放大系统，对检测组织细胞中低含量的抗原具有 灵敏度高、特异性强、显色后背景低，并利于免疫标记后于苏木精等 常规染液对染的优点，比传统的p a p 、a b c 方法更为简便、敏感、特 异。本文观察研究了雌、雄两种蚁型脑中g a b a 和5 - h t 抗原系统及 其功能神经元的分布模式，试图阐明g a b a 和5 - h t 在脑系统内的分 布特点，并探讨日本弓背蚁不同脑区的神经联系，构建一个g a b a 和 5 - h t 抗原分布的中央神经系统模型，为日本弓背蚁等社会性昆虫的学 习、记忆和行为学研究及相关活性物质在信息传递中的分子机理和生 理机制的探索提供理论和解剖学依据，并为神经生物学的发展积累科 学资料。 5 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 药品 自制c p 包埋剂( i 、l i 、i i i 、i v 、v 、v 1 ) 、多聚甲醛、叔丁醇、 免抗g a b a ( 一抗) 、免抗5 - h t ( 一抗) 、s p 试剂盒，d a b h 2 0 2 ( 显色剂) 、 多聚赖氨酸、p b s 、苏木精及石蜡切片常规药品及柯达公司的b 5 胶卷 和国产常规显影剂和定影液。 2 1 2 设备及用具 手摇切片机、l o 个5 0 m l 烧杯、冰箱、孵育盒、石蜡切片所需的其 它设备及o l y m p u s 显微照相机。 2 1 3 材料 f l 本弓背蚁雌蚁3 0 只，体长1 5 6 m m 1 5 8 r a m ；日本弓背蚁雄蚁3 0 只，体长6 2 m m 一6 5 r a m 。 采集时间：2 0 0 2 年5 月、9 月和l o 月下旬。 采集地点：长春东北师范大学校园( 5 月、9 月) 及左家( 1 0 月下旬) 。 2 2 实验方法 2 2 1 前处理 耿活体雌、雄蚁，将其去头后迅速鼍于4 多聚甲醛( 溶于0 1 m 的 p b ) r l h ，在4 。c 下固定八小时。然后用0 1 m 的p b s ( p h7 4 ) 漂洗三次， 每次十五分钟，目的是将组织表面多聚甲醛充分洗干净。标本在梯度 酒精中( 7 0 ，8 0 ， 9 0 ，9 5 ， 1 0 0 ) 依次脱水后，将其转移到 叔丁醇( t e r t b u t a n 0 1 ) 中3 0 。c 透明三十六小时。采用c p 包埋剂( i i ，i i + ， i i i ，i i i + ) 在5 3 。c 下进行包埋j k d , 时( b a oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 。手摇切片机进 行连续切片( 6 m ) 并连续展片于涂有多聚赖氨酸( p o l y l - l y s i ) 的载玻 片上，晾干备用。 2 2 2 免疫细胞化学 首先将干透的标本切片进行复水，依次经过： 二甲苯室温1 5 分钟 ：二甲苯 室温1 5 分钟 1 2 二甲苯+ 1 2 无水酒精室温5 分钟 无水酒精室温5 分钟 9 5 酒精室温5 分钟 9 0 酒精室温5 分钟 8 0 酒精室温5 分钟 7 0 酒精室温5 分钟 5 0 酒精室温5 分钟 蒸馏水室温5 分钟 p b s ( 0 1 m o l l ，p h 7 4 ) 室温5 分钟3 次 然后进入s p 试剂盒( 福州迈新生物技术开发公司，不包括一抗和 显色剂1 ： ( 1 ) 过氧化物酶阻断溶液( 试剂a ) 室温孵育1 0 分钟：( 2 ) 非免疫性动 物血清( 试剂b ) 室温孵育5 分；( 3 ) 1 ：3 0 0 0 免抗g a b a ( s i g m a 公司， n o a 2 0 5 2 ) 或1 ：15 0 0 兔抗5 一h t f s i g m a 公司，n o s - 5 5 4 5 ) 4 。