（分析化学专业论文）分子印迹聚合物的电化学制备及分析应用研究.pdf

u n i v e r s i t yo fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g yo fc h i n a adi s s e r t a t i o nf o rm a s t e r sd e gr e e e l e c t r o c h e mi c a lp r e p a r a t i o na n d a n a l y t i c a la p p l i c a t i o no f mo le cula r l yimp r in t e dp o l y m er s a u t h o r sn a m e ： s p e c i a l i t y ： -， s u p e r v i s o r ： fl n l s h e dt i m e ： w e n g u a n gt a n a n a l y t i c a lc h e m i s t r y p r o s h o u g u ow u m a y , 2 0 1 0 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写 过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确 的说明。 作者签名： 签字日期：。型j 五12 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥 有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人 提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 b 继并口保密( 年) 作者签名：翮虢羔拥 0 7 lu ，、l 导师签名：兰3 垫! ：! 目录 目录 目录i 摘要。v a b s t r a c t v i i 第一章分子印迹聚合物研究进展一1 1 1 分子印迹聚合物的概念和原理1 1 2 分子印迹聚合物的分类和制备方法3 1 2 1 分子印迹聚合物的分类3 1 2 2 分子印迹聚合物的制备方法4 1 3 分子印迹聚合物的应用9 1 3 1 分离和色谱分析9 1 3 2 模拟酶。9 1 3 3 抗体和受体模拟物1 0 1 3 4 传感器1 0 1 4 分子印迹聚合物电化学传感器10 i 1 4 1 引言1 0 1 4 2 分子印迹电化学传感器的制备方法1 1 1 4 3 分子印迹电化学传感器的种类1 2 1 5 本研究课题的提出1 4 参考文献1 5 第二章生物大分子分子印迹聚合物的电化学制备及分析应用2 l 2 1 引言2 l 2 2 实验部分2 1 2 2 1 试剂与材料2 1 2 2 2 仪器2 2 2 2 3 血红蛋白分子印迹聚合物膜修饰电极的制备2 2 2 3 结果与讨论2 3 2 3 1 血红蛋白分子印迹聚合膜的电化学引发聚合2 3 2 3 2 血红蛋白分子印迹聚合膜的物理表征2 5 目录 2 3 3 血红蛋白分子印迹聚合膜的电化学特性2 9 2 3 4 分析测试3 2 2 3 5 选择性3 3 2 3 6 稳定性与重复性3 4 2 4 结论3 4 参考文献3 5 第三章肾上腺素电化学传感器的研究进展3 7 3 1 引言3 7 3 2 肾上腺素电化学传感器3 8 3 2 1 肾上腺素的检测方法3 8 3 2 2 肾上腺素电化学检测原理3 9 3 2 3 自组装膜修饰电极法4 l 3 2 4 聚合物膜修饰电极法4 l 3 2 5 纳米材料修饰电极法4 2 3 ，2 6 氨基酸修饰电极法4 3 3 3 分子印迹聚合物电化学传感器及本研究课题提出的背景4 3 参考文献4 5 第四章聚吡咯分子印迹复合膜检测肾上腺素4 9 4 1 引言4 9 4 2 实验部分5 0 4 2 1 试剂和仪器5 0 4 2 2 肾上腺素分子印迹聚合物膜的制备5 0 4 3 结果与讨论5 1 4 3 1 丙烯酰胺和组氨酸的影响5 l 4 3 2 电子自旋共振( e s r ) 及x 射线光电子能谱表征( x p s ) 5 4 4 3 3 聚吡咯丙烯酰胺组氨酸复合分子印迹聚合物膜5 7 4 3 4 肾上腺素的检测5 8 4 3 5 选择性和干扰试验5 9 4 3 6 稳定性和重复性6 1 目录 4 4 结论：6 l 参考文献6 2 附录：硕士期间完成的论文6 5 致i 射6 7 i u ， 摘要 摘要 分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ，m i p ) 技术是指为了获得在 空间和结合位点上与某一分子( 印迹分子、模板分子) 完全匹配的聚合物的制备 技术。