（遗传学专业论文）抗生素产生菌ap191的鉴定及uv诱变育种的研究.pdf

塑鋈盔堂堡皇兰垡堡窒 抗生素产生菌a p l 9 1 的鉴定及u v 诱变育种的研究 摘要 本文以一株抗生素产生菌a p l 9 1 为出发菌株，对其进行了系统分类学以及 u v 诱变育种的研究。 形态学特征、生理生化性状和1 6 sr d n a 核苷酸序列分析表明，菌株a p l 9 1 属于链霉菌属( 勋印向彤，甜ss b ) 。 用紫外线对a p l 9 1 的孢子及原生质体分别进行诱变育种，获得了产抗生素 的高产菌株。经纸片法和最小抑菌浓度( m i c ) 测定，其中一株由原生质体诱变 得到的菌株，其发酵液中抗生素的相对效价是原始菌株的4 倍，且有较高的遗传 稳定性。实验结果表明，原生质体的紫外诱变比孢子的紫外诱变更易得到抗生素 相对效价提高较多的突变株。 我们同时还研究了不同的培养温度对孢子的紫外诱变正向突变率的影响。将 u v 诱变后的a p l 9 1 孢子，分别置于适宜的生长温度2 7 与接近抑制生长的胁 迫温度3 3 下培养，结果表明：在3 3 下培养获得的子代菌株中，产抗生素水 平超过其出发菌株的正向突变体所占的比例，明显高于在2 7 下培养的结果。 2 7 下培养，正向突变体占总子代菌株数的百分率为2 5 8 ，而在3 3 下培养则 为5 8 1 。用1 7 种1 0 b p 的随机引物对出发菌株与u v 诱变后的子代菌株进行总 d n a 的r a p d 测验证明，在接近抑制生长的胁迫温度3 3 下培养获得的子代， 发生在其d n a 水平上的变异程度要比在2 7 培养下的子代高得多，与对照菌株 r a p d 条带的相似性从2 7 的6 6 4 下降到了3 3 的5 7 4 。这一方法较大幅度 地提高了链霉菌a p l 9 - l 紫外诱变育种的工作效率。同时也为链霉菌紫外诱变后 突变形成机制的进一步研究提供了新途径。 关键词：抗生素，链霉菌，诱变育种，正向突变率，r a p d ，1 6 sr d n a 系统发育分析 浙江人学倾i ：学位论史 s t u d i e so nu v m u t a g e n i cb r e e d i n g a n di d e n t i f i c a t i o n o fa n a n t i b i o t i c p r o d u c i n g s t r a i na p l 9 1 a b s t r a c t s t u d i e so nu v m u t a g e n i cb r e e d i n ga n di d e n t i n c a t i o no fa na n t i b i o t i c p r o d u c i n g s t r a i na p l 9 1w e r ec a i e do u t b a s e do nm er e s u n so fp h e n o t y p i cc h a r a c t e r i s t i c sa i l d 16 sr d n as e q u e n c e a n a l y s i s ，n l ei s o i a t ew 笛弱s i g n e d t om e g e n u s 脚r 0 删阳p s mo r d e rt 0i m p r o v em e 删b i o t i c p r o d u c i n gt r a i to f s 仃a i na p l 9 - l ，w e e x p o s e d i t s p r o t o p l a s t sa i l ds p o r e st ou va i l di s o l a t e dam u t a n ts 订a i ny 2 0 7 n l ea n t i b i o t i c s r e l a t i v et i t e ro ft h em u t a m sf e 彻e m e db m 血w a s4t i m e sa sh i 吐a sm e p a r e 眦s t r a i n t 1 1 r o u g hm i ce x p e r i m e m a n di t sl l i g hc a p a c i 谚f o rp r o d u c i n ga n t i b i o t i cr e m a i n e d s t a _ b i ea f t e r4t i m e so fs u b c l l l t u r e s i t 、v a sa l s of o u n dt h a tt h ee 丘e c to f p m t o p l a s t s tu v m u t a g e n i cb r e e d i n gw a sb e n e r l a ns p o r e s u vi r r a d i a t e ds p o r e so fs t r a i na p l 9 1w e r ei n c u b a t e da t2 7 a n d 3 3 c l o s et o i n h i b i t i n g 酽。