（生物医学工程专业论文）基于纳米金粒子的PCR方法研究.pdf

上海交通大学博士学何论文理作用、催化作用和生化调控等作用的研究向纵深方向发展，更重要的，还将为相关研究者开拓一个广阔而崭新的纳米生物化学研究领域，并为人工纳米生物分子复合体系的构建及应用提供了一条较好的参考途径。关键词：纳米金粒子，生物大分子，聚合酶链式反应( p c r ) ，纳米粒子辅助的p c r ，方法学上海交通大学博十学付论文a b s t r a c tt h er e s e a r c ho np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nm e t h o d o l o g yb a s e do ng o l dn an o p ar t i c l e sa b s t r a c tw i t hc o n s t a n td e v e l o p m e n to fn a n o t e c h n o l o g y ，m o r ea n dm o r en a n o t e c h n o l o g i e sh a v eb e e na p p l i e di nb i o m e d i c a lf i e l d t h eb l o s s o mo fn a n o t e c h n o l o g yl e a d st os u b s t a n t i v ec h a n g e si nb i o m e d i c a lf i e l dw h i c hd r a m a t i c a l l yi m p r o v e st h ee f f e c t i v e n e s so fd i s e a s ed i a g n o s i sa n dt h e r a p y h o w e v e r ，a n y t h i n gp o s s e s s e si t st w o s i d e dc h a r a c t e r s w h e nn a n o m a t e r i a l si n t e r a c tw i t hb i o l o g i c a ls y s t e m s , t h e yn o to n l yc a ng e n e r a t et h ep o s i t i v eb i o l o g i c a le f f e c t s ，b u tc a na l s og e n e r a t en e g a t i v eb i o l o g i c a le f f e c t s t h ei n v e s t i g a t i n go ft h eb i o l o g i c a le f f e c to fn a n o m a t e r i a l sh a v et h e r e f o r ea t t r a c t e ds i g n i f i c a n ta r e n t i o nf r o mr e s e a r c h e r s i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h eb i o l o g i c a le f f e c to fn a n o m a t e r i a l so nt h eb i o - c a t a l y t i cr e a c t i o ns y s t e m nv i t r o ，i nt h i sw o r k ，t h eb i o c h e m i c a lc a t a l y t i cs y s t e mc o n t a i n i n gg o l dn a n o p a r t i c l e sa n dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r )w h i c hh a si m p o r t a n ta p p l i c a t i o nv a l u e , w a ss e l e c t e df o ro u re x p e r i m e n t a lr e s e a r c hm o d e l t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h en a n o m a t e r i a l sc o u l dr e g u l a t eab i o - c a t a l y t i cr e a c t i o n nv i t r o f u r t h e rp a r t i c u l a rs t u d i e sw e r ep e r f o r m e df o rt h ep o s i t i v ee f f e c to fn a n o - m a t e r i a l si nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h en a n o - m a t e r i a l sa n db