（生物医学工程专业论文）血液的Raman光谱和荧光光谱几种新现象研究.pdf

英文摘要 a b s t r a c t t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao fd i l u t e dm o l l s eb l o o d , m o u s er e dc e l l ss u s p e n d i n gh q u i d , r e dc e l lh e m o l y s a t e sa td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o ne x c i t e db yi n c o h e r e n tm o n o c h r o m a t i ct i g h t o f d i f f e r e n tw a v e l e n g t ha r e i n v e s t i g a t e de x p e r i m e n t a l l ya n dt h e o r e t i c a l l yi nt h i sp a p e r t h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r ao fm o u s cb l o o d a r e i n v e s t i g a t e db y m u l t i c h a n n e l f l u o r o l 0 9 3 ps p e c t r o f l u o r o m e t o r ar e m a r k a b l er e l a t i o n s h i pe x i s t e db e “嗍i n t e n s i t yo f s p e c t r ae x c i t e da t4 0 7n ma n dt h em o u s eb l o o ds o l u t i o na td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n e s p e c i a l l y 砒t h er a n g ef r o m4 3 0n mt o5 4 0n 虬as t r o n ga n ds e r i o u sv a r i a t i o nf l u o r e s c e n c e s p e c t r ac a nb e e no b s e r v e d i ti sc o n s i d e r e dt h a tt h er e l a t i o n s h i pi s r e s u l t e df r o m c o n c e n t r a t i o nq u e n c h i n ga n dt h ea b s o r p t i o no ft h eb l o o dc e l l si nt b e o r e d c a la n a l y s i s t h e f l u o r e s c e n c es p e c t r ao fd i l u t e db l o o d , m o u s er e dc e l l ss u s p e n d i n gl i q u i d , r e dc e l l h e m o l y s a t e so fb l o o ds a m p l ew i t hv a r i a t i o no fc o n c e n t r a t i o ne x c i t a t e db ym o n o c h r o m a t i c s o u r c eo fd i f f e r e n tw a v e l e n g t h t h es t l - u g t u r eo ff l u o r e s c e n c es p e c t r ai nt h i se x p e r i m e n t h a v eb e e na n a l y z e dt h e o r e t i c a l l y t h es p e c t r u mo b s e r v e da t4 7 3h i l li sar a m a ns p e c t r u m , w h i c hr a m a nc o n f i g u r a t i o ni sm o r ep r o m i n e n c ew h e nt h ed i l u t e db l o o dc o n c e n t r a t i o ni s l e s st h a n1 f l u o r e s c e n c ee m i s s i o no fc h a r a c t e r i s t i cp e a k so ff r e ep r o t o p o r p h y r i n , z i n c p r o t o p o r p h y r i n , f l u o r e s c e n th e m ed e