（制糖工程专业论文）亲和超滤载体的制备及其在纯化胰蛋白酶中应用的研究.pdf

摘要摘要 具有生物活性物质的分离纯化技术一直是生物工程下游领域的研究重点。 亲和一 超过滤技术将水溶性或非水溶性高分子亲和载体与目标产物进行特异性可逆反应，然后用超滤膜进行错流过滤。亲和一 超滤技术兼有生物亲和技术和膜分离的特点，具有纯化效率高和易于大规模工业化的优点。 本研究采用胰蛋白酶的特异抑制剂为配基， 即对氨基苯甲胖和卵粘蛋白，合成了两种亲和超滤载体，以胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物系为研究对象，分离纯化目标胰蛋白酶。由于二者的分子量相近，单独运用超滤的方法很难将二者完全分离开来， 运用所合成的可溶性亲和载体， 通过吸附目 标分子、 清洗杂蛋白、洗脱目标分子在超滤体系中获得纯化的胰蛋白酶。主要研究内容与结论如下; 1 .确定可溶性亲和超滤载体的制备工艺并对其结构进行表征 采用 2 0 0万的可溶性葡聚糖为载体， 通过环氧氯丙烷活化， 偶联胰蛋白酶的特异抑制剂为亲和配基。分别合成了两种可溶性亲和超滤载体，即对氨基苯甲胖亲和超滤载体和卵粘蛋白亲和超滤载体。 确定了葡聚糖载体活化及其与两种配基偶联的条件，并对葡聚糖与环氧氯丙烷活化的反应历程进行分析。 通过u v, i r , n mr的检测分析，研究载体、活化载体、亲和载体的结构差异及其内在联系， 对两种亲和载体进行结构表征。 得出活化的葡聚糖中含有活性基团，亲和配基已经连接到活化载体上。 2 . 亲和超滤过程的研究 对合成的两种亲和载体进行亲和超滤过程的研究， 考察对胰蛋白酶的纯化效果。 对吸附目标分子、 清洗杂蛋白、 洗脱目标分子的亲和超滤过程工艺进行研究，确定吸附、洗脱的条件。亲和载体纯化胰蛋白酶，获得胰蛋白酶纯化倍数 4 5倍以上，活性回收率 8 0 %以上。并对亲和载体纯化胰蛋白酶的亲和吸附洗脱的机理进行了探讨。 3 . 亲和载体的稳定性分析 对所合成的两种亲和超滤载体的使用次数、储存时间、使用温度范围、使用的p h范围进行考察，并用热重分析技术考察亲和载体的热稳定性。结果表明对所合成的两种亲和载体具有随时间的变化保持稳定的特点，两种亲和载体对 6 0 以下温度测试都有一定的稳定性， 两种亲和载体对强碱都不稳定， 但对于酸都表现了良好的稳定性。所合成的亲和载体可以重复使用，配基的脱落量少。由t g分析可知， 活化的葡聚糖发生剧烈热失重的温度比葡聚糖高 8 .7 c，说明葡聚糖有一定程度的交联。由于载体的配基和偶联量的不同，两种亲和载体的t g有很大的不华南理工大学博士学位论文同。4 .研究亲和超滤过程的膜过滤特性 主要研究亲和载体在静态、动态及动态电超滤情况下的超滤特性。从截留率和膜通量考虑，选择 1 0万的p v d f超滤膜已能满足亲和超滤分离的要求。实验中使用的超滤膜污染轻，清洗后膜通量恢复率在 8 7 %以上，可以反复使用。通过对纯化亲和载体的p v d f 1 0万超滤膜的电镜观察， 清洗后的膜与新膜的表面状态相似， 也从另一方面说明膜的污染程度较轻。 通过在动态超滤过程中添加电场，发现加入电场后膜通量会有一定的变化，膜通量的变化与溶液的p h值及电场的方 向有关。通过动态超滤结合外加电场可使亲和超滤膜通量增大。关键词:亲和超滤;葡聚糖;环氧氯丙烷;胰蛋白酶;分离纯化a b s t r a c tabs tract t h e t e c h n i q u e o f s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f b i o a c t i v e s u b s t a n c e s i s o f g r e a ti n t e r e s t i n b i o c h e m i c a l e n g i n e e r i n g . a l t h o u g h c o n v e n t i o n a l s e p a r a t i o n t e c h n i q u e ss u c h a s s a l t p r e c i p i t a t i o n , g e l c h r o m a t o g r a p h y , e t c . h a v e e x p l o r e d t h e i r c o m m e r c i a la p p l i c a t i o n , t h e a d v e n t o f a f f i n i t y u l t r a f i l t r a t i o n e x h i b i t s a n e w p o t e n t i a l a l t e r n a t i v et o t h e s e t e c h n o l o g i e s . a f f i n i t y u l t r a f i l t r a t i o n u s e s a n a f f i n i t y l i g a n d w h i c h c o v a l e n t l yb i n d s w i t h o n e o f t h e t a r g e t b i o m o l e c u l e s m a k i n g a l a r g e r c