硼1t e m p e r a l m e r e s u l t ss h o w e dt h a t 锄o n gm eo 凰p r i n gf b mu v i r r a d ia t i 丑 s p o r e s掣o w i l a t 3 3 ， t l l e锄o u mo ff o 删dm m a i l t s w h o s e 趾t i b i o t i c s - p r o d u c i n ga b i l i t yw e r eo v e rt l l eo r i g i n a ls t m i n sw e r em a n ym o r et l l a nt h a t a t2 7 t h e p e r c e n t a g eo f n l ef o r w a r dm u t a m sw a s2 5 8 a t2 7 a 1 1 d5 8 1 a t3 3 r e s p e c t i v e l yt 0 t a ld n a o f m e p m g e n y s t r a i na i l d l eo r i g i n 小s t r a i nw a st e s t e db y r a p d 、v i t l ll7p r i m e r s i tw 硒d e m o n s 心l t e dt h a t m ev a r i a n o n s0 c c u r r e di nt h e c 1 1 r o m o s o m a ld n ao f t l l ep m g e n ys 廿a i n sg r o w na t3 3 w e r e m o r et l l a nt h a ta t2 7 t h i sm e m o di m p r o v e dm e e 伍c i e n c yo fu vm u t a g e n i cb r e e d i n ga i l dp u tf o n a r da n e ww a yj nr e s e a r c h i n gi n t on l em e c h a n i s m so f m u t a “o nf o r r l l a t i o ni n 跏印，o 删c p s s p c e l l si r r a d i a t e db yu v k | e yw o r d s ：a n t i b i o t i c ，跏印f o 删c e s ，b r e e d i n g ，f o n a r dm m a t i o nr a t e ，r a p d 1 6 s r d n a ，p h y l o g e n e t i ca i l a l y s i s 前言 到目前为止，大约有2 3 的天然医用抗生素以及其他一些重要的次级代谢产 物，如抗癌和抗真菌物质等来源于链霉菌属【1 1 。由于致病菌对现有抗生素产生抗 药性的问题日趋严重，寻找新的具有广谱抗菌效果的抗生素成为了世界各国有关 科学家极为关注的热点。 本实验室在研究野生动物肠道微生物生态时，从其粪便中分离到一株抗生 素产生菌a p l 9 1 。由该菌产生的抗生素对包括耐甲氧西林葡萄球菌在内的所有 试验过的革兰氏阳性细菌均有强烈的抑制作用，具有潜在的应用价值。因此我们 对菌株进行了比较深入的分类、鉴定，同时开展了以提高其产抗生素水平为目的 的遗传育种及相关研究工作。 近年来，菌株的分类、鉴定方法进展较快。在以形态和生理生化特性分析 为主的传统分类方法的基础上，建立了数值分类法( n m 喇c a lc l a s s m c a t i o n ) 、 化学分类法( c h e m ot a ) ( o n o m y ) 和分子分类法( m o l e c u l a r 切_ ) 【o n o m y ) 。其中，分子分 类法发展最快，应用最广。 s t a c k e b r a n d t 和w b e s e 【2 】在8 0 年代根据1 6 sr d n a 相似性、d n a r r n a 和 d n a d n a 杂交的结果构建了放线菌和其他生物之间的系统发育树，这标志着放 线菌分子分类时期的开始。随着分子生物学的发展，分子分类正成为分类学的主 要方法，越来越受到重视。经常用到的分子特征包括d l n a 的g + cm o l 、 砌b o t y p i n g 、随机扩增d n a 多型性分析( r a p d a ) 、低频限制性酶切片段分析 ( l f r a ) 、扩增r d n a 限制性酶切片段分析( a r d r a ) 、扩增片段长度多型性分 析( a f l p ) 、1 6 s 一2 3 sr r n a 间隔区序列分析、1 6 s 2 3 sr d n a 序列分析、d n a d n a 杂交、d n a - r n a 杂交等【3 1 。其中应用最广的是1 6 sr 肼q a 序列分析。 随着核酸测序技术的发展，1 6 sr d n a 序列越来越多的被用于放线菌的系统 进化研究，并已经成为确立放线菌新分类单位的必要数据。近年报道的链霉菌新 种大多是以1 6 sr d n a 序列分析结果为重要依据的。