（作物学专业论文）基于PCR的水稻RGA标记开发和利用.pdf

硕士学位论文基于p c r 的水稻r g a 标记的开发和利用 肖天霞2 0 0 6 摘要 过去r g a ( r e s i s t a n tg e n ea n a l o g s ，r g a ) 主要是作为r f l p 标记的探针， r f l p 标记在检测上比较麻烦，因此现在已用的很少。从基因定位和标记辅助育 种的实际需要来看，特异p c r 标记具有更大的应用价值。为了开发基于特异p c r 引物的r g a 标记，汪旭升等( 2 0 0 5 ) 采用生物信息学的方法，利用己公布的籼 稻( 9 3 1 1 ) 和粳稻( 日本晴) 的全基因组序列，开发出了4 0 2 个候选的r g a 标 记。这些候选r g a 标记在e p c r 中都产生单一条带，且表现为共显性。为了检 验这些候选r g a 标记的可行性，我们从中随机挑选一些进行实验验证，对r g a 标记的多态性、通用性及其在籼粳亚种问的特异性进行了分析，以期为水稻抗病 分子标记辅助育种提供便利工具。通过实验验证，主要结果如下： ( 1 ) 将随机挑选合成的4 0 对r g a 引物在日本晴和9 3 1 1 的基因组d n a 中 进行扩增，3 l 对引物( 7 7 5 ) 能获得稳定清晰的目标条带并在两亲本间表现出 多态性，片段大小与e p c r 结果一致，这些引物可作为共显性标记；4 对引物 ( r g a 2 9 、r g a 3 5 、r g a 2 8 和r g a 3 3 ) 只在一个亲本扩增出目标带，故可 以作为显性标记；3 对引物( r g a 8 、r g a l 7 和r g a l 8 ) 虽然在9 3 一1 1 和日本 晴中扩增到清晰的条带，但没有多态性；2 对引物( r g a1 9 和r g a 2 5 ) 没有 扩增产物。总之，在测试的4 0 对引物中，有3 5 对引物可以扩增出多态性条带， 可以作为分子标记，成功率达到8 7 5 。 ( 2 ) r g a 标记具有较好的通用性。用获得的3 l 对共显性r g a 引物在2 4 个水稻品种的基因组d n a 中进行扩增，共检测出6 5 个清晰稳定条带，平均每 对引物检测到2 1 0 个条带。这3 1 对引物在2 4 个水稻品种中一次性扩增成功的 比例在7 5 1 0 0 之间，平均为9 4 7 9 。其中有1 9 对引物能在全部品种中都扩 增到目标片段，其它1 2 对引物在1 8 2 3 个品种中扩增到目标片段，说明这些引 物有很好的通用性。另外，有6 对引物在1 4 个品种中出现新带型，这可能是由 r 基因的演变造成的。在品种d i w a n i 和l e m o n t 中，分别检测到5 个和3 个杂合 位点，这可能和品种的纯度有关。2 5 对引物只检测到2 个条带，且片段大小与 9 3 1 1 或日本晴相同，引物有很好的保守性。说明r g a 的片段长度在水稻进化 中是比较保守的。 ( 3 ) r g a 标记具有较好的多态性。3 5 对r g a b 标记中，最大的p i c 值为 硕士学位论文基于p c r 的永稻r g a 稼记开发和剥用肖天霞2 0 0 6 o 。5 8 ( r g a l 4 ) ，竣小为o 1 6 ( r g a 4 0 ) ，平均为o ，4 6 ，表硝r g a 标记具有较高 的多态性。 ( 4 ) r g a 标记具有较好的区分制i 粳亚种的能力。根据在2 4 个品种都能成 功扩增麴1 9 对r g a 引物产生的片段长度多态性，对2 4 个蕊萃孛采用u p g m a 方 法迸毒亍稿叛经聚类。瑷襁钕系鼗o 4 7 分类，可默明显建将2 4 个晶静分成2 类。 第一类由1 4 个粳稻和2 个籼稻品种维成，第二类8 个釉稻品种组成，说明r g a 标记具有较好的鉴别水稻品种籼粳亚种的能力。 关键谭：隶稻；r g a 标记；p c r 硕= 卜学证论文基于p c r 魏永稻r g a 标记的开发和乖j 用海灭霞2 0 0 6 a b s t r a c t r e s i s t a n tg e n ea n a l o g s ( r g a ) i sa nu n p o p u l a rm a r k e rs y s t e md u r i n gt h ed e c a d e s d u et or g ai sap r o b eo f r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( r f l p ) w h i c h i sd i f f i c u l t yt od e e t e c t 。