（生物医学工程专业论文）基于界面性质控制制备光纤探针的研究.pdf

a g 作为光纤探针表面金属膜包覆的材料。为了满足细胞检测的要求，采用化学镀a g 和超卢探针顶 部开口的方法。制备了顼部具有金属i l 洞的银膜包覆探针。基于不同工艺得到的银膜包覆探针开口 率和开口尺寸，筛选出较佳的工艺条件。这样制备的探针解决了光泄漏和完整金属镀层的探针光通 过率低的问题，得到了较大通光率的光纤探针。 3 银包覆探针表面的自组装研究( i 卜银表面混合分子的自组装以及膜中分子含量的控制与测量：考 虑探针表面银镀层氧化会导致探针使用寿命短和探针的生物相容性等问题，选择适当的分子对a g 进行表面修饰。为了定量测量的需要，以新鲜制备的银纳米颗粒为模板，在设定组装分子溶液浓度 的条件下，通过3 - m p t 和c 1 s h 3 7 s h 两种分子的交换和竞争吸附，制备了不同组成的混合自组装单 层膜( s a m m ) ，定量测试结果表明，温度对交换吸附反应的影响较小，而对竞争吸附反应的吸附 量和吸附行为影响较大，从热力学和动力学角度对竞争吸附行为进行了解释。 4 银包覆探针表面的自组装研究( i i 卜s a m m 对界面反应的影响以及膜中分子及其键合状态的分 析：根据上一章对混合膜中分子数量定量研究结果的比对，选择2 5 。c 作为温度条件。为了便于测 试，以银片和银圆盘电极为模板，通过交换和共吸附反应在银表面组装了单分子混合膜，并进行水 解使硅甲氧基转化成硅羟基。利用接触角测量、电化学循环伏安和x 射线光电子能谱( x p s ) 。分析 了银表面水解后的s a m m 中分子键合状态和膜对界面反应的影响。结果表明，交换和共吸附反应所 得到的s a m m ( 分别记为s a m m ( i ) 和s a m m ( i i ) ) 中，分子密度及其键合状态存在差异，但 对界面反应的影响相近。 5 银包覆探针表面的自组装研究( i 卜一聚合物在3 - m p ts a m s 和s a m m 表面的自组装及其表征： 根据前章的结果，选择含有较多硅羟基的3 - m p ts a m s 和s a m m ( i ) 作为共聚物修饰的对象。内 容包括：乙烯基咔唑一与甲基丙烯酸甲腊共聚物的合成和表征；共聚物在3 - m p ts a m s 和s a m m 表 面的组装以及复合膜膜厚的x p s 分析、动态力学热分析( d y n a m i cm e c h a n i c a lt h e r m a la n a l y s i s ， d m t a ) 测试和电化学分析等。聚合物层的厚度在一定范围内取决于表面硅羟基含量，通过选择不 同的单分子层可达到控制聚合物层厚度的目的，如选择3 - m p ts a m s 与共聚物键合组装，可形成较 厚的复合膜。s a m m ( i ) ，共聚物系统的膜厚较小，但膜阻较大。 6 银包覆探针表面的自组装研究( 1 v 卜氓膜界面阳极溶解反应和氧化过程的电化学阻抗谱分析：用 电化学方法对a g 表面修饰层的抗氧化性进行研究。以自组装膜修饰的银圆盘电极为工作电极，以 1 0 n a o h 水溶液为支持电解液，在外加微扰正弦信号的条件下，对a g 电极在腐蚀电位和钝化电位 范围的电极过程进行了系统的电化学阻抗谱( e i s ) 测试和分析，上述电极过程均具有两个以上的时 间常数。结合s e m 解释了电极表面在过程反应中发生的变化，并用x - 射线衍射( x r d ) 对电极表面的 生成物进行了鉴定。分析结果表明，共聚物修饰的s a m m a g ( c s a f ( i f ) ) 在较低的氧化电位下 具有优越的抗氧化能力，而共聚物修饰的3 0 m p ts a m s a g ( c s a f ( 1 ) ) 则在整个氧化电位范围均 显示出稳定的抗氧化能力。 7 银膜包覆探针及其修饰膜的生物相容性：对修饰和未修饰银膜包覆探针的生理盐水浸提液和 r f m l l 6 4 0 培养基浸提液进行了体外( i nv i t r o ) l - 9 2 9 细胞的生长形貌观察、细胞毒性试验和新鲜人 血的溶血实验。初步试验结果表明，所有探针均具有良好的细胞相容性，预计在细胞检测中对细胞影 响很小。 i l l a b s t r a c t s i g n i f i c a n ta t t e n t i o ni sf o c u s e do nt h eo p t i c sa p p l i c a t i o ni nt h es t u d i e so fa l i v ec e l lf o ri t ss m a l l e r i n j u r yo nc e l la n dc r e d i b l er e s u l t t oa c h i e v et h eo p t i cd e t e c t i o ni ni n d i v i d u a lc e l l ，i ti sp r e r e q u i s i t ef o r o p t i c a ld e t e c t o rt ob et i n yv o l u m e ，h i g h l yo p t i c a lc o l l e c t i o n - e f f i c i e n c y , l o wn o i s ea n dl i g h tb a c k g r o u n d a s t h e b i o s e n s o r o f o p t i c t r a n s f e r a n d m e a s u r e m e n t , s u i t a b l e p r o f i l eo f f i b e r p r o b e i se s s e n t i a l f o r i m p r o v e m e n t o f o p t i c a lc o l l e c t i o n - e f