基于该技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高，抗恶劣环境能 力强，使用寿命长，稳定性好，应用范围广等特点。本研究工作旨在研究基于分 子印迹技术的电化学传感器，并探讨了传感器的制作方法及其分析应用。论文主 要工作包括： 1 我们用电化学引发自由基聚合方法在电极表面制备了血红蛋白分子印迹 聚合物，并用扫描电子显微镜、原子力显微镜和电化学方法等对聚合物的表面形 态、印迹效果进行了表征。该方法能在电极表面制备结构均匀，致密的分子印迹 聚合物膜。模板分子洗脱后，在印迹膜上留下了在空间和官能团上跟模板分子有 互补关系的印迹孔洞，该印迹位点能选择性识别和结合印迹分子；这种结合行为 会阻碍铁氰化钾探针分子穿过孔洞在电极表面发生电化学反应，其电化学信号的 降低与蛋白质的浓度之间具有定的函数关系。分子印迹聚合物膜具有很好的选 择性，能选择性识别印迹分子。印迹膜具有良好稳定性，并能重复使用，在生物 及环境检测中有很大的研究及应用价值。 2 我们制备了基于聚吡咯的包含三种功能单体的肾上腺素分子印迹聚合物 膜，并且考察了丙烯酰胺和组氨酸两种单体的加入对膜的影响。丙烯酰胺的加入 形成的复合膜大大提高了膜的印迹效果和选择性，而组氨酸的加入在提高膜的选 择性的同时，也降低了基电流，提高了灵敏度。在1 1 0 l 1 1 0 之m o l l 浓度范 围内，肾上腺素的浓度与其还原峰电流具有良好的线性关系。拟合线性方程是 “| la ) = o 7 2 9xc ( m m o l l ) + 1 3 0 8 3 ，线性相关系数r = 0 9 9 4 3 ，检测限可以达到 1 0 4 m o l l 这种印迹膜对肾上腺素具有特异选择性，能够区分与肾上腺素分子结 构相似的分子，但在高酸度下对阴离子的有一定的静电吸附。总之，这种方法对 今后的制备基于聚吡咯传感器提供了一定的思路。 关键词 分子印迹聚合物，血红蛋白，肾上腺素，电化学传感器 v 了 a b s t r a c t g e n e r a t e db ye p i n e p h r i n ec a nb ed i r e c t l yd e t e c t e d t h er e d u c t i o np e a kc u r r e n t so f e p i n e p h r i n eh a v eal i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n so fe p i n e p h r i n ei nt h e r a n g eo f1 0 4t o1 0 m o l l t h ef i t t i n ge q u a t i o ni s 及ua ) - - - 0 7 2 9 c ( m m o l l ) + 1 3 0 8 3 w i t hr = 0 9 9 4 3 i na d d i t i o n ，t h ei m p r i n t e dp o l y m e rc a nd i s c r i m i n a t ee p i n e p h r i n ef r o m o t h e rs t r u c t u r e r e s e m b l i n gm o l e c u l e se x c e p ts t r o n gn e g a t i v e l yc h a r g e da n i o n s t h i s m e t h o dw o u l db ev e r ye f f e c t i v ef o rf u t u r ed e v e l o p m e n to fp o l y p y r r o l e b a s e d i m p r i n t e dp o l y m e r k e y w o r d s m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r , h e m o g l o b i n ， e p i n e p h r i n e ， e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r v 第一章分子印迹聚合物研究进展 第一章分子印迹聚合物研究进展 1 1 分子印迹聚合物的概念和原理 分子印迹技术的出现最早源自于免疫学的发展。早在2 0 世纪3 0 年代末， b r e i n l 、h a u r o w i t z 和m u d d 就相继提出了抗体侵入生物体时机体产生抗体的理 论。2 0 世纪4 0 年代，著名诺贝尔奖获得者p a u l i n g 【1 】对上述理论进行了进一步的 解释，提出了以抗原为模板合成抗体的理论。