（生物医学工程专业论文）基于在片延伸的dna测序技术研究.pdf

东南大学硕士学位论文 体系用于在片延伸的差异，结果表明逐次加入具有相同核苷两种核苷酸( 荧光标记的双脱氧 核营酸和普通脱氧核苷酸) 的混合物作为延伸反应的核苷酸体系，可以满足在片多碱基延伸 测序的要求。比较了荧光标记的双脱氧核苷酸和普通脱氧核苷酸的浓度比例对在片延伸信号 的影响，实验表明当固定荧光标记的双脱氧核苷酸的浓度不变，随着普通脱氧核苷酸浓度的 不断增高，荧光信号强度随之不断下降。 3 基于在片延伸的d n a 测序技术研究： 在前两项研究的基础上，运用在片延伸技术进行d n a 序列的测定。在单步多碱基测序 实验中运用在片延伸的方法，准确地测定了寡核苷酸探针最长4 个碱基的序列信息，验证 了基于在片延伸d n a 测序技术的可行性。在多步多碱基测序实验中，运用在片延伸的方法。 准确地测定了寡核苷酸探针最长l o 个碱基的序列信息。可以相信，对在片延伸技术的一些 改进可以延长该方法的认读长度，最终使基于在片延伸的d n a 测序技术成为一项在价格、 认读长度和通量上都具有优势的测序技术。 4 荧光信号的淬灭方法的探索： 对d n a 微阵列上荧光信号的淬灭有助于延长本测序方法认读长度，为此我们针对荧光 的淬灭做了一些探索性研究。我们采用过硫酸氨作为淬灭荆，实验证明，过硫酸氨对c y 3 ， c y 5 ，t i u m a 三种荧光分子均有较好的淬灭作用，但同时对d n a 也有一定的损伤。 关键字：测序基因芯片在片延伸淬灭 1 v 英文摘要( a b s t r a c t ) 英文摘要( a b s t r a c t ) t i t l e ：d n as e q u e n c i n gb a s e do i lo n - c h i pn u c l e o t i d ee x t e n s i o nm e t h o d c a n d i d a t em a s t e r ：t uj i n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rl uz u h o n g n a m eo ft h eu n i v e r s i t y ：s o u t h e a s tu n i v e r s i t y r a p i da n de f f i c i e n ts e q u e n c i n gi so n eo ft h em a j o rc m l l e n g e so fg e n o m es c i e n c et o d a y w i t ht h e c o m p l e t i o no ft h eh u m a ng e n o m ap r o j e c t , g e t t i n gt h eg e n o m es e q u e n c ef o ra l li n d i v i d u a l s b e c o m e so n eo ft h ec o l et a s k so ff i f es c i e n c e t i l eg e n o m as c q eo fe a c hi n d i v i d u a lh e l p su s f u l l yu n d e r s t a n dg e n o m ev a r i a t i o n , g e n e t i cs u s c e p t i b i l i t yt od i s e a s e ，a n dp h a r m a c o g e n o m i c so f d r u gr e s p o n s e a n di ti so n eo ft h ec o r ee n a b l i n gg o a l sf o rt h e x c5 1 0y e a r s p r i o rt ot h em i d - 1 9 7 0 sd n ac o u l dn o tb ed i r e c t l ys e q i l e n c e d t h ef i r s tt w od n as e q u e n c i n g i n e t l i o d s ，m a x a m - g i l b e r tt h e m i c a lc l e a v a g el m t h o da n dt h es a n g e rc h a i n t e r m i n a t i o nm e t h o d , w e r eb o t hd e v e l o p e di n1 9 7 7 e n t e r i n g1 9 8 0 s t h eu s i n ga n dc o m m e r c i a l i z a t i o no ff o u rc o l o r f l u o r e s c e n c e l a b e l e dp r i m e r sa n df l u o r e s c e n c e l a b e l e dd i d e o x y - t e r m i n a t o l sl e a d e dt h es e q u e