（微生物学专业论文）灰黄霉素生物合成差异蛋白质组学研究.pdf

福建师范大学学位论文使用授权声明 2 q q 5 9 1 3专 业 邀生物堂 所呈交的论文( 论文题目：灰黄霉素生物合 成差异蛋白质组学研究) 是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。本人了解福建师范大学 有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交的学位论文并 允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容；学校可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 巾 学位论文作者签名告岛指导教师签学位论文作者签名 彦 豳一一一指导教师签 签名日期芝盟基：厶! 圣 摘要 摘要 根据真菌1 8 sr d n a 的保守序列设计引物，对灰黄霉素高产突变菌p e n i c i l l i u m g r i s e o f u l v u mf 2 0 8 与出发菌株p g r i s e o f u l v u m3 5 1 9 0 的1 8 s rd n a 进行克隆测序及对比分 析，并登录g e n b a n k ( 序列号为e f 6 0 8 1 5 1 和e f 6 0 7 2 8 2 ) 。依据1 8 sr d n a 建立的系统进 化树表明突变株f 2 0 8 与出发菌株3 5 1 9 0 的遗传距离较远，而与p u r t i c a e 亲缘关系最近。 出发菌株3 5 1 9 0 与p c o m m u n e 亲缘关系最近。1 8 sr d n a 作为分子标记可有效地鉴别灰黄 霉素产生菌( p g r i s e o f u l v u m ) 高产与低产菌株。 摸索蛋白提取方法及双向电泳条件，成功建立灰黄青霉菌丝体总蛋白双向电泳技术体 系。通过双向电泳联用质谱技术首次对p g r i s e o f u l v u mf 2 0 8 发酵过程蛋白质组图谱进行比 较分析，探寻到灰黄霉素产生前期( 7 2 h ) 与产生高峰期( 1 9 2 h ) 蛋白表达的差异。选取 在灰黄霉素产生高峰期蛋白表达量明显增加的其中5 个蛋白质斑点进行质谱分析及m a s c o t 数据库检索，鉴定出其中2 个蛋白点分别对应于丝氨酸羟甲基转移酶和s 腺苷甲硫氨酸合 成酶，并进一步对其在灰黄霉素合成过程中的作用机制进行初步探讨。 关键词灰黄青霉；灰黄霉素；蛋白质组；双向凝胶电泳；质谱；1 8 srd n a 中文文摘 中文文摘 灰黄霉素( g r i s e o f u l v i n ，简称g r i ) 是从灰黄青霉菌丝体中分离得到的一种含氯代谢产 物，临床上用于治疗由皮肤癣菌属引起的头癣、叠瓦癣及头足甲癣等体表霉菌感染；农业 上亦被用于抗植物真菌病害。灰黄青霉( p e n i c i l l i u mg r i s e o f u l v u m ) f 2 0 8 是野生型 p g r i s e o f u l v u m3 5 1 9 0 菌株经过连续多代复合诱变抗性育种，筛选出的高度耐前体氯离子灰 黄霉素高产突变株。与出发菌株3 5 1 9 0 相比，突变菌株f 2 0 8 改变了以乳糖为最佳碳源的 传统，而以大米粉为碳源时发酵单位最高；其孢子颜色、菌落质地等形态特征也发生显著 改变。 鉴于1 8 sr d n a 已被广泛用来标记微生物菌株之间的差异，本实验根据真菌1 8 sr d n a 的保守序列设计引物，应用p c r 技术对高产突变菌株p g r i s e o f u l v u mf 2 0 8 与出发菌株 p g r i s e o f u l v u m3 5 1 9 0 的1 8 srd n a 进行克隆测序，并登录g e n b a n k ( 序列号为e f 6 0 8 1 5 1 和e f 6 0 7 2 8 2 ) 。根据1 8 sr d n a 序列同源性分析法鉴定菌株的种属原则进行了比对和聚类 分析，采用邻位相连( n e i g h b o r j o i n i n g ) 算法，经c o n s e n s u s 程序计算多数一致数，构建 了进化树。依据1 8 sr d n a 建立的系统进化树表明突变株f 2 0 8 与出发菌株3 5 1 9 0 的遗传 距离较远，而与p u r t i c a e 亲缘关系最近。出发菌株3 5 1 9 0 与p c o m m u n e 亲缘关系最近。 突变株p g r i s e o f u l v u m f 2 0 8 与出发株p g r i s e o f u l v u m3 5 1 9 0 超出了普通的同一物种不同变株 之间的差异距离，这可能是突变株f 2 0 8 在形态学和生理学上较出发菌株已发生显著改变 的原因。通过b l a s t 分析结果，选取二者1 8 sr d n a 序列中差异最大的两段序列可作为分子 标记有效地鉴别灰黄霉素产生菌( p g r i s e o f u l v u m ) 高产与低产菌株，并从分子水平为筛选 产量较高的灰黄青霉作为出发菌株进行育种提供一定的理论依据。 