（生物医学工程专业论文）不同光暗循环周期对小鼠活动性及某些免疫组分的影响.pdf

不同光暗循环周期对小鼠活动性及 某些免疫组分的影响 研究生：郭莉导师：王正荣教授 摘要 目白勺探讨不同光暗循环周期对小鼠活动性、外周血白细胞 计数及分类计数、血清i g g 浓度的影响，为进一步研究光对 机体行为、免疫系统的影响提供理论依据：为时间生物学中， 进一步揭示光与机体行为、免疫系统生物节律间的相互关 系，打下一定的基础。 方法将1 4 4 只l c r 小鼠随机置于三个不同的光暗循环周期 l d 7 7 ( 7 h 光照，7 h 黑暗) 、l d l 2 1 2 ( 1 2 h 光照1 2 h 黑暗) 及l d l 6 1 6 ( 1 6 h 光照1 6 h 黑暗) 下，喂养6 周后，分批取血作自细胞计数及分 类计数，采用双抗体夹心酶联免疫法测定血清i g g 的浓度。 另外9 只i c r d , 鼠亦分为三组，红外线检测装置和数据分析系统 连续6 周监测其活动性的改变。 结果( 1 ) 不同的光暗循环周期下，除嗜酸性和单核细胞 外，小鼠活动性、自细胞计数及分类、血清i g g 的大小不同。 ( 2 ) 小鼠活动性节律与三种光暗循环周期均同步。( 3 ) 小鼠 白细胞计数及分类计数、血清i g g 的节律与l d l 2 1 2 的光暗 循环同步：在l d 7 7 及l d l 6 1 6 的条件下，则不存在节律性。 结论( 1 ) 除嗜酸性和单核细胞外，改变光暗循环周期能 影响小鼠活动性、白细胞计数及分类、血清i g g 的大小。( 2 ) 小鼠活动性节律能被三种光暗循环周期所导引。( 3 ) 小鼠白 细胞计数及分类计数、血清i g g 的节律能被l d l 2 f 1 2 的光暗 循环导引；在l d 7 7 及l d l 6 1 6 的条件下，则不能被导引。 关键词近日节律视交叉上核光暗循环导引活动性免疫 系统 t h ee f f e c to fd i f f e r e n tl i g h t - d a r kc y c l e s o ns o m ec o m p o n e n t so fi m m u n e s y s t e m a sw e l la sl o c o m o t o r a c t i v i t yi nm i c e p o s t g r a d u a t e ：g u ol i s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rw a n gz h e n g - r o n g a b s t r a c t o b j e c t i v e t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fd i f f e r e n tl i g h t - d a r kc y c l e s o nl o c o m o t o ra c t i v i t y ，t o t a la n dd i f f e r e n t i a l l e u k o c y t ec o u n ti n p e d p h e r a lb l o o da sw e l la ss e r u l ni g gc o n c e n t r a t i o n i nm i c e t h i s s t u d yw i l lg i v ee v i d e n c e sf o rf u r t h e rr e s e a r c h e so nt h el i g h te f f e c to n o r g a n i s mb e h a v i o ra n di m m u n es y s t e m m o r e o v e r ，o u rr e s e a r c h e sw i l l c o n t r i b u t et of u r t h e r s t u d i e so nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nl i g h ta n d b i o r h y t h m s o ft h eo r g a n i s mb e h a v i o ra n di m m u n e s y s t e m i n c h o r o n o b i o l o g y m e t h o d s1 4 4i c rm i c ew e r ed i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s d u r i n g s i xw e e k st h em i c ew e r ee x p o s e dt oo n eo ft h r e el i g h t d a r kc y c l e s r e g i m e s ：l d 7 7 ( 7 hl i g h t 7 hd a r k ) ，l d l 2 1 2 ( 1 2 hl i g h t 1 2 h d a r k ) ，l d