（生物医学工程专业论文）基于SPR技术的传感芯片的研制及其应用.pdf

北京协和医学院博士学位论文 研制出多种具有自主知识产权的s p r 传感芯片，不仅大大降低了仪器的运行成 本，而且在一定程度上提高了s p r 生物传感器的检测分析能力，为s p r 生物传 感器的进一步应用推广以及国产s p r 生物传感器的研发应用奠定了基础。此外， 通过应用自主制备芯片进行多方面的分子相互作用分析和物质浓度检测，为s p r 技术在新领域的应用提供了新的思路。 关键词：表面等离子共振，生物传感器，传感芯片，再生，生物分子相互作用 i i 北京协和医学院博士学位论文 a b s t r a c t t h eb i o s e n s o rb a s e do nt h ep r i n c i p l eo fs u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) ，i sa s u r f a c es e n s i t i v eo p t i c a ld e v i c ef o rm o n i t o r i n gb i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n sa tt h es e n s o r s u r f a c ei nr e a lt i m ew i t h o u ta n yl a b e l i n g i ti sb e i n gu s e di na 、析d ev a r i e t yo fa r e a s s u c ha sp r o t e o m i c s ，d r u gd i s c o v e r y , c l i n i c a ld i a g n o s i s ，f o o da n a l y s i s ，e n v i r o n m e n t a l m o n i t o r i n ga n ds oo n t h es e n s o rc h i pi st h ec o r eo ft h eb i a c o r ei n s t r u m e n t s i n c e s e n s o rc h i p sc a nn o wo n l yb ep u r c h a s e df r o mb i a c o r ea b ( u p p s a l a ，s w e d e n ) ，w h i c h m a k e st h e me x p e n s i v e ，m a n yi n s t r u m e n t sa r ee i t h e ru s e da tal o wr a t eo rs l e e p i n g b e s i d e s ，f e wt y p e so fs e n s o rc h i p sa n dd i f f i c u l ti m m o b i l i z a t i o no fm a t e r i a l st ot h e s e n s o rc h i ps u r f a c e ，a r eh i n d e r i n gt h ea p p l i c a t i o no fs p r b i o s e n s o rt oac e n i a ne x t e n t i nt h i sp a p e r , i no r d e rt or e d u c et h ec o s to fs n e s o rc h i p s ，t h ep r e p a r a t i o na n d r e g e n e r a t i o nm e t h o d so ft h ej1 ，c1 ，c m 5 ，s aa n dn t as e n s o rc h i pw e r es t u d i e d ，a n d t h e i r p r e p a r a t i o np r o c e s s w e r e p e r f e c t e d t h r o u g h s u b s t a n t i a l e x p e r i m e n t a l v e r i f i c a t i o na sw e l la san u m b e ro fr e s e a r c hi n s t i t u t e s t r i a l s ，t h es e l f - p r e p a r e ds e n s o r c h i pc a na c h i e v et h es a m eq u a l i t y a st h eb i a c o r es e n s o r c h i pa n dm e e tt h e r e q u i r e m e n t so ft h ee x p e r i m e n t i no r d e rt oi n c r e a s et h et y p e so fo p t i o n a ls e n s o rc h i p s ， ar e d u c e db o v i n es e r u ma