n c i n g t e c h n o l o g yi n t oa u t o m a t i o nt i m e a f t e rd e v e l o p i n gf o rn e a r l y3 0y e a r s ，t h e r ea r cag r e a tv m e t yo f s e q u e n c i n gm e t h o d s c o s t , r e a dl e n g t h , a n dt h r o u g h p u ta r er e m a i n i n gt h et h r e em a j o rs t a n d a r d sf o r e v a l u a t i n gas e q u e n c i n gm e t h o d h i g ht h r o u g h p u ti st h em a r k e dm e r i to fd n am i c r o a r r a y s a n d w ed e s i g n e da n dd e v e l o pan e wd n as e q u e n c i n gm e t h o db a s e do na r r a yp r i m e re x t e n s i o n t e c h n o l o g yb yt h i sm e r i t ( c h i n ap a t e n la p p l i c a t i o nn u m b e r , 2 0 0 6 1 0 0 9 6 3 7 2 4 ) b yt h i sm e t h o d p r i f l i e r sa r eh y b r i d i z e dw i t ht a r g e ts e q u e n c e sw h i c hw e r ei m m o b i l i z e do nt h ec h i pp r e v i o u s l y , a n d l e a dt h eo n - c h i pe x t e n s i o n d u r i n gt h ee x t e n s i o n , s o n i co ft h ep r i m e r sa r et e r m i n a t e db yt h e f l u o r e s c e n c e l a b e l e d d i d e o x y - t e r m i n a t o r s ，a n d o t h e r sa l ee x t e n d e dw i t ht h ec o n l m o f l d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e sf o rt h ef o l l o w i n ge x t e n s i o ns t e p t h ef l u o r e s c e n c es i g n a li s o b t a i n e db yt h ea w a ys e a m i e r t h em a i nc o n t e n t sa f ea sf o l l o w s 1 p r e p a r a t i o na n do p t i m i z a t i o no f d n am i c r o a r r a y sf o ro n - c h i ps e q u e n c i n g g l u t a r a l d e h y d e d e r i v e d g l a s ss l i d e s a n d a g a r o s e f i l m c o a t e d g l a s ss l i d e s w e r e p r e p a r e d f o r c o m p a r i n g t h e r e s u l t ss h o w e d t h a t a g a r o s e f i l m c o a t e ds l i d e sh a d t h e h i g h e r e x t e n s i o ne f f i c i e n c y , a n dt h eh i g h e rf l u o r e s c e n c eb a c k g r o u n ds i m u l t a n e i t y t h r e eo u g o 如c l e o t i d e sw i t hd i f f e r e n tl e n g t h a r mm o l e c u l e sw e r ec h e m i c a l l ys y n t h e s i z e da n di m m o b i l i z e do nt h es l i d e sf o rc o m p a r i n gt h e e x t e n s i o ne f f i c i e n c y a n d l er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo l i g o