（生物医学工程专业论文）全脑神经递质与受体含量三维分布建模及可视化.pdf

a tp r e s e n t ，s t u d yo nb r a i nh a sg o n e d e e pi n t ot h ec e l l u l a ra n d m o l e c u l a rl e v e l h o w e v e r , t h e r es t i l la l em a n yi n t e r m e d i a t el e v e l sf r o m r e s e a r c ho nc e l l si nm i c r o - s y s t e mt ot h a to nb r a i nf u n c t i o na n db e h a v i o r i nt h em a c r o s y s t e m i no r d e rt of u r t h e rt h es t u d yo ft h eb r a i ns h o u l d c a r r yo u tf r o mm u l t i - l e v e ls u c ha st h eb e h a v i o r , t i s s u e ，c e l l sa n ds i g n a l i n g m o l e c u l e s i nt h i sp a p e r , w ec u tt h eb r a i ni n t o5 m m 5 m m 5 m m p i e c e s ， r e c o r d i n gt h e i rc o o r d i n a t e s ，g e tt h ec o r eo fe a c hs m a l lp i e c ea n dm a k e t h e mi n t ot i s s u ec h i p s a n dt h e nw ew i l lu s ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , i n s i t uh y b r i d i z a t i o n ，l a s e rr a m a ns p e c t r o s c o p y , t e r a h e r t zt e c h n o l o g yt o d e t e c tn e u r o t r a n s m i t t e r , r e c e p t o ri ne a c hs m a l lp i e c e ( t h i sr e s e a r c hw i l l c a r r yo u tb yo u rc o o p e r a t i v ed e p a r t m e n t ) m a k e u s eo ft h r e e - d i m e n s i o n a l r e c o n s t r u c t i o nt oe s t a b l i s hb r a i nn e u r o t r a n s m i t t e r , r e c e p t o rq u a n t i t a t i v e d i s t r i b u t i o nm o d e li nb r a i n ，s ot h a ti tc a l lp r o v i d eab a s i sp l a t f o r mf o r r e s e a r c ho nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nb r a i nn e u r o t r a n s m i t t e r , r e c e p t o r q u a n t i t a t i v ed i s t r i b u t i o na n db r a i nf u n c t i o n a tt h es a m et i m e ，r e b u i l dt h e b r a i nf r o ms e q u e n c e sb r a i n - p i e c e si m a g e s ，i no r d e rt op r o v i d ea na c c u r a t e r e f e r e n c em o d e l t i s s u e c h i p s c a n d e l i v e r y t h et h r e e d i m e n s i o n a lb r a i n n e u r o t r a n s m i t t e r s ，r e c e p t o r s d i s t r i b u t i o nw i t ha d v a n t a g e so fl o w - c o s t ， s m a l le r r o r , f a s t ，e f f i c i e n c y i th e l p sp e o p l et of u r t h e rs t u d yo no t h e r s u b s t a n c e s ，a n d t h e no nt h eb r a