f r o mt h ea p p l i c a t i o nv i e wo fq u a n t i t a t i v et r a i tl o c i ( q t l ) m a dm a r k e ra s s i s t a n ts e l e c t i o n ( m a s ) ，t h es p e c i f i e dm a r k e r ( e g r g a ) i sm u c h m o r eu s e f u l i no r d e rt od e v e l o pt h es p e c i f i e dr g am a r k e rb a s e do np c & w a n ge ta l ( 2 0 0 5 ) h a v ed e v e l o p e d4 0 2c o d o m i n a n tr i c er g a c a n d i d a t em a r k e r sb a s e do nt h e w h o l eg e n o m i cs e q u e n c em e s s a g e so f j a p o n i c a ( n i p p o n b a r e ) a n di n d i c a ( 9 3 一1 1 ) u s i n gt h eb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d s a l lt h ec a n d i d a t er g am a r k e r se x h i b i t e do r l e s i n g l eb a n dm a dc o - d o m i n a n td e t e c t e db yt h ee l e c t r o n i cp c r ( e p c r ) w er a n d o m l y c h o s e4 0p r i m e rp a i r st oi n v e s t i g a t et h ef e a s i b i t i t yo ft h er g am a r k e r s ，s u c ha s p o l y m o r p h i s m , c o m a n o n a i i t ya n ds u b s p e c i e ss p e c i f i c i t y t h er e s u l t so f t h ee x p e r i m e n t a r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h e4 0p r i m e r sw e r es e l e c t e dr a n d o m l yt ot e s tb yp c ra n dt h er e s u l t s s h o w e dt h a t3 5p r i m e r se x h i b i t e dp o l y m o r p h i s m sb e t w e e n9 3 1 1a n dn i p p o n b a r e 3 1 m a r k e r s ( 7 7 5 嘞c o u l do b t a i nc l e a rb a n d s i nt w o p a r e n t s a n de x h i b i t e d p o l y m o r p h i s m s ，w h i c hw a sc o n s i s t e n t 谢掘t h ee - p c rr e s u l t s i h u s ，31m a r k e r sc o u l d b ec o n s i d e r e da sc o d o m i n a n tm a r k e r s h o w e v e lr g a 2 9 ，r g a 3 5 ，r g a 2 8a n d r g a 3 3w e r eu s e da sd o m i n a n tm a r k e r s 3p r i m e rp a i r s ( r g a 8 、r g a l 7a n dr g a l 8 ) h a dc l e a rb a n d si nt h et w op a r e n t sb u tw i t h o u tp o l y m o r p h i s m s i na d d i t i o n ，2p r i m e r s ( r g a1 9a n dr g a 2 5 ) f a i l e d t oo b t a i nt h eb a n d 。i nc o n c l u s i o n ，3 5 ( 8 7 。5 哟o ft h e4 0 m a r k e r sh a dp o l y m o r p h i s m sa n dw a sc o n s i d e r e da ss p e c i f i e dm a r k e r s ( 2 ) w ed e t e c t e d6 5c l e a rb a n d sw i t ha na v e r a g eo f2 1 0b a n d sf o re a c hm a r k e r w h e n31c o d o m i n a n tm a r k e r sw e r eu s e dt ot e s tc o m m o n a l i t yo n2 4r i c es u b s p e c i e s ， t h es u c c e s s f u l l ym n p l i c a t i o nr a t eo ft h e3lm a r k e r si n2 4r i c ev a r i e t i e sr a n g e df r o m 7 5 t o1 0 0 ，w i t ha na v e r a g e9 4 7 9 1 9m a r k e r sh a