n n c l e o d d ew i t hl o n g e ra i mm o l e c u l e h a dt h eb e t t e re x t e n s i o ne f f i c i e n c y 2 o p t i m i z a t i o no f o n - c h i pe x t e n s i o ns y s t e m v 东南大学硕士学位论文 1 1 e x i s t i n ge x t e n s i o ns y s t e mw a sd e v e l o p e df o rs i n g l eb a s ee x t e n s i o n , a n dd i du o tm e e tt h e n e e d so fo w c h i pn u c l e o t i d e - b a s ee x t e n s i o nm e t h o d s o m ei m p r o v e m e n t sw e r ed o n et ot h i ss y s t e m 1 1 e x t e n s i o ne f f i c i e n c i e so ft h r e ed i f f e r e n td n ap o l y m e r a s e s ，t a i ld n ap o l y m e r a s e ， t h e r m i n a t o rd n ap o l y m e r a s ea n dk l e n o wd n ap o l y m e r a s ew e r ec o m p a r e d 1 1 l ee x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e dt h a tt h e r m i n a t o rd n a1 3 0 l y l i i c f d g eh a dt h eb e s te x t e n s i o ne f f i c i e n c ya n dg o o d f i d e l i t y 1 1 m i x t u r eo ff l u o r e s c e n c e 1 a b e l e dd i d e o x y - t e n n i n a t o r sa n dc o r n n o nd e o x y n n c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e sw i t ht h es a m eb a s ew e r eu s e da st h en u c l e o t i d es y s t e mi ne a c he x t e n s i o nc y c l e ，1 1 譬 e x p e r i m e n tp r o v e dt h a tt h i sn u c l e o t i d es y s t e mw a sc o m p e t e n tf o rm u l t i p l e b a s es e q u e n c i n g , a n d t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw a sd e t e r m i n e db yt 1 1 er a t i oo f t h et w on u c l e o t i d e s 3 r e s e a r c ho fd n a s e q u e n c i n gw i t ho n - c h i pe x t e n s i o nm e t h o d i nt h i sc h a p t e r , t h eo n - c h i pe x t e n s i o nm e t h o dw a su s e df o ro b t a i n i n gs e q u e n c ei n f o r m a t i o no l o l i g o n n c l e o t i d e s t h es e q u e l a ei n f o r m a t i o no ft h ef a s tf o u rb a s e so fo l i g o n u c l e o t i d e s w a s o b t a i n e db ys i n g l e s t e pa p p r o a c h a n db ym u l t i p l e - s t e pa p p r o a c h , t h es e q u e n c ei n f o r m a t i o no ft h e f i r s tt e nb a s e sw a sa t t a i n e d i ti sc o n f i d e n tt h a ta f t e rs o 眦i m p r o v e m e n t s ，t h eo n - c h i ps e q u e n c i n g m e t h o dw i l lb eas u p e r i o rs e q u