（生物医学工程专业论文）改性丝素蛋白纳米羟基磷灰石复合材料.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第1 i 页 著的影响，高p h 利于分散性好且纯度高的羟基磷灰石的形成，同时诱导了 丝素构象向b 折叠转变。 再生丝素蛋白十分脆弱易碎，不易加工成样品作力学性能检测，而加入 交联剂后，丝素蛋自力学性能得到明显改善，并且随着交联剂加入量的增加， 丝素的柔韧性也越好，但加入量过高，丝紊蛋白的拉伸强度会降低。 在纳米羟基磷灰石丝素蛋白复合材料中，加入交联剂p g d e 对丝素蛋 白进行改性，可以显著提高该复合材料的力学性能。力学测试数据显示加入 交联剂的复合材料拥有更高的抗压强度及弹性模量，这揭示了交联剂对内交 联的有效抑制作用，扫描电镜结果反映出加入交联剂的材料内部缺陷明显减 少，致密度提高，脆性德到了削弱。p g d e 的引入，改变了复合材料颗粒的 形貌，促进了针状纳米羟基磷灰石的形成，提高了复合材料中丝素蛋白的结 晶性，复合材料的韧性也得到了一定程度的改善。s b f 浸泡实验及细胞毒性 实验证明，交联剂p g d e 的引入并没有降低复合材料的生物相容性。因此 p g d e 交联改性瞻纳米羟基磷灰石丝素蛋自复合材料能较好的满足承载部 位骨填充的需求。 关键词：羟基磷灰石；丝索蛋白；交联剂；脆性；改性 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 i i 页 a b s t r a c t f i b r o i nf i b e r sf r o mw e l l - d e f i n e ds i l k w o r ms i l kw h i c hh a v eu n i q u e m e c h a n i c a lp r o p e r t i e sa n de x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i t yi nv i t r oa n di nv i v o ，h a v e b e e nu s e d 弱 b i o m e d i c a ls u t u r em a t e r i a lf o rc e n t u d e s 髓e n a n o h y d r o x y a p a t i t e s i l kf i b r o i n ( n h a s f ) c o m p o s i t ei ss u p p o s e dt ob ean o v d b i o m a t e r i a lt h a ti sf i tf o rh a r dt i s s u e se v e n 菸l o a d - b e a t i n gb o n ei m p l a n t s 。 h o w e v e r , t h er e g e n e r a t e df i b r o i nc o n t a i n sg e n e r a l l yl o t so fm o l e c u l ei n n e rl i n k s ， w h i c he x t r e m e l yd e c r e a s e st h et e n a c i t yo fs o l i ds i l kf i b r o i nm a t 翻a l s t h e r e f o r e , t h ec o m p o s i t en oh a ，s fw i t h o u ti n t e r f a c eb o n d i n gi sr e s t r i c t e do nm e c h a n i c a l p r o p e r t ya n dh a r dt om e e t t h er e q u i r e m e n to f l o a d b c 撕捌ga p p l i c a t i o n i no r d e rt oi m p r o v et h ew e a k n e s s ，t h er e s e a r c hi sc o n c e n t r a t e dt or e d u c et h e m o l e c u l ei n n e rl i n k si nr e g e n e r a t e df i b r o i na n dc o n s t r u c taw e bs t r u c t u r et og u i d e n - h af o r m a t i o ni nt h ec o m p o s i t e f i r s t l y , as e r i e so fc o m p o s i t e sw e r ep r e p a r e d u n d e rd i f f e r e n tr e a c t i o nc o n d i t i o n si no r d e rt os e a r c h o p t i m a l t e c h n i c a l p a r a m e t e r sf o rs y n t h e s i z i n go f 珏度终fc o m p o s i t e 。