（生物医学工程专业论文）壳聚糖及烷基化壳聚糖dna复合物介导的基因转染研究.pdf

a b s t r a c t i nm i st h e s i s ，t h ec h a r a c t e r i s t i c so fc h i t o s a n ( c s 、d n aa n da l k y l a t e d c h i t o s a n ( a c s ) d n ap o l y e l e c t r o l y t ec o m p l e x e s ，a n dg e n e t r a n s f e c t i o n m e d i a t e db vt h e s en o n v i r a lv e c t o r sw e r ei n v e s t i g a t e d t h em a i nw o r k i n c l u d e st h r e ep a r t sa sf o l l o w s ： 1 t h e p r o p e r t i e s o fc s d n aa n da c s 删a c o m p l e x e s w e r e i n v e s t i g a t e db yav a r i e t yo fm e t h o d s t h er e s u l t so ff t i r 。“pn m r c i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d 、a n df l u o r e s c e n c es l ：，e c t r ai n d i c a t e dt h a tt h e i n t e r a c t i o no fd n aw i t hc h i t o s a nm e r e l yc a u s e das l i g h tp e r t u r b a t i o n o fd n ab o n d s a n dd n as t i l lr e m a i n e db c o n f o r m a t i o ni nt h e c o m p l e x ；p a r t so fc h i t o s a nw a sc o n s i d e r e dt ob eb o u n dt ot h em i n o r g r o o v e so f d n a a f m i m a g e ss h o w e d t h a tt h et o p o l o g i c a ls t r u c t u r e s o fc s d n a c o m p l e x e sv a r i e dw i t hc h a r g er a t i o s f r e ed n a m o l e c u l e s e x i s t e da tl o wc h a r g er a t i o s ，w h e r e a sn a n o p a r t i c l e sf o r m e da th i 【g h e r c h a r g er a t i o s d i p a l m i t o y l - s n - g l y c e r o 一3 - p h o s p h o c h o l i n e ( d p p c ) w a s u s e da sam o d e lc e l lm e m b r a n e a n da t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) a n dd i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y ( d s c ) w e r ee m p l o y e dt oe x p l o r e t h et r a n s m e m b r a n em e c h a n i s mo ft h ev e c t o r s b ye x a m i n i n gt h e t h e r m o d y n a m i cb e h a v i o r so f d p p c c sa n dd p p c a c sm i x t u r e s t h e r e s u l t sr e v e a l e dt h a tc h i t o s a na n da l k y l a t e dc h i t o s a nw e r ec a p a b l eo f i n d u c i n gt h ef l u c t u a t i o no fd p p cm e m b r a n e ，a n dt h ep e r t u r b a t i o n e f f e c t sw a se n h a n c e dw i t l lt h ei n c r e a s ei nt h e h y d r o p h o b i c i t vo f c h i t o s a n t h e a