f i c i e n c y p e n c i l - l i k ef i b e rp r o b e sw i t hc o n t r o l l a b l ep r o f i l ew d t ep r e p a r e db yt h ec h o i c eo fc o v e r l a y e r sa n d e t c h i n gt i m ea te t c h a n t c o v e r l a y e d i f f u s i o nt h e o r yw a sa p p l i e di ne x p l a i n i n gt h ee f f e c to f d i f f u s i o no n t h e s i z ea n dp r o f i l eo fp r o b e a g - c o a t i n g - p r o b ew i t ha p e r t u r ea ti t sa p e xh a sb e e no b t a i n e db ym e a n so f ( 3 - m e r e a p t o p r o p y ) t r i m e t h o x y s i l a n e ( h s c a i k s i ( o c h 3 ) 3 ，3 - l v l p ds a m s a s s e m b l e do nf i b e rp r o b es u r f a c e a n dc h e m i e a lp l a t i n gs i l v e ru n d e ru l t r a s o n i cc o n d i t i o n c o n s i d e r i n gt h es h o r t e rh o l dt i m ed u et oo x i d a t i o n o fs i l v e rc o a t i n ga n dc y t o c o m p a t i b i l i t yo fp r o b e ，3 - m p ta n d1 - o c t a d e c a n e t h i o l ( c 1 5 h 3 7 5 h ) w e r eu s e dt o c o n s t r u c tt h es e l f - a s s e m b l e dm i x e dm o n o l a y e r s ( s a m m 、a n dm o r e o v e r , c o - p o l y m e r sc o m p o s e do f n - v i n y l c a r b a z o l e ( v c z ) a n d m e t h y i m e t h a n r y l a t e ( m m a ) w e r e d e p o s i t e d o n 3 - m p t s a m s o r s a m m t o f o r mi n e r tm u l t i l a y e rp o l y m e rf i l m s - - - c o m p l e xs e l f a s s e m b l e df i l m s ( c s a f ) 0 1 1s i l v e r 3 - l v l p ts a m sc a n a l s ob ef o r m e do nf i b e rs u r f a c eb ym e a n so fh y d r o l y z e ds i ( o c h 3 bg r o u po nh y d r o x y l s i 0 2 ，w h i c h p r e v e n t st h ea p e xo f t i p s 矗o mt h ed e p o s i t i o no f c o - p o l y m e r t h et h i c k n e s so f c o - p o l y m e rc a nb ec o n t r o l l e d b ya u g m e n to rd i m i n i s h m e n to f s i ( o h ) 3o na gt os o m ee x t e n t t h ed i s s e r t a t i o ni sc o m p o s e db yf o l l o w i n gc h a p t e r s ： 1 e f r e c to f t h ei n t e r f a c ep r o p e r t i e so np r o f i l eo f f i b e rp r o b e s ： i nt h i sc h a p t e r , t h ep r o f i l e sa n dt h e i rc h a n g e so f p e n c i l l i k ef i b e rt i p si ns t a t i cc h e m i c a le t c h i n gp r o c e s s h a db e e ns t u d i e dw i t hs e v e r a lc o v e r l a y e r - e t e h a n ts y s t e m a t i c a l l y o c t a n e ，p a r a x y l e n e , o t e i ca c i da n d n - x y l e n ew o r ec h o s e na sc o v e r l a y e ra c c o r d i n gt ot h e i rn a t u r e ss u c ha ss u r f a c et e n s i o n 。