l 6 1 6 ( 1 6 hl i g h tt t 6 hd a r k ) b l o o ds a m p l e sw e r ea t t a i n e db y e n u c l e a t i o no fe y ea t4hi n t e r v a l sf o rt o t a la n dd i f f e r e n t i a ll e u k o c y t e c o u n ta sw e l la ss e r a l ll e v e l so fi g gd e t e r m i n e db ye n z y m e l i n k e d i m m u n o - s o r b e n ta s s a y a n o t h e rn i n em i c ew e r ea l s od i v i d e di n t o t h r e eg r o u p sa n dt h e i ra c t i v i t i e sw e r er e c o r d e dc o n t i n u o u s l ya n d a n a l y z e db yc o m p u t e r r e s u l t sf i r s t ，l o c o m o t o ra c t i v i t y ，t o t a la n dd i f f e r e n t i a ll e u k o c y t e c o u n ta sw e l la ss e r u l t ll e v e lo fi g gi nm i c ew e r ed i s t i n c t 、v i m d i f f e r e n t l i g h t - d a r kc y c l e se x c e p t f o r a c i d o p h i l e a n dm o n o c y t e c o u n t s e c o n d ，l o c o m o t o ra c t i v i t yr h y t h mi nm i c ew a ss y n c h r o n i z e dt o a l lt h r e ed i f f e r e n tl i g h t - d a r k c y c l e s w h i l et o t a la n dd i f f e r e n t i a l l e u k o c y t ec o u n t 蹈w e l la si g gr h y 岫nw a s n ts y n c h r o n i z e dt ot h e l i g h t - d a r kc y c l e se x c e p t l d l 2 1 2 c o n c l u s i o n s f i r s t ，d i f f e r e n tl i g h t - d a r kc y c l e sc o u l di n f l u e n c e w b cc o u n ta n dd i f f e r e n t i a lb l o o dc o u n ta sw e l la s s e r u r n i g g c o n c e n t r a t i o n se x c e p tf o ra c i d o p h i l ea n dm o n o c y t ec o u n t s e c o n d ， l o c o m o t o ra c t i v i t yr h y t h mi nm i c ec a nb ee n t r a i n e dt oa l lt h r e e d i f f e r e n tl i g h t d a r kc y c l e sw h i l et o t a la n dd i f f e r e n t i a ll e u k o c y t ec o u n t a sw e l la si g gr h y t h ac o u l d n tb ee n t r a i n e dt o u g h t d a r kc y c l e s c o r r e s p o n d i n g l ye x c e p tl d l 2 1 2 k e yw o r d s c i r c a d i a nr h y t h ms c n l i g h t d a r kc y c l e e n t r a i n a c t i v i t y i m m u n es y s t e m 4 不同光暗循环周期对小鼠活动性及 某些免疫组分的影响 前言 时间生物学的研究揭示，机体各种生理功能并非一成不变，而 是处于周期性的波动中。生物体为适应外界环境变化，在长期进化 中形成了多种生物节律。这些节律的周期长短不一，从超目节棒、 近日节律、到周节律、月节律、年节律等，其中近日节律最为普遍， 研究得也最深入。近日节律是生物体行为、生理及生化活动以约二 十四小时为周期变化的节律。从蓝细菌、植物、动物到人，几乎所 有生物体均存在近日节律i ”。