i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s a n do nt h eb a s i so ft h i st h ep r e l i m i n a r ye x p l o r a t i o nw a sc a r r i e do u tf o rt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo ft h en a n o - m a t e r i a l sa n dt h eb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s ，s ot h a tt h es p e c i a lf u n c t i o n上海交通大学协士学付论义a b s t r a c ta n ds c i e n t i f i cm e c h a n i s mo fn a n o p a r t i c l ei np c ra m p l i f i c a t i o nc o u l db er e v e a l e d o nt h eb a s i so fi n t e n s i v ei n v e s t i g a t i o n s , an e wn a n o p a r t i c l e b a s e da s s i s t e dp c r ( n p p c r ) t e c h n o l o g yw a sd e v e l o p e di nt h i sw o r k i nt h ec o u r s eo fd e v e l o p m e n to ft h i st e c h n o l o g y , t h en p p c rs i m p l eo p t i m i z i n gm o d e ls y s t e m sw e r ee s t a b l i s h e d ，a n dt h em e c h a n i s mo f n p - p c ri n t e r a c t i o nw a sa l s os t u d i e d w h i l ei nt h er e a la p p l i c a t i o no ft h ec o m p l i c a t e dp c ra m p l i f i c a t i o ns y s t e m s ，n p - p c rc o u l da l s oo p t i m i z et h ea m p l i f i c a t i o ne f f e c t i v e l ya si tw a sd o n ei nt h es i m p l es y s t e m i na d d i t i o r l ，d e p e n d i n go nc o m b i n a t i o no fn p p c rt e c h n i q u ea n dp r i m e rw a l k i n gt e c h n i q u gw eh a v es u c c e s s f u l l yc l o s e dag a pi nt h eh u m a ng e n o m ec h r o m o s o m e5 a l t h o u g ht h ed e t a i l e dm e c h a n i s mo fn p p c ro p t i m i z a t i o ni sn o ty e tc l e a r ，t h en p p c ri sv e r yi m p o r t a n ta n dv a l u a b l ef o ri m p r o v i n gt h ep c ra m p l i f i c a t i o na n de x t e n d i n gi t sa p p l i c a t i o n t h er e s e a r c ho nm e c h a n i s mo fg o l dn a n o p a r t i c l e si n v o l v e di nt h ep c ra m p l i f i c a t i o nw i l lb ep r o b a b l yag o o dm o d e la n db r e a k t h r o u g hf o rs t u d y i n gm e t h o d o l o g yo nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h en a n o m a t e r i a l sa n db i o m a c r o m o l e c u l e s o nt h eb a s i so ft h i si tc a nf u r t h e rf a c i l i t a t et h er e s e a r c h e so nt o x i c o l o g y ，c a t a l y s i sa c t i o na n db i o c