o n j u g a t e m o l e c u l e w h i c hi s t h e r e t e n t a t e i n t h e s e q u e n t t r e a t m e n t o f u l t r a f i l t r a t i o n . a f f i n i t y u l t r a f i l t r a t i o n i s ac o m b i n a t i o n o f t w o s e p a r a t i o n p r o c e s s e s o , a f f i n i t y a d s o r p t i o n a n d u l t r a f i l t r a t i o n ,h a v i n g a d v a n t a g e s o f h i g h e f f i c i e n c y , h i g h r e c o v e r y y i e l d a n d e a s e o f s c a l e - u p . i n t h i s p a p e r , t h e o b j e c t i v e w a s t o s e p a r a t e t r y p s i n ( m o l e c u l e w e i g h t = 2 , 4 0 0 0 )a n d c h y m o t r p s i n ( m o l e c u l e w e i g h t = 2 , 2 5 0 0 ) b y u l t r a f i l t r a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f ak n o w n q u a n t i t y o f ma c r o i n h i b i t o r s o f t r y p s i n f o r m e d p - a m i n o b e n z a m i d i n e ( p a b ) a n do v o m u c o i d l i n k e d t o d e x t r a n t 2 0 0 0 ( m o l e c u l e w e i g h t = 2 x 1 0 6 ) . t h et r y p s i n - m a c r o l i g a n d c o m p l e x w a s t h e n r e t a i n e d b y u s i n g a n a p p r o p r i a t eu l t r a f i l t r a t i o n m e m b r a n e , w h i l e i m p u r i t i e s c o u l d p a s s t h r o u g h , a n d t h e b o u n d t r y p s i nw a s e l u t e d b y e l u e n t . t h e m a i n c o n t e n t s a r e a s f o l l o w s : 1 . a s i mp l e a n d e f f i c i e n t p r o c e s s o f p r e p a r i n g a f f i n i t y e s c o r t w a s s t u d i e da n d t h e a f f i n i t y e s c o r t w a s c h a r a c t e r i s e d . d e x t r a n t 2 0 0 0 w a s a c t i v a t e d b y t h e r e a c t i o n o f e p i c h l o r o h y d r i n , c o u p l i n gt r y p s i n i n h i b i t o r o f p - a m i n o b e n z a m i d i n e a n d o v o m u c o i d a s a f f i n i t y l i g a n d . t w ok i n d s o f a f f i n i t y e s c o r t w e r e p r e p a r e d , p a b - a f f i n i t y e s c o r t a n d o v o m u c o i d - a f f i n i t ye s c o r t . t h e i n fl u e n c i n g f a c t o r s o n d e x t r a n a c t i v a t i o n a n d l i g a n d c o u p l i n g w a sa n a l y s e d , a n d r e a c t i o n m e c h a n i s m o f d e x t r a n a c t i v a t i o n w a s d i s c u s s e d t h e d i f f e r e n c e o f s t r u c t u r e i n d e x t r a n , a c t i v a t e d d e x t r a n a n d a f f i n i t y e s c o r t w a se x a m i n e d b y u v , i r , n mr . i t w a s s h o w n t h a t t h e a c t i v a t e d d e x t r a n w a s f o r m e d a n dw a s c o u p l e d w i t h l i g a n d . 