随着互联网的迅速发展，我 们可以快捷、容易地从些大型数据库如：r d p 、e m b l 或g e n b a n k 中获得相 关菌株的1 6 sr d n a 序列用于构建系统发育树。 但是，通过研究发现，一些位于同一表观群中的菌株，在分子分类中出现 浙江大学钡i ：学位论义 在不同的基因群中这说明通过表型特征建立的分类系统存在一定的局限性， 已不能完全客观的反映自然分类关系。1 6 sr d n a 由于只代表了细菌d n a 的一 小部分信息，在反映菌株间的关系时也可能会存在偏差。总d n a 杂交使用的是 菌株的总d n a ，能最大程度的反映菌株间的自然关系，是最可靠的方法。但杂 交不能用于关系较远的菌株间，且这一方法需要两两配对实验，不可能用于大量 的菌株间。所以，现在的分类学研究正发展成为通过综合考虑表型分类( 形态和 生理生化特征) 、数值分类、化学分类和分子分类等各种信息，来确定菌株分类 地位的多相分类( p o l y p h a s i ct a ) ( o n o m y ) 。 本实验室就结合使用传统的表型分类法和基于1 6 sr d n a 序列比较的分子 分类法对菌株a p l 9 1 进行了分类鉴定，确立了它的系统发育学地位。 近年来，利用基因工程方法来提高链霉菌产抗生素水平的研究进展较快5 矧， 是高产菌株选育的发展方向之一。但由于种种原因，还鲜见达到产业化水平的成 果。因而，目前工业微生物育种的方法，仍由经过长期实践证明颇有成效的诱变 育种占据主要地位【7 1 。 诱变育种虽然有工作量大，针对性比较差等缺点，但同时也具有：简便、 易行、安全、有效等优点。特别是利用理化因子进行诱变育种的方法，技术简单， 设备要求低，利用该方法对新分离到的野生型菌株进行育种，一般都能够得到比 较满意的结果。 我们就选用了紫外诱变的方法，对菌株a p l 9 1 进行了诱变育种，获得了高 产菌株。同时，我们还对紫外诱变的方法进行了优化，有效地提高了诱变的正向 突变率，使诱变育种的效率得到了较大地提高。 浙江人学烦l ：学位论义 材料与方法 1 菌株 1 1a p l 9 1 ：实验室保藏菌株，分离自野生动物粪便。 1 2 抗生素相对效价测定用细菌：金黄色葡萄球菌，由浙江省药品检验所提供。 2 培养基和试剂 2 1 形态和培养特征观察用培养基【8 】 2 1 1 高氏一号琼脂培养基 可溶性淀粉2 o k n 0 3 o 1 k 2 h p 0 4 o 0 5 n a c l0 0 5 f e s 0 4o _ o o1 m g s 0 4 7 h 2 0o 0 5 琼脂i 5 p h7 2 ，1 2 1 灭菌2 0 m 血 2 1 2 克氏一号琼脂培养基 葡萄糖2 o k n 0 3 0 1 n a c l0 0 2 k 2 h p 0 4o 1 m g c 0 3 o 0 3 f e s 0 4o o o l c a c 0 3 o 1 琼脂1 5 p h7 2 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 2 1 3 察氏琼脂培养基 n a n 0 3 0 2 k 2 h p 0 4o 1 k c l0 0 5 m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 5 f e s 0 4 0 0 0 1 蔗糖2 0 琼脂1 5 p h7 2 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 2 1 4 葡萄糖一天门冬素琼脂培养基 葡萄糖1 o 天门冬素0 0 5 k 2 h p 0 4o 0 5 牛肉膏0 2 琼脂1 5 p h7 2 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 2 1 5 葡萄糖一酵母膏琼脂培养基 葡萄糖1 0 酵母膏1 o 琼脂1 5 p h 7 2 ，11 5 灭菌3 0 m i n 浙江人学帧i 学位论史 2 1 6 马铃薯浸汁琼脂培养基 取马铃薯2 0 克( 去皮) 切成小块，加水l o o m l ，煮沸0 5 h ，过滤，取滤液， 补足水量到总体积1 0 0 m l ，再加入葡萄糖1 9 ，琼脂1 5 9 ，熔化，调至p h 7 7 4 ， 分装试管，1 1 5 灭菌3 0 m i n 。 2 1 7 马铃薯块培养基 取新鲜马铃薯洗净去皮，切成斜条，水浸0 5 h ，然后装入试管，试管内先放 入脱脂棉球并注入水，水面应高出棉球，达到马铃薯块基部，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 2 2 生理生化特性测定用培养基【8 】 2 2 1 碳源利用试验培养基 ( n h 4 ) 2 s 0 4 0 2 6 4 k h 2 p 0 4o 2 3 8 k 2 h p 0 4o s 6 5 m g s 0 4 。7 h 2 0 o 1 c u s 0 4 。