ds t a b l eb a n d si n2 4r i c e v a r i e t i e sm a d12m a k e r sc o u l do b t a i nb a n d sa m o n g18t o2 3v a r i e t i e s t h i sr e s u l t s h o w e dt h a tr g am a r k e r sh a dg o o dc o m m o n a l i t y i na d d i t i o n 6m a r k e r sp r e s e n t e d n e wb a n d sa m o n g1t o4v a r i e t i e sd u et ot h er g e n e sr e v o l u t i o n w ed e t e c t e d5a n d3 5 硕士学位论文基于p c r 的水稻r g a 标记妁开发和利用泻天霞2 0 0 6 h e t e r o z y g o u sl o c i i nd i w a n ia n dl e m o n t 、r e s p e c t i v e l y n 娃sm a yb ec a u s e db yt h e p u r i f i c a t i o no fd i w a n ia n dl e m o n t 2 5m a r k e r sw e r ed e t e c t e d2b a n d sa n dt h eb a n d s i z ea r ec o n s i s t e n tw i t ht h e9 3 11o rn i p p o n h a r e t i l i ss u g g e s t e dt h a tt h er g aw a s c o n s e r v e di nt h er i c ee v o l u t i o n ( 3 ) 强ep i cv a l u eo f t h e3 5m a r k e r sv a r i e do 。1 6 ( r g a 4 0 ) t oo ，5 8 ( r g a l 4 ) 硒谯 a l l a v e r a g e0 4 6 t h e r e f o r e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tr g am a r k e r sh a dh i 酶 p o l y m o r p h i s m s ( 4 ) w ea l s op e r f o r m e dc l u s t e ra n a l y s i sf o r2 4v a r i e t i e su s i n g19r g aa m p l i f i e d p c r p r o d u c t s w h e nt h es i m i l a r i t yc o e f f i c i e n tw a ss e t t i n ga to 。4 7 ，t h e2 4v a r i e t i e s w e r ec l e a r l yg r o u p e di n t ot w oc l a s s e s t h el a r g e rc t a d ei n c l u d e d1 4 j a p o n i c av a r i e t i e s a n d2i n d i c av a r i e t i e sa n dt h eo t h e rc l a d ec o m p o s e do f8i n d i c av a r i e t i e s t h er e s u r s i m p l i e dt h a tr g a m a r k e r sa r ec o n s e r v e di n j a p o n i c a , w h e r e a sr e l m i v eh i 吐v a r i a t i o n i ns u b s p e c i e s ，j a p o n w aa n di n d i c a , a n dd i s t i n g u i s h e dw e l lb e t w e e nt h es u b s p e c i e s ， k e y w o r d s ：r i c e , r g am a r k e r s ，p c r 赜学位论文基于p c r 的水稻r g a 标汜静开发和利用肖天霞2 0 0 6 前言 植物在生长发育过程中，经常受到各种病原物的侵袭，表现为抗病或感 瘸。植物致病是指由真茵、细茵、瘸瘴、类病毒等病原物通过机械擦伤、琵 虫分导或直接搔入寄主缨魏后通过多转手段使疆物产生浆不庭反应。这些瘸 原体可醣位于植物细胞内，也可以位于细胞外，包括细菌、病毒、真菌、卵 菌、甚至线虫和隐虫。根据基因对撼因假说，植物的抗病( r ) 基因与病原菌 无毒基因( a v r ) 相对应。 分子生物学援术静飞速发震及荬在稽物病理学中静广泛应羟i ，为植物抗 瘸基因静克隆奠定了基础。