2 . t h e s e p a r a t i o n o f t r y p s i n b y a f f i n i t y u l t r a f i l t r a t i o n w a s i n v e s t i g a t e d . t h e o b t a i n e d a f f i n i t y e s c o r t s w e r e e m p l o y e d t o p u r i f y t r y p s i n . t h e a b s o r p t i o n o ft a r g e t t r y p s i n a n d t h e s e q u e n t e l u t i o n o f t r y p s i n w e r e i n v e s t i g a t e d . t r y p s i n w a sp u r i f i e d 4 5 m u l t i p l e , a n d t h e r e c o v e r y r a t e e x c e e d e d 8 0 %. t h e m e c h a n i s m o f a f f i n i t ya d s o r p t i o n a n d e l u t i o n w a s d i s c u s s e d .m华南理工大学博士学位论文 3 . t h e s t a b i l i t y o f a f f i n i t y e s c o r t s w a s a n a l y s e d . t h e e f f e c t s o f u s a g e t i m e s , t e m p e r a t u r e , p h i n s o l u t i o n a n d s t o r a g e l i f e o n t h es t a b l i l i t y o f a f f i n i t y e s c o r t s w a s a n a l y s e d , a n d t h e i r t h e r m a l s t a b i l i t y w a s e x a m i n e db y t h e t g . t h e r e s u l t w a s t h a t a f f i n i t y e s c o r t w a s s t a b l e w h i l e k e p t a t 4 0c f o r t w om o n t h s , b e l o w 6 0 0c f o r o n e h o u r . t h e r e w a s n o c h a n g e i n a f f i n i t y e s c o r t i n a c i ds o l u t i o n , w h i l e t h e y b e c a m e u n s t a b l e i n a l k a l i s o l u t i o n . t h e a f f i n i t y e s c o r t c o u l d u s es e v e r a l t i m e s a n d l i t t l e l i g a n d f e l l o f f . t h e r e s u l t o f t g a n a l y s i s f o r t h e a f f i n i t ye s c o r t s i n d i c a t e d o b v i o u s l y t h a t d e x t r a n w a s l i n k e d a t s o m e e x t e n t , a n d t h e d i f f e r e n c ei n t h e t g r e s u l t s f o r t h e t w o a f f i n i t y e s c o rt s w a s a t t r i b u t e d t o t h e d i f f e r e n t t y p e s o fl i g a n d a n d t h e a m o u n t o f l i n k a g e . 