随着灰黄霉素研究工作的开展，灰黄霉素生物合成的初步过程已基本明了。灰黄霉素 产生菌在代谢过程中是通过7 个乙酸分子的生物合成途径合成灰黄霉素。乙酸代谢、氯化 作用及甲基化作用是灰黄霉素生物合成过程中必不可少的三个关键性作用，三者相互呼 应。但是灰黄霉素具体的生物合成网络及其相关的酶系还未揭示，有待进一步研究探讨。 本实验开展灰黄霉素产生菌蛋白质组学研究，分析灰黄青霉f 2 0 8 摇瓶发酵过程中蛋 白质的表达差异及差异蛋白的表达丰度，旨在探寻其生化合成途径相关酶系( 尤其关键 酶) ，完善该真菌蛋白质图谱和数据库，此有助于进一步深入了解狄黄霉素生物合成过程， 并为在分子水平上揭示灰黄霉素生物合成机理提供一定的理论依据。 首先，通过摇瓶发酵，比色法测定灰黄霉素效价。实验结果表明灰黄霉素高产突变株 f 2 0 8 产生灰黄霉素主要集中在发酵的后期。在发酵1 9 2 h 时，合成速率最大，此时和灰黄 i i i 福建师范大学李晶硕上学位论文 霉素合成相关酶系活力应最高，而在发酵7 2 h 时灰黄霉素合成量低，此时此类酶活性没有 或较低。 接着，摸索蛋白提取方法及双向电泳条件，首次成功建立灰黄青霉菌丝体总蛋白双向 电泳技术体系。酚抽提法所制备的总蛋白样品受多糖、盐类等杂质干扰少，各组分的分离 拖尾现象和横向扩散都较轻微，大小蛋白质组分斑点明显可见，分离效果较理想。与自制 等电聚焦凝胶条相比，利用2 4 c m l p g 胶条进行双向电泳获得的双向电泳图谱胶面背景干 净，纹理较少，蛋白点更加清晰规则，且出现更多的蛋白点，小分子点也明显增多，较易 分辩：与同一p h 值范围的1 3 c m l p g 胶条相比，提高了上样量利于低丰度蛋白的检测并获 得酸碱性蛋白的更佳分离效果。该体系可以满足2 - d e 分析的需要，并为后续质谱鉴定奠 定基础。 本实验采用酚抽提法提取摇瓶发酵培养7 2 h 、1 2 0 h 和1 9 2 h 的狄黄霉素菌丝体总蛋白， 选用2 4 c m l p g 胶条( p h3 1 0 ) 进行双向电泳，获得蛋白点分离清晰的双向电泳图谱。采 用专门的2 - d e 图象分析软件i m a g e m a s t e r2 dp l a t i n u m 对图像进行数据统计分析，探寻到 灰黄霉素产生前期与产生高峰期蛋白表达存在差异。选取在灰黄霉素产生高峰期蛋白表达 量明显增加的其中5 个蛋白质斑点进行一级质谱结合串联质谱进行分析，通过m a s c o t 数据 库检索和综合比对结果，鉴定出2 个蛋白点分别对应于丝氨酸羟甲基转移酶和s 腺苷甲硫 氨酸合成酶。一级质谱( m s ) 结合串联质谱( m s m s ) 法鉴定蛋白质结果更加可靠，因 为m s m s 具有结构分析功能，可以获得检测到的每一肽段的序列。根据m s 测得的精确 分子质量结合m s m s 所测得的序列信息，通过蛋白质数据库检索，大大增加了蛋白质鉴 定的准确性。针对得到的鉴定结果，进一步对其在灰黄霉素合成过程中的作用机制进行探 讨。在灰黄霉素生物合成途径中极可能是丝氨酸羟甲基转移酶催化反应产生n 5 ，n 1 0 一亚 甲基四氢叶酸，后者是细胞新陈代谢中一碳单位的重要提供者，为合成甲硫氨酸等甲基授 体提供重要底物。甲硫氨酸是灰黄霉素生物合成过程中有效的甲基授体。甲硫氨酸在转甲 基之前首先必须与a t p 作用，生成s 腺苷甲硫氨酸，而这一反应正是由s 腺苷甲硫氨酸 合成酶催化完成的。s 一腺苷甲硫氨酸极有可能参与了灰黄霉素合成途径中g d s e o p h e n o n ec 的合成及从g r i s e o p h e n o n eb 转化为g r i s e o p h e n o n ea 中的甲基化作用。甲基授体是实现甲 基化作用的前提，生成足够的甲基授体是加速狄黄霉素生物合成的关键途径之一，对灰黄 霉素的生物合成意义重大。 i v a b s t r a c t a b s t r a c t 1 8 sr d n ag e n e so ft h eh i g hg r i s e o f u l v i np r o d u c i n gm u t a n tp e n i c i i l i u mg r i s e o f u l v u mf 2 0 8 a n di t so r i g i n a ls t r a i np e n i c i l l i u mg r i s e o f u l v u m3 5 1 9 0w e r es u c c e s s f u l l yi s o l a t e db yp c rw i t h t h ep r i m e r sd e s i g n e do nt h eb a s i so ft h ec o n s e c u t i v e1 8 sr d n as e q u e n c e so ff u n g i t h e i r s e q u e n c e s w e r es u b m i t t e dt o g e n b a n k ( a c c e s s o i n n o e f 6 0 8 1 5 1a n de f 6 0 