s o l u b i l i t y , m o l e c u l a r v o l u m ea n dp o l a r i t i e s t h ei n t e r f a c et e n s i o n so fc o v e r l a y e x h fa q u e o u ss o l u t i o nw e r et h e nc a l c u l a t e db y f u - j u - f um e t h o db e c a u s et h ei n t e r f a c et e n s i o n so f c o v e r l a y e r i - i fa q n e o n ss o l u t i o ni sd i f f e r e n tf r o mt h a to f a i r 艘fa q u e o u ss o l u t i o n , a n dt h ec o n eh e i g h t so f t h ep r o b e sw e r ea l s oc a l c u l a t e dw i t ht h ej n t e r f a c el a n s i o n c o m p a r e t ot h ec a l c u l a t i o nv a l u ea n de x p e r i m e n tv a l u ea b o u tc o n el e n g t h , w h e t h e ra d d a ds u r f a c t a n to rn o t , w ef o u n dt h a tt h es o l u b i l i t yo fi - i fa q u e o u si nd i f f e r e n to r g a n i cp h a s e sa n dd i f f u s i o ni nt w op b a s e sp l a ya v e r yi m p o r t a n tr o l ei nt i p sp r o f i l e i th a sb e e nc o n c l u d e dt h a td i f f u s i o ni sa n o t h e ri m p o r t a n tf a c t o rw o r k i n g o nt h ep r o f i l eo f p r o b e s 2 p r e p a r a t i o no f s i l v e r i n gp r o b ew i t hs i l v e ra p e r t u r ea tt h et o po f p r o b e ： c o n s i d e r i n gt h ec y t o c o m p a t i b i l i t ya n db o n d i n ga b i l i t yw i t hs o m eg r o u p so f c o m p o u n d s , m e t a ls i l v e r , i nt h i sc h a p t e r w a su s e d 硒t h ec o a t i n gm a t e r i a lo fp r o b e i no r d e rt oa v o i dt h el i g h tl e a k a g ea n dm e e tt h e n e e do fi n d i v i d u a lc e l ld e t e c t i o n , p r o b e sw i t hs i l v e rc o a t i n ga n da p e r t u r ea tt h et o pw e r ef a b r i c a t e dw i t ht h e h e l po fc h e m i c a lp l a t i n ga n du l t r a s o n i c a c c o r d i n gt ot h ey i e l do fs i l v e r i n gp r o b ew i t ha p e r t u r ea tt h et o p a n dt h es i z eo f a p e r t u r e ，w ef i l t e r e db e t t e rp r o c e s so u ti nd i f f e r e n tt e c h n i q u e s t h ep r o b e sp r e p a r e di nt h i s w a yh a v eh i g h e rl u m i n o u sf l u xa n dt h el e a k i n go f l i g h tw a sa l s os o l v e dp r e f e r a b l y 3 s a s t u d i e so ns i l v e r i n gp r o b es u r f a c e ( i 卜一c o n t r o la n dq u a n t i t a t i v em e a s u r e m e n to f t w om o l e c u l e si n s a m mo ns i l v e r ： c o n s i d e r i n gt h eo x i d a t i o na n dc y t o c o m p a t i b i l i t yo fs i l v e rc o a t i n gp r o b e , i ti sn e c e s s a r yf o rs o m e a p p r o p r i a t em o d i f i c a t i o no ns i l v e r i n gp r o b es u r f a c e i nt h i sc h a p t e r , s a m