i nf u n c t i o n t h r e e d i m e n s i o n a l r e c o n s t r u c t i o nt e c h n i q u ec a np r o c e s se n o r m o u sd a t ai nh i g hs p e e d ，s ot h a t p e o p l e c a n d i r e c t l y o b s e r v et h eb r a i nn e u r o t r a n s m i t t e r s ，r e c e p t o r s d i s t r i b u t i o na n df a c i l i t a t et h ec o m p r e h e n s i v ea n a l y s i so ft h er e l a t i o n s h i p b e t w e e nn e u r o t r a n s m i t t e r , r e c e p t o rq u a n t i t a t i v ed i s t r i b u t i o na n db r a i n f u s i o n k e yw o r d s n e u r o t r a n s m i t t e r , r e c e p t o r , t i s s u ec h i p ，v i s u a l i z a t i o n ， v t k 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。 作者签名：堑 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：丝导师签名丝4 日期：掣陋月坦日 中南大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 1 9 8 9 年，美国第1 0 1 届国会通过了一项决议，决定将2 0 世纪的最后l o 年 定为“脑的1 0 年”。这是美国国会第一次对一个具体的科学领域做出有效期长达 l o 年的决议。可见开展脑科学研究的重要性。随即，欧美、日本等国家也掀起 了脑科学研究的热潮。步入二十一世纪，对脑科学特别是脑的神经科学的研究成 为人类最重要的科学活动之一，是各国科学家们正在角逐的前沿热点。 随着细胞生物学和分子生物学的发展，脑神经科学家们的沿着还原论1 的路 线将研究已深入到细胞和分子水平，并获得重要成功：神经元学说和突触概念的 确立；神经元信号传输的基本机制；形形式式、分子量大小不同的递质的发现； 以及大部分递质受体的一级结构的确定等等。这些重要发现使人们能够从细胞水 平和细胞内化学变化的角度来认识脑功能。 但是仅仅从神经细胞内、外各种分子的活动特点来了解我们的大脑存在一定 局限性。从分子和神经细胞水平到整体、行为水平还有许多中间层次，包括不同 复杂程度的系统，这些系统的研究可以为微观( 分子、细胞) 和宏观水平( 整体、 行为) 的脑研究架起桥梁阻1 。神经科学的研究目的在于了解神经系统内分子水平、 细胞水平及细胞之间的变化过程，以及这些过程在中枢功能控制系统内的综合作 用。这就决定了神经科学在研究方法上体现出多学科、多层次的综合研究的显著 特点朝。 本文就是基于这个思路，结合神经生物化学与计算机信息技术，在测定脑内 微观神经递质及受体的分子含量的基础上，对庞大实验数据加以利用，建立全脑 神经递质及受体分布的三维模型与相应脑组织切片的三维模型，并对其实现可视 化。使人们能直接观察全脑神经递质及受体分布在三维空间上的分布，方便研究 人员对全脑神经递质、受体等的总体分布及与脑功能关系进行综合分析。 1 2 神经递质与受体概念 在介绍神经递质与受体之前，我们首先来了解一下大脑各神经细胞是如何工 作的。 中南大学硕 学位论文 第一章绪论 l2 l 神经元之间的作用机制 神经系统的功能单位是神经细胞，也称为神经元。一个重约14 千克的成年 人大脑有大约1 0 0 0 亿个神经元。神经元形态与功能多种多样但结构上大致都 可分成细胞体和突起( 轴突和树突) 两部分“1 ，如图1 1 。一个神经元的功能虽 然复杂，但必须同其它神经元相瓦作用，才能完成与某一行为调节有关的信息处 理。但神经元之间在结构上并没有原生质相连，每神经元的轴突末梢仅与其他 神经元的胞体或突起相接触，引起接触的部位称为突触。两个神经兀之州主要是 通过突触来进行细胞问的信息传递。每个神经兀和附近神经元之间存在几千到几 十亿个的突触连接”1 。 图i - 2 神经递质。酰胆碱( a c h ) 与受体的竞触传递过程 中南大学硕士学位论文第一章绪论 那么突触是如何传递信息的呢? 我们从图1 2 可以看到，突触前的囊泡释放 的化学物质充斥在突触间隙中，与突触后膜上的某特定蛋白结合。这些蛋白在接 受到这些化学信号后，将这些信号进一步传递给突触后的细胞。这样就完成了突 触的信息传递。这就好比接力赛跑中的接力棒交接一样，前一名运动员( 突触前 膜) 将接力棒( 化学物质) 交到下一个运动员手中( 突触后膜上的蛋白) 。在这 个过程中，那个接力棒( 化学物质) 叫神经递质，后一个运动员( 突触后膜上的 蛋白) 叫递质受体。神经递质必须通过与受体相结合才能发挥作用。