7 2 8 2 ) t h e p h y l o g e n e t i ct r e eb a s e do n18 sr d n as e q u e n c e ss h o w e dt h a tt h ee v o l u t i o n a r yd i s t a n c eb e t w e e n t h em u t a n tf 2 0 8a n dt h eo r i g i n a ls t r a i n3 5 1 9 0w a sf a ra w a y t h em u t a n tf 2 0 8w a sc l o s e dt o p e n i c i l l i u mu r t i c a e ，b u tt h eo r i g i n a ls t r a i n3 5 1 9 0w a sc l o s e dt op e n i c i l l i u mc o m m u n e 1 8 s r d n ac o u l db eu s e da sam o l e c u l a rm a k e rt oi d e n t i f yt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h eo r i g i n a la n dt h e m u t a n th i g h l yp r o d u c i n gg r i s e o f u l v i n b yg r o p i n gs a m p l ep r e p a r a t i o nm e t h o da n do p t i m i z i n go fv a r i o u sc o n d i t i o n s ，w ef o u n d e da s e to fm e t h o do ft w o - d i m e n s i o n a lg e l e l e c t r o p h o r e s i sf o r t o t a l p r o t e i n sf r o mp e n i c i l l i u m g r i s e o f u l v u mm y c e l i a a n dt h e nw eu s et e c h n i q u eo ft w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i sa n d m a s ss p e c t r o m e t r yt oc o m p a r a t i v e a n a l y z et h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fp r o t e i n sf r o m p g r i s e o f u l v u mf 2 0 8d u r i n gt h ec o u r s eo ff e r m e n t a t i o n c o m p a r i n gw i t hs a m p l ec u l t u r e da t7 2 h ， f i v es p e c i a lp r o t e i ns p o t si n c r e a s e di na b u n d a n c ew e r ec h o s e na m o n ga l ld i s c r e p a n c ys p o t sf r o m s a m p l ec u l t u r e da t1 9 2 hw h i c hw a s i na n t i b i o t i cp r o d u c t i o np h a s e ，t h e nt ob ea n a l y z e db ym s a n dm a s c o ts e a r c hp r o g r a m t h et w os p e c i a ls p o t sw e r es u c c e s s f u l l yi d e n t i f i e d ，t h ef 2 0 8 3s p o t i ss e r i n eh y d r o x y m e t h y lt r a n s f e r a s e ，a n dt h ef 2 0 8 4s p o ti ss a d e n o s y l m e t h i o n i n es y n t h e t a s e f i n a l l y ，f u n c t i o n so ft h et w op r o t e i n sw e r ea n a l y z e da tt h ec o u r s eo fb i o s y n t h e s i so fg r i s e o f u l v i n k e y w o r d sp e n i c i l l i u mg r i s e o f u l v u m ；g r i s e o f u l v i n ；p r o t e o m i c s , t w o - d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s ；m a s s s p e c t r u m ；1 8 sr d n a i i 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 灰黄霉素概述 1 1 1 灰黄霉素背景介绍 灰黄霉素( g r i s e o f u l v i n ，简称g r i ) 是一种抗真菌抗生素，是o x f o r d 等于1 9 3 9 年从青霉菌p e n i c i l l i u mg r i s e o f u l v u m 菌丝体中分离得到的一种含氯代谢产物。