mc o n s i s t e do f3 - m p ta n d c l s h 3 7 s hw a sf a b r i c a t e db ym e a n so fe x c h a n g ea n dc o m p e t i t i v ea b s o r p t i o no na ga tg i v e nc o n c e n t r a t i o n s i v s o l u t i o u s t h ea gp o w d e rw a sc h o s e na sf i l et e m p l a t ei no r d e rt om e a tt h en e e do fq u a n t i t a t i v e m e a s u r e m e n t t h ec h a n g eo ft w oc o m p o u n d sa n dt h ec o l r a a ta n g l eo na gs l i r f a c ea g a i n s tt i m ew e r e o b s e r v e da td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s i th a sb e e ns h o w nt h a tw h i l et h ee f f e c to ft e m p e r a t u r eo ne x c h a n g e r u a a t i o ni sl e s s ，t h e r ei sl 盯g e rt e m p e r a t u r ee f f e c to nc o m p e t i t i v er e a c t i o n t h eb e h a v i o ro fc o m p e t i t i v e a b s o r p t i o nh a sb e e na n a l y z e df r o mt h ep o i n t so f v i e wo f t h e r m o d y n a m i c sa n dk i n e t i c s 4 s as t u d i e so ns i l v e r i n gp r o b es u r f a c e ( i i 卜a n a l y s i so f m o l e c u l e sa n d1 1 ”i r b o n d i n gs t a t e si ns a m m h y d r o l y z e da n dt h ee f f e do f s a m mo ni n t e r f a c er e a c t i o n ： a c e o r d i n gt or e s n i t sa b o u tt h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so ft w om o l e c u l e si nt h em i x e df i l m i np r e v i o u s c h a p t e r , w ec h o o s e2 5 ca st h et e m p e r a t u r ec o n d i t i o n s a m m ( 0a n ds a m m ( 1 1 ) w e r ep r e p p e db y e x c h a n g e a n dc o - a b s o r p t i o n r e a c t i o n o n a g a t k r t h 观t h e f u n c t i o n a l g r o u p s i ( o c h 3 b w a s w a n s f o r m o d t o s i ( o h ) 3b ym e a n so fh y d r o l y s i sr e a c t i o n w mt h eh e l po fm e a s i l r e m e mo fc o n t a c ta n g l e ，c y c l i c v o l t a m m a t r y ( c v ) a n dx - r a yp h o t o c l e c w o ns p e c t r u m , b o n d i n gs t u t e so f 3 m p ta n dc t s h 3 7 s hi ns a m m h y d r o l y z e dw c l ea n a l y z e da n dt h ee f f e c to fs a m m o ni n t e r f a c er e a c t i o nw a sa l s ob e e no b t a i n e da sw e l l w ef i n dt h a ts a m m sf a b r i c a t e db ve x c h a n g ea n dc o - a b s o r p t i o n , e x i s ta l m o s tt h es 硼ei n f l u e n c e so n i n t e r f a c er e a c t i o n a l t h o u g ht h e i rb o n d i n gs t a t e sa n dc o r l t e n ti nm o n o l a y e ra r ed i f f e r e n t 5 s as t u d i e so ns i l v e r i n gp r o b es u r f a c e ( 1 l i h h a r a c t e r i s t i c so fp o l y m e rm u l t i l a y e rf a b r i c a t e do