如果受体事 先被药物结合，则递质就很难再与受体相结合，于是递质就不能发挥作用。 1 2 2 神经递质 神经递质( n u r o t r a n s m i t t e r ) 是神经末梢释放的特殊化学物质，它能作用于 支配的神经元或效应细胞膜上的受体，从而完成信息传递功能。 中枢神经系统内存在许多化学物质，但不一定都是神经递质。作为神经递质， 需具备的基本条件是： 1 神经元具有合成神经递质的前体和酶系统，其递质存在于该神经末梢的一 定部位。 2 当神经元兴奋，冲动传递到末梢时，神经递质从囊泡内释放出来，进入突 触间隙。 3 神经递质作用于突触后膜的相应受体，产生突触后电位而发挥兴奋性、抑 制性的生理作用。 4 突触间隙和突触后有该递质的失活酶或其他失活方式，以实现突触传递的 灵活性。 5 用适当的方法使递质直接作用于突触后膜，能引起与刺激神经相同的效 应。 6 有特异的受体激动剂或拮抗剂，能模拟或拮抗其生理效应。 目前已有3 0 多种分子被确定为递质，从大小来分大致有2 类：一类是神经 肽，相对分子质量数百至数千。另一类小分子递质，或称经典递质嘲，相对分子 质量1 0 0 或数百，如和氨基酸类( 谷氨酸、天冬氨酸、y 氨基丁酸、甘氨酸) 、 乙酰胆碱和单胺类递质。每一类神经递质中又包括了许多种递质，并且每一种递 质还分为多个亚型。 在神经生物学研究中，神经细胞中神经递质分析，已经成为探索人类感知和 思维的基础，大脑中枢神经递质的变化直接影响人体的行为和活动，并与多种疾 病有密切关系。近半个世纪来，由于神经递质的发现及深入研究，已为神经系统 疾患或神经功能失调所引起全身功能障碍提供了一大批优良的药物。其中最突出 3 中南大学硕士学位论文第一章绪论 的例子就是帕金森( p a r k i n s o n ) 病n 1 。 1 2 3 受体 受体的概念1 起源于2 0 世纪初。l a n g l e y 分别于1 8 7 8 年和1 9 0 3 年在研究阿 托品和匹罗卡品对猫唾液腺，以及箭毒对骨骼肌的作用中发现，这些药物不是通 过作用于神经、腺体或肌肉，而是通过作用于生物体内的某些“接受物质”而起效 的。 大多数药物必须先与细胞膜上或细胞内的某些特定分子结合，才能发挥效 应，这些特定分子被称为受体( r e c e p t o r ) ，它是构成细胞的物质成份，有的位于 细胞膜，有的位于胞浆和细胞核，大多数是某些蛋白质性质的大分子，具有严格 的立体专一性，能识别和结合特异分子( 配体) 的位点，此位点即受体分子或受 点。与受体相比，生物活性物质的分子量往往很小，故通称为配体。配体包括神 经递质、激素、自身调节物质或药物等。 受体主要分为以下几种类型，即神经递质类受体( 如乙酰胆碱、去甲肾上腺 素等儿茶酚胺类) 、激素类受体( 如胰岛素、甲状腺素、胰高血糖素、催乳素、 肾上腺皮质激素类等) ，自身调节物质受体( 如前列腺素、组胺、5 - h t 等) 以及 中枢神经系统中的某些受体( 如吗啡、苯二氮卓、g a b a 受体等) 。 受体的性质如下： 1 灵敏性：只要很低的药物浓度就能产生显著的效应。 2 选择性：不同化学异构体的反应可以完全不同，激动剂的选择性强于阻断 剂。 3 专一性：同一类型的激动剂与同一类型的受体结合时产生的效应类似。例 如普萘洛尔为p 受体阻断剂，它阻断肾上腺能p 受体而起到降压、抗心绞痛、 抗心律失常的作用。 神经细胞的接受装置树突上的受体，假如没有足够的活性，信息将无法 传递下去，那么不论大脑中有多少游离的神经递质都是徒劳的。细胞膜上的受体 数目或反应性是可以发生变化的，一般来说，受体数目的变化与其周围生物活性 物质的浓度或作用之间呈负相关。所谓受体病，是由于受体的性质或数目发生了 变化，使人体内的一些生物活性物质不能产生应有的作用，从而出现一定的病理 过程。受体缺陷能导致诸多的麻烦。例如，阿尔茨默氏病患者的大脑中，就存在 乙酰胆碱受体数量及功能的缺陷。 4 中南大学硕士学位论文第一章绪论 1 3 论文研究背景及主要工作 1 3 1 论文研究背景 脑研究对认识和防治人类神经和精神疾患至关重要。我国的精神病人就有一 千多万，造成众多家庭不幸和严重社会问题。美国有五千万人因脑受侵袭罹患疾 病或致残，每年用于治疗和康复的费用高达3 0 5 0 亿美元嘲。而脑中枢神经递质 是调节机体生理活动的重要物质基础，测定脑组织中神经递质的含量，可为多种 疾病的诊断和治疗以及精神疾病的机理研究提供依据。 脑是人体结构最复杂，功能最强大的器官，为了对这个人体的“司令部”有更 深刻的认识，千年来人们用多种不同方式研究它。近年来功能磁共振、c t 、p e t ( 正电子发射断层成像) 、诱发电位以及分子生物学、神经生物学等多种方法被 应用在脑的研究上。当前的研究已经从解剖结构上对脑有了一个基本的认识，对 大脑的各个组成部分及脑内神经核团的位置n 及结构已经有了比较清楚的认识。 功能上的研究也取得了一些成果n ，例如帕金森病、老年痴呆症等很多危害人类 健康的脑部疾病及药物依赖、毒品成瘾等进行了研究，但仍然存在很多未知但急 需解决的问题。要想从更深入的角度上分析其产生的机理，必须从整体角度上对 脑进行研究。当前对脑的研究多局限在某一部分，对某一点做病理切片，测定其 中某一种物质的性状。