4 . t h e c h a r a c t e r i s t i c o f u l t r a f i l t r a t i o n wa s s t u d i e d . f i l t r a t i o ne l e c t r i c f i e l dwi t h a c u t - o f fwa s o v e r 8 7 %c h a r a c t e r i s t i c o n s t a t i c s t a t e , d y n a m i c s t a t e a n d d y n a m i c s t a t e w i t hw e r e m a i n l y s t u d i e d . c o n s i d e r i n g r e t e n t i o n a n d f l u x , t h e m e mb r a n em o l e c u l a r w e i g h t o f 1 0 5 w a s c h o s e n . r e c o v e r y r a t i o o f m e m b r a n e f l u x. a n d t h e m e mb r a n e c o u l d r e - u s e . t h e me mb r a n e o b s e r v e d b y s e m a l s os h o w e d t h a t t h e r e w a s l i t t l e c o n t a m i n a t i o n f o r m e m b r a n e . t h e f l u x w a s c h a n g e d b yt h e e l e c t r i c f i e l d a p p l i e d . mo r e o v e r t h e f l u x w a s c h a n g e d w i t h d h i n s o l u t i o n a n d t h ed i r e c t i o n o f e l e c t r i c f i e l dk e y w o r d s : a f f i n i t y u l t r a f i l t r a t i o n ; d e x t r a n ; e p i c h l o r o h y d r i n ; t r y p s i n ; s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o nn 华南理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作 者 签 名 咭瘾 乞日期: 2 0 0 4 年 0 6月 2 5日学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在_年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密eoo ( 请在以上相应方框内打 “j ) 爪 ? _ t 作者签名: / . . q b,: ,导师签名: 撬一一 4 ;k l,x日期:2 0 0 4年 0 6月 2 5日日期:2 0 0 4 年 0 6月 2 5日第一章 绪论第一章绪 论1 . 1蛋白质纯化的问题 近 2 0年来，生物技术的发展非常迅速。运用基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。和其它生物产品的生产过程一样，蛋白质的生产过程一般也分为上游和下游过程o ) 。上游过程是运用生物技术生产目标产物，下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、 纯化、加工。目前， 生产蛋白质的上游技术如基因突变、 基因重组与表达、基因工程菌的大规模培养等技术发展很快， 而蛋白质分离纯化的下游技术却没有得到相应发展。 很多蛋白质在实验室规模己生产成功， 但却无法走向工业化生产而取得经济效益和社会效益2 ,3 1 。第十届欧洲生物技术大会上，蛋白质的稳定被单独列为一个专题。 在加拿大召开的第九届生物产品回收技术会议也对蛋白质的稳定性进行讨论。 蛋白质作为一种生理活性物质一旦从它的天然环境中释放出来就会受到许多失活条件的影响，在提纯过程中存在大量的因素使蛋白质失活4 1 。在细胞内，p h值大约保持在p h 6 . 5 - p h 7 .5 ; 蛋白 质的浓度很高( 大约1 0 0 m g l m l ) ; 还原势也很高。而当细胞破碎后，蛋白质浓度会大大降低，并且蛋白质处于一个氧化环境中。对于组织中的蛋白质而言，破碎还会造成细胞器的破裂，尤其是溶酶体的破裂将会释放大量的蛋白酶并使溶液酸化 5 11 . 1 . 1蛋白质分离纯化的特点 ( 1 ) 大多数蛋白质产品是生物活性物质， 在分离纯化过程中， 有机溶剂、 溶液p h值、 离子强度的变化均可使蛋白 质变性失活。 缓冲液可抗衡蛋白 质溶液中p h值的改变，选择合适的缓冲液对于维持一定p h值下蛋白 质的稳定性及保证实验的重复性均十分重要。 ( 2 ) 蛋白质产品在物料中含量很低， 且物料组成非常复杂。 例如， 利用基因工程菌发酵生产蛋白质，物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等，目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的 1 %。