n 3 - m 盯s a m s s i l v e ro rs a m m ，s i l v e r a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so fe l e c t r o c h e m i s t r yc vm e a s l l r e m e n ti np r e v i o u sc h a p t e r , b e t hs a m m ( i ) a n ds a m m ( i da a l m o s tt h es a m ee f f e c to ni n t e r f a c er e a c t i o n 3 m p ts a m sa n ds a m m ( i ) w e r ec h o s e n a st h es u b s t r a t e sf o rf u r t h e rm o d i f i c a t i o no fp o l y m e r sb e c a u s eo ft h e i rc o n t a i n i n gm o r ef u n c t i o n a lg r o u p - s i ( o h ) 3 i nt h i sc h a p t e r , t h es y n t h e s i sa n dc h a r a c t e r i s t i c so f c o p o l y m e r sc o n t a i n i n go f v c za n dm m a t h e f a b r i c a t i o no fc s a f x p sa n a l y s i sa n de a i c u l a t i o no ft h ef i l mt h i c k n e s s 。d y n a m i cm e c h a n i c a lt h e r m a l a n a l y s i s ( d m l ：a 1o fc s a fa n dc vm e a s u r e m d l ra r ei n e l u d e d 1 1 t h i c k n e s so fc s a fc a l lb ec o n t r o l l e d a tac r t a i ne x t e n tb yc h o i c eo fm o n o l a y e r f o re x a m p l e ，t h et h i c k e rc o p o l y m e ru p p e rl a y e ro n3 - m p t s a m st h a no l ic o p o l y m e r s a m m ( i ) c b ea t t r i b u t e dt ot h em o r e s i ( o h ) 3 f u n a t i o n a lg r o u po ns u b s t r a t e 6 s as t u d i e so ns i l v e r i n gp r o b es u r f a c e ( i v ) - e 1 sa n a i y s i so fc o r r u s i o na n da n o d er e a c t i o no n f i l m - a gi n t e r f a c e ： i nt h i sc h a p t e r ，t h ee l e c t r o d ep r o c e s s e si nt h er a n g eo f c o r r o s i o np o t e n t i a la n dp a s s i v a t i o np o t e n t i a lo f b a t es i l v e rd i s ke l e c m x l ea n das e r i e so fa gd i s ke l e c t r o d e sm o d i f i e db ys e l f - a s s e m b l e dl a y e r sm e n t i o n e d p r e v i o u s l y , w e r em e w e ds y s t e m a t i c a l l yb ye 1 si n1 0 n a o ha q u e o u ss o l u t i o nw h i l et i n ys i n ew a v e i n t e r f e r e n c es i g n a la d d e d i th a sb e e nf o u n dt h a ta l le l e c t r o d ep r o c e s s e sa b o v em e n t i o n e dw e r em o r et h a n t w ot i m ec o n s t a n t s ，n a m e l yt h ep r o c e s s e sw e r ec o n t r o l l e db ym o r et h a nt w of a c t o r s 删si st h e r e f o r e ，t h e c h a n g e so f b a r ea ga n da l lm o d i f i e da g s u r f a c et a k i n gp l a c ei ne l e c t r o d ep r o c e s sw e r ee x p l a i n e dc o m b i n e d w i 恤s e mo b s e r v a t i o n , a go x i d ew a si d e n t i f i e db yx r d 3 - m p ts a m s a gm o d i f i e db