s e c o n d l y , ac r o s s l i n k i n ga g e n t n a m e dp o l y e t h y l e n eg l y c o ld i g l y c i d y le t h e r ( p g d e ) w a sa d o p t e dt oi m p r o v et h e i n t e r f a c eb e t w e e nn h aa n ds fi nt h ec o m p o s i t e 。b yt h ec o n n e c t i n gr e a c t i o n b e t w e e np g d ea n ds fm o l e c u l e s ，t h em o l e c u l ei n n e rl i n k sw e r ce x p e c t e dt ob e r e d u c e d f i n a l l y , t h em i c r o s t r u c t u r e ，p h a s ec o m p o s i t i o na n dc o n f o r m a t i o no f i n s i t e s y n t h e s i z e dc o m p o s i t e w e r cd e t e r m i n e d b y t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p e 脚，x r a yd i f f r a c t i o n ( x r d ) ，f o u r i e rt r a n s f o r mh 1 6 慧r e d ( f h r ) a n d s oo n n a n o h s fc o m p o s i t e sw i t ht h ep a r t i c l es i z eo f1 0 0 1 5 0 n mw e r ep r e p a r e d b ya n ns t uc o - p r e c i p i t a t i o nm e t h o d ，w i t hc a c l 2a n d ( n h 4 ) 2 h p 0 4 a sr e a c t i o n a g e n t sf o rh 八t h ex r dt e s ts h o w e dh ap h a s ew a ss u c c e s s f u l l ys y n t h e s i z e d w i t ht h ee x i s t e n c eo fs e 霸l rr e s u l t sv a l i d a t e d 氇a tt h er a n d o mc o i ls fh a s s t r o n gc h e m i c a li n t e r a c t i o n sw i t hh a i nt h ec o m p o s i t e s ，w h i l et h ep a r tw i t h o u t b o n d i n gw i 凌h a i se a s yt od i s s o l v ei nw a t e ra n dg e t sl o s t t h ep hv a l u ei nt h e 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 v 页 r e a c t i o nh a ds i g n i f i c a n te f f e c to nm o r p h o l o g i e s ，c o m p o n e n t sa n dc o n f o r m a t i o n s o fh a s ea th i g hp hv a l u e ，n a n o - h a s f c r y s t a l l i t e sf o r m e d i n h i g h l e n g t h d i a m e t e rr a t i oa n dt h er a n d o mc o i ls fe a s i l yc o n v e r tt o8s h e e ts t r u c t u r e , w h i l ea tl o wp hv a l u ea d d i t i o n a lp h a s et h a nh a m a ya p p e a r t h er e g e n e r a t e df i b r o i ni st o of r a n g i b l et ot e s tm e c h a n i c a lp r o p e r t y w i t ht h e a d o p t i n go fp g d e ，i t sf l e x i l i t yi so b v i o u s l yi m p r o v e d ，b u ts u p e r f l u o u sc o u p l i n g a g e n tw i l ld e c r e a s et h et e n s i l es t r e n g t h 。 