该理论认为：抗原物质进入机体后， 蛋白质以抗原为模板进行分子自组装和折叠成抗体。p a u l i n g 的理论被后来的“克 隆选择理论 所推翻，但他的理论中仍有两点具有一定的合理性，为分子印迹的 发展奠定了一定的理论基础：( 1 ) 生物体所释放的物质与外来物质有相应的作用 位点；( 2 ) 生物体所释放的物质与外来物质在空间上相互匹配。 1 9 4 9 年，d i c h e y t 2 提出了“专一性吸附”理论，实际上可以视为分子印迹 技术的萌芽，可是在很长一段时间内并没有引起人们的重视。1 9 7 2 年德国 h e i n r i e hh e i n e 大学的w u l 群3 】研究小组首次报道了人工合成分子印迹聚合物之 后，这项技术才逐步为人们所认识。1 9 9 3 年瑞典l u r i d 大学的m o s b a c h 4 】等在 ( ( n a t u r e ) ) 上发表了有关茶碱分子印迹聚合物的研究报道后，分子印迹技术得到 了蓬勃的发展。迄今，在分子印迹技术的作用机理、分子印迹聚合物的制备方法 以及分子印迹聚合物在各个领域的应用研究等都取得了很大进展。 分子印迹技术之所以如此迅速发展，主要是因为它有三大特点：构效预定性 ( p r e d e t e r m i n a t i o n ) 、特异性( s p e c i f i cr e c o g n i t i o n ) 和广泛实用性( p r a c t i c a b i l i t y ) 。 基于该技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高，使用寿命长，稳定性 好，抗恶劣环境能力强，应用范围广等特点。因此，分子印迹技术在许多领域， 如色谱分离与分析、固相微萃取、模拟酶催化、仿生传感、吸附、膜分离及临床 药物分析等得到日益广泛的研究和开发，并有望在生物工程、天然药物、临床医 学、食品工业和环境监测等领域形成产业化规模的应用。同时，分子印迹技术对 于研究酶的结构和功能、认识受体抗体作用机理及在分析化学等方面具有重要 的理论意义和实用价值。 第一章分子印迹聚合物研究进展 分子印迹，又称分子烙印( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ) ，属于超分子化学中主客体 化学范畴，是源于高分子化学、生物化学、材料科学等学科的- f l 交叉学科。分 子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ，m i p ) 技术是指为了获得在空间 结构和结合位点上与某一分子( 印迹分子、模板分子) 完全匹配的聚合物的制各 技术。实现分子印迹通常要经过3 个步骤( 见图1 1 ) 。 a ) 在适当的溶剂介质中，选择具有合适功能基的功能单体通过与模板分子 间的相互作用聚集在模板分子周围，形成单体模板分子复合物； b ) 功能单体与过量的交联剂在致孔剂的存在下聚合形成聚合物，从而使功 能单体上的功能基在特定的空间取向上被固定下来； c ) 通过一定的物理或化学方法把模板分子洗脱。这样在聚合物中留下了一 个与模板分子在空间结构上完全匹配、并含有与模板分子特异性结合的功能基的 三维空穴。这个三维空穴可以选择性的重新与模板分子结合，对模板分子具有专 一性识别作用。用不同的模板分子制备的分子印迹聚合物具有不同的结构和性 质，因此一种印迹聚合物只能与特定的印迹分子结合，类似于“锁”和“钥匙 的原理，即分子印迹聚合物对该分子具有选择性结合能力。 2 c - 图i 1 分子印迹技术原理 f i g u r e1 1s c h e m eo fm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e rt e c h n o l o g y 土移飞 鬈铮 矿彩黪。隧 崦 a 一 ， 量 0尹誊冰 尹 0 3 一一 第一章分子印迹聚合物研究进展 1 2 分子印迹聚合物的分类和制备方法 1 2 1 分子印迹聚合物的分类 按照单体和模板分子形成复合物时作用力的不同，分子印迹可以分为共价型 和非共价型两种，分别又称为预组织法( p r e o r g a n i z a t i o n ) 和自组装法 ( s e l f - a s s e m b l i n g ) ，其中自组装法的研究和应用更为广泛。 1 2 1 1 预组织法 预组织法即共价键合法，是由德国的w u l f f 及其同事在2 0 世纪7 0 年代创立。 此方法的原理是：功能单体先通过可逆共价键与模板分子结合形成单体模板分 子复合物，然后加入交联剂，引发聚合，聚合后再通过化学途径将共价键断裂洗 脱去除印迹分子。