由于对大脑整体的研究花费大、用时长，所以对脑部神经 递质、受体等的总体分布及与功能关系至今尚缺乏系统和深入的研究。本文就是 在这种背景下，开展实验，建立模型，为分析脑神经递质与受体的总体分布及与 脑功能系统之间的关系打下基础。 1 3 2 论文研究意义 神经递质与受体是调节机体生理活动的重要物质基础，测量脑神经系统中这 些神经递质与受体的含量可以为多种疾病的诊断和治疗以及精神疾病的机理研 究提供依据，在神经系统生理、病理以及毒理学研究中有重要意义n 幻n 3 1 。同时， 通过分析脑内受体含量的分布，对研究受体与疾病关系、药物与受体关系提供了 新的帮助。 随着神经科学的迅猛发展，近年来，已经确定神经递质和受体的种类已超过 了一百种，且数目在不断增加，待处理的数据量越来越大，使得对于科学实验数 据的后处理和可视化更是成为迫切需要解决的问题。对所采集到的实验数据建模 并实现可视化具有多方面的重要意义。它可以大大加快数据的处理速度，使产生 的庞大数据得到有效的利用；它可以在人与数据之间实现图像通信，使人们观察 到传统的科学实验中的现象，成为发现和理解科学实验数据内涵的有力工具。 5 中南大学硕士学位论文第一章绪论 总之，本文由整到分，精确测量脑内每一处神经递质与受体的含量，再由分 到整，建立模型，显示脑神经递质与受体含量在脑内的三维空间分布模型的方法， 在微观( 分子、细胞) 水平和宏观水平( 整体、行为) 的脑研究之间架起桥梁， 为深入脑神经递质与受体的总体分布及与脑功能系统之间的关系提供了一个新 的思路。 1 3 3 论文主要工作 本项目采用“微分法”，将大脑分解成小块，并制成组织芯片，用免疫组化、 原位杂交、激光拉曼光谱、太赫兹技术等方法测定脑中各种神经递质、受体的含 量。应用三维可视化技术显示各种物质在脑中的三维分布与脑的模型。为人们进 步研究脑内其它物质的分布状况，进而研究脑功能和物质分布之间关系提供帮 助，进而研究各解剖位置与功能的对应关系。分析大量的标本，我们将来还可以 得到统计学的数据。 以下是实现整个过程的技术线路图： 将脑组织切块、包埋并记录坐标 上 l 将脑组织蜡块制成组织芯片 上 用不同方法测定组织芯片中不同物质的含量 | + 免疫组化原位杂交激光拉曼光谱太赫兹 li 建立脑神经递质与受体含量三维分布模型 | - 上 重建脑的模型 图l 一3 技术线路图 1 将大脑切成若干个5 m m x 5 m m x 5 m m 的小块，每一小块用蜡包埋，制成 脑组织蜡块。建立三维坐标系，标记每一块脑组织在这个坐标系统的空间位置( x ， y ，z ) 。 2 对脑组织蜡块取样制成组织芯片。 3 用免疫组化、原位杂交、激光拉曼光谱、太赫兹等技术测定其神经递质、 6 中南大学硕士学位论文第一章绪论 受体的含量( 此项研究由合作单位承担) 。 4 构建脑组织小块的三维空间模型，建立其神经递质与受体含量与颜色的 映射关系，应用v c + + 、( 软件技术进行可视化。在这个模型中，我们不仅可 以观察到各物质的空间位置分布，还可以观察出空间位置中该物质的浓度分布情 况。 5 根据实验过程所摄脑切片图，可视化脑的模型，与脑神经递质与受体含 量三维分布模型进行空间上的对比。 1 3 4 论文的特色与创新之处 在本论文中，我们采用了由整到分，再由分到整的新思路来研究脑内各物质 与脑的功能系统之间的关系。 提供了一种新的解决问题的方法一组织芯片方法，分析脑内整体的神经递 质与受体的分布状况。此方法快速、高效，能够降低成本、减少实验误差。 建立了脑内神经递质与受体含量三维分布模型与脑模型，为功能研究打下基 础。 1 4 论文的内容与结构 论文各章的内容简介如下： 第一章介绍了本文的选题背景、主要研究工作以及神经科学相关知识。 第二章主要叙述了前期基础实验准备所采用的实验方法，实验过程，并指出 了各步骤需要注意的相关问题。 第三章主要介绍了目前三维数据场建模与可视化的方法。分别采用了体元投 射法和光线投射法方法对脑神经递质与受体含量三维分布与脑切片图像进行三 维重建。 第四章主要讲述了怎样利用v c + + 与v r k 开发环境实现脑神经递质与受体 含量的三维分布模型建立与可视化。 第五章为全文的一个总结，并提出了以后研究的目标。 1 5 论文其他说明 整个项目主要分为三个部分： 一、实验数据的采集，包括脑组织各小块坐标的标定和与坐标对应的各脑组 织小块的神经递质与受体含量值的测定。 7 中南大学硕士学位论文第一章绪论 二、利用三维重建技术，对所采集的实验数据进行三维建模并可视化。 三、通过三维模型观察实验数据，研究脑功能和物质分布之间的关系。 由于前期基础实验数据采集所需工作量大。我们与南华大学开展合作，各脑 组织小块的神经递质与受体含量的测定由南华大学的法医研究与鉴定中心完 成。本文主要实现前两部分的工作。 到目前为止，我们已对两个大脑切割完毕，实现脑组织小块的坐标数据的采 集，并制成组织芯片备用。而神经递质与受体含量的测定工作，将在今后很长一 段时间内才能完成。本文根据坐标数据已经实现三维建模及可视化，等神经递质 与受体含量值测定好以后，我们便能看到真实的分布图，便能进行后续的脑功能 和物质分布之间的关系研究。但这已不属于本文所讨论的范围。 8 中南大学硕士学位论文 第二章实验数据准备 第二章实验数据准备 奉实验阶段，采用“微分法”，由整化零，将a 脑切割成5 m m x s m m x 5 m m 小 块并制成组织芯片，用免疫组化、原位杂交、激光拉曼光谱、太赫兹技术等方 法测定脑中各种神经递质、受体的古量。 