l b u m i n ( r b s a ) s e n s o rc h i pw a sd e v e l o p e d ，w h i c hi san e w s e n s o rc h i pf o rt h eb i a c o r ei n s t r u m e n ta n dc a na c h i e v et h es a m ef u n c t i o na st h ec m 5 s e n s o rc h i p t h ep r e p a r a t i o no fr b s as e n s o rc h i pi ss i m p l e ，r a p i da n dl o wc o s t t h e a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) c h a r a c t e r i z a t i o no ft h er b s as e n s o rc h i ps u r f a c ea n d t h ea p p l i c a t i o nt od e t e c ts u l f a m e t h o x a z o l e ( s m x ) b yt h er b s as e n s o rc h i pu s i n ga n i n h i b i t i v ei m m u n o a s s a yf o r m a t ，d e m o n s t r a t e dh o m o g e n e o u sm a t r i xs u r f a c ea n d e x c e l l e n tp e r f o r m a n c eo ft h er b s as e n s o rc h i p ，w h i c hi sa b l et om e e tt h en e e d so ft h e e x p e r i m e n ta n dt h er e q u i r e m e n to fq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fs m x i no r d e rt oi m p r o v e t h eb i n d i n gp e r f o r m a n c eo ft h en t as e n s o rc h i p ，ah i g h e rm o l e c u l a rd e n s i t yo fan e w i m p r o v e dn t a s e n s o rc h i pw a sd e v e l o p e d t h ep r e p a r a t i o nm e t h o di sr a p i d ，s i m p l e a n de f f i c i e n t t h eb i n d i n go fs e v e nk i n d so f6 x h i s - t a gr e c o m b i n a n tp r o t e i nt ob o t h i m p r o v e da n dn o n i m p r o v e dn t as e n s o rc h i p ，r e s p e c t i v e l y , i n d i c a t e dt h a tt h e i i i 北京协和医学院博士学位论文 i m p r o v e dn t as e n s o rc h i p sh a v ee x c e l l e n tp r o p e r t i e s i na d d i t i o n , w eu s e dt h es e l f - p r e p a r e dc m 5 c h i p st os i m u l a t et h es t a i n l e s ss t e e l e n d o v a s c u l a rs t e n ts u r f a c e ，a n dt oe v a l u a t et h ee f f e c t so fc h i t o s a ns a m p l e sw i t h v a r i o u sm o l e c u l a rw e i g h t s ( m w ) o nt h ep r o t e c t i o no fp l a s m i dd n af r o mn u c l e a s e d e g r a d a t i o nb ys p r t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts p rc a nb eu s e da san e wm e t h o dt o s t u d yt h es t a b i l i t yo fg e n eb i n d i n ga n dt os c r e e nn e wg e n ec a r d e rm a t e r i a l s s u b s e q u e n t l y , w ep r o p o s e