5 h 2 0o 0 0 0 6 4 f e s 0 4 7 h 2 00 o 0 0 1 l m n c l 2 4 h 2 00 0 0 0 7 9 z n s 0 4 7 h 2 0o 0 0 0 7 5 水洗琼脂1 5 p h6 8 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 2 2 2 淀粉水解测定琼脂培养基 可溶性淀粉1 0 k n 0 3 o 1 k 2 h p 0 4 o 0 3 m g c 0 3 0 1 n a c lo 0 5 琼脂1 5 p h7 2 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 2 2 3 硫化氢产生测试培养基 蛋白胨1 o 柠檬酸铁o 0 5 k 2 h p 0 4o 1 琼脂1 5 p h7 2 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 2 2 4 纤维素酶活性测定培养液 k n 0 30 1 m g s 0 4o 0 5 n a c lo 0 5 k 2 h p 0 4o 0 5 滤纸条( 作碳源) 切成宽1 厘米，长6 厘米。试管装此培养液5 6 毫升，装 入的滤纸应一半露出液面，1 1 5 灭菌3 0 m i n 。 2 2 5 明胶液化试验用培养基 蛋白胨o 5 葡萄糖2 o 明胶2 0 o p h 7 o ，1 1 5 间歇灭菌三次，每次3 0 m i n ，灭菌后立即浸入冷水冷却。 6 浙江人学颇i ：学位论文 2 2 6 牛奶凝固与胨化试验用培养基 2 5 石蕊水溶液4 m l ，脱脂牛奶1 0 0 m l ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 。 2 _ 3 营养肉汤培养基 营养肉汤2 2 琼脂1 5 1 2 l 灭菌2 0 m i n 2 4 预发酵培养基( 葡萄糖一酵母膏液体培养基) 葡萄糖1 酵母膏l p h7 2 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 2 5 发酵培养基 淀粉3 黄豆饼粉2 k h 2 p 0 4 o 0 5 m g s 0 40 0 2 5 ( n h 4 ) 2 s 0 4 o 4 c a c 0 3 0 3 p h7 4 ，1 2 l 灭菌2 0 m i i i 2 6 菌丝生长培养基【9 】( h 培养基) 淀粉o 4 麦芽糖l 酵母膏0 4 p h7 5 ，1 1 5 灭菌2 0 m m 2 7s r 再生培养基f 1 0 】 蔗糖1 0 3 葡萄糖o 2 蛋白胨0 2 酵母粉0 2 酪蛋白水解物o 4 k h 2 p 0 4o 0 0 5 m g c l 2 6 h 2 01 0 1 2 c a c l 2 2 h 2 00 2 9 h e p e so 5 9 5 l - h i s0 0 7 7 6 l g l uo 2 5 微量元素l 5 0 0 ( v v ) 琼脂1 8 p h7 2 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 2 8 微量元素液( m 1 ) z n c l 24 0 f e c l 3 6 h 2 01 0 c a c l 2 2 h 2 0l o m n c l 2 。4 h 2 0i o n a 2 8 4 0 7 。1 0 h 2 0l o ( n h 4 ) 6 m 0 7 0 2 4 4 h 2 01 0 2 9p 缓冲液( 1 ) 1 蔗糖1 0 3k 2 s 0 4o 2 5 m g c l 2 6 h 2 02 0 2 微量元素液2 m l蒸馏水8 0 0 m 1 分成8 0 m l 的等份，1 1 5 灭菌3 0 m i n 。使用前每瓶加经过单独灭菌的 k h 2 p 0 4 ( 0 5 ) l m l c a c l 2 2 h 2 ( 3 6 8 ) 1 0 m lt e s ( 5 7 3 d h 7 _ 2 ) 1 0 m l 7 塑兰墨兰坐! ：竺丝竺蔓二一 2 i oi ) “a 提取用主要试剂l j 2 】 t e 缓冲液 5 0 m mt r i s h c l 一5 m me d l a ，p h 8 o 2 0 s d s ( w v )2 4 ：1 氯仿一异戊醇( v ：v ) 平衡酚 r n a 酶无水乙醇 2 1 1r a p d 实验用试剂【1 2 j 殛口d n a 聚合酶r o x p c r b u 能r d n t p 1 0 b pr a j p dp r i m e r琼脂糖t b e 缓冲液 e bd n a 加样缓冲液：0 2 5 溴酚蓝，4 0 蔗糖 实验用到的3 0 种1 0 b pr a p d p r i m e r 序列 2 1 2 其他试剂 1 0 m m l 溶菌酶 l o 3 蔗糖溶液 o 9 生理盐水 h e p e s 路哥( l u g o i ) 氏碘液f 8 】o 0 1 s d s 3 主要仪器设备 恒温培养箱、恒温摇床、高速台式离心机、磁力搅拌器、光学显微镜、透射 电子显微镜、扫描电子显微镜、热循环仪( p e r k i n e l m e r 公司9 6 0 0 型) 、d y y 。1 2 型电脑三恒多用电泳仪、d y c p 3 1 d 型水平电泳槽。 浙江人学硕 ：学位论文 4 菌株a p l 9 1 的菌种鉴定1 8 i 4 1 菌体形态观察 将菌株a p l 9 1 在葡萄糖一酵母膏培养基中，用插片法在2 8 培养2 d 左右。 