它非常重要许多生命活动，如血压、 体温、激素水平、内分泌功能和睡眠觉醒周期等，均呈近日节律 性变化。它是机体固有，具内源性，在无外界环境信号作用的情况 下，仍以近2 4 d , 时周期自由运转( f r e er u n n i n g ) 【2 】。 目前，在哺乳动物体内，已鉴定克隆出九种与近日节律相关的 钟基因，即n r j 、心力、p e r 3 、c l o c k 、b m a l l 、i i m 、c r y l 、c r y 2 ， t a u 。不同生物近日节律产生的分子基础类似，均由钟基因转录和 转录后调控产生的分子振荡引起f 3 】【4 1 。钟基因启动后羟转录、翻译 生成相应的蛋白质。当蛋白浓度达一定程度后，反馈作用于自身基 因启动部位，使其浓度以2 4 小时周期自激性振荡。在近日振荡反馈 环中，正性成分( p o s i t i v ee l e m e n t ) 启动钟基因，使之表达；负性成分 ( n e g a t i v e e l e m e n t ) ，阻断正性成分的作用，使表达减弱或停止1 5 】。钟基 因的自激振荡由多个反馈环组成，其中两个主要的环路，如图1 所示。( 1 ) 负反馈环：节律性转录由两个转录因子c l o c k 和b m a l l 启动。p e r ( p e r l ，几，2 ，p e r 3 ) 基因和c r y ( c r y l ，c r y 2 ) 基因上 游有e 盒增强子，c l o c k b m a l i 异二聚体选择性与之结合，激 活二者转录，其表达产物p e r 和c r y 蛋白从胞浆中返回至细胞核 内，而c r y 蛋白可作为负性成分，与c l o c k 和或b m a l l 直接 作用，抑制转录，关闭负反馈环。( 2 ) i e 反馈环：c l o c k ，b m a l l 异二聚体激活n r 和c r y 基因的同时，也激活r e ve r b 口基因转录， 其表达蛋白r e v - e r ba 可与b m a l l 启动子结合，阻遏b m a l l 的转 录。当c r y 蛋白转至核内，在作用于c l o c k - b m a l l 异二聚体， 抑制p b r 和c r y 基因转录的同时，也抑制r e v e r b a 转录，使b m a l l 基因转录去阻遏。此外，p e r 蛋白在r e v - e r ba 蛋白表达受抑时， 可作为阳性成分驱动b m a l l 转录，其表达产物b m a l l 与c l o c k 蛋白又可组成二聚体，启动p e r 和c r y 基因转录。由于基因转录和 蛋白进入细胞核需一定时间，使近日节律分子振荡的周期正好2 4 h 左右。当然，除钟基因外，还有其它基因参与到近日节律的分子振 荡中，使近日节律时钟更加稳定和精准。 设定并调控机体生物节律的系统称为“生物钟” 6 1 。不论低等 生物，还是高等动植物和人类，生命活动均在生物钟控制下进行 多细胞生物的生物钟可分为母钟( 主钟、中枢钟) 和子钟( 外周钟、 细胞钟) 。前者位于中枢部位，进化不同阶段的生物，母钟所在位置 不同。非哺乳类脊椎动物近日节律的中枢位于松果体内，而哺乳动 物近同节律的中枢则位于下丘脑视交叉上核f s u p r a c h i a s m a t i c n u c l e u s ，s c n ) 盯j ，哺乳动物一系列生理行为与近日节律性活动， 包括睡眠、运动、摄食、饮水、体温及内分泌等，主要由其调控【8 。 6 图1 近日节律的分子振荡模式 s c n 是一对位于视交叉上方、下丘脑第三脑室底壁两侧的神 经核团。从细胞构筑看，s c n 由三个区构成外的吻侧部0 4 ) 年1 大 的尾侧部( 占3 4 ) ，后者又分为腹# , 坝l j ( v e n t r o l a t e r a l ，v l ) 和背内侧 ( d o r s o m e d i a l ，d m ) 亚区吼s c n 内含多种肽能神经元，主要合成 分泌血管活性肠肽( v a s o a e i t v ei n t e s t i n a lp e p d d e ，v i p ) 、精氨酸一血管 加压素( a r g i n i n ev a s o p m s s i n ，a v p ) 、生长抑索( s o m a t o s t a t i n ，s o m ) 胃泌素释放肽( g a s t r i nr e l e a s i n gp e p t i d e ，g r p ) 、组异肽( p e p t i d e h i s t i d i n ei s o l e u c i n e p h i ) 等神经肽，它们在s c n 内的分布具显著 区别：v i p 、p h i 、g r p 神经元位于s c n 的v l 亚区，a v p 神经元 位于s c n 的吻侧部和d m 驻区，s o m 神经元位于s c n 内d m 和v l 两亚区之间。这些神经元，在钟基因调控下产生的节律位 相各不相同，它们之间经整合，相互同步化，组成一个有机整体， 生成并输出稳定的内在节律。