n a l y t i c a l r e s u l t so f e l e c t r o p h o r e s i s a n dd n a s e d e g r a d a t i o n d e m o n s t r a t e dt h a tas m a l l q u a n t i t y o fa c sc o u l d c o n d e n s ed n a a n df u r t h e r m o r ep l a y e dt h es a m es h i e l d i n gr o l ea s c h i t o s a ni np r o t e c t i n gd n af r o mt h ed n a s e d e g r a d a t i o n 2 c sa n da c sw e r eu s e dt ot r a n s f e rp l a s m i d 。e n c o d i n gc h l o r a m p h e n i c o l a c e t j y r l t r a n s f e r a s e ( c a t ) i n t oc 2 c 1 2 c e l l s t h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y w a se v a l u a t e db yd e t e r m i n i n gt h ec o n t e n t so fc a t e x p r e s s e d w i t h e l i s a ，a n dt h ei n f l u e n c eo f h y d r o p h o b i c i t yo f a l k y ls i d ec h a i n so nt h e t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yw a se l u c i d a t e da sw e l l t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a tc sa n da c sc o u l dt r a n s f e rp c d n a 3 1 c a ti n t oc 2 c 1 2c e l ll i n e s t h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yo fc h i t o s a nv e c t o rw a s4t i m e sh i g h e rt h a n t h a to fn a k e d d n a ；t h e t r a n s f e c t i o nl e v e lo fa c sw a sf u r t h e r i n c r e a s e d u p o ne l o n g a t i n g t h e a l k y l s i d ec h a i n t h et r a n s f e c t i o n e m c i e n c yl e v e l e do f fa f t e rt h en u m b e ro fc a r b o n si nt h es i d e c h a i n e x c e e d e d e i g h t 3 d n af r a g m e n tc o d i n gb o t h s i g n a lp e p t i d e a n dm a t u r e p e p t i d e o f i n s u l i n l i k e g r o w t hf a c t o r - i ( i g f - i ) w a s s u b c l o n e di n t o p l a s m i d p t r a c e r c m v b s d a n dt h ee r i e c to f 肝i o ne e l lp r o l i f e r a t i o nw a s d i s c u s s e d i tw a so b s e r v e db yf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p et h a tp l a s m i d d n ac o u l db ed e l i v e r e di n t oc 2 c 1 2 c e l l l i n e s ，a n dt h eg e n e sw e r e e f f e c t i v e l ye x p r e s s e d i nr e c e d t o rc e l l s t h es e l e c t e ds t a b l e t r a n s - i g f - ic e l ll i n e sh a da h i g h e rp r o l i f e r a t i n g r a t et h a nt h e u n m a n s f e c t e do n e s k e y w o r d s ：c h i t o s a n ，a l k y l a t e dc h i t o s a n ，n o n v i r nv e c t o r , g e n e t r a n s f e c t i o n ，p l a s m i d ，p o l y e l e c t r o l y t ec o m p l e x 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤生盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：纭砍签字嗍研年，月，。