21 标本制作与坐标确定 2 1 1 选材及实验工具制作 选取经甲醛溶液固定的肉眼观察无病变的成人大脑标本用于本实验。脑组织 包围有三层膜，山外向内为硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。脑膜组织厚而坚韧，切割 困难。囚此在制作脑组织切块时，需剥去三层脑膜及血管。 目前市场，k 没有适合的仪器能够按实验要求切割脑组织，我们与长沙翔福教 学仪器设备有限公司合作，特制了一个脑组织切割设备。如图2 1 ，2 - 2 。该设备 图2 - 1 脑组织切割设备图2 - 2 带底座的调节器 由两部分组成：上半部分是一个长2 0 0 m m ，宽1 5 0 m m ，高2 0 0 r a m 有机玻璃盒， 用柬置放大脑；下半部分是带底座的调节器，用来调节有机玻璃盒底板。每切割 一层大脑，旋转调节器使底板上升一个层厚。调节器每旋转一圈，底座上升为 2 r a m ，为实现底座上升5 m m ，则需旋转25 圈。 2 12 脑的固定与切片 把大脑放入切片机的有机玻璃盒中，调节有机玻璃盒底座，使大脑顶部刚好 与有机玻璃盒顶齐平。琼脂、凝胶、淀粉与水以一定比例混合，充分加热成为黏 胶状液体缓缓倒入盒中，将整个脑组织包埋住，然后等待其冷却。为了使混合 液充分凝固，通常需等待4 5 个小时，才能切片。若放入冰箱冷藏室，o f ) j l 快冷 中南大学硕士学位论文 第一章实验数据准备 却速度且能保证凝崮质量。混合液的各物质比例是我们通过多次实验确定的，目 的是使混合液凝固后的密度、韧性接近与脑组织的密度与韧性。这样做的好处是， 在大脑切片过程中，脑组织受力均匀，减少切割过程中产生的拉伸变形。 大脑固定好后，用调节器将底座调高5 m m ，使盒中物质高出有机玻璃盒边缘 5 n l t n ，再用特制刀片，沿有机玻璃盒边缘切割一层大脑，记录其层数t ，作为z 轴坐标值。然后再调高底座，如此反复，直至腑组织切割完毕。f 面的图片为随 机抽取的两层切割的结果照片。 脚2 - 5 底部有坐标表的切块槽 图2 - 6 坐标袁 度槽里。刻度槽内缘与有机玻璃盒内缘同等尺寸，槽高5 m m ，槽的边缘刻有5 m m 中南大学硕士学位论文第二章实验数据准备 宽的刻度。实验人员依据刻度，将大脑切片进一步切割成同等大小的小方块。由 于数据量大，实验中，我们要求每切好一个脑组织小块，就准确读取它的坐标。 但如果每切好一个小块，就通过槽的边缘刻度读取坐标，不仅费时费眼，而且还 容易出错。为了方便实验人员在切块的过程中，准确而方便地读取每个脑组织小 块的坐标值，特设计一个与有机玻璃盒内边缘同等尺度的表格，置于刻度槽底部。 见图2 5 。该表格行、列每间隔5 m m 作一条直线，得到一行数为3 0 ，列数为4 0 的矩阵。依次在表格内用黑、红两色标识每个方格所对应的x 坐标与y 坐标。如 图2 6 ，每个脑组织小块所在方格的位置一目了然，可直接读取。 在设计上表时，最先考虑到的是以有机玻璃盒内边缘的左上角为原点( 见图 2 7 的浅灰色圆点) ，横向为y 坐标，纵向为x 坐标，建立坐标系。但以此种方 图2 - 7 坐标系 式，我们所读取的脑组织小块的中心坐标有一半将出现小数点，比如r = i ，c = i 脑组织小块的中心点坐标为( 2 5 ，2 5 ) ，对我们在蜡块上记录坐标造成了很大的 不便。因此，我们将原点移到表格左上顶点的( 2 5 ，2 5 ) 处，建立新的坐标 系。这样极大地方便了我们读取坐标，并在蜡块盒记录坐标的工作。每切完一层 大脑，除了在脑组织蜡块上标识它的坐标外，再另复制一份表格，用打勾的方式 记录它的坐标值，方便后期数据录入，如图2 8 。 由于大脑的形状为不规则球体，且大脑中央存在脑室空隙，因此大脑切片形 状也必然极不规则。所以在实际实验中，我们得到的脑组织小块不可能全是 5 m m x 5 m m x 5 m m 立方体，尤其是位于脑切片边缘部分。因此，在记录脑组织小 块的位置时，我们需要做近似处理：对于大脑边缘的切块，如果切块的体积大于 或等于所在方格体积( 5 x 5 x 5 删一) 的1 2 ，我们将它近视看成一个完整的立方 体，记录它的坐标值，如果切块的体积小于所在方格体积( 5 x 5 x 5 m m 3 ) 的l 2 ， 中南大学硕十学位论文 第一章虫验数据准备 我们便忽略它 囤2 - 8 第2 层脑切片的坐标记录表 2 14 制作脑组织蜡块 脑组织切块后，随即将其制各成蜡块。将织小块用镊子夹入装宵蜡液的金属 包埋容器中。实验室所用石蜡熔点通常为5 6 5 8 c 或6 0 6 2 两种，町根据季 节及操作环境温度来选用。制作蜡液时，石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以 免因含杂质而影响组织芯片的制作。趁蜡液末凝固时，摆好位置，最于包埋容器 中央。待蜡渡表层凝固即迅速放入冷水中冷却，做成含有组织块的蜡块。将其装 入蜡块盒中，在盒面标记此组织块对应的x ，y ，z 坐标，以各后用。 2 2 组织芯片的制作 22 1 组织芯片的概念 组织芯片( t i s s u ec h i p ) ”4 1 足将数十至上千个小组织整齐地排放在一张载玻 片上而制成的组织切片。