p g d ew a si n t r o d u c e dt ot h eh a s fc o m p o s i t eb yi ns i t u c o - p r e c i p i t a t i o n m e t h o d , i no r d e rt oo b t a i nc r o s s - l i n k e ds t r u c t u r eb yr e a c t i n g 硒魄s fa n de n h a n c e t h ei n t e r f a c eb o n d i n gb e t w e e nn - h a p a r t i c l e sa n ds fm a t r i x t h ec o u p l i n ga g e n t c a ns t r e n g t h e nt h ed i r e c t i o n a lg r o w t ho fh ap a r t i c l e si nt h ec o m p o s i t ea n d d e c r e a s et h eb r i t t l e n e s so fs o l i ds ev a r i o u st e s t sh a v ep r o v e dt h a tp g d ec a n i m p r o v et h ec r y s t a l l i z a t i o n o fs fi nt h e c o m p o s i t e ，s i m u l t a n e o u s l y t h e m e c h a n i c a lp r o p e r t i e so fh a s fw a ss i g n i f i c a n t l ye n h a n c e db y1 0 0 t h e f r a c t u r es u r f a c eo fp g d ec o u p l e dc o m p o s i t et o o ko nt r a c e so f p l a s t i c d e f o r m a t i o n t h i sr e v e a l st h eb o n d sb e t w e e ns fm o l e c u l e sb yp g d ec a nr e d u c e t h ei n n e rm o l e c u l el i n k s ，w h i c hi st h em a i nc a u s eo fs f sb r i t t l e n e s s a n dt h e r e s u l t so fs b fs o a k i n ga n dc e l lc u l t u r ee x p e r i m e n t ss h o w e dp g d eh a v e n t d e c r e a s e dt h eb i o c o m p a t i b i l i t yo fc o m p o s i t e s ot h ec r o s s l i n k e dh a s fb y p g d ec a nm e e tt h er e q u i r e m e n to f l o a d - b e a r i n ga p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：h y d r o x y a p a t i t e ；s i l kf i b r o i n ；c r o s s l i n k i n ga g e n t ；b r i t t l e n e s s ；m o d i f y 西南交通大学曲南父逋大字 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使焉学位论文的规定，同意学校德 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 人授权西南交通大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 ，可以采慝影印、缩印或扫搓等复印手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属予 1 保密口，在年解密后适用本授权书； 2 。不保密d ，使震本授权书。 ( 请在以上方框内打“ ) 学位论文作者签名：豁亥多、 霉瓤妒聊尊褙0 指导老师签名； 匿期： 细妒一叩 西南交通大学学位论文创额性声明 本人郑重声鬻：所呈交的学位论文，是在导师指导。f 独立进行研究工作所得 成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 表或撰写遗的研究成果。对本文的研究徽毒贡献的个人和集体，均已在文中终 明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文的主要创薪点如下： 沙碌枣3 衽缯准自涪怠彳再觎识痧墓磷农弘为，焉，老孽3 中h 值碾狩吁掰鼢辅粉翻弛秽甲鲐影响，前对于秭“蔽 书。骺构蒋兰蒋；浑渺坼。 