取下插片，用美蓝染色后，在光学显微镜下观察。 分别用透射电镜和扫描电镜观察、拍摄菌株的菌丝体和孢子链的形态。 4 2 菌株培养特征的观察 将菌株a p l 9 1 分别接种到高氏一号、察氏、葡萄糖一天门冬素、克氏一号、 马铃薯浸汁、葡萄糖一酵母膏琼脂斜面和马铃薯块天然培养基上，2 8 培养，分 别在7 、1 4 、及2 8 d 观察其培养特征和颜色变化。 4 3 菌株生理生化特性的测定 4 3 1 碳源利用试验 将菌株a p l 9 - l 的孢子悬液o 1 m l 接种在无碳源的碳源利用试验培养基平板 上，用无菌的涂布棒涂布均匀，然后划线挖沟，以沟为界，把平板培养基分成若 干小区，每小区分别加入一种碳源：阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、果糖、 蔗糖、甘露醇、和肌醇，每皿设置无糖对照区。在2 8 培养，分别在7 、1 4 d 观 察、记载生长利用情况。 4 3 2 淀粉水解测定 将菌株a p l 9 - 1 点种于淀粉水解测定平板上，2 8 培养4 d ，形成菌落后，在 平板上滴加路哥氏碘液，铺满菌落周围。 4 _ 3 3 硫化氢产生测试 将菌株a p l 9 一l 接种到硫化氢产生测试培养基上，2 8 培养1 0 d 左右，观察 结果。 4 3 4 纤维素酶活性测定 将菌株a p l 9 - 1 接种到纤维素酶活性测定培养基液面外的一段滤纸条上，置 2 8 培养3 0 d 后观察。 4 3 5 明胶液化试验 将菌株a p l 9 l 接种到柱形明胶培养基表面，2 2 培养，分别在5 、1 0 、2 0 及3 0 d 各观察一次液化程度。观察前将菌种管冷冻2 0 3 0 m i n 。 浙江人学坝i 二学位论殳 4 3 6 牛奶凝固与胨化试验 将菌株a p l 9 1 接种到脱脂牛奶中，2 8 培养，分别在3 、6 、1 0 、2 0 及3 0 d 各观察一次，记录结果。 4 4 基于1 6 sr d n a 序列比较的系统发育分析 将菌株a p l 9 1 的1 6 sr d n a 序列( 钱朝东) 提交到e u r o d e a nm o l e c u l a r b i o l o g yl a b o r a t o r y ( e m b l ) 核酸序列数据库。 将a p l 9 1 的1 6 sr d n a 序列通过b l a s m 程序与g e n b a l l l ( 中已有的核酸序 列进行比较。选择与所测菌株的1 6 sr d n a 序列相似性大于9 5 ，片段大小相近， 且己鉴定到种的菌株作为构建系统发育树的菌株，并选择爿c r f n o 所y c p sv 括c o s w 的1 6 s r d n a 序列作为o u t f o u p ，利用序列比对软件c l u s t a lw 1 8 进行多序列 比对。 系统发育树的构建利用p h y l i pp r o g r a mp a c k a g e 中的程序s e q b 0 0 t 、 d n a d i s t 、n e i g h b o u r 和c o n s e n s e 进行。d n a d i s t 将比对信息转化为距 离距阵( d i s t a n c em a 嘶x ) ，n e i g h b o u r 利用邻接法( n e i g l l b o r j o i n i n g m e t h o d ) ”“，根据距离距阵来构建系统发育树。系统发育树的准确性评价利用c o n s e n s e 的引导分析( b o o t s 仃印a i l a l y s i s ) 进行，重复次数为1 0 0 ，用以确定树内不同分支 的可信度，并给出引导值( b o o t s 仃印v a l u e ) ，代表原始树在该结分支模式的数 目。一般如果引导值大于7 0 1 0 0 ，则可以认为该树内部的拓扑结构具有较高的可 信度。最后，用t r e e v i e 、f 1 7 1 软件显示并编辑系统发育树。 5 菌株a p l 9 1 诱变育种的研究 5 1 链霉菌孢子悬液的制备：参照文献1 在成熟的菌株a p l 9 一l 斜面上加入无菌水，用接种环刮取培养物表面的孢子， 制成粗制的孢子悬液。将此悬液倒入装有玻璃珠的三角烧瓶中振荡以打散孢子， 然后用装有脱脂棉的试管过滤悬液，3 0 0 0 r p m 离心5 m i n 后复悬于无菌水中，得 单孢子悬液。 5 1 2 原生质体的制备、再生和纯度榆测：参照文献1 以2 5 m 1 2 5 0 m l 的装量，接0 1 m l 菌株a p l 9 1 的单孢子悬液入菌丝生长培养 基( h 培养基) ，2 8 、2 0 0 r p m 培养2 4 h 。然后以5 的接种量转接到添加了0 5 甘氨酸的新鲜h 培养基中继续培养1 8 h 。 浙江大学顾i ：学位论文 取1 0 m l 培养液，3 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 收集菌体，复悬于1 0 m l l o 3 的蔗糖 溶液中，离心收集菌体，重复一次，得菌丝沉淀。 