它分为多组织片( m u l t i t i s s u es e c t i o n ) ，组织阵列( t i s n ” a r r a y ，最多可含6 0 个直径2 m m 的组织) 和组织微阵列( m i g w o t i s s u ea r r a y ， m t a ，最多可含1 0 0 0 个直径o6 m m 的组织) 。 组织芯片技术旨先由k o n o n e n “”等于1 9 9 8 年研制出来，是近年来基因芯片 ( d n a 芯片) 技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片样，属 于一种特殊生物芯片技术。组织芯片技术被认为是在生理学、病理学和细胞生物 学等方面的一个革命性的技术创新。其主要优点有： 1 体积小，信息含量高，可根据不同需要进行组合和设计。 2 可同时检测大量组织，提高了工作效率，减少了时间和资盒的消耗。 3 由于实验是次完成，实验条件相同，大大降低了实验误差，使其对比性 和可重复性增强。 中南大学硕士学位论文第二章实验数据准备 组织芯片技术克服了传统病理学方法技术中存在的技术缺陷，使研究人员第 一次有可能利用成百甚至上千份正常或处于疾病状态及疾病不同发展阶段的自 然病理生理状态下的组织标本，同时进行某一个或多个特定的基因，或与其相关 的表达产物的研究，可以上百倍地提高病理组织学研究的效率并节约了实验材料 和试剂。组织芯片技术可以与其他很多常规技术，如免疫组化( i h c ) 、核酸原 位杂交( i s h ) 、荧光核酸原位杂交( f i s h ) 、原位p c r 等结合应用，具有广泛 的应用前景n 叼。这也是神经递质与受体含量测定的技术基础。 2 2 2 制作组织芯片 组织芯片的制作常利用手工或半自动组织芯片制作仪。组织芯片仪目前向两 个方向发展：一、更加昂贵和复杂化的全自动组织芯片仪；二、简单实用、易于 操作的手工组织芯片仪。 由于经费限制，本实验采用了国产简易组织芯片制作仪制备组织芯片。该组 织芯片仪的主要组成： 1 打孔采样装置：打孔采样装置对供体组织蜡块进行采样，同时也可对受体 蜡块进行打孔，其孔径与采样直径相同，两者均可精确定位。目前常用的打孔针 有直径有0 6 m m 、1 0 m m 、1 5 m m 和2 0 m m 四种，打洞的深度一般为3 - 一4 m m ，也 可根据需要调节深度。每一种打孔针中心都有一根配套的实心针，它能将采集到 的组织蜡芯推出。 2 定位装置：定位装置可使穿刺针或受体蜡块线性移动，制备出孔径、孔距、 孔深完全相同的组织微阵列蜡块。用它能准确地控制打孔针前后左右移动的距 离，从而使组织芯能整齐地排列在组织芯片蜡块中。 组织芯片制作方法： 1 制作空白蜡块( 即受体蜡块r e c i p i e n t ) ：根据需要可选用大小不同的模具， 将塑料架放在模具上，将融化的石蜡倒入模具，待冷却至室温后，将整个模具放 入一2 0 冰箱6 m i n ，然后很容易将与塑料架凝固在一起的蜡块从模具中取出。常 用的受体蜡块的大小一般为3 5 m m x 2 5 m m x 5 m m ，这种蜡块足以做直径2 m m 组织 芯6 0 个点。也可根据具体需要自行设计蜡块大小。 2 用组织芯片制作机在受体蜡块上打洞。本实验采用的打洞针的直径为 2 0 r a m ，打洞的深度一般为3 m m 。根据预取组织芯的个数确定受体蜡块上打洞个 数及第一个洞的位置。具体操作步骤：调节深度控制杆，确定打洞的深度为3 m m ， 下推持针架，使打洞针进入受体蜡块3 m m 后，右旋针柄，使蜡芯底部截断，再上 推持针架，打洞针退出受体蜡块，再将针芯按下，将蜡芯推出，用镊子将其夹至 废物盒内，至此，第一个洞打成。用距离调节器准确地将打洞针前后或左右移动 1 3 中南大学硕士学位论文第二章实验数据准备 适当的距离，再重复上述的操作方法，根据你所需的数目，在受体蜡块打出整齐 的洞。 3 获取供体蜡块组织芯：用另一打洞针( 其内径等于前一打洞针的外径) ， 在脑组织蜡块的标记部位打洞采集组织芯，其长度比打洞的深度短0 1 n 1 1 n 左右。 采集组织芯的方法与在受体蜡块上打洞相同。组织芯推出后，直接插入或用镊子 小心夹取插入受体蜡块的空洞内，用普通载玻片将组织芯向下按平。如此反复即 可将数十至上千的组织芯整齐地安插于受体蜡块中。最后，用载玻片叠放在一起 将所有组织芯按平，使制成的组织芯片蜡块表面平坦光滑。 4 将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放人6 0 c 烤箱内1 小时，使 组织芯与受体腊块的蜡融为一体，但不可融化过度，否则造成组织芯移位，出现 紊乱。轻轻地从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却3 0 m i n ， 再放入冰箱内冷冻6 m i n 。之后，将组织芯片蜡块从模具中取出，至此，组织芯片 蜡块便制做成功。可进行切片或放人4 c 冰箱内保存备用。 2 3 神经递质与受体含量的测定 神经递质的浓度分布和浓度变化与人体生理功能直接相关，如何对其进行准 确的分析，是探索人类感知和思维的基础，同时也是诊断和预防治疗脑神经疾病 的基础。