s c n 的振荡信号经神经纤维传至脑 的其它部位，其中大部分纤维投射至下丘脑亚室旁带 ( s u b p a r a v e n t r i c u a a rz o r t c ，s u b p v ) 、室旁核( p a r a v e n t d c u l a r , p v n ) 和背内侧核，并通过神经内分泌机制及自主神经系统两大途径，调 控外周组织器官中予钟的节律，使其与中枢的节律同步化，从而调 节局部的新陈代谢与增殖活动。外周组织器官中( 如心、肝、肾等) 也广泛存在着钟基因，其活动方式与主钟类似【1 0 1 。 s c n 产生的节律具内源性，i i i j s c n 内钟基因的m r n a 及蛋 白产物可独立于外环境，自主表达出明显的峰谷曲线，有自主明相 和暗相，且周期近2 4 h 【】。此外，s c n 产生的近日节律尚具可导引 性，这种内在节律可受多种授时因子( z e i t g e b e r ) ，如明暗周期光信 号、环境温度、社交刺激、身体运动、饮食等因素的影响这些授 时因子通过导引作用( e n t r a i n m e n t ) 使生物钟调整自身的位相，与外 界环境保持同步【1 2 1 。在诸多授时因子中，来自明暗周期的光信号尤 为重要。光信号可刺激视网膜，产生的兴奋经直接或间接途径传 至s c n 。s c n 主要含v i p 、a v p 、s o m 等肽能神经元。其中，v i p 神经元属光反应性神经元，a v p 神经元属内源起搏神经元，s o m 神经元属中间神经元。光信号传至v i p 神经元后，信息在该神经元 间互耦合，使之与外界明暗环境同步。然后，再将整合信息经s o m 传 至a v p 神经元，最后由a v p 神经元传出内源性节律至s c n 外的其 余脑组织，从而调控机体各种生理行为与外界环境一致。光信号传 至s c n ，除直接导引其节律外，尚可经室旁核到达松果体，通过 影响褪黑素的合成分泌，来间接校i e s c n 产生的节律m 1 ，见图2 。 大量研究表明，松果体是s c n 重要的靶器官，它主要合成分泌褪 黑素( m e l a t o n i n ) 。褪黑素具相当广泛的生理功能，在调节生殖与 发育、免疫与内分泌、睡眠与觉醒等生理活动中起重要作用i l 。 褪黑素的分泌具明显昼夜波动性，即在黑夜大量分泌，而在白天几 乎测不到。褪黑素释放至周围毛细血管网后，经全身循环，被脉络 丛组织转运到脑脊液，进一步到达s c n ，并与s c n 中高亲和力m e l 受体结合，此可反馈性校正s c n 产生的节律，因此，褪黑索又被 称为内源性授时因子。 图2 光信号传至松果体的途径 免疫系统主要由免疫器官( 包括中枢及外周免疫器官) 、淋巴组 织和免疫细胞组成，能识别、记忆机体自身和非自身的细胞或外来 物质，是机体抵御体外来入侵的重要机构。除免疫防御、免疫监视， 免疫自稳三大功能外，免疫系统亦是机体一个重要的感受和调节系 统，它同神经系统与内分泌系统一起，在维持机体稳态方面，发挥 主要作用。免疫系统、内分泌系统和神经系统内部都有极其严密和 精细的调节。广义上讲，所有内分泌功能均受神经系统的直接或间 接支配，而神经内分泌系统是二者构成的信息网络，网络中神经内 9 分泌细胞( n e u r o s e c r e t o r yc e l l ) 起着将两个系统联在一起的作用， 使神经冲动转化为内分泌信息。目前业已证实，神经内分泌系统同 免疫系统间也有密切的双向互调节联系，形成所谓神经内分泌免疫 网络”。一方面，躯体和精神刺激作用于神经系统，可通过自主神 经系统的功能活动，亦可通过释放激素或其它因子( 包括应激时产 生的免疫抑制因子等) 调节免疫系统。另一方面，病毒、毒素、肿 瘤等这些神经系统无法感受的刺激，可直接作用于对其敏感的免疫 细胞，产生某些细胞因子和激素，从而动员和调节免疫系统本身的 功能。此外，这些细胞因予和神经内分泌激素尚可反馈作用于神经 内分泌系统影响其功能调节。 免疫系统对很多精神因素敏感，如情绪紧张、压力过大、心理 负担、精神刨伤等，均可使机体抵抗力下降，容易患病，这主要是 通过影响神经内分泌系统，使免疫系统功能降低所致。近年来。随 着时间免疫学的发展，研究发现，光照时间长短，如季节变换、昼 交替与免疫系统许多参数相关，以淋巴细胞数量为例，在人类，包 括t h 、t s 、b 细胞等，均是白天较低，夜间升高，峰值在1 7 ：0 0 2 4 ：0 0 时，谷值在0 5 ：0 0 0 7 ：0 0 时之间。人外周淋巴细胞数量以7 9 月最 高，1 2 - 3 y j 最低；而中性粒细胞和巨噬细胞数量恰与之相反【l “。光 影响免疫系统的具体机制尚未明确，不过，研究发现，经眼脑的 神经内分泌调节，是一条重要的途径1 1 7 】。 目前，在研究光信号改变对哺乳动物行为、生理活动及节律 影响方面，国内外有大量报道，但以2 4 h 光暗循环周期居多，非 2 4 h 光暗循环对机体的影响，则研究甚少。在探讨非2 4 h 光暗周期 对机体免疫及节律的影响方面，目前尚未见报道。活动性为监测 小鼠行为的常用指标，白细胞及血清i g g 为免疫系统的基础组分， 它们的数值与机体许多行为及生理一样，亦呈节律性波动。