da n dt o o ka d v a n t a g eo f an e wi m m u n o a s s a ym e t h o d u s i n gs p rc o u p l e dw i t ho n - l i n e ，i n - t u b e ，s o l i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o n ( s p m e ) ，t o d e t e c te s t r a d i o li nh u m a ns e r u ma n ds e a w a t e ru s i n ga ni n d i r e c ti n h i b i t i v e i m m u n o a s s a yf o r m a t t h i sm e t h o dn o to n l ys u b s t a n t i a l l ys i m p l i f i e st h ea n a l y t i c a l p r o c e s sa n ds h o r t e n sa n a l y s i st i m e ，b u ti ta l s op r o v i d e sg r e a t e ra c c u r a c ya n dp r e c i s i o n t h a nc a nb eo b t a i n e d 诵mt h et r a d i t i o n a ld i r e c ti n h i b i t i o ni m r n u n o a s s a y t od a t e ，t o t h eb e s to fo u rk n o w l e d g e ，n oi n t u b es p m e s p rm e t h o d o l o g ya p p l i e dt os u b s t a n c e d e t e c t i o nh a sb e e nr e p o r t e di nt h el i t e r a t u r e t os u l nu p ，s e v e r a lp r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o nm e t h o d so fav a r i e t yo fs p r s e n s o rc h i p sh a v eb e e nd e v e l o p e di nt h i sp a p e r , w h i c hn o to n l yg r e a t l yr e d u c e st h e e q u i p m e n tr u n n i n gc o s ta n di m p r o v e st h ea n a l y t i c a lc a p a c i t yo ft h es p rb i o s e n s o r , b u ta l s o l a y st h ef o u n d a t i o nf o rf u r t h e ra p p l i c a t i o no ft h es p rb i o s e n s o ra n d d e v e l o p m e n to fd o m e s t i cs p rb i o s e n s o r i na d d i t i o n ，t h r o u g ht h ea p p l i c a t i o no f s e l f - p r e p a r e ds e n s o rc h i p st ov a r i o u sb i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o na n a l y s i sa n ds u b s t a n c e d e t e c t i o n ，t h i sw o r kp r o v i d e sn e wp o s s i b i l i t i e sf o ra p p l i c a t i o no fs p rb i o s e n s o ri nt h e n e wa r e a s k e y w o r d s ：s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，b i o s e n s o r , s e n s o rc h i p ，r e g e n e r a t i o n ， b i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n i v 北京协和医学院博士学位论文 第一章绪论 1 1s p r 生物传感器概述 表面等离子共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 生物传感器是2 0 世纪 8 0 年代出现的一种生物传感器技术，是物理学与生物学原理相结合的又一个成 功的例子。