h e m i c a lr e g u l a t i o na n ds oo no ft h en a n o - m a t e r i a l s f u r t h e r m o r ei tn o to n l yo p e n su paw i d ea n df i r en e wn a n o b i o c h e m i c a lr e s a r c hf i e l df o rt h er e l a t e di n v e s t i g a t o r s ，b u ta l s op r o v i d e sar e f e r e n c ea p p r o a c hf o r t h ec o n s t r u c t i o na n da p p l i c a t i o no ft h ea r t i f i c i a ln a n o - b i o - - m o l e c u l a rc o m p l e xs y s t e m 上海交通大学f 9 十学竹论文a b s t r a c tk e y w o r d s ：g o l dn a n o p a r t i c l e ( a u n p s ) ，bi o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s ，p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) ，n a n o p a r t i c l e - a s s i s t e dp c r ( n p p c r ) ，m e t h o d o l o g y上海交通大学协十学俯论文缩略渊表a f ma u n p s缩略词表a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e原子力显微镜g o l dn a n o p a r t i c l e s纳米金粒子b l a s tb a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l基于局部比对算法的搜索工具c h rd n t ph g ph b vc h r o m o s o m e染色体d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e三磷酸脱氧核糖核苷h u m a ng e n o m ep r o j e c th e p a t i t i sbv i r u s人类基因组计划乙型肝炎病毒n p p c rn a n o p a r t i c l e - a s s i s t e dp c r纳米粒子辅助的p c r ，纳米p c rp c rp e gp n ap o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应p o l y e t h y l e n eg l y c o lp e p t i d en u c l e i ca c i ds m p c rs i n g l em o l e c u l ep c rs s bs t rt n f聚乙二醇肽核酸单分子p c rs i n g l e s t r a n d e dd n a - b i n d i n gp r o t e i n单链结合蛋白s h o r tt a n d e mr e p e a t st u m o rn e c r o s i sf a c t o r短串联重复序列肿瘤坏死因子上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作日期：年上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。( 请在以上方框内打“ )学日指导教师签日期：加叩年加月日上海交通大学协十学位论史第一章前言hi_i i 鼍皇皇喜皇詈曼皇皇基皇曼曼曼皇量曼量皇曼曼皇第一章前言1 1 发展新技术，研究生命现象人类一直在了解、开发、利用自然界，同时也不断认识着自身。科学技术随着人类生存需求而产生、发展，并且深刻影响着人类社会和个人生活的方方面面。随着各种学科技术的发展，人类生活发生了巨大变革。2 l 世纪是信息时代，是生命科技的世纪，也是新材料和先进制造技术迅速发展和广泛应用的时代。生物技术将使我们逐步识别、理解、操作、改进和控制生命体( 包括人类自己) ，进一步揭开生命的奥秘，关注健康、改善生活质量。信息技术彳仅大大提高了社会生产力的发展速度，丽月i 对社会总体结构和生活方式有全方位的影响，引发了史无前例的革命，使我们视野变得更加开阔，沟通更加便捷，人类进入知识经济和信息化社会。新材料技术的发展刁仅促进了信息技术和生物技术的革命，而且对制造业、物资供应以及个人生活方式产生重大的影响。而方兴未艾的纳米技术的特点是基础科学研究与应用科学研究同时兼容，同时可能出现横向( 学科间) 交织关联在一体，这集中体现了现代前沿科学技术的最大特征1 1 1 。生命是一个极其复杂的体系，如何解决生命科技研究中的难题，单靠一门学科的独自努力太局限了，亟须发展多学科的新技术，呼唤传统生物技术和新的工程技术( 尤其是纳米技术) 相结合形成交叉学科来解决。