e n c i n gm e t h o de v e n t u a l l y 4 e x p l o r a t i o no f t h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g t h eq u e n c h i n go ft h ef l u o r e s c e n c eo nt h em i c r o a r r a y sh e l p se l o n g a t et h er e a dl e n g t ho ft h e o n - c h i pe x t e n s i o nm e t h o d a n ds o m ee x p l o r a t i o n sw e r ed o n ef o r t h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g a m m o n i u mp e r s u l f a t ew a sc h o s e nf o r t h ee x p l o r a t i o n s i nd 蟹e x p e r i m e n t st h e f l u o r e s c e n t m o l e c u l e sc y 3 ，c y 5a n dt a m r aw e r ea l lq u e n c h e db ya m m o n i u mp e r s u l f a t e b u tt h er e s u l t sa l s o s h o w e dt h a td n aw a sp a r t l yd a m a g eb yt h ea m m o n i u mp e r s u l f a t e k e yw o r d s ：s e q u e n c i n g ，d n am i c r o a r r a y s ，o n - c h i pe x t e n s i o n , q u e n c h v i 缩写及术语表 缩写及术语表 h g p ( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ) ：人类基因组计划 n h g r i ( n a t i o n a l h u m a n g e n o m e r e s e a r c h i n s t i t u t e ) ：美国国立人类基因组研究所 s b h ( s e q u e n c i n gb yh y b r i d i z a t i o n ) ：杂交测序法 d n a ( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ) ：脱氧核糖核酸 d n t p ( 2 - d e o x y n u c l e o s i d e - 5 - t r i p h o s p h a t e ) ：脱氧核苷三磷酸 d a t p ：脱氧腺苷三磷酸 d g t p ：脱氧鸟苷三磷酸 d c t p ：脱氧胞苷三磷酸 d t i p ：脱氧胸苷三磷酸 d u t p ：脱氧尿苷三磷酸 d d n t p ( 2 3 - d e o x y n u c l e o s i d e 5 - t r i p h o s p h a t e ) ：双脱氧核苷三磷酸 d d a t p ：双脱氧腺苷三磷酸 d d g t p ：双脱氧鸟苷三磷酸 d d c t p ：双脱氧胞菅三磷酸 d d t t p ：双脱氧胸苷三磷酸 d d u t p ：双脱氧尿苷三磷酸 s g e ( s l a bg e l e l e c t r o p h o r e s i s ) ：板凝胶电泳法 s b e ( s i n g l eb a s ee x t e n s i o n ) ：单碱基延伸 c e ( c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ) ：毛细管电泳 c c d ( c h a r g e - c o u p l e dd e v i c e s ) ：电荷耦台器件 s t m ( s c a n n i n g t u n n e l i n gm i e ms c o p e s ) ：扫描隧道显微镜 a t m ( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e s ) ：原子力显微镜 d d n t p - d y e ：荧光标记的双脱氧核苷三磷酸 s d s ：十二烷基硫酸钠 东南大学硕士学位论文 p b s ；磷酸盐缓冲液 t e ( t r i s c i - e d t a b u f f e r ) ：t e 缓冲液 a p s ( a m m o n i u mp e r , s u l f a t e ) ；过硫酸氨 a p t e s ：3 - 氨丙基三乙氧基硅烷 a r d ( a m a y i n ga n dr e p l i c a t i n gd e v i c e ) ：阵列复制器 p m t g a i n ；光电倍增管增益 