它在进行生物分子相互作用分析( b i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o na n a l y s i s ， b i a ) 方面具有其它分析技术所无法比拟的优点，其发展非常迅速，已经在生命 科学研究、环境检测、食品安全等领域中得到广泛的应用，也受到越来越多科研 工作者的关注和重视。 1 1 1s p r 的基本原理 表面等离子共振( s p r ) 是一种物理光学现象。在两种不同折射率( r e f r a c t i v e i n d e x ) 的透明介质交界面上( 如玻璃和水) ，当一束光线从高折射率介质入射到 低折射率介质，光线将发生折射和反射。当入射角增大到某一特定值时，折射角 等于9 0 0 ，此时光沿着与界面相切的方向射出，此时的入射角称为临界角。如果 入射角超过临界角，则入射光线将不会进入另一介质，而全部被反射回入射介质 中，发生全内反射。 实际上，尽管全部入射光被反射，一种叫渐逝波( e v a n e s c e n tw a v e ) 的电磁 场会穿过界面渗透到低折射率介质中，能量呈指数衰减【l j 。若在界面处镀上一层 金属薄膜( 一般镀金膜或银膜) ，则金属薄膜表面的自由电子受入射光激发而产 生电荷振荡，进而形成表面等离子体( s p ) 。调整光的入射角或波长到某一适当 值时，s p 与渐逝波的频率和波数相等，二者便发生能量耦合，形成表面等离子 共振。共振时界面处的全反射条件将被破坏，入射光能量被转移到表面等离子体 波( s u r f a c ep l a s m o nw a v e ，s p w ) 中【2 】，从而导致反射光强度在传播中急剧下降， 呈现衰减全反射( a t t e n u a t e dt o t a lr e f l e c t i o n ，a t r ) 现象，其中使反射光完全消失 的入射光角度称为共振角( s p ra n g l e ) 【3 4 】。共振角会随着金属薄膜表面的介质 折射率的改变而改变，而折射率的变化与结合在金属表面的分子的质量成正比 北京协和医学院博士学位论文 ”- 7 。因此通过分析共振角，就可以得到分子间相互作用的信息。 图1 - 1 是s p r 生物传感器的基本原理图。s p r 生物传感嚣的光源为偏振光 ( p o l a r i z e dt i g h t ) ，传感芯片( s e n s o r c h i p ) 表面镀有一层金膜，实验时，先将一 种生物分子( 1 i g a n d ) 固定在金膜表面。然后将与之相互作用的分子( a n a l y t e ) 溶于溶液( 或混合液) 流过芯片表面。s p r 检测器能跟踪溶液中的分子与芯片 表面的分子结合、解离整个过程的变化，不同角度的反射光的光强被记录后得到 角度光强曲线图，每条曲线的波谷即为该曲线的共振角，共振角对应的角度为 共振信号( r e s o n a n c es i g n a l ) ，时间与对应共振信号的曲线即为s p r 传感图 ( s e n s o r g r a m ) 。以免疫学分析为例，在金膜表面固定某种受体( 如抗体) 。然后 流过含相应配体( 如抗原) 的样品，配体与受体的结合将使金膜与溶液界面的折 射率上升，从而导致共振角发生变化。为了表述的方便，共振角( 或共振信号) 可以用共振单位( r e s o n a a c e u n i t s ，r u ) 来表示。对大多数生物分子而言，1 0 0 0 r u 大约等于l m m 2 的面积上有l n g 的质量变化【”，相当于溶液中蛋白浓度为6 m g m l 。 s p r 生物传感器通过检测获得共振角的改变程度，便可以对配体浓度进行定量。 图i - 1s p r 生物传感器的工作原理图( 以免疫传感器为例) h 1 北京协和医学院博士学位论文 由于共振角的漂移是由反射强度变化反映出来的，因此s p r 生物传感器通 过直接监测反射率或反射角的变化速率便可以获得分子间相互作用的各动力学 参数。 图1 2 进一步说明在s p r 传感器响应周期中发生的生物分子结合与解离事 件。在传感芯片上固定有受体分子。当t = o 时，载流缓冲液通过微流通道到达流 通池与受体分子接触。当t = 10 0 s 时，配体分子( 分析物) 随载流缓冲液抵达受 体区域。当配体与受体结合时，芯片表面基质的折射率增加，导致共振信号上升， r u 值增加。对这部分结合曲线进行分析，给出表观结合速率k b s 。如果已知分 析物浓度，就能够得出结合速率常数k a 。在系统达到平衡时，配体与受体的结 合与解离速度相等，此时的共振信号水平与样品中分析物浓度相关。在t = - 3 2 0 s 时，分析物溶液被载流缓冲液取代，配体一受体复合物发生解离。对这些数据进 行分析能得到解离速率常数。最后在t = 4 2 0 s 时通入再生溶液( 高盐、酸性或 碱性溶液等) ，以破坏配体一受体结合，使剩余的配体被完全洗脱下来，从而使芯 片再生( r e g e n e r a t i o n ) 。整个结合周期常常重复数次，每次反应中的分析物浓度 不一样，以满足运算的需要。配体与受体相互作用的亲和力用平衡解离常数k d 表示，k d 可以通过公式( k d _ & 。) 计算得出，或者通过对各种分析物浓度的 平衡态的值进行线性拟合或非线性拟合来获得 9 1 。 