将沉淀菌丝悬于2 m l 溶菌酶溶液中( 用p 液配置，经滤膜过滤除菌) ，3 0 保温1 h ，并不时振荡。酶处理完后，用脱脂棉过滤，除去菌丝体，3 0 0 0 叩m 离心 7 m i n ，沉淀复悬于1 0 m lp 缓冲液中，得原生质体悬液。用血球计数板计数，计 算原生质体悬液的浓度。 原生质体再生：将原生质体悬液分别用p 缓冲液稀释到适宜浓度，涂布到 s r 再生平板上，2 8 培养。 原生质体悬液纯度的检测：将原生质体悬液分别用p 缓冲液和o 叭s d s 稀 释l o 倍后，在光学显微镜下观察两种稀释液的差异。 5 3 原生质体和孢子的紫外诱变 原生质体的紫外诱变：将菌株a p l 9 一l 的原生质体悬液用p 缓冲液稀释调整 到浓度为1 0 8 个m l 。加5 m l 原生质体悬液于直径为6 c m 的平皿中，开盖置于1 5 w 紫外灯下3 0 c m 处照射，在磁力搅拌机上恒速搅拌。分别照射5s 、1 0 s 、2 0 s 、4 0 s 、 7 0 s 、1 0 0 s 后，用p 缓冲液稀释到适宜浓度，涂布于s r 再生平板，2 8 避光培养 7 d 。 孢子的紫外诱变：将菌株a p l 9 1 的单孢子悬液用o 9 的生理盐水稀释调整 到浓度为1 0 8 个m l 。加5 m l 单孢予悬液于直径为6 c m 的平皿中，开盖置于1 5 w 紫外灯下3 0 c m 处照射，在磁力搅拌机上恒速搅拌。分别照射5s 、1 0 s 、2 0 s 、4 0 s 、 7 0s 、1 0 0 s 后，用o 9 生理盐水稀释到适宜浓度，涂布于葡萄糖一酵母膏琼脂平 板上，2 8 避光培养5 d 。 5 4 菌种的发酵 挑选经过紫外诱变后再生的单菌落，将其接种到预发酵培养基中，2 8 、 2 0 0 r p m 预培养2 4 h 。按照5 的接种量转接到发酵培养基中，2 8 、2 0 0 r p m 振荡 培养7 2 h 。 5 5 抗生素效价测定 发酵液经6 0 0 0 r p m 离心5 m i n 后，取上清液，适当稀释。分别利用纸片扩散 法和m i c ( m i n i m a l i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ，最小抑菌浓度) 测定实验来检 测抗生素的相对效价。 浙江人学坝i 学位论文 纸片扩散法：配备营养肉汤培养基，按1 5 m l 皿定量倒平板。接o 1 m l 经过 营养肉汤液体培养基预培养并适当稀释( 终浓度约1 0 5 个m 1 ) 的金黄色葡萄球菌 培养液到平板，涂布均匀。在3 5 的培养箱中倒置一会儿，让平板表面干燥。 用无菌镊子将粘有5 1 发酵液上清的无菌滤纸片( 直径6 m m ) 均匀贴在琼脂平 板表面，轻压纸片使其与琼脂适当接触。在培养箱中培养1 6 1 8 h 后，测量各纸 片周围抑菌圈的直径。 m i c 测定实验( 液体两倍稀释法) ：准备一系列装有l m l 营养肉汤液体培养 基的试管，于第一管中加入l m l 发酵液上清，以对倍稀释法逐管稀释发酵液上清。 加入适宜稀释级( 约1 0 4 个m 1 ) 的金黄色葡萄球菌菌液0 1 m l 于各试管中，摇匀。 将各试验管置于3 5 培养1 6 1 8 h ，观察结果。 经过培养后的试验管呈现澄清，摇匀后仍澄清者，认为该管无菌生长；若培 养管呈现混浊状态，表明有菌生长。从无菌生长的各管中找出最低发酵液浓度的 试验管，该管的药物浓度即为最低抑菌浓度。 抗生素相对效价定义：在纸片法实验中指，测试菌株发酵液上清产生的抑菌 圈直径与原始菌株发酵液上清产生的抑菌圈直径的比值；在m i c 实验中指，发 酵液上清能够抑制细菌生长的最大稀释倍数的倒数。m i c 值越小，则说明发酵 液的抗生素相对效价越高。 5 6 诱变菌株的筛选 挑选发酵液的抗生素相对效价较高的诱变菌株，连续转接4 代，分别测定各 代菌株的抗生素相对效价。那些抗生素相对效价提高较多，而且具有遗传稳定性 的菌株即为诱变筛选得到的菌株。 6 不同培养温度对孢子紫外诱变正向突变率影响的研究 按照上面提到的方法进行a p l 9 1 孢子的紫外诱变。将诱变后的孢子悬液和 作为对照的未经诱变的孢子悬液稀释到适宜浓度，分别在2 4 、2 7 、3 0 、 3 3 、3 6 避光培养5 d 。 6 1 发酵实验检测 随机挑选经过紫外诱变后在各种培养温度下生长的单菌落，先后对1 8 0 株菌 株进行发酵，用纸片法测发酵液的抗生素相对效价，并计算各培养温度下的i _ f 向 突变率，实验重复3 次。使用统计分析软件s a s6 0 对发酵结果进行统计分析。 浙江人学f i ! ；! i 学位论殳 正向突变率在本文中指：发酵液的抗生素相对效价比出发菌株高的突变菌株 在总突变菌株中所占的比例。 6 2 r a p d 检测 6 2 1 链霉菌基因组d n a 的提取：参考文献【1 2 】，略有改动。 取菌株a p l 9 1 的新鲜培养液( 用预发酵培养基培养2 4 h ) 1 m l ，6 0 0 0 r p m 离 心5 m i n ；用l m lt e 缓冲液洗涤沉淀，6 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ：沉淀复悬于4 0 0 i 5 0 m mt r i s 。