有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体，为获取蛋白质，还需进行细胞破碎，结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。 ( 3 ) 含蛋白质产品的物料不稳定，蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。 ( 4 ) 很多蛋白质产品作为医药、 食品被人类利用， 因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的，产品无菌、无致热源等。华南理工大学博士学位论文 根据以上蛋白质的特点设计蛋白质产品分离纯化的最佳工艺，尽量用最少的分离步骤获得最大的产率，并确保蛋白质产品的纯度和活性。1 . 1 . 2采取的措施 分离纯化出高纯度有生物活性的蛋白质一直是一项艰巨的工作。 在基因工程药物蛋白质的生产中， 收率低和纯度低是i待解决的关键问题。 这里除了生物组份复杂、 难以分离外，许多目标蛋白质自身活性的丧失也是一个重要原因。由于药物蛋白质昂贵的市场价格，回收率稍有提高就有可能带来巨大的经济效益， 所以，有关蛋白质在分离纯化中的失活及其对策在近年来受到了极大的关注: ( 1 ) 提供温和的操作条件。 极端p h , 温度和有机溶剂是蛋白质变性的主要原因。由于蛋白 质在胞内 处于中 性环境中， p h 6 - p h 8 的缓冲溶液可有效防止p h变性。 大多数蛋白 质在很宽的p h范围内 ( p h 5 - 9 或更大) 保持稳定。 但在实验中仍需对目标蛋白的p h稳定性进行研究。虽然室温下仅少数蛋白质发生变性，如有条件最好在低温( 4 -c ) 下操作，高于 4 0 的操作温度一般应避免使用，除非该蛋白质属于热稳定蛋白质。 ( 2 ) 避免蛋白酶水解和微生物污染，低温操作是减少蛋白酶水解的有效措施，膜过滤可以实现低温操作且超滤速度快， 可以有效减少蛋白酶的水解及避免微生物的污染。由于层析纯化料液的时间长，所以需定期用。 . 5 - 1 m的n a o h进行层析柱的消毒减少微生物和热源的污染。 添加抑菌剂也是可行的， 但在使用时需十分谨慎，因为某些抑菌剂修饰蛋白质而使其失活。 ( 3 ) 减少纯化步骤或进行纯化的过程集成是减少成本并减少环境因素所造成的不利影响的有效措施6 - 9 1 表 1 - 1利用蛋白质不同性质的几种分离纯化方法t a b l e 1 一 1 s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n m e t h o d s u s i n g p r o p e r t y o f p r o t e i n蛋白质性质分离纯化方法利用溶解度的不同利用分子形状和大小的不同利用电离性质的不同利用生物功能的不同盐析、专一性沉淀、变性、有机溶剂分离、分配层析、吸附层析、疏水层析、逆流分溶、结晶凝胶过滤、超过滤、密度梯度超离心等电沉淀、离子交换层析、电泳亲和层析酶是蛋白质， 通常用以提取和纯化蛋白质的方法都适用于酶，预防变性措施也一样收率。以酶的纯化倍数和产品收率为检测目 标， 尽可能获得高纯化倍数和产品表 1 - 1 为利用蛋白质不同性质的几种分离纯化方法。在众多的方法中，其第一章 绪论中膜分离技术可在常温或低温操作，物质不发生相变化，具有节能、保持物质活性、操作简单等特点。目前在酶、氨基酸、维生素、蛋白质等物质的分离纯化上获得广泛关注 13 7 。 超滤技术己在细菌蛋自酶、 葡萄糖昔酶、 凝乳酶、 果胶酶、胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶、肝素、0 一 半乳糖昔酶等的分离获得应用 1 3 8 。采用超滤法提高了酶的收率，防止了酶的失活、而且简化了提取工艺、降低了操作成本。但是单纯的超滤技术对分子量相近的成分还很难分开， 单纯用超滤的技术还很难获得高纯度的目标蛋白。而亲和技术与超滤技术的结合较好的解决了这个问题。 所以利用己有的和新近开发的生化分离技术将下游过程的有关单元进行有效组合，使分离工艺简单、 快速，各步骤之间紧密联系，不需要对物料加以处理或调整;或把两种以上的分离技术祸合为一种更快、更有效的分离技术，如亲和膜、亲和一 膜过滤、亲和双水相萃取等，都是减少目标产品失活、提高产率的有效途径。 其中膜分离技术被认为是2 0 世纪末到2 1 世纪中期最有发展前途的高新技术之一，其具有保持物质活性的特点，可大规模操作。在二十世纪八十年代以后，尤其是将膜分离与亲和技术结合在一起的技术得到了蓬勃的发展。1 . 2膜分离技术1 . 2 . 1膜分离的特点 膜分离技术具有设备简单，操作容易，能耗低和保持物质活性等优点，广泛用于酶、蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化。膜分离技术的大规模商业应用是从2 0 世纪6 0 年代的海水淡化工程开始的。目前除大规模用于海水、苦咸水的淡化及纯水、超纯水生产外，还用于食品工业、医药工业、生物工程、石油、 化学工业、 环保工程等领域。 世界膜系列产品的年销售额己超过 1 0 0 亿美元，且年增长率达 1 4 %-3 0 %。膜产业将是2 1 世纪新型十大高科技产业之一，它与光纤、超导等技术一样将成为主导未来工业的高新技术之一。 