共价键作用的优点是在聚合中能获得在空间精确固定排列的结 合基团。对于以催化剂为模板分子的分子印迹聚合物来说，其内部结合基团的方 向和空穴中起催化作用的活性基团极为重要，共价结合作用在此情况下更为有 利。 但是，由于共价作用一般较强，在自组装分子印迹聚合物的过程和识别过程 中结合和解离速度慢，难以达到热力学平衡，不适宜快速识别，识别能力与生物 识别相比差别甚远，因此这种方法发展比较缓慢。 1 2 1 2 自组装法 自组织法又称非共价法，由瑞典的m o s b a c h 及其同事在2 0 世纪8 0 年底创 立。此方法的原理是：模板分子与功能单体之间通过非共价键( 氢键、静电作用、 电荷转移、金属螯合键、疏水作用以及范德华力等) 结合，自发形成具有多重作 用位点的单体模板复合物，经交联作用后，这种作用被保存下来，然后将模板 洗脱，形成印迹位点。 迄今使用非共价作用的物质包括丙烯酸及其酯类、丙烯酰胺、甲基丙烯酸及 其酯类、三氟甲基丙烯酸、4 乙烯基吡啶、4 乙烯基苯乙烯、1 乙烯基咪唑、2 ， 6 二丙烯酰胺吡啶等。 另外，在非共价法制备印迹聚合物的过程中，应该尽可能使用多种非共价力。 非共价作用的种类多，制备的分子印迹聚合物的选择性和分离能力要比一种作用 3 第一章分子印迹聚合物研究进展 制得的分子印迹聚合物要好很多。如果在印迹和分离过程中只有氢键一种作用， 其拆分外消旋体的效果不好；而如果在印迹过程中既有氢键，又有其他的物理或 化学作用时，其拆分分离系数很高。s e l l e r g r e n 5 】就静电作用对选择性的影响做了 详细的研究，发现当只有静电作用一种非共价作用时，获得的分子印迹聚合物的 选择性降低；而如果将静电作用跟共价作用结合起来，其选择性比单个共价作用 的选择性要好的多。 与预组织法相比，自组装法简单易行，模板分子容易洗脱，其分子识别能力 更接近天然分子识别系统，如“抗原抗体”和“底物酶”等。在印迹过程中还 可以采用多种单体，提供给模板分子更多的相互作用，以改善印迹效果。 1 2 2 分子印迹聚合物的制备方法 1 2 2 1 分子印迹制备过程理论研究 分子印迹过程通常要经过三个过程：( 1 ) 根据印迹分子( 模板分子) 选择合 适的功能单体，利用共价键或者非共价键相互作用使功能单体和印迹分子形成可 逆复合物；( 2 ) 加入交联剂和引发剂，引发聚合反应以形成高分子聚合物，将这 种复合物“冻结”起来；( 2 ) 通过物理或化学方法将模板分子洗脱下来，这样在 聚合物的骨架中便留下了一个对印迹分子有选择性的空间和结合位点( b i n d i n g s i t e s ) 。 目前，关于分子印迹过程的机理还缺乏定量和系统的研究，基本上停留在定 性水平1 6 。分子印迹聚合物( m i p ) 对分子的识别源于它与模板分子之间在化学基 团以及三维空间结构的相互匹配，m i p 的选择性与模板分子和单体之间的相互作 用的数量与强度以及模板分子的形态与刚性有关。n i c h o l a s 和h o l r o y d 等人【7 8 】认 为，m d 复合物的形成过程以及m i p 与印迹分子之间识别过程均受热力学的制约， 自由能变化可以由下列公式计算： g b i n f g h f + g r + g l 寸a g v i b + ea g p + a g c 伽一g v d w 式中，吼i n d 形成复合物时的g i b b s 自由能的变化； g t ，分子平动和转动引起的自由能减少； g f 一分子内旋受限引起的自由能变化； 4 第一章分子印迹聚合物研究进展 吼疏水作用引起的自由能变化； g 。i 广基团振动引起的自由能变化； g d 一参加反应的所有基团自由能改变的总和； g c 叫广构象变化引起的自由能的变化； g vd _ 广非范德华力引起的自由能的改变。 这个公式不仅考虑到基团专一性反应，而且也充分考虑到了空间匹配对选择性 的作用，用此公式可以分析影响m i p 形成和识别过程因素，进而改善m i p 的设 计和制备。 1 2 2 2 功能单体的选择 分子印迹过程中，选择正确的功能单体是决定印迹效果好坏的一个决定因素 【9 】。同一种功能单体可以印迹不同的模板分子，一个模板分子也可以选择不用的 功能单体。功能单体通常要根据印迹分子( 模板分子) 的性质和相互作用力( 共 价或非共价作用) 及其大小，进行合理的设计和选择。另外，根据模板分子和功 能单体的分子性质参数，也可以建立功能单体库，通过计算机模拟辅助设计【1 0 1 2 】。 另外值得注意的是，两种或三种功能单体的联用可以得到识别能力更强的分 子印迹聚合物 1 3 】同时含有金属离子的功能单体可增强分子印迹聚合物的吸附 能力【1 4 】功能单体与模板分子的比例( m 厂r ) 对分子印迹聚合物识别位点形成的 数量和效果有很大影响【1 5 】。功能单体的种类非常多，性质也各不相同。