h c l 一5 m me d t a ( p h8 0 ) 。 加入4 5 p 18 m g m l 的溶菌酶溶液，3 7 水浴4 5 m i n ；加入5 0 2 0 s d s ，6 0 水浴1 0 m i n 。 加入等体积的氯仿异戊醇，混匀，1 2 0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，上清转入新的离 心管中，加入等体积的酚，氯仿异戊醇，混匀，1 2 0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，将上清转 入新管中。 加入2 倍体积的冰无水乙醇，轻轻混合直到d n a 沉淀下来，1 2 0 0 0 r p m 离心 沉淀，用7 0 乙醇洗涤沉淀后再离心5 m i n ，d n a 沉淀在室温下干燥1 5 2 0 m i n 。 加入t e 缓冲液1 0 0 “l ，并加入2 ii a 酶( 1 0 “1 ) 。用o 7 的琼脂糖凝胶 电泳检测d n a 样品的纯度，稀释到合适的浓度后，作为r a p d 反应的模板。 6 2 2 利用r a p d 方法检测培养温度对紫外诱变的影响 随机挑选野生型菌株5 株，用3 0 种1 0 b p 的随机引物进行r a p d 扩增，用 来筛选引物，同时检测野生型菌株间的相似性。 利用经过筛选的引物，随机挑选经紫外诱变后分别放在2 7 、3 3 培养的 诱变菌株各5 株，与作为对照的野生型菌株一起，进行r 时d 扩增，检测不同 处理组与对照菌株之间的r a p d 扩增条带相似性。 r a p d 扩增体系( 2 0 p 1 ) 参照文献f 1 9 l ： r a p d 扩增条带的相似性比较利用b i o r a d 公司的图像分析软件q u a n t i t y 0 n e4 4 1 进行分析。 结果 1 菌株a p l 9 1 的菌种鉴定 1 1a p l 9 1 菌丝形态特征 菌株a p l 9 一i 经过2 d 培养，分别用光学显微镜、透射电镜和扫描电镜观察菌 丝和孢子形态，发现： 菌株a p l 9 一l 菌丝多分枝，菌丝中不产生横隔膜；孢子圆柱形，表面光滑， 大小约为1 “m 0 4 5 p m ，连接成链状。孢子链一般含有l o 2 0 个孢子，直形或波 曲形，不形成螺旋，不形成孢囊和菌核。( 见图1 图4 ) 圈l 扫描电镜观察孢子链( 8 k ) f i g 1t h ee l e c t r o ns c a n n i n gm i c r o g r a p ho f s p o r ec h a i n s ( 8 k ) 图2 透射电镜观察孢子链( 1 2 k ) f i g 2t h ee l e c t r o nt r a n s m i s s i o nm i c r o g r a p ho f s p o r ec h a i n s ( 1 2 k ) 浙江人 卜# n i 仑芷 图3 光学显徽镜观察孢子链( 4 0 0 ) f i g 3t h el i g h tm i c r o g r a p ho f s p o r ec h a i n s ( 4 0 0 ) 图4 多分枝的气生菌丝( 4 0 0 ) f i g 4t h ei i g h tm i c r o g r a p ho f a e r i a im y c e l i a( 4 0 0 ) l2 a p l 9 1 培养特征 将菌株a p l 9 1 接种到7 种天然与合成培养基上培养，分别在第7 d 、1 4 d 和 2 8 d 时观察其培养特征和颜色变化，结果如表l 所示。 表l 菌株a p l 9 1 在各种测试平板上的培养特征 t a b l e lt h ec u i t u r ec h a r a c t e r so fa p l 9 一la td i f f b r e n tm e d i u m s 培养基培养特征 菌丝体生长呈乳脂色，湿润；气生菌丝米色，菌落曼 葡萄糖一酵母膏培养基 簧善蓄琶蓄喜誊瓷? 篓嚣昌麦萋篙譬：雯霉筹霪备篓 分泌。 马铃薯块培养基 马铃薯浸汁培养基 高氏一号培养基 察氏培养基 菌丝体生长呈黄色，湿润，后变为灰白色：气生菌丝 生长旺盛，扶白色，偶见雪白色菌落出现：后期有黄 绿色可溶性色素产生，薯块及底部棉花和溶液呈深褐 色。 菌丝体生长呈灰脂色，蜡状；气生菌丝白色，单菌落 圆形、绒毛状、饱满、生长旺盛：基内菌丝褐色略绿： 菌落颜色不太一致，有：白色、淡灰色、和青灰色。 菌丝体生长呈无色至白色；菌落小，生长较差，绒毛 状，常有小液滴分泌，某些菌落分泌黄绿色素，基内 菌丝白色。 菌丝体生长呈无色至白色。菌落小，生长不好，绒毛 状，常有小液滴分泌；某些菌落分泌黄绿色素，基内 菌丝白色。 克氏培养基 菌丝体生长极弱，气生菌丝白色，粉状。 葡萄糖天门冬素培养基妻警萋；e 麓券蠢簧萎星导滋雪白色，基内菌 1 _ 3 菌株a p l 9 一l 生理生化特性 1 3 1 碳源利用 菌株能利用：甘露醇( + + + ) 、半乳糖( + + + ) 、木糖( + + + ) 、麦芽糖( + + + ) 、 葡萄糖( + + + ) 、果糖( + + ) 、鼠李糖( + + ) 可能利用：阿拉伯糖( + ) 不能利用：蔗糖( 一) 、棉籽糖( ) 1 3 2 淀粉水解 菌株生长弱，呈绒毛状：微弱水解或者不水解淀粉。 