3 芷 哪p 牲 肇 幸k _ i 卜 1 0 0 釉300粕蔚0嚣瓣 时间( $ 图1 - 2 典型的s p r 生物传感器响应信号曲纠7 】 北京协和医学院博士学位论文 一般而言，利用s p r 生物传感器可以获得以下信息：通过测试不同分子间 的结合程度，得到分子相互作用的特异性；通过分子结合模型分析结合的时间曲 线以及结合水平，得到分子相互作用的动力学和亲和力；通过测量样品所给出的 信号响应值，得到样品中特定分子的浓度。此外，还可以应用v a n th o f f 方程， 通过获得不同温度条件下分子相互作用的动力学和亲和力，得到对生物分子的热 力学分析【1 0 , 1 1 】。 1 1 2s p r 技术的特点 与一些传统的相互作用分析技术相比较，s p r 技术具有很显著的优势： ( 1 ) 无需标记s p r 对样品的折射率敏感，因此待测物无需标记，这意味 着尽可能不影响待研究的相互作用，在许多情况下，这也避免了费时而昂贵的纯 化和标记，此外，一些标记物具有毒性或放射性，这样不需要对样品进行标记就 可以避免环境污染和增强安全性。 ( 2 ) 实时检测s p r 技术能动态地监测生物分子相互作用的全过程，s p r 传感图可以实时和连续记录，这是获得动力学数据的理想途径，另外，跟踪相互 作用过程能得出有价值的诊断信息，这对设计一系列的实验，对摸索自动化分析 实验条件非常有用，而且有利于对分析系统的快速评价。 ( 3 ) 样品用量极少一般一个表面仅需约l p g 蛋白配体。 ( 4 ) 检测灵敏度高生物样品被直接检测到的最小浓度可低于o 0 1 n g m l 。 ( 5 ) 无损伤检测s p r 是光学技术，光线不与待测物接触，也不穿透样品， 因此也适用于混浊、不透明或有色溶液的检测。 ( 6 ) 检测过程方便快捷偶联过程通常只需要不到三十分钟，相互作用一 般也在数分钟之内即可完成，而再生往往更快。 ( 7 ) 能跟踪监控固定的配体的稳定性。 ( 8 ) 对复合物的定量测定不干扰反应的平衡。 ( 9 ) 应用范围非常广泛不仅可检测抗原抗体之间的特异性反应，还能检 测各种脂类、蛋白、多糖、生物膜上的信号分子以及许多生物大分子之间的相互 作用。 ( 1 0 ) 大多数情况下，不需对样品进行预处理。 4 北京协和医学院博士学位论文 目前，基于s p r 技术的生物传感器，因其能实时监测生物分子间相互作用， 且具有无需标记、分析快捷、灵敏度高、前处理简单、样品用量少等优点，己被 广泛应用于蛋白质组学、药物研发、临床诊断、食品安全和环境监测等领域，并 且显示出广阔的应用前景。 1 1 3s p r 生物传感器的发展历程与现状 1 9 0 2 年，w - o o d 观测到用连续光谱的偏振光通过光栅后，光频谱发生了小 区域损失( “w o o d 异常”) ，这是关于s p r 这一电磁场效应的最早记载。 1 9 4 1 年，f a i l o 【1 3 】发现“w o o d 异常”是由于等离子波引起的，提出了体积等 离子体的概念，初步解释了s p r 现象。 1 9 5 7 年，r i t c h i e 1 4 1 发现，当电子穿过金属薄片时存在能量消失峰，他将这 种消失峰称之为“能量降低的等离子体模式，并指出了这种模式与薄膜边界的 关系，第一次提出了用于描述金属内部电子密度纵向波动的“金属等离子体”的 概念。随后，s t e m 和f 黜l l 【1 5 】给出了这种等离子体模式的共振条件，并将其称 作“表面等离子共振”。 一1 9 6 8 年，o t t o 1 6 】发现在金属表面用渐逝波激发可以产生s p r ，提出o t t o 结 构。 1 9 7 1 年，心e t s c l u i l 锄【1 7 1 提出更为简单、可靠的k r e t s c h m a n n 结构，并成功 用于金属薄膜的厚度和光学性质的测定，为s p r 传感器奠定了基础，现代大多 数s p r 研究都是基于k r e t s c h m a n n 结构。 1 9 8 3 年，l i e d b e r g 等人【1 8 】首次将s p r 原理应用于生物化学反应和动力学的 计算。 1 9 9 0 年，世界上首台商品化的s p r 生物传感器由b i a c o r e 公司研制成功。 此后，s p r 技术取得了长足的发展，各种应用于物理、化学和生物领域的新的 s p r 传感结构设计纷纷出现。 目前，已经有许多不同型号的s p r 生物传感器商品化，其中尤以瑞典的 b i a c o r e 公司所占的市场份额最大。下面以b i a c o r e 公司为例介绍一下s p r 生物 传感器的发展历程。 1 9 9 0 年，b i a c o r e 公司开发出世界上首台商品化s p r 生物传感器b i a c o r e ， 北京协和医学院博士学位论文 该仪器可以检测蛋白一蛋白间相互作用，样品流通池为单通道，数据分析系统包 括覆盖图和可以通过分析传感曲线上的几个点而得到的数字信息【1 9 】。 1 9 9 4 年开发的b i a c o r e2 0 0 0 重新设计了流通系统，使同一种样品可以与4 个靶点反应，这样就可以利用参考点的信号进行信号修正。