c y 3 ( c y a n i n e3 ) ：花青素3 c y 5 ( c y a n i n e5 ) ：花青素5 t a m r a ：四甲基罗丹明 p y m 辩q m i n g ：焦磷酸测序技术 出d p a s ：以硫代脱氧腺苷三磷酸 心d p s ：二磷酸腺苷 d n m p s ：一磷酸腺苷 p p i ：焦磷酸盐 r p m ( r o t a t i o np e rm i n u t e ) ：赣| 食 c b ：碳酸盐缓冲液 p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) ：聚合酶链式反应 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：期：亟 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位 论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论 文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包 括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：淦墨导师签名： 第一章绪论 第一章绪论 如何对基因组快速有效地进行测序是当今基因组科学面临的主要挑战之一。在成功完成 人类基因组计划“2 1 之后，生命科学界不禁在问“下一项任务是什么”。答案是获取所有个体 的基因组序列，并依据获取的结果了解不同个体基因序列之间的差异，分析不同个体对疾病 的易感程度的差异，以及在药物反应上的差异。国际顶尖的基因研究中心和科学家们一致认 为这是未来5 一l o 年生命科学的核心研究之一。美国国立人类基因组研究所( n 撕o r a lh u m a n g e n o m er e s e a r c hi n s t i t u t e n h g r i ) 在先前发表的对基因组科学研究的展望中也认可了这一 目标”i 。美国文特尔科学基金( j c r a i g c e n t e rs c i e n c ef o u n d a t i o n ) 最近悬赏1 0 0 0 万美元。 用于奖励任何在d n a 自动测序中取得显著进展的组织或个人，这一进展必须满足在1 0 0 0 美元以内测出人类全基因序列这一要求。 成熟的d n a 测序技术出现在上世纪7 0 年代中期，m a x a m 的化学降解法和s a n g e r 的双 脱氧链终止法几乎同时出现在1 9 7 7 年t 4 - 6 l 。进入2 0 世纪8 0 年代，s m i t h 等人7 在s a n g e r 双 脱氧链终止法的基础上。采用四色荧光标记的测序引物，应用激光激发荧光检测和计算机碱 基识别的方法进行测序，这也标志着自动化测序时代的到来。这种方法之后被p e r l d n - e l m e r 商品化为测序仪。d u p o m 公司采用荧光标记双脱氧核苷酸链终止法进行测序”i ，并将该方法 商品化。目前，d n a 测序技术大致可以分为两类，一类是基于链终止法和凝胶电泳的经典 测序技术，一类是抛弃这两种方法的新一代测序技术。基于基因芯片的测序技术属于革新的 测序技术，目前有杂交测序法( s e q u e n c i n gb yh y b r i d i z a t i o n ，s b h ) 其原理是通过短序列探 针与待测靶序列杂交的方式获取序列信息。我们开发了基于在片延伸的测序技术，是通过特 定引物与待测靶序列杂交后进行在片延伸的方法在延伸过程中用荧光标记的双脱氧核苷酸 终止部分待测靶序列，应用激光激发荧光俭测方法获取序列信息1 9 j 。 1 1 d n a 测序技术 1 1 1d n a 冀序技术的回顾 在2 0 世纪7 0 年代中期之前，d n a 序列是没有办法直接被测出的，想得到d n a 序列， 只能通过其转录翻译出的蛋白质的氨基酸序列倒推。成熟的d n a 测序技术始于7 0 年代中 期。1 9 7 7 年m a x a m 和g i l b e r t 报道了通过化学降解测定d n a 序列的方法o j ，即将模板d n a 的端标记之后，在4 组或5 组互为独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应 特异地针对某一种或某一类碱基。在这几组反应中通过化学裂解形成具有共伺起点而终点不 同的放射性标记的分子。经过电泳及放射自显影可以读出距离标记位点2 5 0 个核苷酸以内的 东南大学硕士学位论文 d n a 序列。同期s a n g e r 推出了双脱氧链终止法嘲。s a n g e r 法测序的原理就是利用种d n a 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序鬏 测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷三磷酸( d n t p ) ，并混入 限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸( d d n t p ) 。