j o h a l 等( 1 9 9 2 ) 克隆出第一个缓物抗病基因，玉 米抗圆斑病基因h m l 以来，基于转鹰子标签法( t r a n s p o s o nt a g g i n g ) 和图 位克隆法( m a p b a s e dc l o n i n g ) 在拟南芥、番茄、水稻、玉米、烟草、亚麻、 ，j 、麦、大麦等l o 种撞物中已有4 0 多个植物r 基因得到克隆( d a n g le la l ， 2 0 0 1 ) 。r 基因是个庞大豹基因家族，瓢不同植物中克隧爨酶挠不同病原物的 4 0 多个r 基黼，在核苷酸水平上同源性很低，利用异源r 基因作探针克隆新 的r 基因较困难，但在氨基酸水平上却有多个保守区( h a n a m o n d - k o s a c ke t 以， 1 9 9 7 ；j o n e se t a l , ，2 0 0 1 ) 。这些保守区为新的r 基因的克隆提供了可髓的方法。根 攒已克隆的r 基因掰编码的蛋自矮鳐搦及其在细麓中豹经置，可将r 蘩溺 分为5 类，帮c 端存在富亮氨酸蓬复序列( l r r ) 类，n 端存在棱苷酸结 合位点( n b s ) 炎，亮氨酸拉链( l z ) 类，蛋白激酶( p k ) 类以及果蝇t o o l 蟹自和哺乳动物自细胞介素1 受体( t i r ) 类。蛋白产物具有相似的结构域， 缀据其蛋自质功能保守域设计笾著弓| 物，通过p c r 扩增可以分嵩出大量的抗瘸 纂囡类戗物( r g a ) 。用这静方法已经在大豆、马铃薯、小麦、大麦、瘩繇和蘩 茄等许多植物中得到r g a ( l e i s t e re t 以，1 9 9 6 ；c a t h e r i n ee ta 1 ，1 9 9 7 ；s e a he ta l ， 1 9 9 8 ；l e i s t e r , e ta l ，1 9 9 9 ；k o l m e r je ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 r g a 既可以作为种基于特异或筒并引物p c r 的d n a 标记，其本身又是 漤程的( 候选) r 蘩翻。从已妻。瑶蹬豹r g a 片段与已知r 罄因比较可以羲出， 有的r g a 与已知r 基因具有 蘸裔的楣似性或是r 基因家族中的成员；奄鲍 r g a 与已知r 基因连锁( a a r t se la 1 ，1 9 9 8 ；c h e ne t a l ，1 9 9 8 ) ；也有r g a 与 所有已知r 基因无关，r g a 与植物的r 基因有较大的区别。但r g a 在一”甓 疆士学位避文基于p c r 起承稻r g a 耘记髓开蓑和剩耀肖天陵2 0 0 6 程度上与植物的r 基因有一定的相关性。而且r g a 相对容易获得，所以研究 r g a 在基因组中的分布和演化，在一定程度上可以说明r 基因的情况。由于r 基因家族成员在基因组中具有成簇存在的特点，因此r g a 标记对r 基因的分离、 定位移克隆特列有用。剩用已知抗瘸基因的傈守序列设计孳l 物进行p c r 扩增， 可戳分离与已知抗病基因同源的d n a 序列。小麦挽时锈病基因l r l o 的分离是 首次成功的报j 童i ，l e i s t e r 等( 1 9 9 9 ) 利用该方法从水稻中获得了1 6 个n b s l r r 类抗病基因类似物，这些序列分布在水稻的9 条染色体上。m a g o 等( 1 9 9 9 ) 同 祥从水稻中获褥1 4 类n b s l r r 类抗瘸基因类似携，势将其作图翻5 个位点上。 杨勤惠等( 2 0 0 1 ) 裁用n b s l r r 类建基因保守序列设计雩| 物从云南承稻霄耱中 亲本云系2 号中扩增获得抗病基因娄似物。克隆测序后发现其中有9 类序列和已 克隆的x a l 、1 2 c - 2 、x a 2 1 、l r l o 、p t o 具有很高同源性，并且发现了个商抗稻 瘟病叛基因。 过去r g a 主要是终为r f l p 标记豹搽针，r f l p 标记在检测上冼较麻烦，翥 制备放射健探针和进行s o u t h e r n 转移及杂交，放射彝显影，因而费时、烦琐、 污染大、对环境和人体造成不良影响，因此现在己用的很少。目前主臻是将 r g a 作为非特异的p c r 标记来使用，利用简并引物筛选与抗病性有关的r g a 。 陈夕军等( 2 0 0 4 ) 采用r g a p c r 的方法发现了与水稻抗稻瘟癌基因p i 谚连锁 耱h s l 的分子标记。烂广海等( 2 0 0 4 ) 禳据水稻抗岛# 桔病x a 2 1 基因的蜜台 亮氨酸重复区域( l r r ) 和番茄抗细菌性斑点病( p s e u d o m o n a ls y r i n g a ep v t o m a t o ) 的p r o 基因编码蛋白质激酶的d n a 序列，设计2 对引物用于扩增抗水 稻白叶桔病黯辩中的抗病基因炎织物。经聚丙烯酰胺凝胶电泳昶聚类分析，结果 表明供试抗瘸黯静阀具有丰枣的r g a 多态经，藤同弓| 锈i | | | 定弱属予网一簇的 品种显示相似的抗性和抗谱。将得到的结果进行聚粪分析，测试的4 7 个抗自叶 枯病水稻品种聚类的结果与品种的实际抗性很相符。r g a 分析结果为水稻抗病 育种选择亲本和利用品种布局进彳j ：自叶桔病生态控制提供了依据。刘二二明等 ( 2 0 0 5 ) 疆6 对r g a 引物对2 1 个水稻品种进行聚黉分移子，结果发现了3 对引 物适宣用于水稻抗稻瘟病抗性基因遗传背景分桥，以上成功表明了r g a 法克隆 抗病基因类似物对于抗病育种的重要意义。 