b i a c o r e2 0 0 0 的检测 能力得到了提高，使直接监测小分子待测物与固定的蛋白配基间的反应成为可能 【2 0 】 o 19 9 6 年开发的b i a c o r ex 是采用手动进样的双通道测试系统。 1 9 9 7 年，b i a c o r e 公司对b i a c o r ex 加入软件b i a e v a l u a t i o n3 0 ，使系统可以 对所有的数据进行整合分析【2 1 1 。 1 9 9 8 年开发的b i a c o r e3 0 0 0 与b i a c o r e2 0 0 0 类似，样品流通池为4 通道，仪 器灵敏度有所提高，并改善了样品回收系统，部分程序语言采用w i z a r d s 软件代 替，用户可以通过向对话框中输入数据来设置复杂的分析流程，从而使s p r 传 感器的操作更加容易2 2 1 。 2 0 0 0 年，b i a c o r e 公司推出专门针对食品分析的b i a c o r eq ，这一系统的浓度 分析与数据采集已经完全实现了自动化。 2 0 0 1 年，b i a c o r e 公司推出了b i a c o r e $ 5 1 和b i a c o r ec ，前者是大规模的药 物筛选系统，目前已经退出市场；后者是根据g l p g m p ( g l p ，药物非临床研 究管理规范；g m p ，药物生产质量管理规范) 设计的质量控制系统，适用于例 行的生物分子定量定性分析。 2 0 0 3 年，b i a c o r e 公司通过优化与质谱( m a s ss p e c t r o m e 仃y ，m s ) 配套的样 品回收系统，使b i a c o r e3 0 0 0 可以实现s p r m s 的联用【5 】；同时增加了g x p ( g l p , g c p , g m p ) ( g c p , 药物临床试验质量管理规范) 软件包，使其符合g x p 应用的 要求，能进行药物的临床前以及临床疗效的评价。此外，b i a c o r e3 0 0 0 还增加了 表面制备单元和自动样品回收引导程序。 2 0 0 5 年，b i a c o r e 公司相继推出了全自动可提供最高质量全面信息的4 通道 仪器b i a c o r et 1 0 0 、高通量的2 0 通道仪器b i a c o r ea 1 0 0 和基于成像技术可同一 时间分析4 0 0 个靶标的b i a c o r ef l e x c h i p 。 2 0 0 7 年，b i a c o r e 公司推出简单易用的两通道仪器b i a c o r ex 1 0 0 ，适合实验 室内蛋白相互作用的科学研究。 6 北京协和医学院博士学位论文 除了瑞典的b i a c o r e 公司以外，英国的w i n d s o rs c i e n t i f i c 公司和f a r f i e l d 公 司；美国的n o m a d i c s 公司、a f f i n i t ys e n s o r s 公司、q u a n t e c h 公司、g w c 公司和 t e x a si n s t r u m e n t s 公司；荷兰的e c oc h e m i eb v 公司；德国的b i o t u l 公司；韩国 的k m a c 公司以及中国的中科院电子研究所等也都在进行s p r 传感器的研制， 并且已经生产了多种型号的系列产品。最近，中国的c y t o t r e n d 公司和美国的 b i o r a d 公司也加入到了s p r 生物传感器的生产商队伍中。值得一提的是， b i o r a d 公司研发的p r o t e o nx t r 3 6 系统具有独特的6 x 6 阵列芯片设计，能同时 分析最多6 个配体与6 个分析物之间的相互作用【2 3 1 。 1 2 s p r 传感芯片 s p r 生物传感器主要由光学检测系统、传感芯片、液流控制系统、温控系统 和计算机软件5 部分元件组成。其中，传感芯片是最为核心的组件：传感芯片提 供了产生s p r 信号的必需物理条件，并且分子相互作用的研究是在传感芯片表 面进行的。 1 2 1s p r 传感芯片的结构特点 传感芯片是s p r 实时信号的传导载体，主要包括耦合器件、金属膜和表面 基质三个组成部分。 1 2 i 1 耦合器件 产生s p r 现象必须将光波与表面等离子体波( s p w ) 耦合并使其发生共振， 因此需要使用耦合器件。常用的耦合器件主要分为4 类：棱镜型、光栅型、光纤 型和光波导型。 ( 1 ) 棱镜型 用于产生衰减全反射( a t r ) 的棱镜型装置有o t t o 结构和k r e t s c h m a n n 结构， 如图1 3 。二者在结构上的区别主要是棱镜底面与金属膜之间是否存在间隙。o t t o 型结构对此间隙的取值有严格要求，在制作和使用上都有一定难度，因此应用的 比较少；k r e t s c h m a n n 型结构简单，制作容易实现且使用方便，较容易达到很高 7 北京协和医学院博士学位论文 的灵敏度，因此应用也最为广泛，是s p r 传感装置最常用的结构。对于 k r e t s c h m a n n 结构来说，由于渐逝波需要穿透金属层，在与被测物接触的表面激 发才能产生s p w ，因此对金属膜的厚度有严格的限制。 