本研 究将小鼠随机置于1 4 h 、2 4 h 、3 2 h 三个不同光暗周期下，采用红 外线检测装置与数据分析系统，连续监测小鼠活动性。喂养6 周 后，分批取血，检测白细胞计数及分类计数，双抗体夹心酶联免 疫吸附法测定血清i g g 浓度。本研究旨在探讨不同光暗循环周期 是否影响小鼠活动性、白细胞计数及分类计数、血清i g g 浓度的 大小与节律性，若有影响，变化如何。本研究的结果将为进一步 探讨光对机体行为、免疫系统的影响提供理论依据；为进一步揭 示时间生物学中，光这种重要的授时因子，与机体行为、免疫系 统节律间的相互关系，打下一定基础。 第一部分不同光暗循环周期对 小鼠活动性的影响 1 材料和方法 1 1 材料 活动性检测系统由我室设计制作。活动性检测系统设备包括： 含有转轮的环境条件控制盒( 转轮直径为1 5 e m ，控制盒大小为4 5 3 5 3 0 c m ) 、红外线检测装置及数据分析系统。 1 2 方法 1 2 1 动物饲养健康三周龄i c r 雄性小鼠9 只，由中国医学科 学院成都分院实验动物中心提供。每组3 只，分别为l d 7 7 组( 光 暗循环：光照7 h ，黑暗7 h ) ，l d l 2 1 2 组( 光暗循环：光照1 2 h ， 黑暗1 2 h ) ，l d l 6 1 6 组 光暗循环：光照1 6 h ，黑暗1 6 h ) ，置于 检测活动性的3 个环境条件控制盒中。控制盒内环境温度( 2 2 2 ) ，隔离外界光线和噪声，并按实验设计自动提供光暗循环饲 养6 周。 1 2 2 样品或数据采集红外线检测装置和数据分析系统分别 采集和分析数据，自动连续检测转轮的转数，以反应小鼠活动性。 系统每3m i n 记录1 次数据并储存。 1 - 2 3 统计分析通过单因素方差分析( o n e w a ya n o v a ) 统计 时间点和组间差别。富立叶变换处理活动性周期，统计软件为s p s s l 】5 。 2 结果 2 1 不同光暗循环周期对小鼠活动性节律的影响 小鼠的活动性模式与光暗循环一致。在光亮状态下，小鼠活动 减少，而在黑暗状态下小鼠活动增加。在l d 7 7 ，l d l 2 1 2 ，和 l d l 6 1 6 的光暗状态下，活动性周期分别为：1 4h 、2 4h 和3 2h ( 见 图3 1 。 1 4x2 h o u r s = 二】 = 2 4x 2 h o u r s = 二】二= 3 2x2 h o u r s i 二二1 abc f 图3 小鼠的活动性模式 2 2 不同光暗循环周期对小鼠平均活动性的影响 l d 7 7 和l d l 6 1 6 组小鼠活动性每小时平均活动性高于 l d l 2 1 2 组。方差分析显示，这一指标有显著性差别( f = 1 5 2 6 3 p 0 0 0 1 ) a 进一步组问比较，l d 7 7 与l d l 2 1 2 组( p 0 0 0 1 ) 和 1 3 l d l 6 1 6 与l d l 2 1 2 组( p 0 0 0 1 ) 有统计学意义，而l d 7 7 与 l d l 6 1 6 组( p = 0 5 2 5 ) 没有统计学差别( 见图4 ) 。 上 j c h 。 m 昌 。 皇 l d 7 7 图4 不同光暗循环周期对小鼠每小时平均活动性的影响 3 讨论 机体所处环境光照与黑暗的昼夜交替称光暗循环，对地球上几 乎所有生物而言，光暗循环是最重要的授时因子。研究发现，在哺 乳动物中，光主要通过近日节律系统来影响机体行为生理及近日节 律。近日节律系统包括三个部分：近日节律系统中枢、近日节律系 统输入和近日节律系统输出。 光信号输入近日节律系统，需作用于视网膜的光感受器。近来 研究发现，哺乳动物近日系统的光感觉器，并非传统的视觉光感受 器一视千纫胞和视锥细胞，而是一部分主要位于视网膜背侧和颞侧 含黑视素( m e l a n o p s i n ，m l o ) 的视网膜神经节细胞【1 8 l ( r e t i n a l g a n g l i o n c e l l s ，r g c s ) ，这类特殊的r g c s 具光敏感性，故被称为光 敏感性r g c s 。m l o 是一种新型视蛋白样感光分子，最早于1 9 9 8 上i 印 0 年，在非洲爪蟾感光性皮肤的载黑素细胞内，i 扫p r o v e n c i o 等人【f 9 j 加以鉴定。 哺乳动物的m l o 由o p n 4 基因编码，含5 3 4 个氨基酸 残基，其氨基酸序列与头足类动物的视蛋白有高度同源性。m l o 主要见于视网膜r g c s 层和内核层。 视网膜神经节细胞的轴突大部分组成视网膜下丘脑束 ( r e t i n o h y p o t h a l a m i ct r a c t ，r h t ) ，投射至下丘脑，是光线传入 s c n 的真接途径【2 0 】。垂体腺苷酸环化酶激活多肽( p i t u i t a r y a d e n y l a t ec y c l a s e a c t i v a t i n gp o l y p e p t i d e ，p a c a p ) 和谷氨酸是r h t 纤维束的神经递质。