它也可 以从黑青霉菌p e n i c i l l i u mn i g r i c a n s 、展开青霉菌p u r t i c a e 、展青霉菌p e n i c i l l i u m p a t u l u m 、p e n i c i l l i u mv i r i d i c y c l o p i u m 、p e n i c i l l i u mb r u n n e o - s t o l o n i f e f u m 、p e n i c i l l i u m r a i s t r i c k i i 等菌丝体中分离得到。灰黄霉素对细菌、酵母菌或放线菌无效，对寄生性 浅部霉菌( 皮肤丝状菌) 作用最显著。临床上用于治疗由皮肤癣菌属引起的头癣、 叠瓦癣及头足甲癣等体表霉菌感染；农业上亦被用于抗植物真菌病害，如能抗真菌 a l t e m a r i a 对烟草的感染【1 捌。 1 1 2 灰黄霉素结构及理化性质 灰黄霉素是一种中性化合物，属于芳香族衍生物类抗生素，分子式为 c 1 7 h 1 7 0 6 c 1 ，分子量3 5 2 7 7 ，化学结构式如图1 - 1 所示【4 1 。 h 3 c o o 图1 - 1 灰黄霉素化学结构式 h g 1 - 1t h es t r u c t u r eo fg r i s e o f u l v i n 灰黄霉素外观呈白色粉末，无臭，味微苦。对热稳定，但在强酸或强碱溶液中 极不稳定。易溶于二甲基甲酰胺和含氯试剂，微溶于丙酮、无水乙醇等有机溶剂， 几乎不溶于水。熔点为2 1 8 - - 2 2 4 0 c 【引。 1 1 3 灰黄霉素的生物合成 随着灰黄霉素研究工作的开展，灰黄霉素生物合成的基本过程( 如图1 2 所示) 已得到共识。灰黄霉素产生菌在代谢过程中是通过7 个乙酸分子的生物合成途径合 成灰黄霉素。乙酸代谢、氯化作用及甲基化作用是灰黄霉素生物合成过程中必不可 少的三个关键性作用，三者相互呼应。r h o d e s 和b o o t h r o y d 等1 6 】研究了由乙酸合成 福建师范大学李晶硕士学位论文 灰黄霉素过程中苯酮的演化机制，指出氯离子通过氯化作用结合到g r i s e o p h e n o n ec 上而形成g r i s e o p h e n o n eb 。如果氯离子浓度过高时会减弱灰黄霉素产生菌的生长活 力，从而影响灰黄霉素的生物合成，但是如果氯化物缺少或完全不存在时，灰黄霉 素合成量亦会下降甚至不能合成，而形成抗真菌活力弱的去氯灰黄霉素。研究还指 出g f i s e o p h e n o n ec 分子上的4 ，2 一位碳原子上的两个甲氧基要通过甲基授体的 作用才能形成，在培养基中加入有关的甲基授体明显激活和加速了g r i s e o p h e n o n ec 的合成，反之当添加氨基喋呤等叶酸拮抗物时将抑制甲基化作用，灰黄霉素的合成 量明显下降。同时，从g r i s e o p h e n o n eb 转化为g r i s e o p h e n o n ea 的过程主要也是甲 基化作用。 目前，对灰黄霉素的生物合成途径还只有初步的了解，具体的合成网络及其相 关的酶系还未明了，有待进一步深入。 7 c h ，c o o h 。 掣吱一求o c v 0 弧c 托 中问产物 l 血弧 p?严 2 ，4 一三羟基一2 一二甲氯墓一一甲基苯酮 5 一氯一，一二羟基一2 ，2 一三甲氧基 一一甲基苯酮 珂髓。曲o 瞳a 5 - - 氯一2 - ，一三羟摹一4 z 一二甲氯基 一，一甲基苯酮 ；l k o p h eb 图1 - 2 灰黄霉素生物合成途径 f i g 1 - 2b i o s y n t h e s i so fg d s e o f u l v i n 1 2 灰黄霉素产生菌p e n i c i l l i u mg r i s e o f u l v u mf 2 0 8 背景介绍 灰黄青霉( p e n i c i l l i u mg r i s e o f u l v u m ) f 2 0 8 是国家级专家、福建师范大学工业微 生物教育部工程研究中心首席科学家吴松刚教授经过数年的艰苦努力，在野生型 一 i ；8 五 o 叫地 产 o 。 。、y ，rg 玲弧 第1 章绪论 p e n i c i l l i u mg r i s e o f u l v u m3 5 1 9 0 菌株的基础上经连续十八代复合诱变抗性育种1 7 1 ，筛 选出的高度耐前体氯离子灰黄霉素高产突变株。