c 过夜； ( 4 ) 次日生物素标记的二抗( 试剂c ) 室温孵育1 0 分钟；( 5 ) 链亲和素一过 氧化物酶溶液( 试剂d ) 室温孵育1 0m i n ；( 6 ) d a b ( 3 ， 3 - d i a m i n o b e n z i d i n e ) h 2 0 2 ( 试剂盒d a b 一0 0 3 1 1 0 3 1 ，福州迈新生物技术 开发公司) 显色5 l o 分钟，以上除2 3 步间p b s 洗一次5 分钟外，其 他各步问p b s 洗3 次，每次5 分钟。 显色后的标本用蒸馏水洗去多余的显色液，转入苏木精( e h r l i c h ， 上海化学试剂厂) 中对染2 分钟，自来水蓝化3 0 分钟，梯度酒精脱水， 二甲苯透明，中性树胶封片，o l y m p u s 显微镜检片及照相。 2 2 3 对照实验 用p b s 代替一抗同步进行上述免疫细胞化学染色过程，结果为阴 陛。 3 结果 日本弓背蚁的脑相当发达，由前脑( p r o t o c e r e b r u m ) 、中脑 ( d e u t o c e r e b r u m ) 、后脑( t r i t o c e r e b r u m ) 及咽下神经节( s u b o e s o p h a g e a l g a n g l i o n ) 构成，在整个头部占相当大的比例，全脑几乎占颅腔的1 6 ( 兵 蚁) 一1 3 ( z 蚁) 。前脑最大，占脑体积的3 4 左右，这和其承担的重要功 能有密切的关系。前脑由前脑叶和视叶构成。视叶是昆虫复眼的基本 视觉中心，由神经节层、外髓和内髓三个神经区域构成。前脑叶包括 蕈形体、中央复合体及其邻近的脑区。蕈形体成对，以左右对称的形 式位于脑的上方，它是由两个杯状的髓质冠及通过冠的柄部向下延伸 的根系构成，根系包括垂直叶( a 叶和v 叶) 和水平叶( bn t ) 。中央体由 上下两部分构成中央上体和中央下体。中央体的背方为脑桥结构， 其连接左右两个半球，脑桥又分为脑前桥和脑后桥。中脑由嗅叶和背 叶组成，其主要成分是嗅叶。后脑与咽下神经节相连，咽下神经节再 与两条腹神经索相连。 本文主要从额方向( 纵切) 、水平方向( 横切) 和矢状方向( 侧切- z 个 角度对脑进行连续切片，通过在这三个方向上g a b a 和5 - h t 标记的 1 = _ l 本弓背蚁脑切片，能够清晰地观察到g a b a 和5 - h t 及其神经元的 分枷情况。结果发现除k e n y o n 细胞外，几乎整个脑都有g a b a 和5 - h t 的分稚，只是分布的密度有所不同。5 h t 能神经元数量比较少，但发 出的纤维投射到脑的广泛区域：大量神经元是g a b a 能的，它们的形 态不尽相同，发出纤维投射到脑的不同区域。5 - h t 在视叶、中央体和 食道下神经节分布尤为丰富，但脑区之间的一些神经纤维通路，染色 深浅不一，有的几乎不着色。 f = j 本弓背蚁雌蚁和雄蚁之间并不存在特异的脑结构，但其相应的 g a b a 和5 - h t 染色情况及其神经元的分布和数量略有不同。对于雌、 雄蚁的头部大小和脑容积，我们简单地通过额面进行了测量，雌蚁头 壳的长、宽、高分别约为3 2 5 5 1 7 5 ( m m ) ，脑的长、宽、高分别约为 1 0 8 0 6 6 0 6 8 ( m m ) ；雄蚁头壳的长、宽、高分别约为2 t 1 5 5 1 0 5 ( r a m ) ， 脑的长、宽、高分别约为0 6 9 1 0 4 5 0 4 8 ( r a m ) 。 3 1 前脑( p r o t o c e r e b r u m ) 位于食道背后方，近头顶，分上、下两部分( 图1 ，2 ) 。端部1 2 明显分为左、右两个半球( h e m i s p h e r e ) ，半球内主要的髓质功能结构是 蕈形体之冠( c a l y x ) 。冠为双杯状，分为内杯和外杯，其周围及杯内群 集着球体细胞( k e n y o n 细胞) ，这些细胞发出树状分支纤维投向冠的不 同髓区，与其它类型神经元( 投射神经元) 的轴突术梢发生突触。球体细 胞发出的轴突经由荤形体的柄两分支后分别进入a 叶和1 3 叶。冠是昆 虫感觉、学习、记忆和指令的中心。两前脑半球分别以蕈形体的柄与 前脑的后1 2 相连。