膜技术具有如下优点: ( 1 ) 膜分离是一种纯物理过程，不破坏目 标产物和有效成分的物质结构。 ( 2 ) 膜分离可在常温或低温下进行，因而特别适用热敏性材料的纯化和浓缩。 ( 3 ) 膜分离集除菌，除热原、纯化、浓缩于一身。 ( 4 ) 膜分离技术分离效率高、 节能、 少污染、 操作方便、 制剂周期短、 成本低、易于大规模生产和自动化。 ( 5 ) 多级膜组合技术可更有效地发挥膜技术的优点。 在反渗透 ( r o ) 、纳滤 ( n f ) 、超滤( u f ) 、微滤 ( m f ) 四种膜分离技术中，由于 o f使用的压力较低 ( 0 .3 -1 .o mp a ) ，水通量大，便于操作，发展速度很快，主要用于超纯水制备、工业废水处理、生物制品浓缩与分离等方面。华南理工大学博士学位论文 虽然超滤膜分离技术己显示其在大分子纯化领域的重要性， 但是，由于其过滤是按照分子量的大小进行分离的，即相当于一种分子筛分的作用。该技术一般要求被分离组分的分子量相差在 1 0倍以上才会较好的分离开来。近年来发展起来的亲和膜与亲和一 膜过滤技术克服了单纯膜分离技术对分子量差别不大的大分子混合物分离纯化效率较低的缺点。 亲和与膜结合在一起的技术利用了生物亲和技术的特异性，对于分子量相近的成分可以分离开来。1 . 2 . 2 生物亲和技术在膜分离领域的应用1 . 2 . 2 . 1 生物亲和技术 膜分离技术具有如上所述的优点，但是对于分子量相近的成分纯化效率很低。生物亲和与膜结合的技术较好的解决了这个问题。生物亲和技术是利用生物分子之间特异性相互作用 ( 既亲和作用)而达到分离目的，这种生物分子之间的相互作用具有排他性的识别并结合能力，即生物分子配基( l i g a n d ) 能够区分结构和性质非常相近其他分子而选择性地与某一种或一类物质配体( l i g a t e ) 相结合，因此运用该技术可快速地从复杂体系如培养液或血浆中获得高纯度的目标产物。亲和作用除了空间几何形状互补作用以外， 还有范德华力作用、 疏水性相互作用、静电作用、氢键、配位键及弱共价键等 9 ,1 0 。生物亲和作用是一种复杂的生物现象，除具备 “ 钥匙”和 “ 锁孔”的关系外，还存在以上提到的特殊相互作用力，这也是亲和作用特异性高的主要原因。此外，当蛋白质分子发生亲和时，蛋白质的分子形态往往发生变化。这种现象可能也是产生亲和结合作用的重要原因。 表 1 - 2 部分商品化的亲和吸附体系 i 1 t a b l e 1 - 2 s y s t e m o n c o m m e r c i a l a f f i n i t y a d s o r p t i o n配基ci b a c r o n bl u e f 3 g-蛋白 aco n aam pi dap - 氨基节胖m- 氨基苯硼酸l 一 赖氨酸h e p a r i nn a d, a t p相关酶、l g g 、免疫复合体糖蛋白、多糖n a d相关酶目标产物白蛋 白、干扰素各种蛋白胰蛋白酶、尿激酶糖蛋白、多糖、转移r n a纤溶酶、纤溶酶原激活剂限制型核酸内切酶、脂蛋白、脂肪酶、凝固蛋白等表 1 - 2 为部分商品化的生物亲和吸附体系。几乎所有生物活性物质与其特异第一章 绪论性互补结合物质之间都存在着亲和作用，如酶与其底物、抑制剂，抗原与抗体，激素与其受体等，这种亲和作用使他们彼此可结合在一起形成可解离的络合物，或在亲和介质上产生可逆性的吸附。1 . 2 . 2 . 2亲和膜 亲和膜与亲和一 膜过滤都是在二十世纪八十年代出现的，主要是针对膜过滤的缺点，吸收亲和的优势，使亲和与膜过滤在同一体系中进行，既具有特异性纯化目标产物，又具有膜过滤易于放大的优势。亲和膜与亲和一 膜过滤都是生物亲和与膜过滤的祸合， 不同的是亲和膜是将膜改性后作为亲和吸附的载体，即膜作为一种过滤介质同时也是亲和吸附的载体。而亲和一 膜过滤是膜只是作为过滤介质，而单独存在一种载体作为亲和吸附的介质，这种亲和载体可以是可溶的，也可以是非可溶的， 但它必须是被滤膜能完全截留的。目前国内亲和方面的载体几乎都需要进口， 国外对载体的制备方面的报道又很少。 国内也开始研究亲和技术，对于亲和膜与亲和一 膜过滤来讲，当前方面的研究论文研究亲和膜的较多，而对于亲和一 膜过滤研究的开展尚处于起步阶段。 有关亲和膜的研究工作始于 2 0世纪 8 0年代，在 9 0年代得到了蓬勃发展t l z - i s l ， e l i a s 在9 1 年出版的专著 a f f i n i t y m e m b r a n e 对亲和膜技术所涉及的膜化学改性 1 6 1 、 亲和配基的偶联方法、 膜过滤原理及亲和膜分离法的优势等作了较为系统的介绍。作者认为亲和膜方法具有处理量大，操作简便，是取代亲和色谱纯化技术的最佳候选。但是有关膜材料化学改性方面的报道很少。亲和膜分离过程对基膜材料有一定的要求 ? : ( 1 )膜表面存在足够多的可利用活性基团，如一 o h，- n h 2 ，- s h等，这些基团经活化后可以接上合适的间隔臂和配基; ( 2 )膜的比表面积大，以便提供较多的可利用活性基团; ( 3 )在许多条件下，为了实现快速分离，一般要加压操作，因此要求膜有一定的机械强度，能承受一定的压力，长期使用不变形; ( 4 )因为在活化和解离阶段，在许多情况下要在酸性或碱性条件下进行，洗脱液有时要用高浓度的盐或有机试剂。因此，基膜材料必须耐酸、耐碱、耐高浓度盐的缓冲液和有机溶剂。 