从基因定位和标记辅助育种的实际需要来看，特霹p c r 标记具有更大的应 砸士学位论文 基于p c r 的水稻r g a 标记的并发翻季l 瘸避天霞2 0 0 6 用价值。水稻籼、粳两个亚种的基因组草图已经完成，粳稻的1 号、4 号和1 0 号3 条染色体已经发布了精细图。在这个基础之上，汪旭升等( 2 0 0 5 ) 采用生物 信息学的方法，耀4 5 个己知功能的植物r 基因序列对粳稻全基因组序列进行搜 索，共我岛2 ，1 1 9 个畏基因同源枣掰或类织物( r g a ) 。然后将粳稻的r g a 与 籼稻的基因缀序列进行比较，共找到7 0 2 个两亚种闯等位的r g a ，并发现箕中 有6 7 1 个( 占9 5 6 ) r g a 的撼凶组序列( 包括编码区和非编码区) 在两亚种 问存在长度麓异( i n d e l ) ，这表明水稻r g a 在两皿种问存在很高的多态性。通 过在i n d e l 两襁设计亏l 窃共进行e p c r 验证，共开发踺4 0 2 个基于p c r 的、表 瑰为共显性静候选r g a 标记。候选标记在两亚耪闲的长度差异在1 - 7 4 2b 之间， 平均为1 0 3b p 。这些候选r g a 标记在e p c r 中都产生单一条带，且表现为共显 性。为了检骏这些候选r g a 标记的可行性，我们从中随机挑选一些进行实验验 证，对r g a 标记的多态性、通用性及其在越粳亚秘闽的特异性进行了分橱，以 黧为承稻抗瘸分予标记辅助育静提供便联工具。 9 嫒士学位论文基于p c r 豹承稻r g a 标记的开发和测掰崖天震2 0 0 6 1 文献综述 1 1 分予标记的发展 自然界的生物是多种多样的，由于所处的生态环境不嗣，表蝥巍会产生 差别，形成了生物分类学上的变种。为了更好地识别生物基因型，充分利用 生物种质资源( g e r m p l a s mr e s o u r c e s ) ，人们进行了系列遗传标记( g e n e t i c m a r k e r s ) 的研究。遗传标记的发展主要有形态标记、细胞学标记、生化标记 帮分子标记4 个阶段。僵尤以分予标记的发展最燕迅猛，也最为有效，怒蘸 三种标记艨无法比拟的。分子标记已成为分予生物学酌重要方面，醒麓它已 深入到人类疾病的诊断、刑侦的辅助手段、作物的遗传育种及物种的遗传多 样性分析等诸多生产价值较高的领域。分子标记不是凭空产生的，如果没有 形态标记、缨胞学标记和生化标记韵发震傲铺垫，瞧不可能产生功能如此强 大的分子标记。 遗传标记( g e n e t i cm a r k e r ) 是基因型的特殊的赫于识别的表现形式。十 九世纪中期，奥地利学者孟德尔用豌豆杂交试验，首先将形态标记作为遗传 标记。遗传标避具有较多的多态性，可以遗传和袭达，并且不影响羹要农艺 性豹表达，蠢耪家篦较容易接受。在檀物遗传商耪研究中可被秘羟j 的遗传标 记应具备以下几个条件：( 1 ) 多态往高；( 2 ) 袭现共显形；( 3 ) 对农艺 性状影响小；( 4 ) 经济方便，容易观察记载。遗传标记包括形态标记 ( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r ) 、细胞学标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r ) 、生化标记 ( b i o c h e m i c a lm a r k e r ) 和分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r ) 四静类型。 1 1 。l 形态标记 形态标记即植物的外部形态特征。可以分为质鬣性状遗传标记和数量性 状遗传标记。形态特征包括肉眼可见的外部特征。常见的形态标记如株离， 籽粒颜色、穗重、花鲍颜色、矮摹千、紫鞘、卷时等 也包摇色素、生理特 性、生殖特性、抗病宝性等有关的些特性等。影态标记简单鸯观、经济方 便，但其数鬣在多数植物中是很有限的，且多态性较差，表现易受环境影响， 突变对有刹的形态标记会产生不利的影响，并盥有一些标记与不良性状连 1 0 颐士学位诖文基于p c r 豹承稻r g a 耩记辩开发和耐用舀天霞2 0 0 6 锁。此外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长，形态 标记在作物遗传育种中的作用是有限的。 羹。1 2 细胞学标记 继胞学标记即橇物缨胞染色体的交异。霾藿着遗传学秽绷稳学兹发展，入 们将遗传现象和染色体结合起来。德围细胞学家s t r a s s b u r g e 于1 8 7 5 年首次 描述了细胞核内染色体( c h r o m o s o m e ) 的存在。1 9 0 3 年，s u t t o n 和b o r e r 把 遗传因子和染色体结合起来，形成细臆遗传这一学科。趣括染色体核型( 染 色体数目、结鞠、随俸有无、着丝粒位置等) 积带型( e 繁、n 带、r 带、 g 带等) 的变化。与形态标记相比，细胞学标记的优点怒能进行一些重要基 因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较 长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变 器滩班瑗缨憩学方法速行裣i 煲| | 。