前脑的后1 2 左右两侧与视叶相连，腹前方与中脑 相连，其中央容纳着重要的髓质功能结构，包括蕈形体之根( a 叶、e 叶、 f j t - ) 及中央复合体。因此，前脑的后l 2 是各种信息整合的中心。 g a b a 在前脑的分布非常丰富。视叶的三个神经纤维网区及整个 前脑叶都呈现g a b a 免疫阳性反应，其中中央下体染色最深。前脑中 的许多神经元被g a b a 标记，只有k e n y o n 细胞未被标记( 图1 ) 。 5 - h t 阳性纤维起源于少量的细胞体，但在不同纤维网中有广泛 的分稚，呈现明显的静脉曲张状。k e n y o n 细胞同样未被标记( 图2 ) 。 3 1 】视叶( o p t i cl o b e s ) 视叶( 图3 ) 是位于前脑两侧的视觉通路，外接复眼，内以视神经进 入前脑后l 2 两侧的髓区。日本弓背蚁雄蚁和雌蚁的视叶包括三个彼 此相连的神经纤维网，由外向内依次为：神经节层、外髓和内髓。三 个髓区间存在两个视神经纤维交叉：外交叉( o u t e rc h i a s m a ，o c h ) 连接 神经节层和外髓，内交叉( i n n e r c h i a s m a ，i c h ) 连接外髓和内髓。 g a b a 阳性纤维呈层状分布于三个视觉髓区中。一些神经元被标 u ，它们分别属于不同的类群。两个视交叉及视叶与前脑之间的几条 神经通路染色比较浅。 5 h t 阳性纤维呈现明显的静脉曲张状，并呈分层现象。三个视神 经纤维网的神经纤维都成柱状排列，与视网膜的柱状排列一致，与层 状结构相垂直。 雄蚁有比雌蚁更大的视叶。 3 1 1 1 神经节层 神经节层主要接受复眼感受器传来的信息。依据神经节层的组织 学特征，可将其分为外侧的细胞体层和内侧的神经纤维层。细胞体层 主要为单极细胞的胞体，宽度约是神经节层的1 2 ，大量的单极神经元 g a b a 和5 - h t 免疫反应皆为阴性( 蓝色) ；神经纤维层又分为a 、b 、c 三层( 图3 ，4 ，5 ) ，a 层最宽，c 层次之，b 层最狭窄，约是c 层的1 3 。 a 层位于纤维层的外侧，与视网膜相连，主要接受光感细胞、无长突 利i 经元和单极神经元的投射，再发出纤维连接b 层和c 层。 a 层有明显的g a b a 免疫阳性反应，染色也很均匀( 图3 ) ，而5 一 h t 阳性反应较弱( 图4 ，5 ) ；b 层g a b a 及5 - h t 免疫阳性反应均最弱， 纤维较稀疏染色最浅，但能看到清晰的神经纤维把a 层和c 层连接起 来( 图3 ，4 ，5 1 。c 层位于纤维层的最内侧，它是靠近外交叉的外网织 层，g a b a 和5 。h t 免疫阳性反应最强烈( 图3 ，4 ，5 ) ，其中含有大量 的阳性纤维，染色深而均匀，细的5 - h t 神经纤维成柱状排列，这些柱 状结构通过边缘的神经纤维相连接。神经节层和外髓之间的外交叉呈 现弱g a b a 及5 - h t 阳性反应( 图3 ，4 ，5 ) 。沿外交叉两侧有许多连接 神经节层和外髓的柱状神经元的胞体，有少数被g a b a 标记( 图3 ) 。 在外交叉可看到来自前脑的一束粗大的5 - h t 阳性纤维，投射到c 层( 图 4 ，5 1 。 3 1 1 2 外髓 外髓体积最大。从额切方向看，雌蚁中外髓的长约2 1 8 4 p m ，宽 约2 0 1 6 9 i n ，高约1 6 2 # m ；雄蚁中长约2 1 8 4 a m ，宽约1 2 6 a m ，高约 1 8 0 9 i n 。可见，雄蚁具有更发达的外髓，其在脑中所占的比例要比雌 蚁大得多。根据g a b a 及5 - h t 染色程度的不同，可以把外髓分为9 层，但两种神经递质在各层中的染色强度却不同。 g a b a 在第一层染色较深，神经纤维呈规则的网孔排列，覆盖在 外髓的表面；第二层和第四层染色较浅。第三层和第五层染色较深， 阳性神经纤维分枝呈垂直层分布；第六层、第七层和第八层染色最浅， 尤其是第八层几乎没有标记；第九层可以清楚的观察到标记的阳性纤 维呈柱状分布，它的染色也较深( 图3 ) 。 5 。