与出发菌株3 5 1 9 0 相比，突变菌株 1 7 2 0 8 改变了以乳糖、玉米浆为最佳碳、氮源的传统，以淀粉质原料为碳源时普遍比 以糖类为碳源时的发酵单位高，尤以大米粉为碳源时发酵单位最高，而添加玉米浆 对灰黄霉素生物合成不利1 8 】，故变株f 2 0 8 具有不用玉米浆为氮源、也不需另加其他 有机氮源的低氮发酵优良特征【9 j 。发酵中节粮增产效果显著，十分利于工业生产发 展。 除上所述，突变株f 2 0 8 在形态学上较出发菌株亦发生了显著的改变：孢子呈现 白色而不是绿色。但它们之间的遗传背景差异尚未被揭示。 1 3 蛋白质组学及其研究技术 1 3 1 蛋白质组学研究的历史背景 上世纪8 0 年代末9 0 年代初，美国生物学家提出并实施了人类基因组研究计划 ( h u m a ng e m o m ep r o j e c t ，h g p ) 。该研究是一项庞大且意义重大的科学工程，很快得 到科学家们和各国政府的重视。继而攻克基因组计划的工作在世界各国合作开展， 这也成为有史以来最大的一项国际科研合作项目。基因组研究工作自开展以来已取 得了举世瞩目的成就。2 0 0 1 年2 月1 5 日出版的n a t u r e 杂志1 1 0 】和2 月1 6 日出版的 s c i e n c e 杂志【1 1 】分别正式发表了人类基因组工作框架图( t h ed r a f tg e n o m e ) 。2 0 0 3 年 4 月1 4 日，美国联邦国家人类基因组研究项目负责人f r a n c i sc o l l i n s 博士在华盛 顿向全世界宣布：经过包括美、英、法、德、中、日等六国科学家1 3 年的共同努力， 耗资2 0 亿美元，终于绘制完成了人类基因组序列图。这是“人类基因组计划 进展 中一个划时代的里程碑。人们把它誉为2 0 世纪既“曼哈顿原子弹计划 和“阿波罗 登月计划之后的第3 大科技工程。此外，生物学家们还完成了多种微生物、昆虫、 啮齿类动物以及水稻、拟南芥和酵母等5 0 多种生物全基因组序列测定工作。如1 9 9 5 年首次破译了流感嗜血杆菌基因组，1 9 9 8 年年底完成第一个多细胞生物线虫基 因组d n a 全序列的测定工作。 基因组计划以空前的规模、惊人的速度不断发展推进，人们在为所取得的辉煌 成就欢呼振奋之时，新问题随之而来：基因组时代，通过测定的d n a 序列信息并 不能预测【1 2 1 5 1 ：( 1 ) 基因表达产物是否或何时被翻译；( 2 ) 基因产物的相应含量， 因为蛋白质和m r n a 之间的相关系数仅为o 4 0 5 ；( 3 ) 翻译后蛋白质的修饰程度； 福建师范人学李品硕十学位论文 ( 4 ) 基因剔除或过表达的影响；( 5 ) 遗留的小基因或 2 0 0k d ) 或过小( 7 ) p r o t e i n s y e a s t ，1 9 9 7 ，( 1 3 ) ：1 5 1 9 1 5 3 4 y o l k e nr m u l t i v a r i t ea n a l y s i so fr n al e v e l sf r o mp o s t m o r t e mh u m a nb r a i n sa sm e a s u r e db y t h r e ed i f f e r e n tm e t h o r d so fr t - p c r n e u r o s c im e t h o d s ，1 9 9 7 ，7 7 ( 1 ) ：8 3 w a s i n g e rv c ，c o r d w e l ls j ，c e r p ap o l j a ka p r o g r e s sw i t hg e n e p r o d u c tm a p p i n go ft h em o l l i c u t e s ： m y c o p l a s m ag e n i t a l i u m e l e c t r o p h o r e s i s ，1 9 9 5 ，( 1 6 ) ：1 0 9 4 1 0 9 7 冯作化医学分子生物学北京：人民卫生出版社，2 0 0 5 ：3 5 2 r o b e r tf c a nc e l e r ad oi ta g a i n 7 s c i e n c e ，2 0 0 0 ，2 8 7 ( 5 4 6 1 ) ：2 1 3 6 z h a n gx i d e n t i f i c a t i o no fp h o p h o r y l a t i o ns i t e si np r o t e i n ss e p e r a t e db yp o l y a c r y l a m i n d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s a n a lc h e m ，1 9 9 8 ，7 0 ( 1 0 ) ：2 0 5 0 c o r t e zd r e q u i r e m e n to fa t m d e p e n d e n tp h o s p h o r y l