g r a d a t i o np r o d u c ta n de r y t h r o c y t em e m b r a n ea t i d e n t i f i e da n ds i m u l t a n e o u s l yd e t e c t e di nm o u s er e dc e l lh e m o l y s a t e s , w h e ne x c i t a t i o n l i g h ti s4 8 8n m i th a sb e e no b s e r v e dt h a tt h e r ee x i s tr e d - s h i f t e di nz i n cp r o t o p o r p h y r i n c h a r a c t e r i s t i cs p c , c t l ao fd i l u t e db l o o da n d 扰db l o o dh e m o l y s a t e sw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n i n c r e a s ef r o ml t o1 0 t h ep h e n o m e n o nh a sb e e na n a l y z e da n de x p l a i n e dl a t e r i nt h i sp a p e rf l u o r e s c e n c es p e c l f f t l mo fb l o o ds a m p l ee x c i t a t e da t4 5 7l i r ax e n o n h g h t h a v eb e e nc o m p a r e dw i t ho t h e rs o u r c e ss u c h 鹤a r + l a s e r0 - - 4 5 7 9e m ) a n dl e dl i g h t 伽= 4 5 7r i m ) , t h e r ea r ed i f f e r e n c ea m o n gt h es p e c t r ab u u c t u r e s t h ee x p l a n a t i o nh a sb e e n g i v ee l e m e n t a r i l y t h er e s e a r c hi nt h i sp a p e rc a no f f e rl _ e f e r o n g et om e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o nb e t w e e n l i g h ta n db l o o d , t h eo p t i c a lb i o l o g i c a le f f e c ta n dc l i n i cd i a g n o s et e c h n o l o g yi nv i r t u eo f s p e c t r o s c o p y k e y w o r d s ：b l o o d , f l u o r e s c e n ts p e c t r a ，r e dc e n s ，r a m a ns p e c t r a 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使甩过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：盔查趋沙。占年6 月；。日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：力一。6 年月2 t 臼 硕士论文 血液的r a m 光谱和荧光光谱几种新现象研究 1 引言 1 1 血液的光谱学研究进展 光谱学和光谱4 4 一- - 垂 1 , 2 l 是通过物质( 原予、分子、团簇等) 对光的吸收与发射， 研究光与物质的相互作用，研究物质结构、物化特性和物理化学定律等。荧光光谱技 术属于光谱技术中的一种，通过研究组织和体液的荧光光谱就能够获得细胞的组成和 代谢信息，而且具有极高的光谱和时间分辨率、灵敏度以及无损、安全、实时等优点， 因而成为光生物医学研究领域的主要研究工具之一 光谱学方法也是研究光与血液相互作用过程的有效方法之一，当光照射到血液， 会发生散射、吸收和发射等现象。通过检测和分析血液的散射光谱、吸收光谱和发射 光谱，能够获得一些反映血液状态和内部物质构成情况的信息网，以及光子与血液相 互作用过程的有关信息。 。 血液的吸收光谱表示血液对于光的吸收随波长的变化情况，吸收曲线上各峰值的 位置和相对强度能够反映血液中生物分子的部分能级结构川；血液的荧光光谱则可以 部分地反映血液分子吸收光子能量以后所发生的能量转移情况。分析研究这些谱线的 结构，有助于进一步理解激光与血液的相互作用机理。 1 1 i 血液的散射光谱研究! 血液是一种强散射介质。