因此测定各神经递质与受体在脑内的整体分布，是对脑部神经递质、受 体等的总体分布及与功能关系研究的一个基础。 目前测定神经递质、受体等含量的方法主要有免疫组化、原位杂交法、激光 拉曼光谱等，并且已经有文献报道。例如：邱红霞等对大鼠大脑皮质与纹状显微 拉曼光谱的研究n ，用s p e x 1 4 2 8 显微激光拉曼光谱仪测定正常大鼠大脑皮质和 纹状体的激光拉曼光谱的变化，发现正常大鼠大脑皮质和纹状体的激光拉曼光谱 在模式上大同小异，包含有十分丰富的生物大分子结构信息。郑虹等研究了氨基 丁酸( t - - a m i n o b u t y n r i ca c i d ，g a b a ) 在前庭束梢神经传递中的作用。用大鼠内 耳石蜡切片，地高辛标记的g a b a a a 2 c d n a 探针( 5 4 9 个碱基) ，抗地高碱性磷 酸酶检测系统，b mp u r p l e a ps u b s t r a t e 显色系统，原位杂交( i 1 1 s i t uh y b r i d i z a t i o n ) 检测大鼠前庭末梢g a b a a 2 m r n a 受体的表达n 8 】。 由于条件限制，此项研究由合作单位承担，下面只简单介绍各种测量神经递 质、受体等含量的方法。 1 免疫组化 免疫组化是免疫组织化学( i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ) 的简称，它是利用抗原与 抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂( 荧光素、酶、金属 1 4 中南大学硕士学位论文 第二章实验数据准备 离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原( 多肽和蛋白质) ，对其进行定位、 定性及定量的研究，称为免疫组织化学。根据标记物的不同分为免疫荧光法，免 疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力 为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原( 抗体) 在细胞或亚 细胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用n 州制。 2 原位杂交术 原位杂交( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 乜妇是应用特定物质( 如生物素或地高辛) 标记的己知探针与细胞待测核酸，按照碱基配对原则进行特异性结合，形成杂交 体。杂交后的信号依靠免疫组织化学原理放大、显色，在光镜或电镜下观察在研 究d n a 分子复制原理的基础上发展起来的一种技术。 其基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，能过氢键结合，形成 d n a d n a 、d n a r n a 或r n a r n a 双键分子的特点，应用带有标记的( 有放 射性同位素，如3 h 、3 5 s 、3 2 p 、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质) d a n 或r n a 片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸( 砌峨或d n a ) 片 段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 m r n a 或d a n 的存在与定位。用原位杂交术，可在原位研究细胞合成某种多肽 或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水来探 讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重 要手段2 2 。衢1 。 3 激光拉曼光谱 激光技术的兴起使拉曼光谱成为激光分析中最活跃的研究领域之一，已被广 泛地用于物质成分的分析和分子结构的鉴定嘲。当用波长比试样粒径小得多的单 色光照射气体、液体或透明试样时，大部分的光会暗原来的发现透射，而一小部 分则按不同的角度散射开来，产生散射光。在垂直方向观察时，除了与原入射光 有相同频率的瑞利散射外，还有一系列对称分布着若干条很弱的与入射光频率发 生位移的拉曼谱线，这种现象称为拉曼效应1 。由于拉曼谱线的数目，位移的大 小，谱线的长度直接与试样分子振动或转动能级有关。因此，与红外吸收光谱类 似，对拉曼光谱的研究，也可以得到有关分子振动或转动的信息。目前拉曼光谱 分析技术已广泛应用于物质的鉴定，分子结构的研究。 4 太赫兹技术 太赫兹辐射通常指频率在1 - 一1 0 t h z 区间的电磁辐射，其波段位于微波和红 外光之间，是人类尚未完全认识并很好加以利用的最后一个波( 光) 谱区间【2 引。 物质的t h z 光谱( 包括发射、反射和透射) 包含有丰富的物理和化学信息，研究 有关物质在这一波段的光谱响应，探索其结构性质及其所揭示的新的物理内容已 1 5 中南大学硕十学位论文 第一章实验数据准备 成为一个新的前沿领域。 