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘壅盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权叁凄盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名 弓祆取 翩躲猡i 文您 签字日期2 n 年年f 月，。日签字日期：) 。午年 月f 切日 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 基因治疗是指将具有防治潜能的外源基因( 目的基因) 通过合适载体转移 到患者的有关器官组织( 靶组织) 的细胞内，并获得适当表达，以达到防治或 减轻疾病的目的。基因治疗的关键技术是基因转移，包括治疗基因的选择、 基因导入系统的选择，同时还包括治疗基因的高效靶向表达及对此表达的调 控。对于某一肿瘤治疗基因可以有多种，可通过优化组合来确定，这将有赖 于人类基因组计划的发展。大量的实验研究成果揭示出外源基因需克服一系 列障碍才。能转入目标细胞的细胞核内( 图卜1 ) 叫】。 图卜1 外源基因转运宿主细胞所经历的阻碍 如图1 - 1 所示外源基因需通过与载体复合而得到保护，免受酶的降解( 步 骤1 ) ，与目标细胞的结合( 步骤2 ) ，进入细胞内体( 步骤3 ) ，从内体中进入 细胞质( 步骤4 ) ，进入细胞核( 步骤5 ) ，在细胞核内基因从复合物中解脱 ( u n p a c k i n g ) 出来，然后表达转录成m r n a ( 步骤6 ) ，再出核翻译成蛋白质。 第一章绪论 可见，基因须经历多重障碍爿能到达细胞核，因而，基因治疗的成功很 大程度上依赖于开发出安全高效的载体3 1 。 1 2 转基因载体 基因导入系统( g e n ed e l i v e r ys y s t e m ) 是基因治疗的核心技术，可分 为病毒载体系统和非病毒载体系统。常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒、 疱疹病毒等。病毒是非常有效的转基因载体，然而，病毒载体的使用受限。 缺陷在于，病毒载体的结构会产生免疫反应或细胞毒性 4 。虽然复制缺损型结 构被大量用于疾病的治疗，但是危险性在于产生致病的缺损型病毒口 。逆转录 病毒仅被用于有丝分裂系统，而这种病毒又会引起基因组的致癌反应。重复 使用病毒载体会诱导免疫反应，从而削弱转基因的表达效果 6 , 7 1 。考虑到这些 局限性，对非病毒载体的研究愈来愈引起人们的关注。 非病毒载体可以克服病毒载体的缺陷，具有低细胞毒性和低免疫反应等。 此外，非病毒载体没有基因尺寸方面的限制，而病毒载体被限制在6 - 8 k b a s e s 。 但非病毒载体的转染率较病毒载体低。然而，科学家们已经用大量方法加以 改进并取得了满意的效果。 1 2 1 非病毒载体 1 2 1 1 裸d n a 载体 裸d n a ( n a k e dd n a ) ，又称自由d n a ，是结构最简单的非病毒载体，需要 避开胞内外屏障才能发挥作用。因此该类载体主要通过直接的物理或机械方 法( 如直接注射或基因枪) 导入易及部位( 如皮肤、骨骼肌、肝脏、支气管 内、心肌和瘤体内) 。当其用于激发免疫反应时可称为d n a 疫苗( d n av a c c i n e ) ， 是一种非常有希望的疫苗方式。 其中的基因枪( g e n eg u n ) 方法又叫微粒轰击技术，它采用能自发吸收 d n a 的钨或金微粒，通过高压电所产生的高能电弧促使d n a 包被的金属颗粒产 生高速度，能有效穿透单细胞层或靶器官从而将d n a 导入培养细胞或动物组 织中。此时还可以通过电场( 电穿孔方式) 来提高转染率。另外，超声波也 已用于转染。超声作用于细胞膜后也能产生孔，使得质粒能通过被动扩散穿 透进入细胞。由于超声能定焦于身体的特定部位，该方法对于体内转染具有 一定的应用前景。 裸d n a 能有效转运并表达目的基因，但仍缺乏靶向性，并且只能在局部 2 第一章绪论 作用，不能转染大量细胞，并且可能还需进行外科手术以暴露靶器官( 内窥 镜技术也许有助于减少此局限) 。对于全身用药来说，裸d n a 需要保护以避免 其在从给药部位迁移至基因表达部位的过程中被内切核酸酶降解。 