新世纪纳米技术的出现为解决生命科学研究中的难题提供了崭新的契机。1 2 蓬勃发展的纳米技术1 2 1 纳米科技的诞生和发展纳米是英文n a n om e t e r 的译名，是一种长度单位，符号为n m ，就是1 0 4 米。纳米科技是指在1 l o o n m 尺度空间内，研究电子、原子和分子运动规律、特性的高新技术学科，其最终目标是人类按照自己的意志直接操纵单个原子、分子，制造出具有上海交通大学m 士学佗论文第一审前言特定功能的产品1 2 - 3 1 。1 9 5 9 年，在美国加利福尼亚理工学院召开的美国物理学会上，著名物理学家、诺贝尔奖获得者理查德费曼预言，人类可以用小的机器制作更小的机器，最后将变成根据人类意愿，逐个地排列原子，制造“产品”，这是关于纳米技术最早的梦想【4 】。七十年代开始，科学家开始从不同角度提出有关纳米科技的构想。2 0 世纪8 0 年代初期，i b m 公司苏黎世实验室的两位科学家g b i n n i g 和h r o h e r 发明了扫描隧道显微镜【5 l ( s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p os t m ) 。这种新型显微仪器的诞生，使人类能够实时地观测到原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物理化学性质，对表面科学、材料科学、生命科学以及微电子技术的研究有着重大意义和重要应用价值。e i g l e r 等1 9 8 9 首次实现了以s t m 操纵单个原子排成了i b m 三个字母商标 6 1 。1 9 9 0年7 月，第一届国际纳米科学技术会议在美国巴尔的摩举办，标志着纳米科学技术的正式诞生。经过几十年的发展，纳米科技已成为一个由化学、物理学、材料学、生物学、电子学等多门学科相互交叉、相互渗透的综合性新兴学科。纳米材料一般分为纳米粒子、纳米纤维、纳米薄膜、纳米块体等。当常态物质被加工到极其微细的纳米尺度时，会出现特异的表面效应、体积效应和量子效应，其光学、热学、电学、磁学、力学乃至化学性质也就相应地发生十分显著的变化【3 】。尺寸在1 1 0 0 n m 之间微粒处在微观世界和宏观物体交界的过渡区域，这样的系统既非典型的微观系统亦非典型的宏观系统，显示出独有的特性和效应，即小尺寸效应、表面效应、量子效应和宏观量子隧道效应。( 1 ) 小尺寸效应：微粒尺寸变小所引起的宏观性质的变化称为小尺寸效应。微粒的尺寸与光波波长、德布罗意波长以及超导态的相干长度或透射深度等物理特征尺寸相当或更小时，晶体周期性的边界条件将被破坏，非晶态纳米粒子的粒子表面层附近的原子密度减少，导致声、光、电、磁、热、力学等特性呈现新的小尺寸效应。( 2 ) 表面效应：随着纳米微粒尺寸的减少，纳米微粒的表面原子数与总原子数之比大幅度地增加，微粒的表面能及表面张力亦随着增加，从而引起纳米微粒性质的变化，即表面效应。球形微粒的比表面积与直径成反比，当尺寸小于1 0 n m 时，其表面原子百分数急剧增长。由于表面原子数增多、原子配位彳i 足和高的表面能，使纳米微粒表面活性很高，且极小稳定，很容易与其他原子结合。( 3 ) 量子效应：是指当微粒尺寸减小到某一值时物质中电子连续能带将由准连续变为离散( 分立) 的能级的现象，能级间距随微粒的尺寸的减小而增大，当热能、电场能或磁场能比平均的能级间距还小时，超微粒子将呈现一系列与宏观物体截然不同的特性。2上海交通大学他十学位论艾筇一章前言( 4 ) 隧道效应：微观粒子具有贯穿隧道的能力称为隧道效应，2 0 世纪6 0 年代后人们发现一些宏观物理量，例如微粒的磁化强度，量子相干器件中磁通量等也显示隧道效应，称为宏观量子隧道效应。隧道效应将会是未来微电子器件的基础，或者它确立了现存微电子器件进一步微型化的极限，当微电子器件进一步细微化时必须考虑上述的量子效应。因此纳米材料具备其它一般材料所没有的优越性能，纳米微粒所具有的量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应与协同效应使其展现出许多特有的性质，如比表面积大、表面活性中心多、表面反应活性高、吸附能力强、催化能力高、不易受体内和细胞内各种酶的降解等，为其在生物医学研究应用向纵深发展开辟了崭新的途径，提供了更加科学的手段。纳米技术可广泛应用于电子、医药、化工、军事、航空航天等众多领域，存整个新材料的研究应用方面占据着核心的位置。总之，纳米科技已经对全球科学技术领域带来了巨大冲击，产生了一系列新兴的综合性边缘交叉学科，对信息科学、材料学、生物医学等发展提供了一个全新的技术界面。一些学者进而指出，纳米科技的发展，将会引起一场新的产业革命，其深远意义堪与1 8 世纪的工业革命相媲美。纳米科技将成为2 1 世纪的科学的前沿和主导科学，是物理、化学、生物、材料、电子信息等多学科交叉的汇合点。1 2 2 生物科学和纳米科技交叉融合是必然趋势纳米科技和生命科学是当今两大热门的前沿科学领域。纳米技术催生了大批边缘交叉学科，给许多行业带来巨大变化。纳米科技和生命科学技术，两者的交叉( 即b i o x )形成了新的科技前沿，并狭得广泛的应用，这对生物医学的渗透与影响是显而易见的| 2 1 。