常用的 共价单体主要有含有乙烯基的硼酸或二醇以及含硼酸酯的硅烷混合物等；常用的 非共价键单体主要有丙烯酰胺、羧酸类( 甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸、乙烯基 苯甲酸等) 、磺酸类( 二丙烯酰胺2 甲基1 丙磺酸) 、杂环弱碱( 乙烯基吡啶、 乙烯基咪唑等) 等。图1 2 中列出了一些常用的制备分子印迹聚合物功能单体的 分子结构式。 5 第一章分子印迹聚合物研究进展 疹矽。矿丫。 码 a c r o l e t n a c t t l a m l d e 於，避 吖o ￥邓 吖v 邓 蛔”a m i d o 一2 - m e t h y l - i 【 p r o p a n e s u l f o n i ca c i d 坞 协。 舢v i a m i n e m - d l v t n y lb e n z e n e 一 e t h y l e n eg l y c o k d i m e t h a c r y l a t e 珏h 吖、飞 0 0 n 奠- m e t h y l e n eb t s a c r y l a m l d e 枷砸 2 l 薹、d r o 醇e n 蹲【 m e t h a c r y l a t e v 电 h o ， i ! 矿 l - v i n y l i l n k h l z o l e n n - d i t 瞳h y l a m i n o e t h y lm e t h a c d - i a t e 呛 厂g m e t h a c r y l i ca d d u r o c a n l ca c i de t h y le s t e r v i n y lb e n z e n e 勺凡 图1 2 分子印迹技术常用功能单体的结构【1 3 】 f i g u r e1 2s 缸u c t i i r e so ff u n c t i o n a lm o n o m e r su s e di nm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r t e c h n o l o g y 1 2 2 3 聚合反应和聚合反应类型的选择 分子印迹聚合物大都是通过自由基引发制备，一般以偶氮二异丁腈( a i b n ) 或偶氮二异庚腈为引发剂。引发剂的引发有高温热引发和低温光引发两种，低温 光引发因为具有可以稳定模板分子和单体形成的复合物以及印迹热不稳定化合 物等优点，应用更为广泛。为保证特定空间的构型和刚性，分子印迹聚合物一般 需要控制较高的交联度( 通常高达8 0 ) ，一些常用的交联剂如n ，n 亚甲基双 丙烯酰胺( m b a ) 、二乙烯基苯( d v b ) 、二甲基丙烯酸乙二醇酯( e g d m a ) 、 三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯( t r i m ) 等都可以用于分子印迹技术中。 另外，影响分子印迹聚合反应的因素包括浓度、温度、压力、光照、溶剂种 6 = “ 吖 i | 心一 一h 第一章分子印迹聚合物研究进展 类和极性等。其中，溶剂的选择在分子印迹制备中发挥着重要作用【l6 】，尤其在 自组装体系中。高压下形成的分子印迹聚合物具有更紧密的结构和更低的孔体 积，能很大程度提高分子印迹效果。一般，按照自组装分子的原理，低温下单体 与模板分子能形成更为有序和稳定的聚合物 t 7 - 8 】，选择性也好。 在高分子聚合反应中常用的聚合反应类型都可以用于分子印迹聚合物的制 备。目前，制备分子印迹聚合物常用的聚合方式有本体聚合、原位聚合、乳液聚 合、悬浮聚合、表面印迹和电化学聚合等。 本体聚合本体聚合是将功能单体、印迹分子、交联剂和引发剂等按一定的 比例溶解在溶剂里，聚合交联反应后将其干燥、研磨、破碎、筛分得到一定粒径 的分子印迹聚合物颗粒，最后洗脱除去模板分子。本体聚合是早期分子印迹聚合 物大多采用的方法，此种方法合成操作简单，实验易于控制，其缺点是( 1 ) 处 理过程复杂，研磨过程中会产生一些不规则的粒子和大量的过细粒子，这些过细 粒子需要经过沉降除去，费时费力，使产量大大降低；( 2 ) 网络交联度高，模板 分子包裹在内部，很难去除；( 3 ) 印迹点在合成过程中被包埋在内部，结合点利 用率低并且模板难以洗脱。 原位聚合【1 9 2 4 】将一定量的模板分子、功能单体、交联剂等溶于适当的溶剂 中，再将混合液填充到纳米层状物的层间，让其在纳米层间发生聚合反应。 p i l e t s k y 【1 9 】等在1 9 9 0 年首次以腺苷酸( a m p ) 为模板，丙烯酸酯为功能单体，采 用原位聚合法制备了分子印迹聚合物膜，实现了对模板分子的选择性识别和分 离。 