r g c s 轴突除直接投射至s c n 外，尚有- - d , 部 分投射至外侧膝状体膝间小叶( t h et h a l a m i ci n t e r g e n i c u l a t el e a f l e t ， i g l ) ，再由后者发出n p y 纤维经膝状体下丘脑束 ( g e n i c u l o h y p o t - h a l a m i ct r a c t ，g h t ) 投射至双侧s c n 的v i p 神经 元。该纤维束的神经递质是神经肽y ( n e u r o p e p t i d ey , n p y ) 1 2 1j ，此 为光线传入s c n 的间接途径。 光照周期能使动物的近日节律发生位相移动( p h a s e s h i f t e f f e c t ) ，光对近日节律的位移在不同时间点存在不同反应。光在主 观黑夜的开始阶段，引起位相延后，丽在主观黑夜的结束阶段，引 起位相提前。就夜行性和昼行性动物而言，在一天的中间，光均不 能引起位相移动。光是如何导致近日节律发生位移，其中机制很复 杂。研究发现，在近日节律的光导引过程中，光照引起黑视素辅基 视黄醛分子构象改变，即由原来的1 1 顺型变为全反型1 2 2 i ，此反应 促进黑视素与g ，蛋白n 亚基相结合，引起谷氨酸和垂体腺苷酸环 化酶活化肽( p a c a p ) 从r h t 末端释放，刺激s c n 神经元相应受体， 启动钟基因与几种即刻早期基因( i m m e d i a t e e a r l yg e n e s ，i e g s ) c - l o s ，c - j u n ，j u n - b , 啦，与胁7 7 的表达1 2 ”，从而引起近日节律位 相的变化。 p a c a p 和谷氨酸与v i p 神经元膜上受体结合后，主要经有丝 分裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk - i n a s e ，m a p k ) 信 号转导途径调节近日节律基因p e r l 和a 以的表达，m a p k 磷酸化 是近日节律系统光信号转导的重要步骤【2 4 】。在黑夜光增女 1 p e r l 和p e r 2 m r n a 转录和蛋白表达，增加i p e r 系列基因表达。在主观黑 夜的开始阶段，引起位相延后，而在主观黑夜的结束阶段，引起位 相提前。然而，在白昼期闻，p e r 系列基因已很高，它们的表达增 高对分子振荡的位相没有影响。在光导引所致近臼钟重置过程中， p e r j 和凡门的作用似乎尤为重要，有研究表明，光信号不能引起 m 心r j 突变小鼠的位相提前，也不能引起r o p e r 2 突变小鼠的位相延 后i ”l 。 光刺激在作用于钟基因的同时，也强烈引发哺乳类动物s c n 内i e g s 的表达。l e g s 表达产物即转录因子，可能作为信号传递通路 的第三信使调节靶基因，其中也包括钟基因的表达。此外，在光对 近日钟的重置中，i g l 神经末梢释放的n p y ，可能也起一定作用， 有研究表明，它可阻滞光对近日节律位相的前移【2 郇。 近日节律系统中枢s c n 产生的振荡信号，可通过多种直接及 间接途径输出，并传至靶器官，如松果体、免疫系统、内分泌系统、 心血管系统等。松果体是近日节律系统重要的靶器官，它在s c n 调控下合成并分泌的褪黑素，还可反作用于s c n ，校正其对近日 节律的调节【2 7 】。褪黑素的分泌昼低夜高，光照抑制其分泌的途径 大致如下：由于松果体受颈交感节后纤维的支配，当光线投射到视 网膜，并将信息传至s c n 后，s c n 通过某种尚不清楚的神经联系， 1 6 经内侧前脑束把光照信息传到交感低级中枢，再经脊髓传至颈上神 经节，抑制松果体褪黑素的合成和分泌活动1 2 ”。 综上，光线可通过近日钟的输入、中枢及输出系统，改变内在 近日节律的位相，实现内在节律的重置，使其与外界明暗变化同步， 此为光影响机体行为生理及近日节律的主要机制。此外，对某些行 为生理而言，如褪黑素、活动性及睡眠觉醒周期等，光线尚具直 接作用1 2 9 1 ，a s c h o f f 首先强调光对近日节律的直接作用，并称之 为掩羞( m a s k i n g ) 【3 0 1 ，研究发现，在夜晚，光立即减少褪黑素释 放，并抑制夜行性啮齿动物活动。光对活动性的掩盖结果，视动物 习性而定。夜行性动物夜间活跃，若活跃时见光，则与内源性节律 信息的“夜晚”相悖，掩盖则纠正此偏差，使活动迅速减少，且光 脉冲结束后，抑制仍持续一段时间。反之，在昼行性哺乳动物中， 掩盖表现为光触发其活动。不仅光，黑暗脉冲也具直接效应，例如， 在白天，黑暗脉冲激发夜行性啮齿动物活动，引起黄昏时活动呈跳 跃式开始。这些直接作用超越内部生物钟控制，使机体针对光线变 化，做出迅速而准确的调节，并纠正近日钟错误或不精确的同步化。 需指出的是，掩盖效应仅掩盖或模糊内源节律中枢的影响，但并不 改变内源节律，掩盖结束后，内源节律中枢仍起控制作用i3 1 】。 本研究将小鼠置于l d 7 7 、l d l 2 1 2 和l d l 6 1 6 三个不同光 暗循环周期下，连续监测其活动性，鹭在探讨光暗循环周期对小鼠 活动性大小及节律的影响。