考参鼢论多却溽够鼬嘲啦瞎性， 黄翰量羚牡姆豫即哟脚 铷礞掺蜘镌彩 儆冢1 岛 喇译枷 篇一 渺鬈 驴勖弘 萝，届教磁砘黏 塞鬯唆哆 ，奎眵豫 0 1 务嗡 肌翱啦 缈娜如 匿南交通大学硕研究生学位论文第1 页 第1 章绪论 生物医鞠材料( b i o m e d i c a lm a t e r i a l s ) 又称生物材* q - ( b i o m a t e r i a l s ) ，它是对 生物体进行诊断、治疗和置换损坏的组织、器官或增进其功能的材料f l , 2 1 。生 物医髑材料是一种特殊的功能材料，是研制人王器窘及一些医疗器其的物质 基础，是一类与人类的生命和健康密切相关的新型材料。生物材料学是生命 科学和材料科学的交叉研究领域，是一门涉及生物材料的组成结构、性能与 制备相互关系和规律的科学，其主要目的是分析天然生物材料微组装、生物 功熊及形成机理，发展新型医用材料以用予人体组织器富修复与替代，发展 仿生高性能工程材料【3 1 。 生物医用材料的起步缀翠。公元前5 0 0 0 年就已经用人王牙植入鞠腔颁 骨来修复失牙。随着科技的进步，生物医用材料不断发展。2 0 世纪中后期， 高分予正业的迅猛发展推动了生物医用材料的发展。但是，一些临床应用的 生物医用材料起初并不是针对医用而设计的，如透析膜，最初是选用商品塑 料醋酸纤维素铡造；最初的d a c r o n 血管植入物原予纺织业等。此詹，逐渐 重视生物医用材料的设计与制备，使其本体特别是表面具有所需的物理、化 学和生物学特性，因丽扩大了应用领域。世纪6 0 年代初，聚甲基丙烯酸 甲酯野始应用于髓关节的修复。到了7 0 年代，出现了大量的医用新材料和 人工装置，如入王瓣膜、人工血管、人王肾用透橱膜、心脏起搏器以及骨生 长诱导因予等。到了8 0 年代，人类开始将生物技术应用于研制生物材料， 在材料结构及功能设计中弓| 入生物支架活性细胞，利用生物要素和功能去 构建所希望的材料，从此提出了组织工程的概念。当代生物材料已处于实现 重大突破的边缘，不远的将来，科学家有可麓借助予生物誊季料设计和制造整 个人体器官，生物医用材料和制品产业将发展成为2 l 世纪世界经济的一个 支柱产业1 1 , 矧。+ 西南交通大学硕士研究生学位论文。第2 页 1 1 纳米生物医用材料概况 纳米生物材料是指蔫于对生物材料进行诊断、治疗、修复或替换其病损 组织、器官或增进其功能的新型高技术纳米材料。纳米生物材料可以分为两 类：一种是适合予生物体内应用的纳米材料，它本身既可以是具有生物活性 的，也可以不具有生物活性，而仅仅易于被生物体接受，而不引起不良反应； 另一类是利用生物分子的特征燕发展的新型纳米毒季料，它们可能不霉被用于 生物体，而被用于其它纳米技术或微制造。纳米生物材料分为两个层次：纳 米微粒和纳米固体。纳米材料由于其结构的特殊性，因此表现出许多不同予 传统材料的物理、化学性能。 在医学领域孛，纳米材料已经得到成功的应用，最弓l 入注罄的是作为药 物载体，或制作人体生物医学材料，如人工肾脏、人工关节等。在纳米铁微 粒表面涂敷一层聚合物焉，可戳霾定蛋自质或酶，以控制生物反应。应用纳 米陶瓷微粒作载体的病毒诱导物取得成功。由于纳米微粒比血红细胞还小许 多，因此可以在盎液中自由运行，从而在疾病的诊断和治疗中发挥独特作用。 纳米材料科学是一门新兴的并正在迅速发展的科学，成为近些年来材料 科学研究的热点之一，被誉为搿2 l 世纪最有前途的材料黟1 5 翻。目前对“纳 米技术尚无精确的定义，般是指在纳米尺度范围内，人类按照自己的意 志直接操纵原子和分子或者原子翻和分子团，进行材料加工以及创制具有特 定功能的产品等。纳米材料是8 0 年代以来兴起的一个崭新的领域，它是指在 三维空间中材料至少有一维处于纳米尺度范围( 1 l o o n m ) 或由它们作为基 本单元构成的材料。纳米材料具有三个共同结构特点；( 1 ) 尺寸在纳米量级； ( 2 ) 有大量的界面或自由表面；( 3 ) 各纳米单元之闻存在着或强或弱的相 互作用。由于这些结构上的特殊性，所以纳米材料具有一些独特效应，如表 面效应和体积效应等。 在囊然晃，缀多生物现象发生在纳米水平。例如，核酸与蛋自质是维持 西南交通大学硕士研究生学位论文第3 页 和执行生命功能的重要成分，是最好的天然纳米生物材料同。这些成分相互作 用编织了一个复杂的、完美的生物世界。纳米生物材料研究，不仅涉及基因 与蛋白质的结构与功能，包括它们的识别、结合、相变、特殊因子的释放、 生物电化学信号的产生与传导、生物力学与热力学特性，而且还涉及新技术 工具的发展。总体来讲，纳米生物材料可分为4 类：( 1 ) 纳米无机材料；( 2 ) 纳米高分子材料；( 3 ) 纳米复合材料；( 4 ) 纳米仿生材料。躁前带有生物与 纳米特征的新材料研究与开发已取得很大进展。 纳米无枧材料 无机纳米材料包括无机纳米粒子、纳米陶瓷等。近年来一些学者在无机 纳米粒子针对正常细胞的生物相容性方面作了一些研究。“等嘲将肝细胞与 无机纳米微粒共同培养，发现肝细胞生长、增殖状况良好。c a o 等1 9 】引入无 机纳米粒子分离肝细胞，不但实现了快速分离，而且能得到高纯度的肝细胞。 生物陶瓷包括生物活性玻璃、羟基磷灰石、磷酸三钙等，并多与高分子材料 复合用予人工骨、人工关节和牙种植体等组织工程。传统的陶瓷材料存在许 多缺点，应用受到一定限制。纳米陶瓷的晶粒尺寸、晶界宽度、第二相分布、 气孔尺度、缺陷尺寸等都限于纳米量级水平，因而其强度、韧性和超塑性均 大大提高。更重要的是，纳米材料固有的表面效应增加了陶瓷材料的生物活 性和成骨诱导能力。h a r t 等【l o 】比较了纳米复合烤瓷与普通烤瓷一纯钛复合材 料两种常用修复材料的细胞毒性以及对细胞形态和功能的影响。