由于d d n t p 缺乏延伸所需要的3 - o h 基团， 使延长的寡聚核苷酸选择性地在g 、a 、t 或c 处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。 每一种d n t p 和d d n t p 的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止 产物。它们具有共同酌起始点，但终止在不同的核昔酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分 离大小不同的片段，凝胶处理后可用x 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 2 0 世纪踟年代自动测序的出现将d n a 测序引入高通量的时代。1 9 8 6 年，l e r o yh o o d 实验室的s m i t h 等人用荧光标记、激光激发荧光检测和计算机碱基识别技术取代了传统的放 射性同位素标记、放射自显影和人工碱基识别技术【7 l 。这标志着自动化测序时代的到来。该 方法分别用四种荧光标记测序引物，每一条引物放入有一种d d n t p 和四种d n t p 的体系反 应，在反应结束之后，四个独立的反应体系被锄入同一个聚丙烯酰氢凝胶电泳。四色激光激 发荧光检测仪对凝胶进行扫描，扫描结果被送入计算机通过软件进行处理，最终得出测序结 果。1 9 8 7 年，d u p o n t 的科学家们开发出了基于荧光双脱氧链终止法d n a 快速自动测序系 统例。之后多家公司在此基础上发展出多种d n a 自动测序仪，并投入商业化生产。 经过多年的发展，目前国际上正在研究的d n a 测序技术大体上可以分为两类：第一类 是经典d n a 测序技术。是进一步发展与完善目前广泛采用的以凝胶电泳分离为基础的d n a 序列分析技术，如毛细管凝胶电泳法、阵列毛细管凝胶电泳法、超薄层板凝胶板电泳法，这 类方法都是以传统的化学降解法和双脱氧链终止法为基础发展而来；第二类是d n a 测序新 技术，这类方法抛弃传统的凝胶电泳分离步骤直接进行测序的方法，如杂交法、质谱法、原 子探针显微镜法、单分子实时检测法、循环阵列检测法等。 1 1 2d n a 舅序技术的现状 1 1 2 1 经典d n a 测序技术 目前在d n a 测序及其相关研究中，最常使用的是基于电泳的双脱氧链终止法，有较为 原始的板凝胶电泳法，及由其发展而来的超薄板凝胶电泳法，也有诞生于2 0 世纪9 0 年代的 初期的毛细管凝胶电泳法。 1 ) 板凝胶电泳法( s l a bg e le l e e t r o p h o r e s i s ，s g e ) 最早的两种成形的测序技术1 4 - 6 1 ，都是利用板凝胶电泳技术对不同长度的核酸片断避行 分离。电泳技术是利用抗对流介质，如聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，分离不同长度的核酸片断， 在通过放射自显影技术或荧光标记技术，判读核酸片断。为了适应大规模测序的需要，高速 2 第一章绪论 d n a 测序技术不断发展。人类基因组大规模d n a 测序，已普遍采用板凝胶电泳及激光荧 光实时检测法，基于双脱氧链终止法的原理，采用激光诱导荧光进行检测。 早期使用的电泳凝胶板厚达4 0 0 1 t m ，易于形成高电流而产热，影响电泳条带结果的分析， s a n g e r 等人后来的研究对胶的厚度作了一些改进”1 。超薄板凝胶电泳( u l t r at h i n s l a bg e l e l e c t r o p h o r e s i s ) 结合了毛细管凝胶电泳与板凝胶电泳的优势：利用板凝胶电泳基本装置使多 个样品的分离同时进行，结合毛细管凝胶电泳的优势使分离在超薄层凝胶( c= 圈一1 基于在片延伸的d n a 测序技术原理图 1 3 3 本论文的主要研究内容 i v l 比较在芯片制各过程中各参数对在片延伸的影响： 分别制备醛基修饰玻片片基的基因芯片和琼脂糖膜涂覆玻片片基的基因芯片。比较两种 片基的荧光信号强度和均一度，及荧光背景的强度。分别设计具有1 0 个、1 3 个和1 6 个碱 基长度手臂分子的核酸探针，比较其在延伸效率的高低，以此为依据设计具有合适长度的手 臂分子用于在片测序研究。 2 优化在片延伸基本条件： 比较不同实验条件下，探针的在片延伸效率和长度的差异。比较t a qd n a 聚合酶、 t h e r m i n a t o rd n a 聚合酶和k l e n o wd n a 聚合酶在延伸效率及延伸时间上的差别，选择适宣 的聚合酶用于在片延伸及在片测序。比较相同条件下，d d n t p 、d n t p 、d d n t p 和d n t p 混 8 第章绪论 合物的延伸情况，以在片测序为目的选择合适的核苷酸或核苷酸组合用于延伸。比较不同 d d n t p 和d n t p 浓度比例下的在片延伸信号。设计两步延伸法提高每一步延伸的反应效率 第一步加入低浓度的荧光标记的d d n t p 和d n t p 混合物，第二步加入高浓度的d n t p ，以使 未延伸的探针充分延伸，以此达到提高延伸效率的目的。 