因此翔鞠蓠为止，真正瘟爆子 笮物遗健弯奉孛 磷究中的细胞学标记还缀少。 1 1 3 生化标记 生他标记主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是一种结构和理化性质 不同，恒健纯功熊样静酶类。等位酶楚一静特殊形式的嗣工酶。势褫方法 楚从擅穆组织的矮白糖提镑中通过电泳和组织化学染色法将酶的多秭形式 转变成肉眼可辩的酶谱带型。与形态标记、细胞学标 i ；j i 相比，生化标记具两 个方面的优点；一是表现近中性，对檎物经济性状一般没有大的不良影响： 二是直接反映了基嗣产物差异，受环境影响较小，在分橱遗传多襻性研究中 仍然具有较大的应雳潜力。但曩翦可馒爝的生位标记数爨还穗当有限，且霄 些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。 1 1 4 分子标记 长麓潋来，植物育种中选择都怒麓予檀株豹表塑性状遂行的，当性状的 遗传基础较为简零域繇表现加往基因遗传效应时，表型逡撵是有效的。比如 说水稻的许多重要农艺性状为数量性状，如产量等；或多藻因控制的质缀性 状，如抗性等；戚袭型难以准确鉴定的性状，如根系活力等。此时根据哀型 提供的对性状遗传潜力的度量是不确切的，因面选择是低效的。遗传育种家 颈士学位论文基子p c r 的水稻r g a 标记的开发和剥用 鸯天霞2 嬲略 们很早就提出了利用标记进行辅助选择以加速育种改良进程的设想。形态学 标记等常规遗传标记是最早用于植物育种辅助选择的标记，但由于它们数量 少、遗传稳定性嫠，且常常与不良性状连锁，因而利用受到很大限制。近专。 年来，分子生物学技术的发震兔檬物育耱提供了一种鏊予d n a 变舅魏掰型 遗传标记一d n a 分子标记，简称分子标记。与传统应爝酶常规遗传标记相比， 分子标记具有许多明显的优点，被广泛应用于现代作物遗传育种研究的各个 方面。大量蛆前无法进行的研究目前利用分子标记手段正蓬勃开展，并取得 丰硕的成果。尤其是当分子标记技术走出实验室与常规肖秘紧密结合舞，正 在为植物育穆技术带来一场薮斡变革。 分子标记指能反映生物个体或种群问基因组中某种差异特征的d n a 片 段，它直接反映基因组d n a 问的差异。与上述三种标记相比较，分子标记 具有许多明显的优越性。( 1 ) 直接以d n a 的形式表现，在生物体的各个组 织、各个发商除段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等蠲 题；( 2 ) 分予标记数量极多，遍布整个基因组，可捡测座位几乎无限；( 3 ) 多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；( 4 ) 表现为中性， 不影响目标性状的表达；( 5 ) 许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合 体秘杂合体。疆裁分子标记已广泛用予疆兹分子遗传强谱浆梅建，德戆遗传 多样性分褥与释覆鉴定，重要农芑性状基因定位与鞠位克隆，转基因德物褡 定和分子标记辅助育种选择等方两。 分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。第一类是以 分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段妖度多态牲( r e s t r i c t i o n f r a g m e ml e n g t hp o l y m o r p h i s m ，简称r f l p 标记) 、d n a 指纹技术( d n a f i n g e r p r i n t i n g ) 、原位杂交( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 等；第二类是以聚合酶链 式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，简称p c r 反应) 为核心的分子标记技 术，包括随机扩增多态性d n a 标记( r a n d o ma m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s m d n a ，麓舔r a p d 标记) 、筏肇序列重复标记( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，麓 称s s r 标记) 或简擎序列长度多态憔( s i m p l es e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s m ， 简称s s l p 标记) 、扩展片段长度多态性标记( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，简称a f l p 标记) 、序标位( s e q u e n c et a g g e ds i t e s ， 简称 硕士学位沦文蒜乎p c r 的水稻r g a 标记的昴发和树用肖天霞2 0 0 6 s t s 标记) 、序列特征化扩增区域( s e q u e n c ec h a r a c t e r e da m p l i f i e dr e g i o n ，简 称s c a r 标记) 等；第三黉是一些掰型静分子标记，如：单核萤酸多态性( s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ， 简称s n p 标记) 、表达序列标签( e x p r e s s e d s e q u e n c e st a g s ，简称e s t 标记) 等。