a t i o no fb r c a li nt h ed n a d a m a g er e s p o n s e t od o u b l e s t r a n db r e a k s s c i e n c e ，1 9 9 9 ，2 8 6 ( 5 4 4 2 ) ：1 1 6 2 n e u b a u e rg m a p p i n go fp h o s p h o r y l a t i o ns i t e so fg e l - i s o l a t e dp r o t e i n sb yn a n o e l e c t r o s p r a ym a s s s p e c t r o m e t r y a n a lc h e m ，1 9 9 9 ，7 1 ( 1 ) ：2 3 5 7 5 福建师范大学李晶硕= 学位论文 b e t t sj c i d e n t i f i c a t i o no fp h o s p h o r y l a t i o ns i t e so nn e u r o f i l a m e n tp r o t e i n sb yn a n o e l e c t r o s p r a y m a s ss p e c t r o m e t r y jb i o lc h e m ，1 9 9 7 ，2 7 2 ( 2 0 ) ：1 2 9 2 2 n u w a y s i rl e s im a s ss p e c t r o m e t r yo fp h o s p h o p e p t i d e si s o l a t e db yo n - l i n ei m m o b i l i z e dm e t a l a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ja m s o cm a s ss p e c t r o m ，1 9 9 3 ，( 4 ) ：6 6 2 p a n d e ya p r o t e o m i c s t os t u d yg e n e sa n dg e n o m e s n a t u r e ，2 0 0 0 ，4 0 5 ( 6 7 8 8 ) ：8 3 7 p a t t o nw f p r o t e o m e a n a l y s i s ，i i ：p r o t e i n s u b c e l l u l a r r e d i s t 曲u t i o n ：l i n k i n gp h y s i o l o g y t o g e n o m i c sv i at h ep r o t e o m ea n ds e p a r a t i o nt e c h n o l o g i e si n v o l v e d jc h r o m a t o g rbb i o m e ds c i a p p l ，1 9 9 9 ，7 2 2 ：2 0 3 g e r s t e i nm i n t e g r a t i n gi n t e r a c t o m e s s c i e n c e ，2 0 0 2 ，2 9 5 ：2 8 4 - 2 8 7 i t ot ，m u t as ，m u t as t o w a r dap r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o nm a po ft h eb u d d i n gy e a s t ：a c o m p r e h e n s i v es y s t e mt oe x a m i n et w oh y b r i di n t e r a c t i o n si na l lp o s s i b l ec o m b i n a t i o n sb e t w e e n t h ey e a s tp r o t e i n s p r o cn a i la c a ds c iu s a ，2 0 0 0 ，( 9 7 ) ：11 4 3 u e t zp ，g i o tl ， c a g n e yg ac o m p r e h e n s i v ea n a l y s i so fp r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n si n s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e n a t u r e ，2 0 0 0 ，4 0 3 ：6 2 3 夏其昌，曾嵘蛋白质化学与蛋白质组学北京：科学出版社，2 0 0 4 ：2 3 7 林向民大肠杆菌与嗜盐菌的外膜蛋白质组学研究【厦门大学硕士学位论文】2 0 0 5 ：3 陈姗蛋白质组学研究方法肾脏病与透析肾移植杂志，2 0 0 5 ，1 4 ( 1 ) ：5 2 5 8 f e ys j ，l a r s e np m 2 do rn o t2 d t w od