3 发展应用在片延伸的d n a 测序技术： 在前两项研究的基础上，运用基因芯片进行d n a 序列测定。设计具有3 端自复性发夹 结构的核酸探针用于在片测序原理性研究。成功在片测出1 0 个碱基的序列信息，并针对荧 光信号过强的情况进行淬灭研究。 9 第二章测序基因芯片的制备 第二章测序基因芯片的制备 基因芯片制备的方法很多，在第一章中已经作了介绍。在先前的研究课题中，本实验室 已经发展或使用了多种片基基因芯片的制备方法，包括修饰玻片基因芯片( 包括醛基修饰玻 片、氨基修饰玻片、多聚赖氨酸修饰玻片等) ，琼脂糖膜涂覆基因芯片，聚丙烯酰氨基因芯 片和尼龙膜基因芯片等。本论文中，我们选用了醛基修饰玻片和琼脂糖膜涂覆玻片作为片基， 在此基础上发展基于在片延伸的d n a 测序方法。 在本章，我们将介绍这两种基因芯片的制备方法，包括芯片片基的处理。寡核苷酸探针 的设计、点样和固定，在片延伸的基本实验条件，在片延伸后荧光扫描图的获取及数据的分 析。同时，我们比较了两种片基的基因芯片在延伸结果上的差异，比较了具有不同长度手臂 分子的寡核营酸探针对在片延伸的影响。 2 1 实验材料 2 1 1 实验试剂 i o x t e 缓冲液，2 0 x s s c ，1 0 s d s ，0 1m p b s ，o 1 m c b ，p i r a n h a 洗液，f i b ，以上 溶液为自配，具体配方参见附录。 ( 氨基乙胺) 丙基一二甲氧甲基硅烷( 3 - ( 2 - a m i n o e t h y l a m i n o ) p r o p y l d i m e t h o x y n t h y l s i l a n e ，a p t e s ) 为美国s i g m a 公司产品； 琼脂糖为英国o x o i d 公司产品； 高碘酸钠为天津市科密欧化学试剂有限公司产品； 碘化钾，氢氧化钠甲醇( 分析纯) 为南京化学试剂厂产品： 戊二醛( 2 5 ) 为中国医药( 集团) 产品； 9 5 乙醇，无水乙醇，盐酸，硫酸，为上海试剂公司产品； t a qd n a 聚合酶( 5 u 1 t 1 ) ，t a qb u f f e r ，m g c b 溶液( 2 5 r a m ) ，d a t p 、d c t p 、d g t p 、 d t r p ( 1 0 r a m ) 为北京天为时代产品； t h e r m i n a t o rd n a 聚合酶，t h c r m o p o lr e a c t i o nb u f f e r ，k l e n o wd n a 聚合酶为美国n e w e n g l a n db i o l a b s 产品； t a m r a - d d a t p 、t a n a a - d d c t p 、t a n a - d d g t p 、t a n u a - d d t i p ( 1 0 0 i u m ) 为美国p e l d n - e l i m e r 公司产品： 1 1 东南大学硕士学位论文 c y 5 一d u t p 、c y 5 - d d a t p ( 1 m m ) 为英国a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 寡核苷酸探针由上海英骏公司合成。 2 1 2 仪器和设备 褒二一1 实验仪器与设备列表 名称型号生产厂家 离心机 c e n t r i f u g e5 4 1 5d 旋涡振荡仪v o r t e x - 2g e n i e 电热恒温水浴箱s h h w 2 1 4 2 0 超声振荡 电子天平 点样仪 扫描仪 k q 2 2 0 0 r l 0 0 4 p i x s y s 5 5 0 0 l u x s c a n1 0 k a 数显鼓风干燥箱g z x - 9 0 7 0m b e 数显培养箱d p x 9 0 5 2 8 1 脱色摇床 移液器 离心管 e p p e n d o r f s c i e n t i f i ci n d u s t r i e s 国华电器有限公司 昆山市超声仪器有限公司 上海天平仪器厂 c a r t e s i a nt e c h 北京博奥 上海博迅实业有限公司 医疗设备厂 上海福玛实验设备有限公司 南京大学 2 5 1 、1 0 1 t t l 、2 0 1 t l 、2 0 0 9 l 、1 0 0 0 9 le p p e n d o r f o 2 m l 、0 5 m l 、1 5 m l 、2 m l e p p e n d o r f 玻片，培养皿、乳胶手套、滤纸、镊子、洗耳球、玻片架、烧杯、量筒若干 2 2 实验方法 2 2 1 基因苍片片基的处理 在芯片的制备过程中，基底材料的选择及其表面的化学修饰是至关重要的。许多材料都 可以用作生物芯片的基底材料，如滤膜、玻璃片以及水凝胶膜。本研究主要使用后两种表面 修饰的芯片基底：一种是醛基硅烷化处理的玻片；一种是琼脂糖膜涂覆的玻片。下面两小节 一1 2 第二章测序基因芯片的制各 将分别介绍这两种基底的制备和活化的方法。 2 2 1 1 醛基玻片的修饰 玻片清洗 玻片浸泡于含去污剂的水中，反复搓洗，并浸泡3 0 分钟；置于双蒸水中，超声振荡2 0 分钟；用双蒸水充分清洗3 遍后，平铺于表面皿中。 