最近，m i r 等人【8 】报道应用肌肉注射e l e c t r o t r a n s f e r 法，即肌肉注射裸 d n a 结合电脉冲( 方波，电场力 i m s 脉冲) ，可使外源基 因在骨骼肌内高水平表达，并可持续表达9 个月以上。该方法还具有重复性 好、变异性低的特点。这将大大推进裸d n a 在基因治疗中的应用。 1 21 2 脂质体d n a 复合物 脂质体( 1 i p o s o m e ) 是具有双层膜的封闭式粒子，其介导d n a 进入细胞 的研究已有约2 0 年的历史，主要是利用脂质体能促进极性大分子穿透细胞膜 的原理。磷脂同时包含亲水和疏水基团，因此这些分子在水中自动组装结合 并形成有序的微观和宏观结构，如胶粒、平坦的双层以及薄层囊泡，以最低 限度地减少分散的液相和长碳氢脂肪酰基间的不稳定。脂质体d n a 复合体形 成的过程极慢而且很难达到平衡。这个动态的过程受多种类型的弱分子力所 控制，除了占主要地位的静电作用以外，还包括离子键、氢键、疏水性作用 和溶剂排除力( s o l v e n te x c l u s i o n ) 等。通过内吞作用特定物质进入细胞的 过程是一个大小限制性的步骤( 内吞小泡大约8 0 2 0 0 n m ) ，因此脂质体d n a 复合物必须足够小以进入细胞。 一、阳离子脂质体 阳离子脂质体包括双十八氨基甘氨酰精胺( d o g s ) ( 图卜2 ) 、d o t m a 、 l i p o f e c t i n 等1 9 】。这些高电荷密度的高聚物已经在体外转染多种细胞，然而 在体内的应用并不多见。阳离子脂质体不需要特殊的细胞表面受体与细胞膜 相互作用。d n a 脂质体的作用是通过d n a 被赋予带正电的表层，从而与细胞 膜作用进入细胞的( 图1 1 ) 。在这一过程中，阳离子脂质体起了中间桥梁的 作用，通过静电力的作用连接了相互排斥的d n a 和细胞膜表面。当d n a 与d o g s 的电荷比大于等于3 时，转染率可达7 0 。然而，高聚物带如此高密度的电荷 是不能应用于体内的。经研究，b a s s i m a d o 等人发现，在低量l i p o s p e r m i n e 和d o g s d n a 正负电荷比小于2 时，转染效果比较好。 第一章绪论 图i - 2d o g s 分子式 二、阴离子脂质体载体 含有磷脂酰丝氨酸或含5 0 二棕榈磷脂酰甘油的脂质制成的阴离子脂质 体可以将寡聚核苷酸转运至细胞中“”。由于磷脂和寡聚核苷酸均带负电荷， 必须在脂质体中加入钙离子方可提高包装效率。由阴离子脂质体转运的寡聚 核苷酸首先定位于细胞核，也延长了寡聚核苷酸在细胞内的保留时间。人们 发现阴离子脂类可以置换阳离子脂质体d n a 复合体中的d n a ，加入等摩尔的 阴电荷脂类可以使约8 0 的d n a 释放。在内吞小泡膜中所含的负电荷脂类也 可以有效地把阳离子脂类从复合体上解离下来，并将d n a 释放入胞浆。这种 d n a 置换释放机制可能是由于负电荷脂类表面的多价特性以及静电相互作用 的协同和脂类亲水一疏水相互作用效应引起电荷中和所致。 三、口h 敏感型胎质体载体 细胞摄取脂质体主要通过胞吞途径，脂质体与其内含物遇到溶酶体即被 降解。p h 敏感脂质体可在一定程度上避免溶酶体降解并增加d n a 摄取量和稳 定性f l ”。p h 敏感脂质体其原理是酸性条件下可导致其脂肪酸羧基的质子化而 引起六角晶相的形成导致膜融合的发生，因此，内吞小泡形成后进入溶酶体 之前，其p h 值从7 4 降至5 3 6 3 左右时，p h 敏感脂质体膜与内吞小泡膜融 合，将内容物导入胞浆。p h 敏感脂质体可由二油酰胆碱( d o p e ) 、胆固醇和油 酸以4 ：4 ：2 ( 摩尔比) 组成。p h 敏感脂质体的脂质成分中常用的d o p e 决定 了脂质体在中性p h 条件下的稳定性和酸性条件下与细胞融合的能力；脂膜中 4 第一章绪论 含有不易水化的不饱和的p e ( 磷脂酰乙醇胺) 。 d h 敏感脂质体由于是通过静电吸附与细胞膜产生非特异性相互作用，转 运效率比普通脂质体高，但实际上也只有1 0 的基因释放至细胞质中，其余 仍在溶酶体中降解，只不过在p h 较低的胞噬小泡中不稳定，可将d n a 释放至 细胞质中。p h 敏感脂质体在血浆和血清中并不稳定，常导致内含物的泄漏。 将胆固醇、神经节苷脂或聚g _ - 醇磷脂酰乙醇胺( p e g p e ) 等有立体稳定作 用物质包含入腊质体，可以提高稳定性而延长脂质体的循环时间。立体稳定 性的p h 敏感脂质体在血循环中被迅速清除，可在血管部位渗出并在肿瘤组织 发挥作用，已成功地用于人体肿瘤治疗的临床静试验。 四、融合脂质体载体 通过模拟某些病毒( 例如h i v 或s e n d a i 病毒) 在中性p h 值时可与细胞 膜融合的现象，人们在制备脂质体时加入可在膜上形成可逆的六角形结构的 融合荆，如聚乙二醇、甘油、聚乙烯醇或重组病毒细胞膜、病毒蛋白等即可 制得融合脂质体i 川。d o p e 一般被用作阳离子脂类d n a 复合体的基因融合脂类。 在阳离子脂类与膜上的阴电荷脂类结合后发生分离时，d o p e 融合区膜稳定启 动，可逆的六角形结构和孔开始形成。