i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s c u r to p i nc h e m b i o l ，2 0 0 1 ，5 ：2 6 m o l l o ym p t w od i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i so fm e m b r a n ep r o t e i n su s i n gi m m o b i l i z e dp h g r a d i e n t s a n a lb i o c h e m ，2 0 0 0 ，2 8 0 ：1 j o h nma r t h u r p r o t e o m i c s c u r to p i nn e p h r o lh y p e r t e n s ，2 0 0 3 ，1 2 ：4 2 3 c h a n gj ，r e m m e nh v ，w a r dw f e l e c t r o p h o r e s i sf o rs t a t i s t i c a la n a l y s i s ：m i s s i n gd a t a ， n o r m a l i z a t i o n ，a n ds t a t i s t i c s jp r o t e o m er e s ，2 0 0 4 ，3 - 1 2 1 0 k l e i ne ，k l e i nj b ，t h o n g b o o n k e r dv t w od i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ：af u n d a m e n t a lt o o l f o re x p r e s s i o np r o t e o m i c ss t u d i e s c o n t r i bn e p h r o l ，2 0 0 4 ，1 4 1 ：2 5 c u t i l l a sp ，b u r l i n g a m ea ，u n w i nr p r o t e o m i cs t r a t e g i e sa n dt h e i ra p p l i c a t i o ni ns t u d i e so fr e n a l f u n c t i o n n e w sp h y s i o ls c i ，2 0 0 4 ，1 9 ：1 1 4 d eh o o gc l ，m a n nm p r o t e o m i c s a n n ar e vg e n o r n i c sh u mg e n e t ，2 0 0 4 ，5 - 2 6 7 h o n o r eb ，o s t e r g a a r dm ，v o m mh f u n c t i o n a lg e n o m i c ss t u d i e db y p r o t e o m i c s b i o e s s a y s ，2 0 0 4 ，2 6 ：9 0 1 夏其昌，曾嵘蛋白质化学与蛋白质组学北京科学出版社：2 0 0 4 ：2 4 6 y a nj x ，w a i tr ，b e r k e l m a nt am o d i f i e ds i l v e rs t a i n i n gp r o t o c o lf o rb i s u a l i z a t i o no fp r o t e i n s c o m p a t i b l ew i t hm a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o na n de l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n - m a s s s p e c t r o m e t r y e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 0 ，2 1 ( 3 6 6 6 - - 3 6 7 2 ) c a n d i a n og ，b r u s c h i lm ，m u s a n t e ll b l u es i l v e r ：av e r ys e n s i t i v ec o l l o i d a lc o o m a s s i eg - 2 5 0 s t a i n i n gf o rp r o t e o m ea n a l y s i s e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 4 ，2 5 ：1 3 2 7 - 1 3 3 3 7 6 毖 乃 孔巧 弱 勰 凹孔勉 弱 弘 弘 勰剪 钉 铊 参考文献 c a s t e l l a n o s s e r r al ，h a r d ye d e t e c t i o no fb i o m o l e c u l e si ne l e c t r o