以下将介绍其中最常期的一些分子标 记技术。 1 1 4 1r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 该投求出g r o d z i c k e r 等予1 9 7 4 年雹l 立。溅纂的改变和染色结构豹交他导 致生物个体或种群之问d n a 片段酶切位点的变化，用限铷性内切酶切割改 变的d n a ，则产生长缀、种类、数目不同的限制性片段，这些片段经聚丙烯 酰黢凝最电泳分离届，在凝胶上景瑷不嚣的带炊分布，具有蓉舞的d n a 片 段可通过s o u t h e r n 杂交检测出来。r f l p 标记的主要特点青：( 1 ) 遍布于 整个基因组，数量几乎是无限的；( 2 ) 限制性内切酶识别序列具有专一性， 结栗稳定、可靠；( 3 ) 有静属特异睦，在实舔应耀中受蓟黻剖。( 4 ) d n a 需要量大，检测技术繁杂，难以厢于大规模的育种实践中。( 5 ) 需制备放 射性探针和进行s o u t h e r n 转移及杂交，放射自强影，因而赞时、烦琐、污染 大、对环境稷人体造成不良影晌。 1 1 4 2r a p d ( r a n d o m a m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s md n a ) 由w i l lj a m s 和w e l s h 等于1 9 9 0 年创立。其基本原理与p c r 技术一致。 r a p d 标记技术就是弼个( 有露用两个) 醋税弓l 物( 一般8 1 0 个碱墓) 簿 定点地扩增基因组d n a ，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组 d n a 鸯h 纂在特定引物绪台区域发生d n a 片段撼入、缺失域躐基突变，就有 可能导致弓l 物结台使点的分布发生耧应的变化，导致p c r 产物增加、缺少或 发生分子龌变化。蓿p c r 产物增加或缺少，则产生r a p d 标记。r a p d 标 记的主要特点有： ( 1 ) 不需d n a 探针，设计弓| 掳也无须知道序列绩息，有 极大的丰鬻性，反应懿个基因缎的变化；( 2 ) 技术简便，不涉及分予杂交 和放射性自显影等技术，环境污染小；( 3 ) d n a 样品需要最少，引物价格 便宣，成本较低； ( 4 ) 标记行状为摄性，不能区分纯会体和杂合髂，易产 生非特昴憔条带。 颐士学位论文豢予p c r 的水稻r g a 标记的开发和利用肖天霞2 0 0 6 1 - 1 - 4 3a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 由z a b e a l l 秘v o s 予1 9 9 3 年发明。a f l p 标记是选择蠛扩增基因缘d n a 酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片 段的长度多态性，只不过这嵇多恣牲是以扩增片段的长度不同被检测出来。 该技术鳐台了r f l p 豹稳定性帮p c r 技术的简便离藏性，阏融又熊壳骚r f l p 带型少、信息量小以及r a p d 技术不稳定的缺点。 a f l p 标记的主要特点有： 1 ) 由于a f l p 分析可以袋翅豹限制性两甥 酶及选铎往碱基秘类、数目缀多，辑以该技术所产生的标涎数目是无隈磐瀚； ( 2 ) 熟型的a f l p 分析，每次反应产物的谱带在5 0 1 0 0 条之间，所以一次 分析可以嗣时检测到多个痤位，且多态性极搿；( 3 ) 表现共显性，莹典型 盂德尔式遗传；( 4 ) 分辩率高，络果可靠；( 5 ) 目前该接术受专嵇傈护， 用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。 1 i 4 s s r ( s s l p ) ( s i m p l es e q u e n c er e p e a to rs i m p l es e q u e n c e l e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 由m o o r e 等和s o l l o t t e r e r 予1 9 9 1 年创立。亦稔s t m s ( s e q u e n c et a g g e d m i c r o s a t e l l i t e ) 和s s r p ( s i m p l es e q u e n c er e p e a tp o l y m o r p h i s m ) ，逐霹称为 短串联熏复多态性( s h o r tt a n d e mr e p e a tp o l y m o r p h i s m ，简称s t r p ) 。s s r 却微卫鼹d n a ，是类由几个( 多为1 - 5 个) 碱基组成的蘩序( m o t i f ) 审联 重复丽成舱d n a 序瓤，其长度一般较短，广泛分布于綦融缝的不同位置， 如( c a ) 1 1 、( a t ) n 、( g g c ) n 等重复。