结果表明，在所有组中，小鼠活动性均 存在明显节律，光亮状态下，小鼠活动减少，而黑暗状惫下，小鼠 活动增加，且小鼠活动性节律与光暗循环同步，在l d 7 7 、l d l 2 1 2 及l d l 6 1 6 组中，活动性周期分为：1 4h 、2 4h 及3 2 h ，说明小鼠 活动性内在节律可被外界光暗循环导引，主要为光作用于近同系 1 7 统，重置内在节律的结果，当然，掩盖效应也发挥一定作用，它使 活动性节律的同步化更精准。不过，活动性掩盖的机理，目前尚未 明确。掩盖效应的神经中枢，须接受r h t 或其它旁路光信息输入， 而视皮层及部分近日系统，如s c n 和i g l ，并非活动性掩盖所必 需。活动性掩盖的潜在中枢包括顶盖前区和下丘脑腹外侧视前区 ( t h ev e n t r o l a t e r a lp r e o p t i cn u c l e u s ，v l p o ) 。光脉冲后，也许并非 单一部位负责活动性掩盖，而是多个部位协同作用，具体机理尚需 深入研究。在l d 7 7 及l d l 6 1 6 组中，活动性节律分与1 4 h 及3 2 h 光暗周期同步，提示内在节律被光导引范围较大，超出文献报道的 2 0 2 8 h 瞰j ，光导引活动性节律的上下限，尚可深入探讨。 此外，本研究尚证实，不同光暗循环可影响小鼠每小时平均 活动性，l d 7 7 及l d l 6 1 6 组活动性均高于2 4 h 组，与文献报道一 致( 3 3 1o 光线变化对小鼠平均活动性的影响，可能为近日系统及掩 盖效应共同作用的结果，不过，具体机制尚未明了。c a m p u z a n oa 等报道，在7 个不同光暗周期下( 2 1 2 7 h ) ，观测小鼠的平均活 动性，结果以2 4 与2 5 h 组最低，二者中，( 指一天中活动性高 于平均的时刻) 与暗相的开始时间重叠，它们之间相位角的绝对值 亦最低，表明在2 4 及2 5 h 光暗循环下，与暗相一致；而余组平 均活动性均高于2 4 及2 5 h 组，n 与暗相开始时间不重叠，且相位 角绝对值均更高，提示平均活动性的大小同a 与暗相的一致程度有 关。不同光暗循环影响小鼠平均活动性的机制，尚可进一步探讨。 第二部分不同光暗循环周期对小鼠白细胞 计数及分类计数的影响 1 。材料和方法 1 1 材料 1 1 1 仪器光学显微镜；血球计数板；载玻片 1 1 2 试剂 ( 1 ) 白细胞稀释液：冰醋酸l m l 加l o g l 龙胆紫数滴，再加蒸馏 水至l o o m l 。 ( 2 ) 瑞氏染液：瑞氏染料l g 加甲醇6 0 0 m l 。 ( 3 ) 磷酸盐缓冲液( p h 5 2 ) ：磷酸十氢钾0 3 9 加磷酸氢二钠0 2 9 ， 再加蒸馏水1 0 0 0 m l ，配成后用磷酸盐调至p h 5 2 。 1 2 方法 1 2 1 动物饲养健康三周龄i c r 雄性小鼠1 4 4 只，由中国医学 科学院成都分院实验动物中心提供。随机分为3 组，每组4 8 只。 与活动性的检测一样，每组亦采用不同的光暗循环条件，分别为 l d 7 7 、l d l 2 1 2 和l d l 6 1 1 6 。l d l 2 1 2 组于6a m 至6p m 光照， 于6p m 至6a m 黑暗。将小鼠置于大小、构造相同的三个饲养盒 内，自由饮水进食，室温维持在2 2 2 ，隔离外界光线和噪声， 饲养6 周。 1 2 2 样品采集小鼠在不同的光暗循环条件下，饲养6 周后分批 采血，其中l d 7 7 与l d l 2 1 2 组于6 ：0 0 ，1 0 ：0 0 ，1 4 ：0 0 ，1 8 ：0 0 ，2 2 ：0 0 ，2 ：0 0 各采集一组样品，每组6 只：l d l 6 1 6 组除上述6 个点外，加采次日6 ： 0 0 ，1 0 ：0 0 两个点，每组亦6 只。乙醚麻醉后，眼球取血2 0 u l ，擦去枪 头外余血，立即加入0 3 8 m 1 1 刍细胞稀释液中，混匀备用。另眼球取 血1 滴立即制成血涂片，晾干备用。 1 2 3 白细胞计数检测 ( 1 ) 用枪头吸取少量混匀液至血球计数板中，静置2 3 分钟， 使血细胞下沉。 ( 2 ) 用低倍镜计数四角的四大方格中白细胞总数。 ( 3 ) 按下式计算小鼠外周血中的自细胞总数： 白细胞数l = ( 四大方格内白细胞总数1 0 ) 2 0 1 2 4 白细胞分类计数检测血涂片加瑞氏液2 4 滴，固定 o 5 1 r a i n ，再滴加等量缓冲液与染料混匀，染色1 0 1 5 r a i n 。用蒸 馏水冲去染液，待其自然干燥。选择血片体尾交界处染色良好区域， 在高倍镜下，按一定顺序移动视野，据形态特征对1 0 0 个白细胞进 行分类计数。 1 2 5 统 汁分析单因素方差分析比较自细胞计数及分类计数 各时间点差别及组间差别。采用余弦分析法，对测定结果按下述余 弦方程拟合： f ( t ) = m + ac o s ( t + 庐) 式中m 为中值，即涨落变化的中线；a 为节律振荡的振幅， 表示上下波动幅度；u 为角速度( 3 6 0 。2 4 h ) ：中为峰值位相，即 2 0 振荡到达峰值的时刻。 