结果表鳃， 纳米复合烤瓷材料同样具有良好的生物相容性，对细胞无毒性作用，而其机 械性能却明显优于普通烤瓷材料。 纳米高分子材料 一些高分子材料具有无毒、亲水、生物相容性和细胞亲和性好以及可降 解等优点，因而是组织工程中常用的材料。n a g a o k a 等1 1 1 l 采用表面擦痕技术 西南交通大学硕士研究生学位论文第4 页 对氟化聚酞亚胺材料表面进行处理，使其其有宽l o o n m 、凹凸相差2 - 3 n m 的 规则沟槽，与不易聚集生长的成纤维细胞组装成细胞一纳米界面材料，4 8 h 即观察到成纤维细胞聚集成直径8 0 - - - l o o u m 的球形聚集体，细胞分泌胶原的 功能显著增强。y o s h i m o t o 等1 1 2 1 应用静电纤维缠绕技术制备多孔聚已内酯支 架，聚合物纤维直径达纳米级，培养来自新生鼠骨髓的间充质干细胞，一周 时细胞即呈浸润生长，细胞基质大量出现，扫描电镜可见细胞聚集，基质矿 化形成，并出现i 型胶原蛋白的分泌。l i 等1 1 3 1 在高压电场下制成一种特定 的含有童径5 0 8 0 0 n m 的聚( 乙交酯丙交醒) 二元共聚物( p 撼a ) 超微纤维 的高度多孔支架，其力学性能良好，形态类似于活组织的细胞外基质，能显 著提高细胞的粘附性能和增殖能力，并能很好地保持细胞的形态并引导细胞 按纤维方向定向生长。 纳米复合材料 纳米复合材料可以模拟出与人体组织相似的细胞基质微环境，因而是生 物材料尤其是组织工程支架研究中应用最为广泛的材料f 1 4 l 。从材料学观点来 讲，生物体内多数组织均可视为由各种基质材料构成的复合材料，尤以无机 一有机纳米生物复合材料最为常见，如骨骼、牙齿等就是由羟基磷灰石纳米 晶体和有机高分子基质等构成的纳米生物复合材料。研究和开发无机一无 机、有机一无机、有机一有机以及生物活性非生物活性的纳米结构复合材 料用于细胞种植、生长，使种植的细胞保持活性和增殖能力，是目前组织工 程学研究的重点内容之一。k i k u c h i 。等1 1 5 】通过化学反应合成的羟基磷灰石 胶原复合纳米材料的机械强度为芷常嚣组织的1 4 。体内实验表明，该材料 通过破骨细胞样细胞的吞噬作用而降解，并可在材料附近诱导成骨细胞形成 薪韵骨组织。t a n 等i 1 6 1 将壳聚糖与胶原蛋鑫按不同比例混合，制各具有纳米 结构的复合材料，随着壳聚糖比例的增大，复合物支架的机械强度增加，孔 径尺寸增大，在此三维支架上生长的k 5 6 2 细胞功能得到显著的增强。 西南交通大学硕士研究生学位论文第s 页 纳米仿生材料 生物体的细胞终基质为复杂豹蛋自质和糖胺聚糖形成的物理与化学交 联网络，该基质不仅使细胞在空间结构形成特定的组织，而且还由此为其提 供和传导环境信号，引导细胞粘连，并形成组织之闻的间隔。运用仿生学原 理和纳米表面工程原理和工艺，将多肽、生长因子、基因等特定分子识别信 号固定在材料表蕊，对其进行分子设计和生物囊二处理，研制具有特定结构和 功能的仿生“智能基质材料就可以实现分子识别，并用于组织工程。制备 仿生材料的方法主要有分子自组装、模板法、光刻法以及等离子表瑟处理等 技术。 应用分子自组装技术，依靠分子闻菲共价键的键合作用制备出超分子纳 米材料，作为一种先进仿生材料正在受到组织工程学家们的密切关注。体内 许多纳米尺度的结构，如细胞貘均赉蛋自质、糖和d n a 分子组装两有序化。 在材料表面通过非共价键形成自组装膜，吸附分子存在时，局部形成的无序 单层可以自我再生，形成更完善的有序体系，置具有较大的流动性和可变形 性，赋予适宜细胞生长的材料表面拓扑结构【1 7 1 。h o r t g e r i n k 掣1 蚴】将一端 为亲水性r g d ，另一端禽磷酞纯氨基酸残基的嚣亲性多肽通过胡分导自组 装形成纳米纤维，作为模板指导羟基磷灰石结晶生长。这种纳米纤维与矿化 羟基磷次右形成的复合材料重现了细胞辨基质，羟基磷灰石晶体的c 晶轴与 纤维的长轴方向致，与天然骨骼中胶原纤维和羟基磷灰石晶体的排列方式 一致。这种特定的结构和所携带的分子识剐信号，不仅能通过特定的纲胞通 讯与信息传递系统对细胞的生物学行为进行精确的调控，而且使复合材料获 得了较离的强度。砸等1 2 1 l 在半胱氦酸改性的金膜表蕊鲁组装金胶纳米粒子， 结果培养肝细胞在1 2 h 内生长最为明显，肝细胞的合成功能增强，他们还发 现，纳米金胶表面固定肝细胞的麓力与纳米粒子的尺寸有关，尺寸越小露定 能力越强，原因可能为小尺寸粒子比表面积增大，表面能更高所致。z h a n g 等l 蠲发现，某些肽分子可以自组装成稳定的凝胶状，排列成亲水一疏水交替 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页 的纳米结构，可以促进多种哺乳动物细胞的增殖。k i s i d a y 等f 2 3 】据此制备出 成骨细胞k l d l 2 肽水凝胶复合的三维结构，肽分子自组装成规则的纳米纤 维，并形成网状结构维护着成骨细胞，提供了良好的肤细胞信号传递，稳定 细胞显型，促进富含蛋自多糖和i l 型胶原的软骨样细胞外基质产生，且与材 料硬度的增加相平衡。 模板技术是制备仿生材料的重要手段之一。模板印迹蛋白质纳米结构表 面不仅能提高细胞对材料的粘附能力，还能提高材料的生物相容性，同时通 过材料表面与细胞闻相互的生物作用，能刺激并诱发所期望的细胞响应，有 利于细胞的分化和增殖，在组织工程中有良好的应用前景。