不同遗传材料重复次数的可变 性，导致了s s r 长度豹高度变舅性，这一变舅性正是s s r 标记产生的基础。 微卫羼d n a 分布予黎个基因组的不同位置，健其两端序弼多是保守的荦拷 贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过p c r 技术将其 闽的核心微卫星d n a 序列扩增如裳，利用电泳分析技本敷可获得箕长度多 态性，即s s r 标记。 s s r 标记的主要特点有：( 1 ) 数量丰富，广泛分布于整个基因组；( 2 ) 具有较多弱等使性变异；( 3 ) 共是性标记，可鉴别出杂合予釉纯合子；( 4 ) 实验重复往菇，结果w 靠；( 5 ) 由于创建新的标记时需知道重复序列两端 的序列信息，因此其于| 二发有一定困难，费用也较高。 1 4 硕士学位论文基于p c r 鸽承稻r g a 标记鹃开发秘科瑚鹊天霞2 0 0 6 l 145m i n i s a t e l l i t ed n a 最早由j e f f e r y s 等和n a k a m u r a 等分别于1 9 8 5 和1 9 8 7 年提出，又称为 v n t r ( v a r i a b l e n u m b e ro f t a n d e mr e p e a t ) 。它是指基因组中一类1 0 6 0 个碱 墓，或到几露个碱基船重复廖列。其多态性由纛爱单位之阕的不平衡产生， 通过分子杂交检溅至l 。它的多态性较高，僵探针欢乏，实验罚期鞍长。 1 1 4 6s n p ( s i g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ) s n p 是同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核瞥酸的差 异。从分予角度来检验单个核营酸变异。随着计算规和d n a 芯片技术的发 展，研究蠹可以同时对成千上万个克隆进行溺序，扶焉褥出有意义的结论。 s n p 技术1 9 9 8 年建立，已经有2 0 0 0 个标记定位于人类染色体上，程植物上 也进行了开发研究。s n p 县有高信息量，高密廉的特点，将有更多的s n p 标记登录到数据库中。 分予标记的发展虽然只商二卡几年，但是已经被广泛应嗣于遗传图谱构 建、基因定位、变异后代的凝定和选择、杂交育种、回交育种、杂种优势分 析、绘制晶种、品系的遗传指纹图、对种质资源的遗传多样性进行分析及鉴 定。 l 。2 植物抗瘸基因及其作照魄理 植物在生长发育过程中，经常受至0 各种病原物的侵袭，表现为抗病或感 病。植物致病是指由真茵、细菌、病毒、类病毒筹病原物通过机械擦伤、昆 虫介导或赢按插入寄主细腻后通过多种手段使植物产生的不良反应。这些病 原体可戳位子植物绍胞内， 趣可以位于缅飚外，龟疆细菌、病毒、真蓠、努 菌、甚至线虫和昆虫。植物对瘸原菌的抗病性表现有几种不同的途径。一方 面是植物本身的某些结构障碍和化学成分具有抗瘸功能。比如说细胞壁的角 质、蜡质捡质、术质素及特殊的气孔结构等属于结构障碍，小分予抗瘸物质、 影璃病原藏缀憝透性的爨螽震鞠棱糖锌失活蛋白这些化学成分爨有赣病功 能。另一方藤，植物在受至餐染时抗病基因( r 基因) 表现出抗病的反应 ( d h a l o w a le ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 硕士学位论文 基于p c r 豹亦弼r g a 标记的开发和毒l 嬲肖天霞2 0 0 6 从二十世纪开始人类逐步认识了许多病原微生物。四十年代f l o r ( 1 9 5 6 ) 通过遗传分析，提出了基因对基因学说，从遗传上初步说明病原和寄主的相 互关系。六十年代，发现寄主对瘸驻的过敏反应，称为寄主的一种基本抗病 糖至反应。七十年代开始运用分予生耱兹概念和技术分辑凌愿的无毒移致瘸 基因，确定寄主的防卫基因。八十年代，主要研究出窿主系统抗病反应和水 杨酸有关。九十年代开始克隆寄主的抗病基因，主要是传导蛋白基因。现在 主要研究病原诱导下寄主多种防卫反应发生早期的信号传导机理。根据f l o r ( 1 9 7 1 ) 的“基因辩基因”假说，寄主髓穆静每一个抗性基因( r e s i s t a n c eg e n e ， r 基因) ，在瘸原菌中就存在橡应的无毒基因( a v i r u l e n c eg e n e ，口w 基因) ， 与a v f 基因相对应的是病原菌的毒能基因( v i r u l e n c eg e n e ，v i r 基因) 。病 原和寄主的关系有亲和及不亲和两种，其中亲和则寄主表现感病，反之则抗 病。而寄主的抗瘸机理又因为抗瘸鏊因和防卫基因的习；溺丽不同。 重3 抗病基嚣的结构与分类 分予生物学技术的飞速发殿及其在植物病理学中的广泛应用，为植物 抗病基因的克隆奠定了基础。j o h a l 等( 1 9 9 2 ) 克隆出第一个植物抗病基因 玉米挠国斑病基因h m l 以来，纂予转痤予标签法( t r a n s p o s o n t a g g i n g ) 和图 缎克隆法( a 垂a pm b a s e dc l o n i n g ) 在数南芥、番茄、承稻、玉