由于制备方法复杂，细胞特异性和血 浆稳定性较差、有病毒蛋白颗粒的融合腊质体免疫原性较强等原因使得此方 法的应用受到一定限制。 脂质体包裹质粒d n a 后直接注射到体内可以使目的基因有效地到达靶细 胞，该法具有基因转染效率较高、安全、无免疫原性的特点。但由于无靶向 特异性、基因表达时间短，因而在临床的广泛应用受到限制。 1 2 1 3 阳离子高聚物 阳离子高聚物的典型代表是聚乙烯亚胺( p e i ) 。p e i 是一有机大分子( 图 1 3 ) ，具有高的正电荷密度，是将d n a 和r n a 引入神经元的极高效的载体。 聚乙烯亚胺的叔胺氮原子可质子化，人们形象地将它比作“质子海绵”。 b a s s i m a 等人一】用荧光寡核萤酸( 卜i o i j m ) 与p e i 复合转染神经元细胞，结果 表明可标记上8 0 的神经元细胞。这些神经元细胞是后减数分裂的这意味着， 部分r n a p e i 复合物通过核膜，或是它们在细胞质内分解，在细胞质中自由 的核苷酸呈现出核趋向性。体外转染时，聚合物中正电荷与d n a 中负电荷的 最佳比例稍偏向阳离子一边，并经实验证明这种比例同样适用于体内。研究 表明，p e i 可以像d o g s d o p e 一样用于转染d n a 于新生小鼠脑细胞中。在后续 第一章绪论 的研究中，他们又发现p e i 可用于成熟神经系统的转染。 b o u s s i f 等人1 1d j 用聚乙烯亚胺将荧光素酶报告基因转入不同细胞系和原 代细胞，转染结果优于脂多胺。在后续的研究中，他们用荧光探针做了将寡 聚核苷酸转入胚神经元细胞的试验。研究表明，神经元细胞核均被标记，并 且无毒副作用。脑内荧光素酶基因转染到新生小鼠的试验结果与对原鼠脑内 皮细胞或雏鸡胚神经元细胞的体外转染一致。 聚乙烯亚胺作为转基因载体的机理可能是对溶酶体的缓冲作用。这种缓 冲作用使d n a 免受核酸酶的降解，并且溶酶体的溶胀及破裂给聚乙烯亚胺d n a 颗粒提供了逃逸的机会。 由此可见，p e i 毫无疑问也是适用于其它体内系统的有前景的转染载体。 删l ， 封 s 髓 h ，奠n a h f i 图卜3p e l 分子式 1 2 ，1 4 壳聚糖载体 m u m p e r 等人1 2 1 首先提出了使用壳聚糖作载体将基因释放到细胞中。壳聚 6 患一 r 掣v 一 第一章绪论 糖d n a 聚电解质复合物( p e c ) 的3 f 均尺寸与所用壳聚糖分子量有关 ( 1 0 8 5 4 0 k d a ) ，而与缓冲液组成无关，粒径尺寸在1 5 0 n m 至6 0 0 h m 之间变化。 其他学者也报道了其它一些因素对p e c 尺寸的影响，如壳聚糖分子量、d n a 浓 度、盐浓度、p h 值、电荷比率和温度等。从药物释放角度看，p e c 的颗粒尺 寸尤为重要，尺寸的变化将严重影响复合物颗粒在血液的循环时间、向靶细 胞的进入以及在体内的效用。 客观地说，虽然有许多有关壳聚糖转染的相关报道，但是很少有人将转 染率与壳聚糖d n ap e c 的尺寸相关联【l “。典型的例子是，小于l o o n m 的颗粒 被内泡囊包住，通过转铁蛋白细胞摄入而进入靶细胞【1 ”。很多研究表明，d n a 壳聚糖p e c 系统的尺寸在0 1 5 i 的n a c l 中从8 0 n m 至5 0 0 n m 不等【t 6 1 。而 e r b a c h e r 等人”发现接近零电位时复合物尺寸达i 帅至5 帅。在关于阳离子 胆固醇衍生物介导的基因转染研究中，n i k a n i s h i 等人发现中等尺寸大小 ( 0 4 一i 4 帅) 的颗粒具有最高的转染率；而小于4 0 0 n m 的则转染率较低。可 见，不同研究者所得结论似乎互相矛盾。因此，阳离子聚合物的转染率的机 理仍有待进一步研究。 最近，s a t o 1 9 1 等人详尽地研究了p h 、血清浓度以及壳聚糖分子量对转染 率的影响。为了测定壳聚糖体外基因转染的能力，于不同p h 的血清介质中通 过荧光素酶质粒( p g l 3 ) 来转染人肺癌a 5 4 9 细胞。研究表明，p h 为6 9 时的 转染率要高于为p h 为7 6 的转染率。p h 低于7 时，壳聚糖中的部分氨基被质 子化，壳聚糖d n a 复合体带正电荷，从而易于和带负电荷的细胞结合。 r i c h a r d s o n 等人【2 0 j 报道，d n a 与商纯度的壳聚糖( 分子量小于5 0 0 0 ， 5 0 0 0 1 0 0 0 0 和大于1 0 0 0 0 d a ) 以电荷比为1 ：1 复合时会完全抑d n a 被d n a s ei i 降解。所选用的不同分子量的壳聚糖均不具细胞毒性和溶m 活性，并且低分 子量壳聚糖在静脉注射时无肝脏的累积。应该指出的是，复合物在血清中的 稳定性在壳聚糖分子量低于5 0 0 0 d a 时会降低 1 6 】。 在含2 0 的血清中，p g l 3 一壳聚糖对a 5 4 9 细胞的基因表达要比无血清存在 时高2 3 倍。这被认为2 0 的血清细胞活性最适于基因转染。e r b a c h e r 等人 也有相似报道，当壳聚糖( 平均分子量为2 4 5 k d ) 与鲑鱼鱼精d n a ( 平均分子 量为2 4 5 k d ) 形成复合物，分别转染h e l a 细胞和血液单核细胞，h e l a 细胞的 接纳率为4 4 ，而血液单核细胞为9 。