如何使合成材料 选择性地识别蛋白是材料表面特异化途径之一。有人以辉光放电等离子沉积 方式形成聚合物薄膜，将二糖与薄膜共价键合，构建多糖状空腔，它们可高 度选择性地识别许多模叛簧自，如自蛋自、免疫球蛋自、溶菌酶、核糖核酸 酶和链酶亲和素等。 1 2 纳米羟基磷灰石简介 l 。2 1 纳米羟基磷灰石的特性及应用 纳米羟基磷灰石粒予由于颗粒尺寸的细微化，比表面积急剧增加等特 点，丽具备了和普通羟基磷灰石粒子不同的理化性能。目前，对纳米羟基磷 灰石的应用研究，主要集中在以下几个方面，即硬组织修复材料、药物载体 及抗肿瘤活性等。 硬组织修复材料 人体骨磷灰石的结构长约4 0 6 0 n m ，宽约2 0 r i m ，其主要基本单元是针 状和柱状的磷灰石晶体，它们或定向螺旋排列，或相互缠结，构成多种织构。 不同的织构形成了骨在纳米尺寸上的功能单元，如柬状结构和团聚结构适于 承受高强度，丽卷趋和撬状交织结构具有很好的韧性，并有利于营养物质的 西南交通大学硕士研究生学位论文第7 页 传递。纳米h 高分子复合材料通过对天然硬组织的模仿，以期得到性能良 好的骨修复材料。 崔福斋等f 2 4 l 将采用仿生沉淀法制得的纳米h a 胶原骨修复材料植入新 西兰大耳白兔骨髓腔中后发现，植入体的界面层可发生溶解一沉积的动态快 速更新过程，巨噬细胞可在种植体表面或深入种植体内通过吞噬和细胞外降 解吸收种植体材料，季申植体表面及内部被吸收后伴随有新骨的沉积，种植体 与骨组织可形成化学键合。李玉宝等【2 5 , 2 6 l 通过共沉淀法、常压共溶法等获得 了高纳米h a 含量和分散均匀的纳米融v 聚酰胺复合材料，动物实验结果表 明，纳米h 聚酰胺6 6 复合材料具有良好的生物相容性和生物活性，且在 狗的软骨组织中发现有诱导软骨的特性，是一种较为理想的嚣修复材料。天 津市口腔医院曾对控制析出法制备的纳米尺寸h a 胶原复合骨材料进行修 复家兔颅颁蟊实验性穿逶型骨缺损研究，结果发现纳米级h a 结晶均匀沉积 于胶原蛋白上，便于被机体组织和细胞识别与利用f 2 7 1 。i t o h l 2 8 l 通过动物实验 研究了载有骨形态发生蛋自( r h b m p ) 2 的纳米h a 胶原复合材料的性麓， 结果表明，载有r h b m p 的h a 胶原复合材料具有较高的骨诱导性，加速骨 重塑过程，将其植入承重部位，熊够有效缩短骨整合时闻。 另外，针对金属及其合金骨移植材料植入人体盾易被体液腐蚀等相容性 差的缺点，人们试图采用纳米羟基磷灰石对其表明进行处理，以增加其生物 相容性。黄立业等【2 9 1 采用电化学沉积一水热合成法在钛金属的表面制备了纳 米针状羟基磷灰石涂层，发现经处理后材料在t y r o d e 生理盐水中有较好的化 学稳定性和抗溶解性。t u a n t u a nl i 等l 捌采用浸渍的方法在钛金属的表面涂上 一层羟基磷灰石纳米晶，作为猗股骨移植材料，实验结果表明，经过涂层的 材料与人体组织的结合强度比未经涂层的材料高出2 倍。 药物载体 a o k i 等1 3 1 】将羟基磷灰石纳米微晶用作药物载体，对其吸附和释放药物的 性能进行了细致的研究。体外动物细胞培养实验证明，粒子大小为4 0 n m 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 1 5 n mx 1 0 r i m 的纳米h a 溶液对阿霉素的最大吸附量为0 2 - l m g ；阿霉素和 阿霉素一h a 对癌细胞均有抑制作用，但阿霉素一h a 的抑制作用明显长于 阿霉素。加纳诚介等1 3 2 l 通过对h a 纳米微晶对各种替化抗生素类药物的吸附 和脱附性能的研究发现h a 纳米微晶具有较理想的药物吸附一脱附性能，可 有效地控制药物的释放速率，且对药效无明显影响。 i j n t e m ak 等1 3 3 1 采用共沉淀法将蛋白类药物b s a 包裹于纳米h a 晶粒中 获得了具有缓释功能的药物释放体系。体外缓释实验结果表明，药物的释放 速率由h a 的溶解过程控制。 抗肿瘤活性 a o k i 等l 蚓将纳米h a 微晶终为抗癌药物的载体，在进行体井细胞培养的 实验中发现，用作空白对照的h a 对c a 一9 癌细胞的增殖也有明显的抑制。 同时还发现，h a 对癌细胞增殖酶抑制效应需要一定的时阀才可以表现出来， 培养液的p h 值发生变化，大量纳米h a 进入细胞内部，引起细胞空胞变形， 导致细胞大量死亡。张士成等圜研究表明，h a 徽晶在一定的浓度( 最低l o - - 5 m o l l ) 和时间条件下，对h e l p - - 2 细胞、m g c 等细胞的生长、增殖均 有骧显的抑制作用。进一步研究发现，h a 徽晶对霉癌m g c - - 8 0 3 缨胞的微 管和微丝有明显的解聚和破坏作用；h a 微晶作用后，癌细胞的微结构发生 舞显变化。夏清华等湖研究也表暖，经h a 处理的w 一2 5 6 癌肉瘤细胞，其 形态和结构也发生了明显的变化。h a 微晶对w 一2 5 6 癌肉瘤细胞的d n a 含 量及细胞周期有定的影响，对g 1 期和s 期的细胞最具杀伤力，同时h a 微晶还可以阻止癌细胞的增殖分化，使g 2 期细胞积累，阻止g 2 一m 期的进 程。李世普等l 明发现5 0 n m 的h a 对入肺癌及胃癌细胞具有抑制作溺。