2 结果 2 1 不同光暗循环周期对小鼠外周血白细胞计数节律 的影响 在l d l 2 1 2 组中，白细胞计数各时点比较有显著性差别 ( f = 9 9 8 8 1 a o 0 0 0 1 ) ，提示存在节律性，而l d 7 7 ( p = o ，0 9 3 ) 及 l d l 6 1 6 ( p = o 1 1 4 ) 组各时点比较无统计学差别，不存在节律性。 l d l 2 1 2 组余弦拟合后，近日节律峰值位相为- 2 3 8 1 7 8 ，峰值时间为 9 ：5 3 ，峰值位于明相( 见表1 ) 。白细胞计数随时间变化趋势，如图 5 所示。 表1 白细胞计数与分类计数近日节律的平均余弦法参数 o o h 一 u 芒 a o u u 1 2 1 0 8 6 4 2 o 6 ：0 01 0 ：0 01 4 ：0 01 8 ：0 02 2 ：0 0 2 ：0 06 ：0 01 0 ：0 0 图5 小鼠外周血白细胞计数随时间变化趋势 ( 白蘩代表l d l 2 1 2 组明相，黑条代表l d l 2 1 2 组暗相下同，恕不赘述) 2 2 不同光暗循环周期对小鼠外周血白细胞计数大小 的影响 单因素方差分析示，白细胞计数的大小在三组间的差别有统计 学意义( 庐6 3 0 6 ，p = 0 0 0 2 ) ，以l d l 6 1 6 组最高，l d l 2 1 2 组次 之，l d 7 7 组最低( 见图6 ) 。两两比较结果，l d 7 7 组与另外两组 差别有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 2 3 不同光暗循环周期对小鼠外周血白细胞分类计数 节律的影响 在l d l 2 1 1 2 组中，白细胞所有分类各时点比较均有显著性差别： 提示存在节律性，而l d 7 7 及l d l 6 1 6 组各时点比较均无统计学差 别，不存在节律性( 表2 ) 。l d l 2 1 2 组行余弦拟合后，中性粒细胞 峰值位相为- 2 4 4 1 9 4 ，峰值时间为2 2 ：1 7 ，峰值位于暗相：淋巴细 胞峰值位相为2 4 0 5 3 l ，峰值时间为1 0 ：0 2 ，峰值位于明相；单核 细胞峰值位相为1 1 1 1 8 ，峰值时间为1 3 ：2 5 ，峰值位于明相；嗜酸 性细胞峰值位相为一1 1 6 7 0 8 ，峰值时间为0 l ：4 7 ，峰值位于暗相； 嗜碱性细胞峰值位相为- 1 0 2 6 6 3 ，峰值时间为1 2 ：5 1 ，峰值位于明 相，详见表l 。白细胞分类随时间变化的趋势，如图7 1 1 所示。 l d 7 7 一 图6 不同光暗循环周期对小鼠外周血自细胞计数的影响 8 6 4 2 o 一1obi一芒nou釜 表2 小鼠外周血白细胞分类组内各时点比较结果 9 0 8 5 8 0 7 5 阳 6 5 6 ：0 0l o ：0 01 4 ：0 01 8 ：0 02 2 ：0 02 ：0 0 6 ：0 01 0 ：0 0 l ：! ：! ! ! ! ! 塑! ! ! ! ! 二! ：业! ! ! ! ! j 图7 中性粒细胞分类百分比随时间变化趋势 6 ：0 01 0 ：0 01 4 ：0 01 8 ：0 02 2 ：0 02 ：0 0 6 ：0 0l o ：0 01 4 ：0 0 f i ：i 6 衫丁二i 面芴f = o ：。l 1 6 ) i 6 ： 图8 淋巴细胞百分比随时间变化趋势图 唧 黜 慨 矾 嘶 6 ：0 0 1 0 ：0 01 4 ：0 01 8 ：0 02 2 ：0 0 2 ：0 06 ：0 01 0 ：0 0 4 l：!：!一+ldl212-ldi!盟 图9 单核细胞百分比随时间变化趋势图 6 ：0 01 0 ：0 01 4 ：0 0 - 。 j l d 7 7 1 8 ：0 02 2 ：0 02 ：0 0 6 ：0 01 0 ：0 0 土l d l 2 1 2 _ _ 生l d l 6 1 6 图l o 嗜酸性细胞百分比随时间变化趋势图 讹 聃 强 驰 埔 溅 o 8 o 6 0 4 0 2 0 o 一0 2 6 ：0 01 0 ：0 01 4 ：0 0 1 8 ：0 02 2 ：0 02 ：0 06 ：0 01 0 ：0 0 f i _ 五而f j i 五函西= ；i 而丽6 图l l 嗜碱性细胞分类百分比随时间变化趋势 2 4 不同光暗循环周期对小鼠外周血白细胞分类计数 大小的影响 单因素方差分析显示，中性、淋巴、嗜碱性细胞百分比三组间 比较有统计学意义，中性以l d l 2 1 2 组高，l d l 6 1 1 6 组次之，l d 7 7 组最低：淋巴以l d 7 7 组最高，l d l 6 1 6 组次之，l d l 2 1 2 组最 低；嗜碱性以l d l 2 1 2 组最高，l d l 6 1 6 组次之，l d 7 7 组最低。 两两比较结果均为l d l 2 1 2 组与另外两组差别显著，l d 7 7 与 l d l 6 1 6 差别无统计学意义；单核、嗜酸性细胞百分比三组间比较 无统计学差别( 见表3 ) 。 2 7 表3 不同光暗循环周期对小鼠外周血白细胞分类 计数的影响( 2 s ) 说明：+ 与l d 7