随着现代生物学和现代医学的彳断发展，人类在生物学和医学等领域的研究内容早已从细胞，染色体等微米尺度的结构深入到更小的层次，进入到单个分子甚至分子内部的结构。这些极其微细的分子结构的特征尺寸大多在0 1 l o o n m 之间，属于纳米技术的尺度范围，研究这些纳米尺度的分子结构和生命现象的学科，就是纳米生物学和纳米医学的范畴。在自然界里，纳米粒子与生物体有着密切的关系。构成生命要素之一的核糖核酸蛋白质复合体，生物体内的多种病毒等都是纳米粒子。细胞本身也存在着大量的纳米生物学结构，它们是介于生物分子和病毒尺寸之间的功能结构，如：细胞器、分子马达、离子通道等，为纳米生物技术提供了很好的范例。纳米微粒的尺寸一般比生物体内的细胞小得多，而一般生物大分子都是在纳米尺度。纳米生物3上海交通大学博十学付论文第一章前言学研究可以借鉴、研究、了解细胞内生物分子的作用机制，这为生物学研究提供了一个新的途径，如研究细胞里的分子马达的作用机制，有助于研究从纳米角度设计这类微型分子机器，也可以利用纳米微粒进行细胞分离、细胞染色及利用纳米微粒制成特殊药物或新型抗体进行局部定靶向治疗等。类似于人体器官组织功能的由分子组成极微小的纳米装置和机构，这些装置和机构，可以方便地植入人体，用来改善人体的生命系统。同时，这些装置和机构还可以用作医疗工具，在人体内各处畅游，甚至出入细胞的内外，完成特殊的医疗使命。例如，修复发生畸变的基因；扼杀萌芽状态的癌细胞；捕捉侵入人体的细菌和病毒，并在它们致病之前就消灭它们；探测人体内化学和生物化学成分的变化，适时地释放药物及人体所需的微量物质，改善人体的健康状况。利用纳米技术可将生物降解性和生物相容性的聚合物与药物一起制成纳米药物，作为靶向药物制剂，直接导入病灶部位的器官、组织甚全细胞，达到提高药物疗效，降低毒性的作用；将纳米材料作为药物载体，可增加某些药物的胃肠吸收，提高其生物利用度；将纳米材料作为载体，可用于基因的输送和治疗。随着人们在分子水平上认识生命的规律，已经开始了纳米医学、纳米生物材料和纳米生物技术等多方面的探索。纳米生物学是一门在纳米尺度上测量和控制生物大分子来研究生物大分子的结构、功能和生命活动规律的科学。它的研究对象是亚细胞结构和生物大分子体系。纳米生物学所运用的新兴的纳米技术，其最重要的特色之一便是在单分子水平上对生物大分子进行探测和控制，研究生物大分子和纳米材料之间的相互作用。目前纳米生物技术在已经包括生物芯片、纳米探针、量子点、分子马达、纳米孔、纳米生物传感器等许多方面重要研究或应用。由此可见，纳米技术将带给生物医学一场前所未有的技术革命，它将大幅度提高人类健康和保健的水平，使人们能够真正做到延年益寿。1 2 3 纳米材料的生物效应研究纳米技术的商业前景极其可观，许多国家早已开始采取积极行动，准备抢占制高点。纳米技术彳、= 仅在近期可以改造传统工业技术( 如减少原料消耗，减少污染排放，降低成本，提高性能等) ，而- 丑在远期有希望给2 l 世纪的科学技术、工业和农业等领域带来革命性的变化。随着纳米技术的产业化，各种形式的纳米尺度的物质已经以各种不同的途径进入我们的生活，例如：纳米材料目前已经应用于染料、涂料、化妆品、医药诊断等传统产业中，或在生产和使用过程中直接进入人体，或通过环境、食物链4上海交通大学俳十学位论文筇一节前言进入人体。总之，人们在工作和生活中接触到纳米材料的机会越来越多。然而，科学是一把双刃剑，纳米技术的负面效应问题也逐渐引起人们重视i 。众多国家大力支持的纳米研究也遇到了警示性黄灯。2 0 0 3 年4 月s c i e n c e m j 、2 0 0 3 年7 月n a t u r e l 9 1 ，相继发表文章，开始讨论关注纳米尺度物质的生物效应、对环境和健康等可能带来的潜在影响问题。2 0 0 4 年1 月美国化学会的e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e &t e c h n o l o g i e s t l o j 杂志、2 0 0 4 年6 月s c i e n c e 】又再次载文强调，必须对纳米技术的安全性问题进行研究。我国科学院高能物理所的纳米生物效应与安全性实验室，很早就开展纳米材料的生物负效应( 如毒性) 研究r 7 1 2 1 ，同时也开展纳米生物负效应的反向应用研究，并且把观察到的负面生物效应应用到纳米医学诊断和治疗技术上。当物质细分到纳米尺度时，其性质会发生很大变化，从而导致它们在生物体内的生理行为与常规物质可能有很大的不同。因此，对宏观物质的安全性评价，包括对人体健康及生态环境的影响，也许并不适用于纳米尺度物质。北京大学刘元方研究组l i3 j将一种水溶性的纳米碳管导入小鼠体内，结果发现表观分子量高达6 0 万的这种羟基化的水溶性纳米碳管可以在小鼠的不同器官之间自由穿梭，通过尿液排泄。而6 0 万分子量的常规物质是不可能出现如此奇特的现象的，以目前现有的生物学和生理学的知识尚无法解释这种现象。纽约州罗切斯特大学的一个研究小组让大鼠在含有2 0a m聚四氟乙烯颗粒的空气中生活1 5m i n ，就导致大多数大鼠在4 小时内死亡【l4 。在没有了解清楚纳米技术安全性的情况下，有的人甚至大胆地提出应暂停纳米研究，就纳米技术在社会经济、卫生健康和环境方面的影响进行评估。