魏凤 香等【3 8 1 研究发现粒径在1 0 0 n m 以下的h a 颗粒能够抑制宫颈癌h e l a 细胞的 分化和毒株的形成，并能诱导其死亡。 西南交通大学硕士研究生学位论文第9 页 1 2 2 纳米羟基磷灰石的制备方法 h a 的制备方法很多，大致可以分为以下三类：干法( 固相反应法) 、水 热法和湿法( 溶液反应法) 。 干法( 固相反应法 团l 目前通常采用的方法是c a 3 ( p 0 4 ) 2 或c a c 0 3 和啪0 9 在1 2 0 0 ( 2 的高温 下通入水蒸气，通过固相反应合成h a 。必须严格控制反应的温度，因为在 1 2 0 0 c 烧结温度下，反应的晶相为h a ；面在1 2 5 0 烧结温度下，晶相为 h a 和t c p 两种混合物。该法的优点是可以得到无晶格缺陷和结晶程度高的 h a 晶体。缺点是原料粉末需要长时闯混磨，易污染，反应速度慢，产物粒 径大，产物的活性较差。 水熟法1 雒- - 4 2 1 水热合成法是在一个密闭的压力容器中，用水溶液作为反应介质，通过 对反应容器加热，使得在通常条件下难溶或不溶的物质溶解并重结晶。将 c a ( n 0 3 h 与h t ；p 0 4 按钙磷比1 6 7 混合均匀，放入特制密闭的高压锅内，加 入蒸馏水。按一定加热速度升至不同温度，在指定温度下进行水热反应，从 而使 o h 加入晶格中生成h a 。待反应容器冷却至室温取出h a 晶体，用去 离子水反复清洗于净，在1 1 0 1 2 予燥郯可。 该法最大的优点是产物直接为晶态，无须烧结晶化，可以减少在烧结过 程中难以避免的团聚。粒度均匀、形态比较规剡：丽且改交反应条件可以得 到不同晶体结构和结晶形态的产物。随着水热合成温度的提高和时间的延 长，晶粒发育越完整、粒度越大。僚此法对设备要求很高，而且成本也很高。 湿法 湿法，是指将所需原料分散子溶剂中，混合进行反应，从而获得产物的 方法，包括酸碱反应法、沉淀法、水解法、溶胶一凝胶法及微乳液法等。 西南交通大学硕士研究生学位论文第l o 页 酸碱反应法 4 3 1 ：酸碱反应法是根据酸碱中和反应生成h a 。如用c a ( o h ) 2 与h 3 p 0 4 反应生成h a 。先将一定量c a ( o h ) 2 的粉体用水调成糊状，再加入 蒸馏水并加热至7 0 c 左右，搅拌，缓慢滴加h 3 p 0 4 调节p h 值，即可生成 h a 。此法操作篾单方便丽且最经济，不需要复杂的设备，比较适合工业化 生产。 ，沉淀法【4 4 1 ：一般采用c a 僻0 3 ) 2 和( n h 4 ) 2 h p 0 4 在p h 值一定的条件下在 常温或加热条件下进行滴定，反应生成羟基磷灰石。 水解法1 4 5 】：水解法和水热合成法原理相似。在水解法中，遵常c a h p 0 4 在7 0 左右和p i l 为8 5 的条件下使 o h 加入晶格生成h a 。 溶胶凝胶法降裙j ：其基本原理是将金属醇盐或无机盐水解，然恁馒溶 质聚合凝胶、干燥和焙烧。其技术方法是将c a 溶胶缓慢滴入p 0 3 一溶胶中， 体系中分别加入不同来量n h 4 h c 0 3 ，用氨水调节磷僮，生成的h a 凝胶经 2 4 h 陈化一洗涤忡干燥一焙烧。 该方法工艺过程简单，产物组成容易控制置无需大型设备，嚣此被广泛 应用于制备各种高纯和均匀的超细粉体。 微乳液法【4 9 l ：薪加坡逼立大学材料系i j m 采用微乳液法制备纳米h a ， 其技术方法是将c a ( o h ) 2 与( n h 4 ) 2 h p 0 4 分别制成微乳液，油相为环己醇，表 面活性剂为正己烷，将两种微乳液混合蓐放置一定的时闻，将沉淀物用无永 乙醇洗涤，可获得粒径为2 0 - - 一4 0 n m 的h a 粉体。 以上就是劁备纳米羟基磷灰石的三类方法。化学沉淀法制备羟基磷灰石 纳米粒子具有以下优点：( 1 ) 共沉淀化学反应过程温度较低，般为室温或 稍高温度；( 2 ) 制各材料颗粒较夺、均匀，各组分的亿学计量比容易控制； ( 3 ) 可以保证最终产品的纯度；( 4 ) 工艺简单，操作简便，对操作设备要 求不高。所良本实验采用化学沉淀法，结合复合材料翻备方法，加以改进， 以原位复合的方式制备纳米羟基磷灰石丝素蛋白复合材料。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 1 页 1 3 丝紊蛋白羟基磷灰石仿生骨 1 3 羔丝素蛋白的结构与组成 丝素( s i l kf i b r o i n ，简称s f ) 和丝胶( s i l ks e r i c i n ，简称s s ) 秀 种天然蛋白质构成蚕丝蛋白，蚕丝分子量为5 5 ，0 0 0 - - - 1 5 0 ，0 0 0 ，聚合度为 4 0 0 5 0 0 氨基酸单元。其中，丝素形成蚕丝长丝，约占蚕丝重量的7 潞8 溅， 是蚕丝的主要组成部分，它赋予蚕丝许多独特的物理化学性能i 删；丝胶为球 状蛋白，1 8 种氨基酸组成，含有的极性侧链的氨基酸毙侧较丝素离，约为 8 1 5 w t ，其中丝氨酸的含量约为3 2 w t 5 ，甘氨酸、丝氨酸及天门冬氦酸 的含量占氨基酸慧含量的6 0 m 0 1 以上s 2 - 5 7 1 。丝胶是5 - - 6 条多肽的混合体， 在分子量( 约4 0 0 4 0 0 k d a ) 、化学组成、结构性能等方面存在着很大差异【堋。 