h t 在第1 、2 、3 、7 、8 、9 层染色浅，反应弱，而中间的第4 、 5 、6 层，阳性纤维分稀最广，染色均匀，在向心方向呈规则的网孔排 列，与外髓柱状细胞相垂直( 图6 ) 。这三层边界不明显，约占外髓的三 分之一。 外髓与内髓之间存在第二个视交叉一内交叉( i n n e rc h i a s m a ，i c h ) ， 它呈现弱g a b a 和5 - h t 免疫阳性反应( 图6 ) 。三种神经元与外髓有关： 第种是无长突神经元( a m a c r i n ec e l l s ) ，胞体较小，位于外髓的两侧， 突起深入髓的层状结构并形成许多细小分支，少量被g a b a 标记。第 二种是柱状神经元，连接外髓和内髓，胞体位于内交叉两侧，胞体向 外髓、内髓发出轴突，少量被g a b a 标记。第三种是切向神经元 ( t a n g e n t i a l n e u r o n s ) ，其反应最强烈且胞体较大，直径约为 5 6 1 1 2 p , m ( 雌蚁，图7 ) 和5 6 9 8 p m ( 雄蚁，图8 ) ，发出轴突到外髓和 前脑。根据其胞体的位置可分为两群，群位于外髓和蕈形体的外冠 之间，在雌蚁中约有1 6 个、雄蚁中约1 4 个呈现5 - h t 免疫反应；群二 位于外髓和侧前脑之间，在雌蚁中约有5 4 个、雄蚁中约4 4 个呈现5 h t 免疫反应。 3 1 i 3 内髓 内髓是视叶的第三个神经纤维网，体积约为外髓的一半，通过内 交叉与外髓相连。内髓的染色分层没有外髓显著，分层在水平切面较 明显，因为内髓的分层稍倾斜于额切面。 g a b a 阳性染色使内髓分成四层，但这四层染色密度不同，并且 互相覆盖，不容易清晰的划分。第一层染色最深，主要由来自外髓的 柱状及切向神经元末端分枝密集而成，后三层染色程度非常相似，第 三层比第二层、第四层染色稍深，可以把它们模糊分开，第四层包含 许多粗大的神经纤维，这些纤维投射到前脑的不同区域( 图3 ，9 ) 。 5 - h t 染色使内髓分为5 层，第2 层染色最浅，第l 、4 层染色均 匀，没有明显的阳性纤维。第3 、5 层阳性纤维细，染色深而清晰，这 两层呈向心排列并且与外髓的阳性纤维层相垂直。第五层有少量阳性 纤维呈不规则分散状分布( 图6 ，l o ) 。 在视叶中普遍存在的三种神经元均与内髓有关，其中位于内交叉 两侧的无长突神经元、连接内髓各层的柱状神经元和连接内髓和前脑 的切向神经元均有部分被g a b a 标记，直径最大的达1 4 p 。m ( 图9 1 。但 5 - h t 免疫阳性反应神经元仅有一个，其胞体位于蕈形体的外冠和内髓 之问( 图1 1 ，1 2 ) 。在整个视叶中，除了标记的髓质和神经元外，还有 清晰的弱阳性视觉通路：一条是外髓侧前脑通路( 图l o ) ，还有一条 内髓一侧前脑通路( 图9 ，1 0 ) ，最后一条是内髓一内髓通路( 图1 3 ) ，它 们染色很浅。 同本弓背蚁雄蚁的视叶比雌蚁发达，雄蚁的视叶在脑中所占比例 比雌蚁大，而且雄蚁内髓占整个视叶的体积也比雌蚁大，并且分层现 象也比雌蚁更明显。 3 1 2 单眼 昆虫的眼睛是头部骨骼的一部分。表面是角化而透明的角膜，光 线可透入。蚂蚁除了有大的复眼外，还有对光也敏感的视觉构造，叫 做单( 1 艮( o c e l l u s ) 。单眼从表面向内方由透镜状的几丁质角膜( 角膜晶 体) 、角膜细胞层及若干个视觉细胞包围着视杆集合成小网膜而构成， 在小网膜周围有色索细胞( 网膜色素) ( 图1 4 ) 。在蚂蚁中，单眼只存在 于雌蚁和雄蚁中，在工蚁和兵蚁中没有。日本弓背蚁j a p o n y c u s 的 单眼为背单眼，位于雌、雄蚁头部的背额区上方，共有3 个，呈三角 形排列，形成单眼三角区，三个单眼的大小基本相同。 从额切、水平切和侧切三个方向可看出，单眼神经的基本走向为： 中单眼神经下行，然后分为两支( 图1 5 ，1 6 ) ，分别与两个侧单眼的神 经下行通路融合或并行继续向腹后方下行，穿过中央体后方( 图1 6 ， 1 7 ) ，在四分体平面上部分延伸进入侧前脑，其余部分接着向腹后方下 行，最后伸入后脑( 图1 8 ) 。