yc o p o l y m e r s ( c s a f ( i ) ) s h o w st h es t a b l er e s i s t a n c et oo x i d a t i o ni nl a r g ep o t e n t i a lr e g i o n , s a m m a g m o d i f i e db y c o p o l y m e r s ( c s a f ( i d ) s h o w si t so u t s t a n d i n gr e s i s t a n c ea g a i nt oo x i d a t i o na tl o w e ro x i d a t i o np o t e n t i a l ，b u t i si n f e r i o rt ot h a to f c s a fo ) a th i g h e ro x i d a t i o np o t e n t i a l 7 b i a c o m p a t i b i l i t ye v a l u a t i o no f b a r ea n dm o d i f i e ds i l v e r i n gp r o b e ： b a r ea n dm o d i f i e ds i l v e r i n gp r o b ew a si m m e r s e di n t op h y s i o l o g i c a ls a l i n ea n dc u l t u r ef l u i dt oa c q u i r e l i x i v i u m l 9 2 9m o u s ef i b r o b l a s t i cc e l l sw e r ec u l t u r e di nt h el i x i v i u ms 0 1 i o n , a n dt h e i rm o r p - h o l o g y , g r o w t ha n dp r o d u c t i o nw e r eo b s e r v e d m t ta s s a ya n dh e m o l y s i st e s tw e r eu s e dt oe v a l u a t et h ei nv i t r o c y i t o x i c i t ya n db l o o dt o x i c i t yr e s p e c t i v e l y r e s u l t ss h o wt h a tt h ec y t o t o x i c 酊o f a l lp r o b e sw a sb a t w n o 1d e g r e e a n dt h eh e m o l y s i sr a t i ow a sb e l o w5 a l lp r o b e sm a yb ee x p e c t e d 协h a v es l i g h t c y t o t o x i c i l y a n d h e m o l y s i s i n t h e p r o c e s s o f c e l ld e t e c t i o n v 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：盘坠 日期：丝：曼：乡 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位 论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论 文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包 括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：壶坠导师签名：诹日期： 第一章绪论 第一章绪论 2 0 世纪生命科学领域中细胞生物学和分子生物学的两大飞跃，使人类对生命本质的认识达到了 一个前所未有的高度。 细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单位，考察细胞的结构和功能，探索细胞的生命活 动，是了解生物体生命活动规律的基础。由于细胞生物组织的不均匀性，同种细胞的大小、形状、 生物活性及生理状态等的差异，由细胞群体分析获得的统计平均结果，不能反映单细胞之间的差异， 导致了生物学及医学等很多领域的发展受到了限制。随着生命科学研究的不断深入和发展，对生物 活体的研究己从动物深入到对器官、细胞，又从细胞深入到了对亚细胞( 细胞质、细胞膜、囊泡) 、 突触等微环境的分析，成为2 1 世纪生物，生物医学和分析化学前沿研究热点之一。 4 0 年前m a t i c l i 1 1 等报道了分离和直接观察单细胞中的血红蛋白方面的工作并提出微薄层色谱、 气相色谱、质谱、高效液相色谱、电化学检测及酶放射性标记法等细胞分析方法，这些方法由于灵 敏度不够或对测定组分的限制而无法得到广泛应用 2 - 5 1 1 9 7 6 年，n e h e r 和s a k m a n n 开发了可以检测单个离子通道的膜片钳( p a t c hc l a m p i n g ) 技术，用 于单细胞神经生理学研究取得了很大的成功 6 1 ，于1 9 9 2 年获诺贝尔生理学和医学奖。 1 9 8 8 年e w i n g 首次采用毛细管电泳分析无脊椎动物蜗牛的单个神经细胞 7 1 ，大大促进了单细 胞分析的发展肛”j 。近几年来，单细胞的分析方法学已发展到微流控芯片分析法、图像分析法( 多种 光学、扫描点电化学、质谱、原子力显微镜、扫描隧道显微镜等) 和实时动态检测分析法等。荧光 探针和纳米技术的应用，使单细胞分析手段呈现日新月异的景象。 