由此推测壳聚糖d n a 复合体在低d h 介 质中选择性地转染癌细胞，而不被正常细胞如血液细胞摄入【2 i 】。 第一章绪论 1 2 2 壳聚糖基非病毒载体 122 1 脱氧胆酸改性的壳聚糖( d a m c ) 载体 l e e 等人【2 2 _ 2 4 1 用脱氧胆酸对壳聚糖进行疏水性修饰。脱氧胆酸是胆汁酸的 主要成分，由于胆汁酸可在水中自缔合，所以脱氧胆酸改性的壳聚糖也可以 自聚集形成平均直径为1 6 0 n m 的胶束。 壳聚糖自聚体与质粒d n a 间形成复合物可用琼脂糖凝胶电泳加以证实( 图 1 - 4 ) 。由于电荷的中和作用，阻滞电泳条带可以表征复合物的形成。如图所 示，当壳聚糖与d n a 的电荷比大于4 1 ( 条带7 1 1 ) 时，复合物未发生迁移， 表明此时复合物己形成。 以脱氧胆酸壳聚糖介导质粒d n a ( 含氯霉素乙酰转移酶报告基因) 对c o s i 细胞( 猴肾细胞) 的转染，研究表明，此复合物的转染率高于裸d n a ，但低于 l i p o f e c t a m i d e 试剂。 图1 4 脱氧胆酸改性的壳聚糖一d n a 复合物在琼脂糖凝胶电泳中阻滞条带分析 条带1 ，d n a 分子量m a r k e r i i ；条带2 ，d n a ： 条带3 ，壳聚糖一d n a 电荷比为0 2 5 1 ； 条带4 ，壳聚糖一d n a 电荷比为0 5 1 条带5 ，壳聚糖一d n a 电荷比为i l ： 条带6 ，壳聚糖一d n a 电荷比为2 1 ： 条带7 ，壳聚糖一d n a 电荷比为4 1 ； 条带8 ，壳聚糖- d n a 电荷比为6 1 ； 条带9 ，壳聚糖一d n a 电荷比为8 1 ； 条带l o ，壳聚糖一d n a 电荷比为1 0 i 条带1 l ，壳聚糖一d n a 电荷比为2 0 1 第一章绪论 1 2 2 2 十二烷基壳聚糖载体 在基因释放到目标细胞核的整个过程中，保护d n a 不被酶解是十分必要 的。本课题组以十二烷基壳聚糖与d n a 通过静电相互作用形成复合物1 2 5 ”j ， 测定不同温度下d n a 和其在复合物中的紫外吸收发现，由于十二烷基壳聚糖 的保护作用，d n a 分子热稳定性提高。低分子量的盐，如n a + 、k 、m g ”离子能 够使d n a 从复合物中解离出来。d n a 酶解实验表明，原始d n a 被酶解成碎片， 而被十二烷基壳聚糖保护的d n a 保持完好( 图l 一5 ) 。 ( a ) ( b ) 图1 5 加d n a s e 后纯d n a 和从复合物中释放的d n a 的a f m 照片 1 2 2 3 季铵盐壳聚糖载体 尽管壳聚糖具有很多优越的性能，但是它在生理p h 值时不溶。而只有可 溶性质子化壳聚糖才使细胞膜形成短暂的通道，提高基因跨膜运输的效率。 为了克服这一缺点，t h a n o u 等人【2 7 , 2 8 1 合成了三甲基壳聚糖( t m o ) ，并检验了 作为基因载体对c o s l 和c o s 一2 细胞转染的效果。用季铵盐化为4 0 的t m 0 4 0 和5 0 的t m o 一5 0 分别与质粒d n a 形成复合物，检测它们对c o s 一1 细胞的转染 能力，同时与壳聚糖寡聚物和脂质体d o t a p 相对照。结果表明，d o t a p d n a 复 合物对c o s 一1 细胞的转染率高于裸d n a ，壳聚糖寡聚物的转染率是裸d n a 的 9 第一章绪论 2 - 4 倍。t m o 一5 0 在与d n a 的配比为1 6 和1 1 4 时分别使c o s l 细胞的转染率 提高5 倍和5 0 倍。t m o 4 0 显示更高的转染率，在与d n a 配比为1 6 时提高 2 6 倍，配比为1 1 4 时提高1 3 1 倍。然而，并非所有这些载体均能显著提高分 化细胞如c a c o 一2 细胞的转染率。壳聚糖和三甲基壳聚糖寡聚物与d o t a p 相比 无细胞毒性，而d o t a p 使细胞活性降低5 0 。 1 ，2 2 4 半乳糖改性壳聚糖载体 虽然在一些情况下壳聚糖d n a 复合物纳米微粒在没有任何配体一受体作 用下可被细胞摄入，但是要进入特定的靶向细胞，需将壳聚糖以不同的生物特 异配体修饰。近期，p a r k 等人臼伽制备了半乳糖改性的壳聚糖一接枝一葡聚糖 一d n a 复合物。半乳糖基团与壳聚糖化学连接以赋予对肝细胞的靶向性，葡聚 糖的接枝可提高复合物在水中的稳定性。这一体系能有效地转染表达脱唾液 酸糖蛋白受体( a s g r ) 的c h a n g 肝细胞，a s g r 能特异性地识剐壳聚糖上的半 乳糖配体。在后续的研究中 3 ”，他们研制了半乳糖改性的壳聚糖一接枝 - p e g ( g c p ) 载体。由于亲水p e g 的保护使d n a g c p 免于被血浆中的酶降解，从 而使d n a - g c p 更加稳定。同时，g c p 具有尺寸小的特点( 8 0 ，粘均分子量2 0 0 0 ，5 0 0 0 ，5 万) ：青岛海汇生 物工程有限公司 烷基化壳聚糖( a c s ，实验室自制) ：通过溴代烷与分子量5 万的壳聚糖反应 制得。