可见，单眼神经在整个脑中都有分支。 雌、雄蚁的单眼及神经走向基本相同，但也存在一些差别。在雌 蚁中，中单眼神经下行后分为两支，分别与两个侧单眼的神经下行通 路融合，然后两束神经继续向腹后方下行( 图1 9 ) ；而在雄蚁中，分支 后的中单眼神经并不马上与侧单眼神经相融合，而是相隔一段距离的 并行( 图2 0 ) 。这样，四束神经继续向腹后方下行，直到四分体的额平 面上，中、侧单眼神经才融合成两束( 图2 1 ) 。 3 1 3 前脑叶 g a b a 和5 一h t 在前脑叶中均有广泛分布，但它们的反应模式存在 明显的差别：基本上，整个前脑叶呈现均匀且显著的g a b a 免疫阳性 反应，仅中央下体的染色较深，其余各结构之间没有明显的染色程度 的区别( 图1 ) ；而对于5 - h t 阳性反应，各结构之间存在明显不同的染 色强度。蕈形体的冠最浅，柄和叶次之，且a 叶比b 叶稍深，侧前脑 髓区染色较深，中央体着色最强烈，而且中央上、下体的5 - h t 反应强 度一致，没有明显的差别( 图2 ) 。视叶与前脑之间、嗅叶与前脑之间分 稚有许多g a b a 阳性神经元，它们大多属于投射神经元，发出轴突投 射到前脑。而5 - h t 阳性神经元的数量则少得多。 在前脑叶中，视突结构发达且复杂，可分为前视突、视突和后视 突，它们分别与内髓和外髓相连。前视突位于前脑叶的背前方，呈椭 圆体( 图2 2 ，2 3 ) ；视突位于前脑侧角；后视突位于前脑叶的侧后方、 蕈形体外冠的前方，与侧前脑没有明显的界限( 图2 4 ) 。它们的g a b a 和5 h t 免疫阳性反应均与周围的侧前脑相一致，只是明显的曲张状阳 性纤维分布稀疏而已。而且，雄蚁的视突结构尤其是前视突，明显比 雌蚁发达。在雄蚁中，前视突长约7 5 6 “m ，最宽处直径约为2 8 耻m ； 雌蚁的前视突长约8 0 u m ，最宽处直径约为2 5 9 m 。可见，雄蚁前视突 的相对体积比雌蚁大。 3 1 _ 3 1 蕈形体 蕈形体是前脑中最明显的两个对称的神经纤维区，由两种组织成 分组成：本地神经元，即k e n y o n 细胞和由k e n y o n 细胞及外源性的投 射神经元的分支构成的神经髓质区。髓区分为三个部分：杯状的冠( 由 k e n y o n 细胞的树突及外源投射神经元轴突终末形成) 、柄和叶( 由 k e n y o n 细胞的轴突及其侧枝与外源性神经突形成) 。在c j a p o n i c u s 中， 每个蕈形体由两个冠( 分别称为中冠和侧冠) 、一个先分枝后合一的柄以 及与柄相连的n 叶、b 叶和y 叶组成。冠在形态上被分为三个区：唇、 领和基环，唇区最大，领区次之，基环与蜜蜂中描述的一样，位于柄 的周围，是一个更小的近端环，从光镜下即可看出基环的髓区更粗糙， 能与其它的分区相区别( 图1 3 ) 。 o 叶，是蕈形体根部的一个逆行髓质结构，在蕈形体冠下方呈两 个对称的圆柱形结构，在基底由包绕它们的神经纤维分隔成四瓣( 图 2 5 ) 。它与目叶的走向成直角，直接通向包围脑周围的神经束膜f 图2 6 ) 。 在解剖固定后的标本时，通过神经束膜可直接观察到前脑后1 2 中部 的两个色暗的圆形结构，即a 叶。观察连续切片时，从第一片开始， 直到n 叶在0 叶上消失，均能清晰的见到这个结构，在雌蚁中其直径 约1 0 0 1 t m ，长约1 5 0 b t m ；在雄蚁中，其直径约8 4 i t m ，长约1 0 2 9 m 。 0 叶，即蕈形体柄后根的大部分，直径约9 2 4 t x m ( 雌蚁) 和5 6 耻m ( 雄 蚁) 。两侧0 叶均向前脑下部中央弯曲，并在中央体下方相接，故b 叶 的术端呈截形，之间有纤维通道相连，不呈阳性反应( 图2 7 ) 。 y 叶，位于b 叶末端后方，呈短分叉状。y 叶根据其形态和位置， 又可分为y l 和y2 ( 图2 8 ) 。y 1 位于1 3 叶的腹后端，为一对明显呈圆 盘状的d , - t g 节( t u b e r c l e ) ：y2 位于yl 的腹