在发展纳米科技的同时，各国科学家、一些国家政府越发对纳米材料的生物效应给予了很大关注。由于纳米材料的比表面积大，粒子表面的原子数多，周围缺少相邻原子，存在许多空键，故具有很强的吸附能力和很高的化学活性，与生物大分子的强烈结合性。纳米污染物往往具有显著的配位、极性、亲脂特性，有与生命物质强烈结合进入体内的趋势。那么影响纳米粒子在有机体内命运的因素有哪些? 一般而言，一种物质进入有机体是否产生毒害作用，剂量的控制是很关键的，但是针对纳米材料还有很多其他影响因素【j 川，包括：( 1 ) 粒径f 1 每1 7 】粒径是纳米材料最直观也是最重要的参数之一，这是纳米材料定义的依据所在。一般粒子粒径越大，其体内的免疫原性越强，越容易遭到体内免疫系统的识别并攻击，从而在免疫系统发达的器官( 肝，脾) 所捕获并降解。另外，纳米粒子的一大重要特性就是表面效应，粒子越小，处于粒子表面的原子比例越大，粒子的反应活性越高，其在体内对生物体的组织，细胞等伤害就越大。这种毒性主要来自于纳米粒子的氧化5上海交通大学博十学竹论文第一带前言应激性( o x i d a t i v es t r e s s ) ，以及由此导致的谷胱甘肽的缺失而导致的一系列细胞损伤。同种粒子越小毒性越强，刁同种粒子间，粒子的毒性则与粒径无绝对的关系。粒子的这种体内毒性彳、= 仅与粒径大小有关，还大多成剂量依赖性，即剂量越高毒性越明显。此处，粒子的粒径必须建立在粒子稳定性基础上，也就是说粒子无论存体内还是体外，都是单个稳定存在的，刁 存在聚集问题。否则粒子本身的粒径就失去了意义。( 2 ) 电荷表面电荷也是影响纳米粒子体内行为的重要参数之一。在体内环境下，由于血管壁，血小板及血浆蛋白都呈负电性，所以粒子要想尽量在体内保持稳定，最好带适量的负电荷，以避免被血浆蛋白等物质吸附，以及避免在血管壁沉积。但是粒子表面的负电荷密度也不能无限大，以免将血小板排斥至血管壁聚集，引起血栓。粒子的表面电荷还能很好的保证粒子在体外的稳定性。( 3 ) 化学组成纳米粒子的化学组成在粒子的体内毒性中起到了最基本的体现，其对毒性的影响甚至高于粒径带来的差异。h u iy a n g 等l l8 j ( 2 0 0 9 ) 讨论了几种纳米粒子( z n o ，s i 0 2 ，炭黑纳米粒，碳纳米管) 的体内毒性差异。z n o 作为唯一考察的金属氧化物纳米粒，在粒径，形貌与其他粒子类似情况下，具有最强的毒性，而炭黑纳米粒即使粒径最小，确拥有最轻微的毒性。( 4 ) 柔韧性和亲水性其实这部分和化学组成，电荷性，粒径等有重叠。粒子柔韧性越好，即越易变形，其免疫原性越小，因而其造成的伤害越弱。而粒子的柔韧性和亲水性又有很大关联，只有亲水性好的分子链方可有好的韧性。p e g ( 聚乙二醇) 化的纳米粒子由于其和血液接触的部分都是p e g 链，其亲水性和低免疫原性能够有效避开免疫系统对纳米粒子的攻击，对纳米粒子起到了“隐形作用”，因而p e g 化的纳米粒子也可以称之为隐形粒子。一般含有两亲性结构的粒子，由于其分子结构中同时含有疏水和亲水基团，其粒子可以在一定条件下吸水或排水，展示出很好的粒子变形性及柔韧性。柔韧性越好，粒子表面亲水基团越多，粒子体内越稳定，引起的伤害越微弱。与纳米水凝胶或p e g 化粒子相反的是实体粒子，如金属类纳米粒和量子点，这些粒子往往需要进行表面修饰或包壳及加上适当的稳定剂配体，方可在体内有较好的应用。( 5 ) 晶型和微观形貌粒子晶型越规则，越接近圆球形，其体内的稳定性和安全性越好。同为z n o 纳米材料，晶型规则的粒子和晶型遭到破坏的粒子对细胞膜的损伤会完全不同，晶型不规则的会导致细胞大量死亡，而规则的粒子造成的伤害则少得多。6：海交通大学懈十学付论文第一审前言由于纳米材料的生物环境效应、毒性、安全性的研究刚刚起步，刁i 仅实验数据有限，而目实验方法学也有很大难度，仅根据当前有限的资料，得出结论还为时过早。要消除对纳米技术的误解，得到准确、客观、负责的科学结论，可能还需要几年或者更长时间。纳米生物效应的研究是一项庞大而艰巨的任务，需要诸多领域如纳米、生物、化学、毒理学、物理学、医学等的合作与交叉。在研究纳米材料生物效应的负面效应的同时，也应该研究发掘其正面效应。目前研发出来的纳米材料越来越多，迫切需要研究引导利用纳米材料的正效应，抑制其负效应。1 2 3 纳米材料中的金元素一一纳米金( g o l dn a n o p a r t i c l e s , a u g p s )在众多可用于生物医学研究领域的纳米材料中，纳米金纳米粒子因存生物标记、光热治疗等方面可发挥重大作用倍受人们关注。纳米金又称胶体金( 术语“胶体”源于法国，c o l l e ) ，是指粒子直径在1 l o o n m 之间的金粒子，具有特殊的光学、电学性质、良好的催化活性和生物分子亲和能力，在光、电学元器件的研制、催化以及分析科学等方面具有广泛的应用前景【l9 1 。纳米金是最常用的纳米材料之一。目前最经典的制备纳米金的方法是柠檬酸钠还原法【z 。根据还原剂的种类和浓度的小同，可以在实验室条件下制备出刁 同粒径的纳米金，且方法简单、原料价廉。纳米金在5 1 0 - - - 5 5 0a m 可见光谱范围内有一吸收峰，吸收波长随金粒子直径增大而增加。当粒径从小到大时，表观颜色依次呈现出淡橙黄色( 5n m ) 、葡萄酒红色、深红色和蓝紫色变化。纳米金的性质主要取决于金粒子的直径及其表面特性。