其编号为：n 一丁基壳聚糖( 4 - - c s ) ，n 一辛基壳聚糖( 8 一c s ) n - 十二烷 基壳聚糖( 1 2 - - c s ) ，n 一十六烷基壳聚糖( 1 6 - - c s ) 。 h o e c h s t3 3 2 5 8 ( h o c ) ：北京鼎国生物技术公司 溴化乙锭( e b ) ：北京鼎国生物技术公司 二棕榈酰磷脂酰胆碱( d p p c ) ：f 1 u k a 公司 第二章壳聚糖及其烷基化衍生物d n a 复合物的研究 p b s ：北京鼎国生物技术公司 2 2 2 复合物的表征 2 2 21 红外光谱 分别将分子量5 0 0 0 的壳聚糖和d n a 溶于去离子水中配成浓度1 w t 的溶 液，按d n a c s 电荷比l l 混合均匀，然后倒入塑料培养皿中，真空干燥箱中 5 0 c 成膜，在b i o r a df t s l 3 5 傅立叶红外光谱仪上记录光谱。 2 2 ，3 2 核磁谱图( n m r ) 用d 2 0 h 2 0 溶解分子量为5 0 0 0 的c s 粉末至1w t ，溶解d n a 至2 叭 。按照d n a c s 电荷比1 2 、8 1 将c s 溶液与d n a 溶液混合均匀，在4 0 0m h z 核磁共振仪( v a r i a nu n i t yp l u s4 0 0 ) 上记录3 1 p n m r 谱【4 9 】。 2 2 3 3 圆二色谱( o d ) 用0 1 m o 1 mn a a c h a c 缓冲溶液分别溶解分子量为2 0 0 0 的c s 粉末至 0 2 m g m l ，溶解d n a 至0 1 m g m l 。配制l m g m l 的h o c 水溶液。 将d n a 溶液与h o c 溶液混合作用l h ，按d n a 壳聚糖电荷比为4 1 、l 2 、 1 8 加壳聚糖溶液于d n a h o c 混合溶液中。在j 一7 1 5 0 圆二分光光度计上记录 圆二色谱，实验温度为2 5 1 3 ，波长范围为3 2 0 1 8 0n m ，扫描速度为2 0n m m i n 。 同样条件下测定不含h o c 的复合物c d 谱。 2 2 3 4 荧光光谱 用l m m 的h a c 水溶液溶解分子量为2 0 0 0 的c s 粉末至0 2 m g m l ，溶解d n a 第二章壳聚糖及其烷基化衍生物d n a 复合物的研究 至0 i m g m l 。配制0 i m g m l 的e b 水溶液。 取2 0ul 的e b 溶液加入i m ld n a 溶液中，吹打混匀，静置l h 。再加入与 d n a e b 等体积的c s 溶液，振荡2 0 s 。在s p e xf l 2 1 2 荧光光谱仪上观测d n a 与壳聚糖相互作用的荧光光谱，激发波长为5 1 8 n m ，发射波长6 2 0 n m “1 。 2 2 3 5 原予力显微镜 ( 1 )壳聚糖d n a 复合物的观测 用2 的h a c 水溶液溶解分子量为5 0 0 0 的c s 粉末至1 0 m g m l ，溶解d n a 至1 0 m g m l 。按照d n a c s 电荷比2 1 、l l ，l 2 将c s 溶液与d n a 溶液混匀。 取1 0ul 复合物溶液滴加在新剥离的云母表面上，3 7 。c 真空干燥。在原 子力显微镜( n a n o s c o p e i i l a s y s t e m ，d i g i t a li n s t r u m e n t s ，i n c s a n t a b a b a r a ，c a ) 下，以振荡模式观测表面形貌，扫描速度为1 h z 5 2 1 。 ( 2 ) 壳聚糖及烷基化壳聚糖与d p p c 的相互作用 将2 m gd p p c 与0 6 m 0 1 壳聚糖( 5 万) 在p b s 缓冲液中混合，6 0 振荡 3 h ，取2 0 ul 混合物滴在新剥离的云母片上，室温干燥，d p p c 、d p p c a c s 混 合物a f m 样品制备方法同上。 将1 的d p p c 溶于氯仿中，取2 0ul 稀溶液滴在新剥离的云母表面上， 再滴加1 5ulc s d n a ( 电荷比为1 t ) 和a c s d n a ( 电荷比为1 4 ) 的复合物溶 液，于室温干燥。以同样方式观测a f m 图像。 2 2 3 。6 差示扫描量热法( d s c ) 称取o 一4 o m g d p p c 无水粉末与1 o - 7 o m g 壳聚糖( 5 万) 或n 一烷基化壳 聚糖混合于一定量的p b s 缓冲溶液中，依次配制壳聚糖摩尔浓度为0 、0 5 、 1 、5 的混合液样品。热分析之前，为了分散溶液中的脂质与脂质壳聚糖混 合物，d s c 样品在6 0 。c 下持续旋涡振荡两小时以达平衡，在这种情况下，水 化的d p p c 分子形成庞大的堆积多层脂质体。热转变曲线由p e r k i n e l m e rd s c 7 量热计测得，加热和冷却的温度在2 5 - 5 0 的范围内，扫描速率为5 m i n 5 3 1 。 