芒兰兰兰兰当 o t t o 型k r e t s c h m a n n 型 口金属膜 甾麓表面基质 图1 - 3 棱镜型s p r 传感器的原理图 ( 2 ) 光栅型 在光栅的表面覆盖一层金属膜，金属膜与分析溶液接触，当入射光照射在光 栅表面时，反射光将出现散射，如图1 4 ，当某一阶( l _ o ，1 ，2 ，) 的 动量与s p w 的动量相等时，二者发生共振。大多数s p r 传感器采用棱镜耦合入 射光，而不采用衍射光栅，主要是因为光栅型s p r 传感器的灵敏度要比棱镜型 低一些【2 4 1 ，同时数学模型和理论计算也复杂得多2 5 1 ，另外在流动溶液中进行分 析时样品消耗量也较大，而且被测样品和流通池必须是透明的，这也给检测带来 额外的噪声干扰。一种改进方法是采用曲面衍射光栅耦合法，可提供很高的信噪 比，获得很高的灵敏度【2 6 1 。光栅型s p r 传感器的优点在于它的尺寸小，价格低 廉，容易实现微型化和批量化生产。 m = - - 1 图1 4 光栅型s p r 传感器的原理图 ( 3 ) 光纤型 自1 9 9 3 年j o r g e n s o n 等人首次提出基于光纤的s p r 传感装置以来，光纤型 s p r 的研究得到了广泛的发展【2 7 1 。光纤型s p r 传感器采用光纤作为光的传输媒 介，主要有两种形式：终端反射式和在线传输式，其结构如图1 5 所示。由于光 8 北京协和医学院博士学位论文 纤的独特性质，加上这种s p r 传感器的结构紧凑、小巧，很容易实现微区探测、 遥测和分布式检测。目前影响光纤型s p r 传感器的主要问题是制作工艺复杂， 成本高。 终端反射式在线传输式 口金属膜 竣簸表面基质 图l 一5 光纤型s p r 传感器的原理图 ( 4 ) 光波导型 光波导型s p r 传感器的原理与棱镜型十分相似，如图1 - 6 所示，不同之处 在于光波传输的媒介由棱镜变为光波导，在理论上，它可达到的检测精度也与棱 镜型的相仿。所谓的光波导是光波传导的材料，能把光束缚在一定区域内传播。 光波导型s p r 传感器有其自身的优点：光波的传输途径可以人为控制；易于实 现微型化；稳定性好等。 1 2 1 2 金属膜 波 表面基质 f 甲传俏h _ 兀驭缀嬲黝黝黝黝瓣 t f 呼蜓岛o ，? ，t ，矿矿矿，矿矿矿矿，? l 基片 图1 - 6 光波导型s p r 传感器的原理图 导层 金属元素的性质各不相同，因此选择不同种类金属材料作为产生s p r 的基 质膜，将会对s p r 光谱产生很大影响。由于s p r 是利用反射光谱来进行研究的， 因此金属材料首先考虑的是反射率高的金属。在可见光范围内， a g 、a u 、a 1 和c u 的反射率都比较高，并且随波长变化而改变的幅度较小。4 种金属中，a g 的反射率最高；a l 的高反射率区最宽且平稳，波动最小；a u 、c u 的反射率没有 a g 、a l 理想，高反射率区范围较窄。但是，金属膜的化学稳定性也是一个需要 考虑的重要因素。在这4 种金属当中，a 1 的稳定性最差，极易被氧化，在其表 面形成致密的氧化铝膜层，从而影响s p r 的产生；a g 的稳定性虽然也不理想， 9 北京协和医学院博士学位论文 但高于a 1 ；c u 也容易被氧化；a u 的稳定性最好，不易与其他物质发生反应， 具有化学惰性，适合长期使用。综合以上因素，a g 和a u 两种金属比较适宜。 另外，从s p r 光谱的三个特征参数( 共振波长，共振宽度和共振深度) 来 看，在同样的条件下，a g 膜的共振波长变化比a u 膜灵敏，共振深度大于a u 膜， 共振峰宽小于a u 膜【2 引。理论上，a g 膜是s p r 首选的金属膜，不过由于a u 膜 的化学惰性较强，尤其适用a g 膜不能使用的体系，因此，s p r 传感芯片的金属 膜多为a u 膜。最近有研究人员结合a g 膜的高灵敏性和a u 膜的稳定性，制备 了a g a u 双层复合膜，取得了令人满意的结果 2 9 - 3 1 】。 除此之外，金属膜的厚度直接影响共振深度，是获得高灵敏s p r 信号的关 键参数。随着膜厚度的改变，反射光强度亦会随之改变；当膜厚度为某一数值时， 反射光强度近似为零，共振深度达到最大；当膜厚度超过一定值时，共振峰将消 失。图1 7 所示为b k 7 玻璃棱镜与金膜界面的s p r 反射率曲线【3 2 1 ，从图中曲线 可以看出，金属膜厚度为5 0 n m 时所得到的共振深度最大，即s p r 信号响应最灵 敏，因此在同等条件下，用于s p r 检测的最佳金属膜厚度为5 0 n m 。而事实上， 目前一般选用的金属膜厚度也是5 0 n m 左右。 1 2 1 3 表面基质 摹 、一 褂 菸 谜 图1 7 金膜厚度对s p r 光谱的影响 大多数s p r 传感芯片的金膜表面都连有一层基质，它一般通过内层的组装 层共价连接上去的，然后其它分子可以通过多种方式连接到基质分子上。s p r 传 1 0 北京协和医学院博士学位论文 感芯片的表面基质并不影响s p r 的特性，而且不同类型的芯片其表面基质亦不 相同。未修饰的金膜通常不适合进行生物分子相互作用研究，如b i a c o r e 公司， 其大部分芯片的金膜上都连有一层烷基硫醇或巯基烷醇分子，这主要是为了避免 生物分子直接接触金膜，同时也提供了偶联下一层基质的途径，从而增强表面的 实用性。 