由于其直径在1 1 0 0a m 之间，而大多数重要的生物大分子( 如蛋白质、核酸等) 的尺寸都在这一尺度内，因此可以利用纳米金作探针探测生物分子的生理功能，进而在分子水平上揭示生命过程；而其独特的颜色变化也是其应用于生物化学的重要基础。f a u l k ( 1 9 7 1 ) 1 2 l 】把胶体金引入免疫化学，这一年被公认是免疫胶体金技术诞生的一年。近年来，研究人员根据纳米金的物化性质进一步拓展基于金标记的生物检测技术。1 9 9 6 年m i r k i n 等1 2 2 j 发展的核酸比色分析法为核酸检测提供了新的启示。其原理是利用巯基修饰的寡核苷酸在一定尺寸的金纳米粒子上进行组装，形成寡核苷酸包裹的金粒子探针，当该探针与互补的靶分子杂交时，使纳米金等离子共振吸收峰由5 2 0n m红移至6 0 0a m ，形成网状聚集体而使纳米金溶液颜色由红变紫，从而指示靶分子的存在。他们进一步深入研究了影响d n a 与金纳米粒子结合的热力学因素，以及连接d n a 后金纳米粒子光学性质和d n a 熔化温度的变化情况，为纳米金探针检测d n a7上海交通大学博十学付论文第一审前言奠定了理论基础。金是化学惰性的，块状金几乎没有任何催化活性，原因在于它的化学吸附能力太小。然而八十年代后期，u 本的h a r u t am 发现担载在过渡金属氧化物上的金催化剂【2 3 l ，彳仅对c o 低温氧化具有很高的催化活性，而且还具有良好的抗水性、稳定性和湿度增强效应，打破了认为金没有催化活性的传统观念，致使人们对其催化特性产生了极大兴趣和关注。纳米金催化剂存除臭、气体探测器中、汽车尾气净化、卤代烃分解等得到广泛研究应用，并取得了较好的结果。制约纳米金催化剂发展的主要因素是其活性稳定性有待提高。通过改进载体与a u 粒子的相互作用，延缓a u 粒子的长大速率，有可能改善a u 催化剂的活性稳定性。一直以来，金纳米粒子被看作具有良好的生物相容性和无毒副作用，近年来广泛应用于生物分析化学，在生物分子标记和检测、纳米生物传感器和纳米生物芯片等技术的开发和应用方面有着广泛的应用，还可以作为载体应用在药物靶向运输、基因治疗等方面。然而近年来有关纳米金的生物安全性逐渐成为人们关注的新热点【2 4 j 。中国科学院化学研究所分子动态与稳态结构国家重点实验室自由基与生命科学课题组研究人员在有关纳米金的生物负效应研究方面有了新发现【2 5 j ，研究成果发表在近期的美国化学会杂志。自由基的氧化损伤是构成细胞毒性的机理之一，研究人员以纳米金与血液的相互作用为切入点，深入研究了纳米金与血液中内源性多肽的相互作用。实验发现纳米金可以促使血液中一氧化氮( n o ) 含量迅速提高。进一步研究表明，该现象起因于血液中内源性亚硝基化的巯基蛋白( 或多肽) 与纳米金通过a u s 键相“互作用时，释放出活性的n o 。在细胞内部，释放的n o 极可能与超氧阴离子( 0 2 )发生反应生成氧化活性强、破坏性更大的过氧亚硝基阴离子( o n 0 0 ) ，从而诱发一系列的氧化应激效应。这一发现对纳米金作为生物探针、药物的载体及赋型剂在细胞或生物体内的应用提出了警示，对纳米金在生物医学中的应用和与n o 相关的研究具有重要借鉴意义。体内细胞的一系列生命活动都是建立在生化催化反应的基础上，在体外模拟体内的生物大分子的生化反应体系，研究纳米金和生物大分子( 蛋白核酸等) 的生物效应，可以作为一个突破口，在传统的生物催化体系引入纳米技术，研究纳米材料对生化反应的调控作用。8上海交通大学他十学付论文筇。审前言1 3 生物催化与纳米技术1 3 1 催化概述自1 8 3 6 年b e r z e l i u s 首次提出“催化作用 这一全新的概念以来，催化过程和催化剂的研究取得了巨大成就，给人类的生活带来了重大影响汹哪! 。根据国际纯粹与应用化学联合会( i u p a c ) 于1 9 8 1 年提出的定义啪1 ，催化剂是一种物质，它能够改变反应的速率而彳 改变该反应的标准g i b b s 自由焓变化。这种作用称为催化作用。涉及催化剂的反应为催化反应。催化剂有三种类型凹1 ：均相催化剂、多相催化剂和生物催化剂。均相催化剂和它们催化的反应物处于同一种物态( 固态、液态、或者气态) 。多相催化剂和它们催化的反应物处于不同的状态。目前固体非均相摧化剂是目前应用最广的，其气液相产物易与固相摧化剂相分离，工艺简单。均相催化剂可以通过负载化，来解决摧化剂的分离、回收及再生问题。催化剂是影响化学反应的重要媒介物，是开发许多化工产品生产的关健。一直以来，工业催化剂是化学工业的基石，在国计民生中起着重要作用憎。酶是由生物活细胞产生的一种生物催化剂。大多数酶由生物大分子蛋白质组成( 少数为核糖核酸r n a ) ，能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖等都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是存酶的催化下进行的，酶催化化学反应的能力叫酶活力( 或称酶活性) 。酶活力可受多种因素的调节控制，从而使生物体能适应外界条件的变化，维持生命活动。没有酶的参与，新陈代谢只能以极其缓慢的速度进行，生命活动就根本无法维持。因此，研究生物酶催化具有重要意义。