p h o r e s i sg e l sw i t hs a l t so f i m i d a z o l ea n dz i n ci i ：ad e c a d eo fr e s e a r c h e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 1 ，2 2 ( 8 6 4 - - 8 7 3 ) k u s t e rb ，a n d e m e nj s ，a n d e m e nj s m a s ss p o c t r o m e t r ya l l o w sd i r e c ti d e n t i f i c a t i o no fp r o t e i n si n l a r g eg e n o m e s p r o t e o m i c s ，2 0 0 1 ，1 ：6 4 1 g y g is p m a s ss p e c t r o m e t r ya n dp r o t e o m i c s c u r to p i nb i o l ，2 0 0 0 ，4 ：4 8 9 y a t e sj r ，l i n ka j ，s c h i e l t zd m a s ss p e c t r o m e t r yf r o mg e n o m i c st op r o t e o m i c s t r e n d s g e n e t ，2 0 0 0 ，1 6 ：5 钱小红，贺福初蛋白质组学：理论与方法北京：出版社，2 0 0 3 ：1 - - 2 0 2 张鹭应用蛋白质组学技术对缢蛏血淋巴抗逆机制的研究【福建师范大学硕士学位论 文】2 0 0 3 ：6 1 8 m a n nm ，h e n d r i c k s o nr c ，p a n d e ya a n a l y s i so fp r o t e i n sa n dp r o t e o m e sb ym a s s s p e c t r o m e t r y a n n ur e vb i o c h e m ，2 0 0 1 ，7 0 ：4 3 7 k a t a y a m ah i m p r o v e m e n to fi n - g e ld i g e s t i o np r o t o c o lf o rp e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t i n gb y m a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m e - o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y r a p i dc o m m u n m a s ss p e c t r o m ，2 0 0 1 ，1 5 ( 1 6 ) ：1 4 1 6 - 1 4 2 1 万晶宏，贺福初蛋白质组技术的研究进展科学通报，1 9 9 9 ，4 4 ( 9 ) ：9 0 4 - - 9 1 1 k e o u g ht am e t h o df o rh i g h - s e n s i t i v i t yp e p t i d es e q u e n c i n gu s i n gp o s t s o u r c ed e c a y m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y p r o cn a t la c a ds c iu s a , 1 9 9 9 ，9 6 ： 7 1 3 1 7 1 3 6 g e v a e r ti c p r o t e i ni d e n t i f i c a t i o nm e t h o d si np r o t e o m i c s e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 0 ，2 1 ：1 1 4 5 - 11 5 4 a n t h o n yw t h eu s eo fp o s t s o u r c ed e c a yi nm a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o nm a s s s p e c t r o m e t r yt od e l i n e a t etc e l ld e t e r m i n a n t s ji m m u n o lm e t h o d s ，2 0 0 1 ，2 4 9 ：1 7 3 1 h a r r yj l ，w i l k i n sm r ，h e r b e r tb r p r o t e o m i c s ：c a p a c i t yv e r s u su t i l i t y e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 0 ，2 1 ： 1 0 7 1 周冰赕，