乳液聚合2 习将模板分子、功能单体、交联剂溶于有机溶剂中，然后将溶 液移入水中，搅拌，乳化，最后加入引发剂引发交联聚合，可直接制备粒径较均 匀的球形分子印迹聚合物。 悬浮聚合【2 6 - 2 7 】悬浮聚合法是制各聚合物微球最简单，最常用的方法之一。 通常使用的单体都是疏水性的，所以连续相常用水或者高极性的有机溶剂，但在 分子印迹过程中高极性溶剂会极大的降低功能单体与模板分子之间相互作用的 7 第一章分子印迹聚合物研究进展 数量和强度，从而影响聚合物对印迹分子的识别。为了克服这个缺点，人们提出 了以全氟烃为分散相的悬浮聚合法，即在液态全氟烃中形成非共价作用印迹的混 合物乳液，采用全氟化的表面活性剂及其他含氟的表面活性聚合物为稳定剂，得 到稳定的含单体、印迹分子、交联剂和致孔剂的乳液液滴。全氟烃无毒，易处理。 缺点是易燃、价格昂贵，并且使用后要蒸馏重复使用。 表面印迹上述几种聚合方式都属于三维印迹，表面印迹是一种二维印迹方 法。表面印迹是通过对表面( 般为粒子) 进行修饰制备分子印迹聚合物，形成 印迹膜覆盖的粒子。这种方法可以充分利用粒子的特性( 如较高的孔度和表面积 等) ，并可以对粒子表面进行官能团修饰以适应印迹需求【2 8 枷】，或者利用表面自 组装技术【3 l 】。表面印迹在生物大分子( 如蛋白质) 分子印迹聚合物的制备中使 用的最多【3 2 3 3 1 。何锡文研究小组分别在马来酸酐修饰的硅胶【3 4 1 和光接枝聚苯乙 烯【3 5 】表面，印迹了牛血红蛋白分子印迹聚合物，该分子印迹微球对模板分子有 着很好的吸附容量和识别选择性。 ： 电化学聚合一些功能单体( 如吡咯、苯胺等) 可以通过电化学引发在电极 表面聚合成膜，从而可以将模板分子一同印迹在电极表面。电化学聚合方法通常 有循环伏安法、恒电流法和恒电位法等。循环伏安法及恒电位法成膜速度较慢， 形成的膜整齐致密，但循环伏安法会因过度氧化对印迹膜结构产生一定的损害； 恒电流法成膜速度较快，但沉积颗粒较为粗大。电化学法制备的电化学传感分子 印迹聚合物膜有很大优势，其它常用的成膜方法，如压膜法、原位聚合法和旋涂 法等制成的膜，其厚度多在微米以上，均匀性差，难以重复，极大地影响了传感 器的灵敏度，而电化学法可以很好的将传感器跟分子印迹识别膜结合在一起，灵 敏度高。 1 2 2 4 模板分子的洗脱 将占据在识别位点上的模板分子洗脱下来，一般采用高极性溶剂( 水、甲醇 水、乙腈、甲醇乙酸等) 来反复洗涤。对于生物大分子如蛋白质等的洗脱一般 用s d s 和乙酸的混合液等溶剂，其洗脱原理是使蛋白质变性分解，从而从印迹 8 一一一一 第一章分子印迹聚合物研究进展 位点上脱落下来。模板分子的洗涤过程通常非常缓慢，需要耗费大量溶剂。 1 3 分子印迹聚合物的应用 1 3 1 分离和色谱分析 色谱分离和分析是分子印迹聚合物最主要的用途。分子印迹聚合物微球可以 用来填充色谱柱【3 6 1 ，或者通过原位聚合直接在色谱柱中制备色谱分离的固定相， 与高效液相，气相，毛细管电泳等联用进行手性分离、同分异构分离等，也可进 行样品的前期预处理。 分子印迹聚合物分离在手性识别和拆分中有独特的优势，被认为是进行大规 模手性物质拆分的非常有潜力的方法。y o s h i k a w a 3 7 - 4 3 】等自1 9 9 4 年以来一直致力 于m i p 膜用于手性物质分子方面的研究。d z g o e v 阳】等对氨基酸类物质的手性拆分 也进行了研究。 分子印迹聚合物用于色谱分析和分离中存在的问题是( 1 ) 印迹聚合物的容 量太小，主要是因为聚合物中实际存在的有效结合位点太少所致；( 2 ) 分子印迹 聚合物在制备前需要纯的对映体，这就给一些用一般方法难以拆分的消旋物的拆 分工作带来了困难。 1 3 2 模拟酶 4 5 】 自然界中的酶以其高效、专一、反应条件温和等成为一类重要的催化剂。化 工生产、化学合成和生物工程等领域的发展很大程度上依赖于催化剂。但是，天 然酶提取困难、耐受性差、易失活和难以回收重复利用等缺点限制了它们的生产 和应用。利用分子印迹技术可以将这些酶的识别位点和催化基团引入聚合物内部 制备模拟酶，或者称“塑料酶”。模拟酶跟天然酶相比，性能更加稳定，结构可 调，耐高温，耐酸碱，价格便宜，易于储存和规模化生产。对于分子印迹技术而 言，这也是最具有挑战和最困难的应用研究。 制备分子印迹模拟酶的模板分子主要有底物类似物( s u b s t r a t ea n a l o g u e ) 4 6 】、 过渡态类似物( t r a n s i t i o ns t a t ea n a l o g u e ) 4 7 4 8 1 和产物类似物( p r o d u c ta n a l o g u e ) 9 第一章分子印迹聚合物研究进展 4 9 - 5 0 】。