太赫兹波的光子能量低。频率为1 t h z 的电磁波的光子能量只有大约4 m e v ， 约为x 射线光子能量的1 1 0 6 ，因此不会对生物组织产生有害的电离，适合于对生 物组织进行活体检查。如利用太赫兹波域谱技术研究酶的特性，进行d n a 鉴别 等。 a 赫兹波在生物技术和信息技术领域的虚用太赫兹波在这两个领域的应用 能够带动高水平的学科交叉研究，无论在科学问题的解决，还足发展新型应用技 术，具有广阔的前景。在生物技术方面，不同生物分子的a 赫兹光谱表征、脱氧 核糖核酸( d n a ) 和蛋白质的无标记检测、分子反应的测量等方面，已经取得 了一些鼓舞人心的进展，吸引了越来越多的注意。 2 4 实验方法评述 当前对脑的研究多局限在某一部分，对某一点做病理切片，测定其中某一种 物质的性状。传统的病理切片每次只能测定一个点，要对整脑进行研究，工作量 非常巨大且误差大。如果我们用传统的方法将脑组织小块制作成病理切片，然 后测定其中我们感兴趣的物质神经递质或受体的含量，那么，要得到某一种 物质在脑内分布含量，则需要进行上万次的实验。 组织芯片可以一次测定多个组织，且达到同样的效果，因此，我们采用组织 芯 的方法来研究脑内物质的分布。如图2 - 9 。我们在每个脑组织小块中心取一 点组织代表该脑组织小块，将其制成组织芯片，实现快速、高效的测试。组织芯 片中的每点的测试值即为它代表的脑组织小块的物质含量。 图2 - 9 对三维脑组织取芯制成二堆组织芯片 虽然目前柬看，我们用直径为2 m m ，深度为3 m m 的小芯柱代表 5 m m s m m x 5 m m 的组织来制作组织芯片进行测试，它牺牲了一定的精确性。但 是我们的实验数据主要为将来统计分析服务，这个误差还是可以接受。另外，如 果将来经费充足仪器设备改进，我们将大脑切割成2 m m x 2 m m x 2 m m 小块，就 中南大学硕士学位论文第二章实验数据准备 不会有这样的误差出现了。 2 5 本章小结 本章详细地介绍了各个实验步骤的具体过程：从脑的固定开始、到脑组织切 片、切块、再包埋、最后制成组织芯片蜡块。对每一步骤中所应采用的方法和操 作过程中所应注意事项，以及如何建立坐标系，读取脑组织小块的空间位置都做 了详尽的说明。由于不同种类的神经递质与受体，需要用不同的测定技术来测定， 最后本章简单介绍了几种常用的测定神经递质、受体等含量的方法。 1 7 中南大学硕士学位论文第三章三维模型建立及可视化 第三章三维模型建立及可视化 在利用计算机对客观事物进行分析和研究时，需要建立相应的模型来表示实 际或抽象的对象或现象，这个过程称之为建模汹】。模型是客观事物的抽象表示， 它描述对象的结构、属性、变化规律或各个组成部分之间的关系。通常对客观事 物进行研究时，所得到科学数据蕴藏着丰富细腻的物体结构，但其本身并不包含 任何几何信息，它只是某种属性的空间采样。因此，只有通过重建现实世界中物 体的三维几何模型，才能有效地对物体的几何信息和属性信息进行定性或定量的 分析，才能识别和区别体数据中的各种物体m 1 。数据模型的可视化过程，即是将 处理的数据转变为用几何描述，建立起描述数据的三维几何模型。 在建立科学数据的三维几何模型之前，需要对所掌握的数据进行分析，了解 它在三维空间数据场中所属的数据类型，分析用何种方法去建立模型，用何种手 段将其可视化。所谓可视化( v i s u a l i z a t i o n ) ，牛津英语词典解释为“构成头脑 情景的能力或过程，或不可直接察觉的某种东西的视觉”。此术语亦指使本来看 不见的东西成为可见图像的过程啪1 。可视化的实质是，运用计算机图形学和图像 处理技术将科学计算过程中的数据以及计算结果的数据转换为图像，在屏幕上显 示出来并进行交互处理。它涉及到三维数据的可视化，计算过程的交互控制和引 导，图形生成和图像处理的并行算法，面向图形的程序设计环境，图像传输的宽 带网络和协议以及虚拟现实技术等。而其核心则是三维空间数据场的可视化。 3 1 三维空间数据场的数据类型 在三维空间数据场中，数据点的数据类型包含两层含义：一是数据本身的类 型，二是数据分布及连接关系的类型。 3 1 1 数据本身的类型 数据本身的类型分别有标量、向量和张量。 1 标量是指可用以一个不依赖于坐标系的数字表示其性质的量。例如：密度、 质量、温度等。标量最大的特征是没有方向。在某一个坐标系中，一个标量可以 表示为f ( x , y ，z ) ，而在一个新的坐标系中，该标量可以表示为f ( 一，y ，z ) 。由于 标量的数值不依赖于坐标系，于是有 厂( 工，y ，z ) = f ( x ，j ，z t ) ( 3 1 ) 这样就给出了标量的另一个定义：若对每一个直交坐标系o x y z 有一个量，它在 1 8 中南大学硕士学位论文第三章三维模型建立及可视化 坐标变换时满足( 3 1 ) 式，即保持其值不变，则此量定义了一个标量。 2 向量是指需要用不依赖于坐标系的数字及方向表征其性质的量。例如，位 移、速度、加速度等。设x 表示某一向量。而，x 2 , 而与五，x 2 ，x 3 分别是x 在旧 坐标系和新坐标系中的投影，那么，_ ，x 2 ，而和五，x 2 ，x 3 之间有如下关系： 或者简写为a 一“扩a 。这样就给出了向量的另一种定义：对每一个直交坐标系 o x y z 来说有三个量