玻片预处理 玻片浸泡于甲醇盐酸( 1 ：1 ，w w ) 混合溶液中摇床振荡3 0 分钟；双蒸水冲洗3 遍，吹 干；浸泡于硫酸溶液中摇床振荡3 0 分钟：用双蒸水冲洗干净；用9 5 乙醇充分冲洗3 遍， 每次5 分钟，除去表面残酸，氮气吹干玻片后置于4 c 保存待用。 醛基修饰1 6 4 6 5 l 预处理好的玻片以9 5 乙醇与氨基硅烷( 4 9 ：1 ，w w ) 混合溶液浸泡、摇床振荡3 0 分钟； 弃去硅烷溶液后，用9 5 乙醇充分清洗3 遍，每遍5 分钟，除去残余硅烷；双蒸水清洗3 遍，每遍半分钟；玻片置于玻片盒中，4 0 0 0r p m2 分钟甩干；玻片移至金属玻片架上，放于 1 1 0 c 烘箱中干燥3 0 分钟，即制备得氨基硅烷化修饰玻片。 2 5 的戊二醛用0 0 1mp b 溶液( p 87 o ) 稀释为5 的戊二醛溶液：将已经氨基硅烷 修饰的玻片平铺于干燥的表面皿中，倒入戊二醛溶液，浸泡2 小时：用0 0 1mp b 溶液清洗 玻片3 遍，每遍2 分钟，除去残余戊二醛；用9 5 乙醇清洗2 遍，每遍5 分钟，最大限度 降低玻片背景；双蒸水清洗3 遍，每遍睾分钟；玻片置于玻片盒中离心机4 0 0 0 r m p 2 分钟 甩干，即制备得醛基修饰玻片。 2 2 1 - 2 琼脂糖膜玻片的处理i 鹋，e q 玻片预处理： 选择大小合适的载玻片，在8 0 c p i r a n h a 洗液超声洗涤2 小时，然后用洗涤剂反复搓 洗，彻底清洗；用去离子蒸馏水再次彻底清洗、烘干备用； 涂覆琼脂糖膜 制备l 的琼脂糖溶液：1 0 0 m g 琼脂糖溶于l o m l 的去离子蒸馏水中，混合并煮沸5 分 钟：将清洗干净的载玻片预热至6 0 ，然后再载玻片上均匀涂覆l 的琼脂糖溶液；琼脂糖 成胶后，将玻片置于烘箱中3 0 过夜； ， 活化 在室温下将琼脂糖胶置于2 0m m 的高碘酸钠( n a l 0 4 ) 溶液( o i mp b s ，p h7 2 ) 浸泡 3 0 分钟，用以活化，高碘酸钠可以使琼脂糖分子中相邻的羟基氧化，得到醛基；用去离子 一1 3 东南大学硕士学位论文 蒸馏水再次彻底清洗，4 c 保存备用。 ( ) 琼脂糖分子 ( c ) 膜片袭面修饰了醛基 亏弓弓 选逝瞄翰翰翻缫嬲嬲翻嘲搿翰翰黼 ( d ) 固定探针 圈二1 琼脂糖膜的高磷酸钠活化及氨基修饰的d n a 分子探针的固定。 2 2 1 3 醛基玻片与琼脂糖膜片的延伸比较 分别按上文方法制备醛基修饰的基因芯片和琼脂糖膜涂覆的基因芯片。按照本节后面介 绍的方法，固定p 4 ( 表二一2 ) 于两种基因芯片上，按照下文介绍延伸体系和图像获取方式 比较两种片基的基因芯片在延伸上差异。 2 2 2 发卡结构探针的设计与优化 2 2 2 1 发卡结构探针的设计方法 本论文的在片延伸及基因芯片测序实验中，所使用的探针均为自复性发卡结构探针( 图 二一2 ) ，探针设计方法如下： 1 合成一条单链d n a 探针，其5 端标记一个氨基基团( n i i z ) ，它的作用是与醛基修 饰的玻片发生缩水发应，使探针固定在玻片上( 图二1 ) ； 2 在氨基后，设计一段手臂分子，长度大约为1 0 - 2 0 个碱基，手臂分子的作用是减小 空间位阻，使玻片表面环境更有利于聚合酶与探针的结合； 3 在探针的3 + 端设计一个互补序列，比如g c g g a c c g c ； 4 处于探针中间位置的碱基序列根据实验具体需要设计； 5 将探针固定在玻片表面后，自复性在远离玻片表面的一端形成发卡结构： 1 4 第二章测序基因芯片的制备 6 然后利用这个发卡结构的短片断为引物，在d n a 聚合酶延伸体系下进行延伸实验 及测序研究。 abc 图二2 单链发卡结构探针 寡核苷酸的合成及氨基的修饰在上海英骏生物工程公司完成，p a g e 胶纯化。 表二- 2 化学合成的寡核苷酸探针 探针序列( 5 一3 ) 分组编号 氨基手臂分子碱基序列发卡结构 p l n h 2a g t g t c t c t c t c c t c t c c c g gg c g g a c c g c lp 2 n h 2f n 飞g r g t 1 1 c k c 兀。田 _ c c 徽c g gg c g g a c c g c p 3 n l - hf n 飞g r k 玎饥a c k c 兀_ o g 嗍c 0 0 g gg c g g a c c g c p 4 n h 2o n l o a c g t a c g t a c g t a c g t g c g g a c c g c p 5n h 2 ( t n l oc g t a c g t a c g t a c g t rg c g g a c c g c 2 p 6 n h 2 o n l o g t a c g t a c g t a c g t r f g c g g a c c g c p 7 n 啦0 1 3 1 0 t a c g t a c g t a c g t t r rg c g g a c c g c 3 粥 n h 2f 几m o t a c g t a c g t a c g t a c g g c g g a c c g c 41 ：9 n i l , _ ( t r