研究较多的模拟酶催化反应主要有水解反应、合成反应、氧化还原反应、 转移反应、异构化反应等。 1 3 3 抗体和受体模拟物 用分子印迹技术制备的人工抗体和受体具有很高的灵敏度，从理论上来说是 对生物抗体的一种有益的补充。用分子印迹聚合物作为模拟抗体，能得到比化学 分析方法更精确地结果，而且操作简单，费用低廉，检测条件要求不高，所以 m i p 有望成为药物检测中的升级替换品【5 2 1 。m o s b a c h 等用印迹聚合物代替抗体， 在放射免疫测定中可以检测药物中的吗啡、茶碱等 5 3 _ 5 5 1 。 1 3 4 传感器 传感器一般由用于识别和接受传感物的接收器和将这种识别行为转换为可 测信号的转换器两部分组成。分子印迹膜因为具有特异性识别和结合模板分子的 能力，可以用于传感器的设计和制作。目前，基于分子印迹聚合物传感器的传感 方式有电化学传感【5 6 。5 7 1 、光传感 5 8 。6 0 】、声传感【6 1 】和质量敏感型6 2 删等。 设计m i p 传感器的一个重要方面是找到适当的方法解决聚合物与转换器结 合的界面问题。m i p 可以涂覆在转换器表面( 旋转涂层或喷雾涂层) ，也可以在 表面原位合成。用电化学聚合方法在电极表面原位合成m i p 膜，结合紧密，传 感效果好，具有很大的发展前景。本章第四节将详细介绍分子印迹聚合物电化学 传感器的研究进展。 1 4 分子印迹聚合物电化学传感器 1 4 1 引言 分子印迹技术用作传感器的敏感材料是分子印迹技术的一个重要研究方向。 电化学方法是一种非常灵敏和方便的信号检测方式，常用作传感器的换能器。将 分子印迹技术和电化学检测手段相结合，能充分发挥两者的优势，提高传感器的 选择性和灵敏度，并且能够方便的实现微型化和自动化，制备可批量生产且低成 l o 第一章分子印迹聚合物研究进展 本的便携式传感器，这在环境分析上极为重要。 设计和制备成功的分子印迹电化学传感器有三个重要的方面需要考虑：( 1 ) 高灵敏度的信号转换器( t r a n s d u c e r ) ，该转换器能够检测分子印迹聚合物和模板分 子的结合行为，并能将这种结合行为转换成可处理的信号；( 2 ) 制备具有特异识 别能力的分子印迹聚合物，在需要的测定条件下对模板分子的选择性高；( 3 ) 转 换器与分子印迹聚合物的结合。 1 4 2 分子印迹电化学传感器的制备方法 1 4 2 1 自组装法口l 删 分子自组装膜( s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，s a m s ) 是分子在溶液( 或气态) 中自发的通过强健作用力( 如共价键、静电吸引、疏水作用力和配位键等) 牢固 地与基质结合形成的高度有序的单分子层膜c 7 0 1 。在制各自组装分子印迹电化学 传感器中，一般常用有机硫化合物( 如长链烷基硫醇、巯基丙酸等) 作为功能单 体，在金电极表面自组装成分子印迹聚合物膜。p i l e t s k y t 6 5 】等用十六烷基硫醇为 功能单体，在金电极上自组装制成胆固醇分子印迹电化学传感器，用铁氰化钾为 探针检测m i p 的选择性识别能力，发现随着溶液中胆固醇浓度的增加，铁氰化钾 还原峰电流逐渐减少，二者之间存在着一定的定量关系。 由于在自组装制备分子印迹聚合物膜的过程中没有加入交联剂，单分子层缺 乏一定稳定性，在溶剂冲刷和洗脱模板的过程中，印迹膜很容易损坏。另外，烷 基硫醇链的长度会影响自组装膜的选择性，硫醇链太长，链的伸缩会破坏印迹位 点。据报道，最好的印迹体系是十二烷基硫醇【6 6 1 和十四烷基硫醇【6 7 】。 1 4 2 2 溶胶一凝胶法n 刊 溶胶凝胶技术是指有机或无极化合物经过溶液溶胶凝胶而固化，在经热处 理而制得的氧化物或其他化合物固体的方法。分子印迹溶胶凝胶体系是一类具 有大孔、刚性结构的无机或有机聚合物，能够承受强酸，强碱。溶胶凝胶法制 备分子印迹聚合物方法简单，条件易于控制，容易在电极表面成膜。常用的功能 单体有有机硅烷和氧化物( - - 氧化硅) 等。近几年，苯基三甲氧基硅烷( p t m o s ) 第一章分子印迹聚合物研究进展 印迹含有苯环的模板分子制备有机无机杂化的分子印迹聚合膜受到了很多关注 7 2 , 7 8 - 8 1 】p t m o s 同时含有苯基和硅烷基团，可以跟模板分子的苯环形成丌相互 作用，也可以跟正硅酸甲酯形成溶胶凝胶。m a r x 8 1 1 等用这种方法制作了盐酸普 萘洛尔分子印迹聚合物，发现该印迹聚合物跟丙烯酸体系相比，能大大降低印迹 膜的非特异性吸附。 1 4 2 3 电化学聚合法 电化学聚合法是制各分子印迹电化学传感器最有潜力的方法。聚合物膜很容 易在电极或其他导电基质上生长，同时可以通过调节电化学参数能严格控制膜的 厚度。电化学聚合方法简单，操作方便，特别适合于表面印迹。