1 3 2 生物酶催化概述生命体系里的一系列生化反应，都是在各种酶的精确调控下井然有序地进行。酶作为生物大分子，具有以下特性：( 1 ) 、高效性：酶的催化效率比一般无机催化剂更高，使得反应速率更快；( 2 ) 、专一性：一种酶只能催化一种或一类底物；( 3 ) 、多样性：酶的种类很多，大约有4 0 0 0 多种；( 4 ) 、温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在体内较温和的条件下进行的。( 5 ) 、活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。酶的这些性质使细胞内错综复杂的物质9上海交通大学f i l ；士学位论文第一审前言代谢过程得以有条不紊地进行，使物质代谢与正常的生理机能互相适应。如果因遗传缺陷造成某个酶缺损，或其它中毒等原因造成酶的活性减弱，均可导致该酶催化的反应异常，使物质代谢紊乱，甚至发生疾病。因此酶与医学的关系十分密切。在体外酶的生物活性受到各种因素影响，人们则借此调控生物催化为自身服务。生物催化和生物转化一直是人类文明与社会赖以生存与发展的基础，它维系着地球上最大的物质循环与能量转换( 包括c 、n 、o 的循环和太阳能的吸收和转化) 。生物催化在解决当代资源、能源和环保等许多方面有着举足轻重的作用，是当代优先发展的高科技产业之一，生物催化的重要意义在于哺，：( 1 ) 生物催化与生物转化既是人类文明赖以生存和发展的基础，又是与生命活动和人类发展关系最密切的自然规律之一；( 2 ) 基于生物催化与生物转化的物质加工模式，是人类发展的必然趋势。随着化石资源的日益枯竭，能源危机加剧，人类必然对传统基于化学过程的物质加工模式进行革命性转变，转向以生物可再生资源为原料，环境友好，高效的生物加工或生物制造模式；( 3 ) 生物催化的独特优势还可以促进传统产业的升级改造，生物催化与化学催化相比，条件温和，能耗低，选择性好，环境友好，相容性好，可建立高效清洁的制造业，便于实现社会经济的可持续性发展。为了揭示生命活动的规律，人们发展各种新技术，模拟体内环境，存体外试管内研究各种生化反应，逐步识别、理解、操作、改进和调控生化反应，使之按照人们意愿设计的反应进行，这对改善人们的生活质量，有着极其重要的意义。而引入纳米技术则有可能实现新的突破。1 3 3 纳米和催化从纳米概念出发，纳米催化剂可以分为纳米尺度催化剂和纳米结构催化剂两大类汹，。纳米尺度催化剂是指活性组分以纳米尺寸的粒子分散在高比表面积的载体上，包括超细金属催化剂、过渡金属氧化物超细催化剂、纳米膜催化剂等。生物酶催化剂是典型的纳米尺度催化剂，其本身就是具有特殊结构的蛋白质或r n a 分子。纳米粒子由于其大的比表面积，表面活化中心多，作为催化剂的催化活性和选择性大大优于常规催化剂。纳米结构催化剂有纳米微孔分子筛和纳米介孔分子筛等。随着纳米技术的发展，一些纳米材料的模拟酶的催化活性也逐渐被发掘。中国科学院生物物理研究所阎锡蕴研究小组的氧化铁纳米粒子具有过氧化物酶活性一文，l o上海交通大学博士学付论文筇一审前言2 0 0 7 年9 月的由( ( n a t u r en a n o t e c h n o l o g y 杂志发表。驯。该刊物同时配发的评论文章氧化铁纳米粒子：蕴藏的功能称：“阎锡蕴、柯沙和同事们首次发现氧化铁纳米粒子具有类似过氧化物酶的催化活性，并提出了氧化铁纳米粒子模拟酶的概念。这一发现不仅为惰性金属材料在纳米尺度具有催化活性的学说提供了新的论据，而且拓展了磁性纳米粒子的应用。虽然如何在生物技术和医疗领域更好地利用纳米材料的催化活性还有待探索，但氧化铁纳米粒子催化活性的发现，无疑将使人们对此产生更多的关注。而纳米材料和生物酶大分子相互作用，有的可以有催化活力增强效应，例如：纳米金粒子对葡萄糖氧化酶( g o d ) 活力的增强作用已经从掺金葡萄糖氧化酶电极响应电流的变化中得到证实口，当粒子粒径从3 0 n m 减小到l o n m 时，这种增强效应发生了质的飞跃。对于这一现象，有两种可能：一种是表面效应的作用，即粒子粒径变小所带来的总比表面的增大，提供了越来越多的葡萄糖氧化酶吸附位点与作用位点，使总催化能力增强；另一种是量子尺寸效应，即当粒子小到定程度时，粒子表面与葡萄糖氧化酶分子能够发生电子传递，进而影响葡萄糖氧化酶的催化能力。l if e i 等( 2 0 0 9 ) 一些研究也表明。硭1 ，由于小尺寸效应和表面效应，纳米粒子能够影响大分子蛋白质的折叠和聚集，这种纳米生物效应有着潜在的有益应用，但是如果控制不当，也可能还包括对人类健康和环境潜存的风险。因此，在目前没有确定纳米材料的毒理安全性之前，先从体外模拟体系着手，研究生物催化、生物大分子( 核酸蛋白质等) 与纳米材料相互作用，显得尤为必要。现代生物技术发展几十年来，聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o r p c r ) 技术就是最重要的体外模拟体内生物催化反应的成功实例之一。1 4p c r 是一项重要里程碑技术1 4 1p c r 的发明、发展核酸作为生物大分子，是遗传信息的重要载体，为生命的最基本物质之一，其重要性不言而喻。核酸研究已有1 0 0 多年的历史。1 8 6 9 年，f m i e s c h e r 从脓细胞中提取到