l _ 3 _ 3 硫化氢产生 阴性，培养基没有出现黑褐色沉淀。 6 塑：苎塑堂! 塑! 一 1 34 纤维素水解 可利用纤维素，生长绒毛状；滤纸i 二部里黄绿色( 可能是分泌的色素) 但 纸片无明漫被分解的现象。 1 3 5 明胶水解 明胶中度水解，呈火山口状；气生菌丝体白色，菌体生长为块状：可产生黑 色素。 l3 6 牛奶胨化 牛奶不凝固，胨化迅速，液体变酸、变红。具体过程为：牛奶首先胨化为黄 色澄清溶液，然后下部产生灰色絮状沉淀；液体颜色逐渐从黄色转变为棕红色： 菌体生长乳脂色，呈皱褶的膜片状菌体浮于液面，气生菌丝白色；培养后期可产 生黄绿色可溶性色素。 1 41 6 sr d n a 的p c r 和测序结果 菌株a p l 9 1 的1 6 sr d n a 序列经p c r 扩增、测序之后，共有1 4 5 4 个碱基， 其中a 占2 3 、c 占2 3 、g 占3 4 、t 占1 9 ，具体结果如下： 5 一g g c g g c g t g c t t a a c a c a t g c a a g t c o a a c g a t g a a g c c t t t c g g g g t g g a 订a g t g g c g a a c g g g t g a g t a a c a c g t g g g c a a t c t g c c c t t c a c t c t g g g a c a a g c c c t g g a a a c g g g g t c t a a t a c c g g a t a a c a c t c t g t c c t g c a t g g g a c g g g g t t a a a a g c t c c g g c g g t g a a g g a t g a g c c c g c g g c c t a t c a g c t t g t t g g t g g g g t a a t g g c c t a c c a a g g c g a c g a c g g g t a g c c g g c c t g a g a g g g c g a c c g g c c a c a c t g g g a c t g a g a c a c g g c c c a g a c t c c t a c g g g a g g c a g c a g t g g g g a a t a r r g c a c a a t g g g c g a a a g c c t g a t g c a g c g a c g c c g c o t g a g g g a t g a c g g c c t t c g g g t t g t a a a c c t c t t t c a g c a g g g a a g a a g c g 岛鸟4g t g a c g g t a c c t g c a g a a g a a g c g c c g g c t a a c t a c g t g c c a g c a g c c g c g g t a a t a c g t a g g g c g c a a g c g t t g t c c g g a a t t a t t g g g c g t a a a g a g c t c g t a g g c g g c t t g t c a c g t c g g a t g t g a a a g c c c g g g g c t r a a c c c c g g g t c t g c a t t c g a t a c g g g c t a g c t a g a g t g t g g t a g g g g a g a t c g g a a t t c c t g g t g t a g c g g t g a a a t g c g c a g a t a t c a g g a g g a a c a c c g g t g g c g a a g g c g g a t c t c t g g g c c a t t a c t g a c g c t o a g g a g c g a a a g c g t g g g g a g c g a a c a g g a t t a g a t a c c c t g g t a o t c c a c g c c g t a a a c g t t g g g a 7 浙江人学坝i 学位论正 a c t a g g t g t t g g c g a c a t t c c a c g t c g t c g g t g c c g c a g c t a a c g c a t t a a g t t c c c c g c c t g g g g a g t a c g g c c g c a a g g c t a a a a c t c a a a g g a a t t g a c g g g g g c c c g c a c a a