常用聚合单体( 吡 咯、苯胺等) 为功能单体，直接在电极表面聚合成膜，或者用电聚合膜将分子印 迹颗粒包埋在电极表面【8 2 1 。聚吡咯【8 3 - 8 7 1 、聚苯酚8 8 1 、聚邻氨基苯酚【8 9 - 9 1 1 、聚邻 苯二胺【9 2 - 9 4 1 、聚氨基苯硼酸【9 5 母刀等都已成功应用于分子印迹电化学传感器，很多 新的功能单体也在积极的开发中。与丙烯酸类和乙烯基类衍生物为单体的发展成 熟的分子印迹膜相比，电聚合法的应用相对还非常有限，很大部分都是用于传感 器的制作。 1 4 3 分子印迹电化学传感器的种类 当m i p 传感层与换能器结合后，电化学信号的检测可以分为电势型( 包括 离子选择性电极) g s q 0 1 、电导型【1 0 2 - 1 0 5 1 、电流型【1 晦1 明和电容型【1 0 8 1 0 9 】等四类， 近来还有人报道用印迹膜修饰悬汞电极，用阴极溶出伏安法进行测量 1 l o ；另外， 电信号的检测也可以按照模板分子的电活性分为直接检测、间接检测和竞争型检 测【l l l 】等。 电化学信号检测方式的选择一直是制备分子印迹电化学传感器的一个难题， 通常分子印迹聚合物的制备相对简单，信号检测却有一定的困难，这也是导致分 子印迹聚合物电化学传感器灵敏度和检测限较其他电分析化学方法低的一个主 要原因。根据分子的电化学活性，有电活性的分子可以在电极表面发生氧化还原 反应，制作成电流型传感器，但要注意电极表面的污染；无电化学活性的分子， 1 2 第一章分子印迹聚合物研究进展 可以用电势、电导或者用电化学石英微天平来检测信掣1 1 2 ”。其中，电导法是 这些测试方法中最不灵敏的，选择性也不高。电容型分子印迹电化学传感器一般 用电化学阻抗谱来表征印迹膜的选择性。电势型传感器常制备成离子选择性电 极，即制作离子或带电荷分子的分子印迹膜，利用这种膜对该离子的特异选择性 导致膜电位的变化。 另外一种方法是间接法，即利用另一种电活性小分子化合物( 如铁氰化钾等) 在电极表面的信号强弱来间接检测模板分子在印迹膜上的吸附量。模板分子在电 极表面吸附的越多，留下的印迹孔道就越少，电活性小分子穿越这种孔道在电极 上产生的电化学信号就相应的减少【6 5 , 1 1 4 - 1 1 5 】。关于分子印迹电化学传感器检测的 方式可以参看图1 3 。 图1 3 分子印迹电化学传感器电化学信号测量方式【1 1 6 1 f i g u r e1 3m e a s u r e m e n tp r o t o c o l su s e df o r t h ed e v e l o p m e n to f m i p - b a s e de l e c t r o c h e m i c a l s e n s o r s 1 3 第一章分子印迹聚合物研究进展 1 5 本研究课题的提出 分子印迹聚合物是以目标分子即印迹分子为模版，选择合适的功能单体与模 板分子结合形成复合物，在交联剂作用下引发聚合，在印迹分子周围形成交联度 很高的二维表面或三维高分子聚合物网络，然后用洗脱剂将印迹分子洗脱下来， 形成具有互补结构的分子印迹聚合物。根据印迹分子与单体的作用方式，印迹聚 合物的制备方法可以分为共价法( 预组织法) 和非共价法( 自组装法) 。 分子印迹聚合物之所以发展如此迅速，主要因为它有三大特点：预定性，识 别性和实用性。分子印迹聚合物具有抗恶劣环境的能力，表现出高度的稳定性和 长的使用寿命等优点。因此，对印迹聚合物的合成及应用研究十分活跃，涉及的 范围很广，己应用于手性物质分离、生物传感器、模拟抗体与受体、酶模拟催化、 色谱分析和分离等领域。但到目前为止，大多数研究都集中在小分子印迹聚合物 的合成和分离检测，蛋白质等生物大分子分子印迹【1 1 7 。1 2 1 1 正处于研究初级阶段， 但已经展现了广阔的应用前景，是现在和未来分子印迹聚合物研究的一个热点。 迄今为止，对蛋白质、核酸和多糖的印迹，甚至对整个微生物细胞( 病毒) 印迹 的研究报道极少，而在电极表面上直接进行生物大分子印迹聚合物膜的制备研 究，尚未见报道。因此，发展基于电化学快速检测识别的生物分子印迹传感器有 很大的基础研究和应用意义。 当前，大多数分子印迹聚合物的合成都是在有机溶剂中进行，毒性大，污染 环境，并且由于生物大分子只能在水环境条件下才能保持其结构和形态稳定。因 此，加强水环境下分子识别现象的研究，对制备水环境下高选择性分析印迹聚合 物传感电极，有着十分重要的意义【1 2 2 。 1 4 一一一一 第一章分子印迹聚合物研究进展 参考文献 【1 】p a u l i n gl j a m c h e m s o c ，1 9 4 0 ( 6 2 ) ：2 6 4 3 2 】d i c h e yfh 跏n a t l a c a d s