常用的亲和膜基膜材料有: 脂族烃类 ( 聚乙烯， 聚丙稀) ， 芳香族共聚物 ( 聚碳酸酷，聚枫，聚醚枫) ，脂族聚酞胺 ( 尼龙6 ，尼龙 6 6 ) ，以及一些特殊的聚合物，如聚乙烯醇，纤维素。芳香族共聚物和酞胺类都有末端官能团，通过化学改性后可以与配体连接。纤维素材料本身带有大量可利用活性基团的材料， 但是他们的机械强度和化学稳定性较差， 大多化学改性方法用来提高其机械强度和化学稳定性。目前，在亲和膜制备过程中，较受人关注的是脂族烃类材料，如聚乙烯和聚丙稀， 这类材料的机械强度和化学稳定性较好， 虽然他们没有活性的侧链或华南理工大学博士学位论文末端基团，但是可以通过化学活化、共聚、共混、等离子处理等方法对其表面进行改性，引入所需的化学基团。1 . 2 . 2 . 3 亲和一 膜过滤 亲和一 膜过滤( a f f i n i t y f i l t r a t i o n ) 技术也称亲和错流过滤( a f f i n i t y c r o s s - f l o wf i l t r a t i o n ， 简称a c f f ) 由m e d d a 于1 9 8 1 年首先提出 1 8 1 ， 将水溶性或非水溶性高分子亲和载体与目标产物进行特异性可逆反应，然后用膜进行错流过滤。因此，亲和一 膜过滤技术兼有生物亲和技术和膜分离的优点，具有纯化效率高和易于大规模工业化的优点。亲和载体与超滤结合的技术为亲和超滤( a f f i n i t yu l t r a f i l t r a t i o n ) 。亲和超滤的载体有水溶性的和非水溶性的。水溶性载体的优点是亲和载体与目标蛋白在均相中吸附和洗脱，反应速度快，达到平衡的时间短。目前对水溶性大分子作为亲和载体研究的较少， 特别是在亲和载体的制备上更是很少报道。 r e m e r o 1 9 】 等研究了 在亲和超滤中p h和盐对手性物质分离的 影响， 实验选用牛血清白蛋白( b s a ) 作为立体选择性大配基分离d 一 和l 一 型色氨酸， l 一 型色氨酸在p h 7 - 1 0 之间为亲和结合的最佳值， 其结合效果受p h的影响较大。 r o m e r o 1 2 0 1等人还对多级亲和超滤过程进行了研究，同样研究的是 d 一 和 l 一 型色氨酸的混合体系，二级的亲和超滤过程纯度提高2 0 倍以匕 产率超过9 0 % o 亲和一 膜分离技术既充分利用了载体上的配基对目标组分的专一的可逆的亲和吸附作用和超滤膜分离易于实现大规模生产的优点， 又克服了超滤膜对分子量相近的大分子无法实现分离的缺点，而且， 该技术在分离和纯化低浓度的生物制品的同时实现产品的浓缩，较好地解决了生物物质活性的保持及稳定性的问题，具有纯化效率高和易于大规模工业化的优点， 在生物工程下游纯化过程中具有广阔的应用前景。 图 1 - 1为采用的几种亲和过程的示意图，a为采用中空亲和膜的形式，亲和基团在中空膜上:b 为平板亲和膜的示意图，模仿亲和色谱做成膜堆的形式，即将多个平板亲和膜重叠，提高纯化效率和回收率: c 为亲和一 膜过滤示意图， 膜为普通的滤膜， 在溶液中存在大分子量的可溶性或不溶性的亲和载体， 载体可被滤膜截留，吸附到载体上的目标分子通过洗脱获得纯化。第一章 绪论.:十 : +月 十扮石.甲a中空亲和膜b亲和一 膜过滤 ( 具有亲和载体)平板膜膜堆与平板膜膜孔示意c平板亲和膜图 1 - 1几种亲和与膜结合过程示意图f i g . l 一 1 d i a g r a m m a t i c s k e t c h o f s e v e r a l a f f i n i t y f i l t r a t i o n p r o c e s s1 . 3亲和一 膜分离技术1 . 3 . 1亲和 膜分离体系 亲和一 膜分离是将水溶性或非水溶性高分子亲和载体与目标产物进行特异性可逆反应，然后用膜进行错流过滤。亲和超滤技术是生物亲和技术与超滤膜分离相互结合的新型纯化技术， 其研究涉及生物化学、化学工程和生物工程等多门学科交叉的前沿领域。 亲和一 膜分离即利用可被膜完全截留的水溶性高分子化合物、不溶性微粒或凝胶为载体固定亲和配基， 亲和吸附目标分子， 使目标分子被滤膜截留，而其它杂蛋白 分子则透过滤膜，与目 标蛋白 质分离。如图 1 - 2 所示( 9 ,2 1 ,2 2 ，原料液中是含有目标分子和杂质分子的混合物，二者的分子量较为接近，如果单纯用膜分离的方法很难将二者分开。亲和载体的分子量很大，可完全被滤膜截流，且亲和载华南理工大学博十学位论文体可与目标分子专一性的可逆结合。 首先为原料液的进料吸附阶段，目标分子被亲和载体专一吸附;未被亲和载体吸附的杂质， 通过缓冲溶液进行清洗，透过滤膜;用洗脱液洗脱目标分子。目标分子与杂质分子分离开来，得到纯化。亲和-膜分离使用的膜理想状况是对溶液分子完全透过，而对亲和载体能完全截流的。亲和载体与目标分子的分子量相差很大。亲和载体由载体和配基组成，载体必须活化后才能与配基偶联，成为亲和载体。载体不同，活化和偶联方法也不同。a f f i n i t y e s c o rt - p r o d u c tcr u d e 图 1 - 2亲和一 膜分离系统流程f i g . 1 - 2 s c h e m a t i c d i a g r a m o f a f f i n i t y u l t r a f i l t r a t i o n1 . 