1 1 光纤生物传感器在单细胞分析中的应用 活细胞单分子行为及实时检测研究是生命科学向微观世界深入探索的一个重要标志。活细胞各 种生化反应的实时动态检测，要求高的时间分辨率和空间分辨率，已成为单细胞分析中的熟点。近 几年已有大量有关电化学方法检测单细胞释放以及细胞内分子反应过程的研究报道【1 6 - 2 7 1 。各种高灵 敏显微成像技术的发展，使光学探针在细胞的精细结构观察、细胞内分子高灵敏实时动态检测以及 单细胞分子反应研究等方面起着不可替代的作用，有关这方面的报道正在迅速增长 2 8 - 3 7 1 。光纤传感 器将示踪染料包裹于聚合物基质中。细胞中的离子可以自由穿过基质与示踪染料结合而染料却无法 穿过聚合物基质，克服了传统示踪染料一般具有细胞毒性或能与细胞内物质发生鳌合作用、与蛋白 质键合或能够从细胞中渗漏出来而干扰检测结果的缺陷。小的尺寸又能使探针在检测过程中对细胞 没有或仅有轻微损伤。 第一章绪论 根据感受器与待测物质之间反应的不同，光纤纳米生物传感器可分为光纤纳米荧光生物传感器 件和光纤纳米免疫传感器件等。 构建将感受的生物化学信息转换成荧光信息变化而输出的光纤纳米荧光生物传感器，是基于一 些蛋白质类生物分子本身能够发出荧光，或通过标记、修饰发出荧光。这方面的工作，最早见于 k o i ) e l m a n i ”1 等在1 9 9 2 的报道。他们在光纤末端修饰一种敏感于p h 变化的荧光染料聚合物，以检测 样品中的p h 值。通过对制成的该光纤纳米荧光生物传感器的检测范围、响应时间、使用寿命以及 稳定性等进行研究，发现特别适合于单个细胞和亚细胞结构的检测。对胚胎细胞p h 值的测定得到 了较好的结果。 b a r k e r 等f ”1 构建了一类n o 传感的光纤纳米荧光生物传感器，并将这种光纤纳米传感器件应用 于小鼠巨噬细胞内n o 水平的检测。当光纤探针用吸附了荧光素衍生试剂的纳米金修饰后删，对n o 的选择性、响应性、稳定性均得到了很大的改善，且具有完全可逆的特点。 光纤纳米荧光生物传感器具有荧光分析特异性好，敏感度高等优点，无需使用参比电极，在单 细胞分析中具有广泛的应用前景。 光纤探针还可用做于光纤纳米免疫传感器件。这类传感器件是将光学技术与免疫学结合，利用 抗原抗体特异性结合的性质，将感受到的生物化学信息转换成可用光学输出信号的一类传感器。具 有很好的特异性、稳定性和灵敏性，光纤纳米免疫传感器件将敏感部分的尺寸“纳米”化，因此特 别适合于单细胞的分析。 有关这方面的代表性工作是d i n h 等m ”1 研制的用于苯并比呋喃( b e n z o p y r e n e t e t r o l ，b p t ) 检 测的光纤纳米免疫传感器件。他们将传感器头部的探针上结合了特异性单克隆抗体，通过抗原抗体 特异性结合对单细胞内的生物化学物质进行检测，有望用于检测活细胞中的蛋白和其他生物化学物 质。 在传感器头部的探针上联接抗细胞色素c 的抗体，结合酶联免疫分析( e l i s a ) 对m c f - 7 细胞 中的细胞色素c 的释放进行监测1 4 ”，其灵敏性由于酶联反应的放大作用而得到很大的提高。为在细 胞水平上调查细胞凋亡提供了新的思路与方法 4 4 1 。 光纤纳米免疫传感器件可弥补目前常规免疫检测方法不能进行定量检测的缺点，同时还能实时 监测抗原抗体反应。无需进行检测前的一系列分离步骤，便于抗原抗体反应的动力学分析。此外， 相对于其他传感器，具有更高的特异性，可用于细胞内物质的检测。 1 2 光纤探针的制备及其研究进展 研究具有生物活性、灵敏度高、选择性好、不损伤活细胞、使用寿命长、尺寸小及价格低廉的 探针针尖，是改善和提高传感器的性能，实现单细胞实时动态检测的关键之一。因此，构造理想的 2 第一章绪论 光纤纳米探针是开发光纤纳米传感器及其应用的一个重要的先决条件。 探针有孔洞型和实心型两种，后者主要以光纤作为探针的主体材料。一般采用单模光纤研制而 成，其尖端为锥形，孔洞直径在5 0 r i m 左右，即亚波长尺度，用做纳米光源或微收集器。光信号通 过光纤传输，达到信号传感的目的。4 种典型的光路图如图1 1 ( a d ) 所示嘲。在a ) 中，当入射光 在衬底表面发生全反射时，在z 方向的隐失场被样品调制后由光纤探针在近场范围导出；在b ) 中， 光纤探针用来提供近场光源，来自样品的光信号再由光学系统( 镜头) 传到探测器；c ) 采用外部光 照射，而光纤探针收集来自样品表面反射产生的散射光；而d ) 是由光纤探针提供入射光，并由一 个环型收集器，如反光镜将较大立体角范围的散射信号收集并送至探测器。以上四种光路从本质上 可以分为两类：一类是入射光为远场提供，而采集隐失场信号，如a ) 和b ) ；另一类是探针提供近场 光源，用普通光学系统收集信号，如c ) 和d ) 。 f i 蛋1 - 1 p h o t i cr o u t eo f o p t i c a ls i g n a lt h r o u g ht h ef i b e rp r o b e 探针的尖端尺寸和锥尖角度直接决定光的传输效率、分辨率和成像效果，尖端尺寸越小，分辨 率越高，锥尖角度越大，透光率越高，因此，如何可控、可重复的制备各种尺寸和角度的光纤探针 成为关注的焦点。 为了获得高质量的光纤探针，国内外许多研究组对光纤探针的制备做了大量的工作。目前，应 用最广的是利用单模光纤制备的探针，这种探针的光透过率比早期的镀膜石英棍或中空微玻璃管提 高了4 到5 个数量级。制备光纤探针的主要方法有加热拉伸法1 4 6 4 s j 、选择性化学腐蚀法1 4 9 - 5 ”、微 管化学刻蚀法嘲、动态刻蚀法1 5 3 。6 l 、静态化学刻蚀法【”- 6 0 l 、以及微机械法和纳米刻蚀法1 6 1 - 6 6 等( 图 1 2 1 。 加热拉伸法( h e a t i n g - p u l l i n gm e t h o d s ) 的基本原理是利用市售的微管拉伸机( 如s u t t e ri n s t r u m e n t p - 8 7