表卜l 蚕丝化学组成 丝索( s f ) ：是由甘氨酸( 4 2 8 ) 、丙氨酸( 3 2 4 ) 、丝氨酸( 1 4 7 ) 、 酪氨酸( 6 ，4 4 ) 等1 8 种氨基酸所组成，为纤维状蛋白，难溶予永，是种含 氮的高聚物，分子量约为3 5 0 k d a ，约占蚕丝重量的7 0 8 0 ，其中小侧基 的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸位于丝素蛋自的结晶区，约占总组成的8 5 m 0 1 ( 7 9 叭) ，且三者的摩尔比为3 ：2 ：1 ，而带有较大侧基的苯丙氨酸、酪氨 酸、色氨酸等则主要存在于非晶区，结晶度为4 。5 0 。结晶区与菲晶区交 替分布。每一个结晶区和非晶区都含有若干条肽链的链段，而每条肽链都通 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 2 页 过若干个结晶区和非晶区，各条肽链大体上是沿着纤维外形的延伸方向排列 的。这就是整个丝素中肽链排列的大致形象。丝素，具有1 9 亲水基侧键， 主要由重复的g i y a l a - g l 扩a l a s e r 多肽单元所组成。丝素存在多层结构， 表层无定形区的比例较高，里层结晶区的比例较高，且丝素纤维的表层分布 着相对较多的易予构成无规卷曲链的酪氨酸、苯丙氨酸等芳香环侧基的氨基 酸及其它大侧基氨基酸，中闻层到里层分布着相对较多的易于构成1 3 折叠链 的甘氨酸( 侧链- h ) 、丙氨酸( 侧链。c i 3 ) 、丝氨酸( 侧链c h 3 0 h ) 等小侧 基氨基酸。在医学上，丝素作为缝合线使用已有相当时间，另外，丝紊可被 当作许多种其它的生物材料应用，如药物缓释系统【5 察- 6 0 l 、人造肌腱韧带f 6 l 】、 人造皮肤1 6 2 】，以及细胞培养 6 3 - 6 6 1 等。 表l 屹蚕丝豢自主要氨基酸组成表( g l o o g ) 丝素蛋白的晶态结构和结晶度是决定其机械性能和生物医学应用的性 能的关键因素。一般认为丝素结晶送部分的分子链排毒主要有三种形式； ( 1 ) s i l k i ( 主要在非结晶区) ：水溶性，亚稳定性丝结构，立体构象 包括无规线团和氆一螺旋。在丝素的非晶区，肽链排列不整齐且疏松，并有 弯曲和缠结，在外力拉伸下可以变直、伸长，从而使蚕丝具有较好的断裂伸 长度：丽在除去外力后，又可以部分回复原状，故蚕丝又具有较好的弹性回 复蚓。 ( 2 ) s i l k i i ( 主要在结晶区) ：水不溶，呈反平行叠一折叠。肽链的链 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 3 页 段排列整齐，相邻肽链之间的氢键和分子间引力使它们结合得相当紧密，抵 抗外力拉伸的能力强，所以蚕丝的断裂强度大。 ( 3 ) s i l k i ：近年来发现的昼一折叠螺旋结晶。蚕吐丝成纤的过程中， 丝纤维构象由螺旋转变为折叠构象，故丝素中呈多折叠构象的s i l k i i 是丝 素的主要晶形，是丝素具有高弹性模量和高强度的主要因素。 垦蓠，透过人为控制条件可以控制丝素晶体结祷的形成，如通过改变温 度、溶剂极性、溶液p h 值和应力作用可使s i l k i 变为s i l ki i 。 丝素作为一种天然蛋自质材料它有四种结构层次，具体包括为：一级结 构( p r i m a r y ) 、二级结构( s e c o n d a r y ) 、三级结构( t e r t i a r y ) 和四级结构 ( q u a t e r n a r y ) 。 蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸 的线性序列，包括组成蛋白质的多肽链数目，多肽链的氨基酸顺序，_ 以及多 肽链内或链闻二硫键的数遐和位置。一级结构中包含的共价键主要指肽键和 二硫键。 在蛋自质中，多肽链折叠形成特殊的形状，即除一级结构外，蛋良质的 二、三、四级结构均属于空间结构。不同的晶体结构是由不同的蛋白质二级 结构所决定的，如丝素蛋自的二级结构主要包括构成s i l k 至晶型的8 一螺旋 和无规卷曲结构，及构成s i l ki i 晶型的反平行b 一折迭构象3 种类型。 由手参折叠结构，分子呈高度拉伸取向状态，具有笼g 一螺旋和无规卷 曲结构更高的弹性模量，这对于制锯高性能仿生复合材料，使其力学性能更 接近于囱然骨极为有利的，所以本实验采用的实验方法方法，使丝素再结晶 时尽量向机械性能更优的折叠结构转变，其蛋白具体二级结构示意图如下 所示： 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 4 页 n p 邓 g 锈剿n 图l 一3 丝素无规卷曲及其它二级结构示意图 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 5 页 1 3 2 丝素蛋白的生物学性能及应用 生物褶容性 作为一种生物性原料，蚕丝与胶原一样具有生物相容性，最早作为缝合 线应用于临床手术中。蚕丝本身及其体内降解产物均对组织无毒性、无致敏 和刺激作用。a l t 妣n 闷】指燃i 豳s 水平的升高是丝胶反应产生的，丝素蛋白杂 质是主要的免疫荆而不是丝素纤维本身。丝素蛋白对机体的生物应答可与其 它普遍应用的生物相容性