3 . 2亲和一 超滤体系的组成 对于形成水溶性亲和载体的亲和超滤系统。 首先必须制备亲和载体过程中亲和载体与待纯化目标分子结合标分子步骤，使 目标蛋白得以分离纯化，通过吸附目标分子、清洗杂质、在超滤洗脱 目。亲和载体的制备包括载体的活化和偶联亲和配基形成亲和载体。对于待纯化的目标大分子与亲和配基吸附时，如果空间位阻较大， 则需在亲和配基前先连上间隔臂 ( 一般为碳链2 -1 2 的有机化合物) 。以减少目标大分子与配基吸附的位阻。分子间作用方式简化为:活化载体一亲和配基一目标蛋白; 活化载体一间隔臂一亲和配基一目标蛋白。目标蛋白通过洗脱第一章 绪论来得以纯化。1 . 3 . 2 . 1载体 在亲和一 膜过滤技术的研究中，制备具有较高结合力和良好选择性的亲和载体一直是该领域的研究重点。 理想的载体在操作条件下其化学性质和机械性质应保持稳定，对杂质分子无非专一性吸附，易被配基所修饰，有足够大的亲和吸附容量。一般来说，用于亲和一 膜分离的载体有两类，一类是水溶性大分子载体 1 8 ,2 3 ,2 4 ,2 5 1 ，另一类是水不溶性微载体2 6 - 2 8 1 。 表 1 - 3为水溶性载体的亲和一 膜过滤体系，水溶性载体的分子量与滤膜截留分子量相比，相差很大，可被滤膜截留。 在亲和一 膜分离技术中采用水溶性载体时，由于亲和载体与目标蛋白在均相体系中反应速度快， 达到吸附或洗脱平衡的时间极短， 而且吸附容量大。这些优点对亲和超滤很有利，可以将目标蛋白溶液与亲和载体溶液，一边混合，一边进行超滤，而无需另备储槽进行反应;洗脱时也一样 2 9 1表 1 - 3 水溶性载体的亲和一 膜过滤体系t a b l e 1 - 3 s y s t e m o f w a t e r - s o l u b l e a f f i n i t y f i l t r a t i o n水溶性载体纯化目标产物载体分子量参考文献 de x t r a n de x t r a np o l y a c r y l a m i d ep o l y a c r y l a mi d em abm abt r y p i s i nur o k i n a s et r y p i s i nur o ki n a s e2 x 1 0 62 x 1 0 61 x 1 0 51 x 1 0 52 63 02 51 3 6注: 对氮基苯甲 眯 ( p a b ) ; . 邻氨基苯甲 眯 ( m a b )d e x t r a n :葡聚糖;p o l y a c r y l a m i d e :聚丙烯酞胺t r y p i s i n :胰蛋白酶: u r o k i n a s e 尿激酶 非水溶性载体的种类较多， 报道可用非水溶性基质，如各种菌类的完整细胞( 酵母、芽抱杆菌、 链球菌等细胞 3 1 ,3 2 1 。 纳米硅石微粒、琼脂糖、 凝胶、 脂质体等也均被作为基质使用过 3 3 - 3 6 . 1 1 1温居一等用y a d h 酵母乙醇脱氢酶) 作为亲和载体， 运用亲和超滤法分离和纯化n a d h( 还原型烟酞胺腺嗓吟二核普酸) 。酵母细胞化学渗透液含有 n a d h , a t p( 三磷酸腺昔) 、n a d( 烟酞胺腺嗦吟二核营酸)和其他辅酶等许多小分子物质，选用y a d h作为亲和配体，在p h 8 . 0 ,离子强度为o . l m o l / l时，用y a d h把细胞渗透液中的n a d h分离出来。使用截留分子量3 万的滤膜超滤， n a d h - y a d h复合物留在截留液中， 从而与其他小分子物质分离。 改变p h值和离子强度， n a d h - y a d h复合物解离， 通过超滤, n a d h分离到滤过液中， y a d h作为截留而回收，回收率达9 3 %，活性损失1 5 % ( 3 7 1 .华南理工大学博士学位论文1 . 3 . 2 . 2配基 在生物分离过程中使用的亲和配基一般可以分为两类，一类是特异性配基，这类配基只与其对应的分子发生特异性结合，如抗原、抗体、抑制剂、激素、激素受体等 3 8 , 1 0 4 ; 另一类是通用型配基， 这类配基能与某一类物质结合， 如n a d ,n a p d + 等辅酶能与许多需要这些辅酶的酶结合。 此外， 由于活性染料的分子形状、大小以及电荷分布在某种程度上与辅酶相类似，即它们能模仿辅酶的构象，使之成为较为常用的通用型配基之一，比较常见的染料配基是三嗦类染料，如c i b a c r o n b l u e f 3 g - a ( p r o c i o n b l u e h - b ) , p r o c i o n r e d h - 3 b 、p r o c i o n r e d h e - 3 b和p r o c i o n b l u e m x - 3 g等。图1 - 3 为染料配基c i b a c r o n b l u e f 3 g - a的分子结构示意图。s %h图1 - 3 c i b a c r o n b l u e f 3 g - a的分子结构f i g . 1 - 3 s t r u c t u r e o f c i b a c r o n b l u e f 3 g - a 配基的选择当然是以特异性的结合为前提，但特异性是相对