第二章壳聚糖及其烷基化衍生物d n a 复台物的吲究 22 3 7 复合物的电泳 分别称取适量的壳聚糖( 分子量5 万) 、n 一丁基一、n 一辛基一、n 一十 二烷基一和n 一十六烷基壳聚糖，用0 i m o i mn a a c h a c 缓冲溶液溶解成 0 i m g m l 溶液，在1 5 m le p p e n d o r f 管中加入2 0 口1 质粒与适量壳聚糖或烷 基化壳聚糖溶液轻轻吹打混匀，室温下静置3 0 m i n ，形成复合物，改变质粒 d n a 与壳聚糖或烷基壳聚糖的电荷比形成一系列复合物。在d y y i l l 2 型电泳仪 上观测电泳条带。电泳条件：1 琼脂糖凝胶，d n a 以e b 标记，1 t a e ，1 0 0 v 电压3 0 m i n 。 2 2 3 8 复合物的d n a s e 降解性测试 将c s ( 5 万) d n a 和a c s d n a 复合物放入2 m l 含有5 m mm g c l 2 的p b s 缓 冲液中，溶液中加入1 0 个单位的d n a s e ，于2 5 。c ，2 6 0 n m 波长下测量溶液的 吸光度。每5 分钊，测试一次，共测试1 h 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 红外光谱分析 壳聚糖、d n a 和复合物的红外光谱示于图2 一i 中。由图( a ) 可见，1 6 5 7 c m 。1 为n h 2 的剪切振动峰，1 5 6 4c m o 为c = o 的伸缩振动，i 0 7 卜1 0 2 9c m 1 吸收 峰归属于壳聚糖毗哺糖环的c 一0 伸缩振动。在图( b ) 中，d n a 分别在1 6 0 2c m ， 1 6 5 0c m ，1 6 8 4c m 一，和1 4 8 1c m 。处出现腺嘌岭、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞 嘧啶的特征峰，i 2 3 6c m 。为磷酸酯键吸收峰，9 6 3c m 。为脱氧核糖特征峰， 以上吸收峰的出现反应了d n a 为b 型构象。对于壳聚糖d n a 复合物，尽管壳 聚糖与d n a 特征峰部分重叠，但是，来自壳聚糖的羰基振动峰( 1 5 6 l c m q ) 和 毗哺糖环吸收峰( 8 9 1c f l l 。) 清晰可见。与纯d n a 相比，复合物中d n a 的特征 吸收峰几乎未发生变化，说明在复合物中，d n a 依然保持b 构象。 第二章壳聚糖及其烷基化衍生 j d n a 复合物的岍究 图2 一l c s ( a ) ，d n a ( b ) 和c s d n a 复合物( c ) 的红外谱图 9 第二章壳聚糖及其烷基化衍生物d n a 复合物的卅f 究 2 3 23 1 pn m r 谱 b l l i i l l j l 一石一7 百r r i ”1 、二+ 。忑 图2 - 2d n a ( a ) 、壳聚糖d n a 复合物1 ：2 ( b ) 和8 ：1 ( c ) 的3 1 pn m r 谱 2 0 lld*j。k_ilahjiiiii 一 。 第二章壳聚糖及其烷基化衍生物d n a 复合物的研究 图2 2 给出d n a 及其复合物的3 1 pn m r 谱。通过对比发现，复合物中的 d n a 与纯d n a 的”p 谱只发生微小的变化，可能是由于磷脂键中0 - p o 的扭转 造成的，不会改变d n a 的构象。 2 3 3 复合物的圆二色谱和荧光光谱 d n a 及不同配比的复合物的圆二色谱由图2 3 给出。d n a 显示出典型的b 型构象，壳聚糖未显示任何特征峰( 数据未提供) ；随着壳聚糖含量的增加， 峰强度减弱，但峰的形状和对称性保持不变，意味着d n a 在复合物中仍保持b 型构象，与前面的讨论一致。 图2 3d n a 及其复合物的圆二色谱 图中比例为壳聚糖与d n a 电荷比 第二章壳聚糖及其烷基化衍生物d n a 复合物的研究 为了迸一步考察壳聚糖与d n a 的相互作用，我们采用目前广泛应用的溴 化乙锭( e b ) 取代方法。e b 首先与d n a 混合后，溶液于激发波长为5 1 8 n m 下 发射荧光，其相对荧光强度最强，而随着阳离子聚合物的加入并与d n a 结合， 荧光强度将逐渐降低。聚阳离子与d n a 结合越多则体系相对荧光强度越小， 由此反应阳离子聚合物与d n a 的结合强度。 如图2 4 所示，在未加入c s 时，d n a e b 体系相对荧光强度为l ，这是 因为，d n a 与e b 完全作用。当加入c s ，c s d n a 电荷比为l 8 时，体系相对荧 光强度明显降低，有1 2 的e b 被c s 置换出来。随着c s 的继续加入，当 c s d n a 电荷比为4 1 时，体系相对荧光强度降至约9 0 ，即有1 0 的e b 被 c s 置换出来。这一趋势表明，随着c s 的加入，d n a e b 体系中的e b 逐渐被c s 置换出来，c s d n a 复合物逐渐形成，当c s d n a 电荷比为4 1 时，体系相对荧 光强度趋于最低且稳定，这意味着当c s d n a 电荷比超过4