具体来说，烷基硫醇层呈现强疏水表面环境，在专门为脂单层膜研究而设计 的h p a 芯片中就是直接利用了这种性质。然而，在大多数的传感芯片上，表面 所覆盖的是共价连接在巯基烷醇上的一层羧甲基化葡聚糖。它是一种不分支的柔 性糖链，能在芯片表面形成大约1 0 0 n m 厚的覆盖层( 针对c m 5 芯片而言) 。表 面葡聚糖的浓度如果换算成水溶液中的浓度大约为2 ，这赋予了芯片表面一些 重要的特性： ( 1 ) 它提供的亲水环境有利于大多数生物分子相互作用； ( 2 ) 可以通过很多常用的化学方法将生物分子偶联到芯片表面； ( 3 ) 负电的羧基基团对溶液中的带正电分子产生吸引，使得偶联能在较低 浓度时有效进行； ( 4 ) 相对于平的表面来说，它大大增加了表面的偶联能力； ( 5 ) 它拓展了检测相互作用的范围，这个范围和渐逝波的穿透距离是处于 同一数量级的； ( 6 ) 在大多数生物分子相互作用中，葡聚糖是相当惰性的分子，而无分支 的柔性葡聚糖分子还能为偶联的分子提供一定程度的自由运动。因此，基于葡聚 糖基质的芯片为许多生物分子相互作用提供了一个极佳的环境。 可见，传感芯片的表面基质对分子相互作用的研究有着重要的影响。一般而 言，传感芯片金膜上固定生物分子的方法主要有以下几种： ( 1 ) 直接物理或化学吸附法 3 3 , 3 4 1 早期的研究经常采用此方法。一种是通过疏水作用能够将生物分子直接物理 吸附在金膜表面，该方法的缺点是吸附的生物分子层不够稳定，金膜表面覆盖率 低，其它生物分子容易在裸露的金膜上产生非特异性吸附；另外一种吸附方法是 表面富含巯基的生物分子通过a u s 键直接化学吸附到金膜表面，此方法仅适用 于少数蛋白质的固定，如蛋白质a ，在金膜表面形成的分子膜比较牢固，常常作 北京协和医学院博士学位论文 为固定免疫球蛋白g ( i m m u n o g l o b u l i ng ，i g g ) 的媒介。 ( 2 ) 共价偶联法【3 5 ，3 6 】 末端为巯基的双功能分子( 如1 6 - 巯基十六烷醇、1 1 一巯基十一烷酸等) 能 与金膜形成牢固的a u s 键，在金膜表面形成一层自组装单分子层( s e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r ，s a m ) ，在这基础上，一种方法是直接通过偶联剂与生物分子表面相 应的功能基团共价键合，从而将生物分子牢固地结合在芯片表面；另一种方法是 在功能分子的末端基团上，进一步共价偶联具有空间网状结构的高聚物分子( 如 葡聚糖、琼脂糖等) ，接着通过羧化试剂使高聚物分子羧基化，然后再利用偶联 剂将生物分子固定于高聚物分子表面。根据生物分子表面参与偶联的基团不同， 常用的方法可分为氨基偶联法、羧基偶联法、巯基偶联法和醛基偶联法等，如图 1 8 所示。 ( 3 ) 金属螯合法【3 7 。9 1 金属螯合借鉴了固定化金属螯合亲和色谱法( i m m o b i l i z e dm e t a l c h e l a t e d a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，i m a c ) 中生物分子的固定方法，其基本原理是利用n i 2 + 、 c 0 2 + 、c u 2 + 等过渡金属离子与重组蛋白质表面的组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等的 配位作用，将重组蛋白质固定在预先螯合金属离子的金膜表面。 ( 4 ) 亲和素一生物素结合法【4 0 4 1 】 通过共价偶联法将亲和素固定在金膜表面，然后利用亲和素与生物素的高亲 和力，将生物素标记的蛋白质固定到芯片表面。 ( 5 ) l b 膜法【4 2 】 通过l b 膜( l a n g m u i rb l o d g e t tf i l m ) 将液面上有序排列的化合物逐层地转 移到金膜上，实现金膜上的特定分子的高度有序排列。 ( 6 ) 分子印迹法h 3 4 6 1 将分子印迹( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ，m i ) 技术与s a m 技术相结合以固定生 物分子，可以提高s p r 检测的灵敏度和稳定性。 其中，( 2 ) 、( 3 ) 、( 4 ) 是目前较为常用的偶联方法，但整个偶联步骤相对比 较复杂，为此，各s p r 传感器生产商都有向用户提供构建好基质的传感芯片， 如b i a c o r e 公司的c m 5 、n t a 和s a 芯片便是这三种偶联方法的典型代表，以便 用户可以快速、直接地在表面基质上固定生物分子。 1 2 北京协和医学院博士学位论文 ( b ) 羧基偶联法 le 址懈s r 。、 】 圈1 - 8 常用的共价偶联固定生物分子的方法 综上所述，目前大多数s p r 传感芯片主要采用k r e t s c h m a n n 结构，在玻璃 基片上覆盖一层金属薄膜( 通常是金膜或银膜) ，然后在金属薄膜表面连接不同 的基质以固定不同性质的生物分子。最典型的代表就是b i a c o r e 公司的葡聚糖系