当一束光作用于血液时会发生散射现象，如r a y l e i g h 散射、m i e 散射或t y n d a l l 散射和r a m a n 散射，其中r a y l e i g h 散射、m i e 散射或t y n d a l l 散射属弹性散射，散射光与入射光的频率相同；r a m a n 散射是非弹性碰撞，散射光的 频率相对入射光的频率有位移【5 1 。关于血液或血细胞的散射特性，国内外研究的已比 较多【6 7 j l ，这方面的理论相对比较成熟。根据血细胞的散射特性理论制成的血细胞计 数器【9 1 0 j 成功用于临床。 在血细胞的共振散射光谱研究方面，蒋治良等人【1 1 】利用u - 3 4 0 0 型紫外可见光 分光光度计获得了人的血液、红细胞、自细胞和血清的共振散射光谱，图1 1 所示。 由图可知全血和红细胞在波长为3 1 0 咖、4 7 0n m 、5 6 0n l n 、6 0 0m 处产生四个共振 散射蜂白细胞和血清在3 1 0n m 、4 7 0n m 处产二个共振散射峰；但共振散射峰强度 较弱。全血的共振散射谱图是由红细胞、白细胞、血清的共振散射光谱图组合而成， 相对吸收强度值( 1 r s ) 跟颗粒的大小和数量有关。其中在波长为4 7 0n m 处的共振峰 主要由红细胞贡献，而白细胞的贡献相对较小；在波长为5 6 0 衄和6 0 0n m 处的共振 峰可以认为是红细胞的特征峰血清对图1 1 各峰的贡献较小。 硕士论文血液的r a m a n 光谱和荧光光谱几种新现象研究 1 1 2 血液的吸收光谱研究 在生物组织中，主要的吸收光的生色团是水分子以及如蛋白质和色素的大分子。 在红外波段的吸收主要是由水分子引起的，而蛋白质和色素的主要吸收光谱在紫外和 可见光范围。 图1 1 各种血液成分的共振散射光谱 t 全血稀释4 0 0 倍； c 白细胞稀释5 0 0 倍： b 红细胞稀释5 0 0 倍 d 血清稀释1 0 0 倍 图1 2 中给出了全血( w h o l e b l o o d ) 和各种生物组织的主要成分的光学吸收曲线， 如大动脉( a o r t a ) ，表皮( e p i d e r m i s ) ，黑( 色) 素( m e l a n o s o m e ) 0 2 1 ，其中全血在紫 色光4 0 0 r i m 处吸收最强。 图1 2 全血及生物组织吸收光谱 图中取：红外；n 吸：近红外；c o e f f i c i e n t ：系数 2 硕士论文 血液的r a m a a 光谱和荧光光谱几种新现象研究 国内外的研究结果均表明全血的吸收光谱曲线与红细胞的吸收光谱曲线分布情 况基本上一致。陈祖林等人的实验( 1 9 9 4 ) 1 3 1 表明，在波长为2 4 0 8 0 0 n l n 范围内，全 血与红细胞均在波长为3 4 2 衄，4 1 6n m ，5 4 0m n 和5 7 8 姗处附近存在吸收峰，在波 长为4 1 6n m 附近的吸收最强，如图1 3 所示。只是红细胞在波长为2 7 8n l n 处未见吸 收峰( 如图1 3 中( 2 ) ) 。全血与红细胞的吸收光谱曲线( 图1 3 ) 又与b o u l n o i s ( 1 9 8 6 ) _ 毗n g 血 图1 3 全血和红细胞的吸收光谱 ( 1 ) 全血，( 2 ) 红细胞 给出的血红蛋白的吸收光谱曲线( 图 1 4 ) 很相似【1 4 】。由此可见，血液的吸 收光谱主要来源于血红蛋白的吸收。 根据gs t h o m a s 等人【1 5 1 对卟啉 环作的光谱分析，其特征吸收峰位于 波长为4 1 5 皿，5 4 0 衄，5 7 8 衄处 因为血液的主要成分是血红蛋白，其 主要化学结构为血卟啉环，因此也可 以认为血液吸收光谱中在这三个波 长附近的峰是由血红蛋白中的血卟 啉环所为。 s b b r o w n 【1 6 1 ( 1 9 8 0 ) 研究了血 红蛋白在波长为5 0 0 9 0 0n i n 所吸收 光谱，得到了图1 5 。其中，虚线是 氧合血红蛋白( h b 0 2 ) 的吸收光谱曲 m k l 蓦- , t h o m 0 图1 4 血液中的血红蛋白的吸收光谱 穰 砖 八 i 一 w _ 司目m 图1 5 血红蛋白在波长为5 0 0 9 0 0n m 波段的 吸收光谱 线；实线是脱氧血红蛋白o b ) 的吸收光谱曲线。在波长为5 4 0 - 5 8 0 蛳之间，两条曲 线都有比较强的吸收峰。当波长大于波长为6 0 0 皿附近，两条曲线都迅速下降，但 3 争l毒i卓。一0e2皇 _#-i-i _目置亩0e毋奇2宅 硕士论文血液的p b m a n 光谱和荧光光谱几种新现象研究 两条曲线的下降程度有所差别。i - i b 0 2 曲线约在波长为6 7 0l i r a 处下降到最低点；而 h b 曲线则在波长为7 2 0 a m 处才下降到最低点。 骆晓森【1 7 l 的研究结果表明，在生理温度下，与周围环境达到平衡的生物分子按能 量呈玻尔兹曼分布，即大多数生物分子都处于电子基态的最低振动能级，这些处于最 低振动能级的大多数分子对吸收曲线做出主要贡献；而处于较高振动能级的少数分子 则对吸收曲线的“斜坡”部分做出贡献。血液中，氧合血红蛋白与脱氧血红蛋白通常同 时存在，并且静脉中脱氧血红蛋白的含量显著高于动脉中脱氧血红蛋白的含量。波长 为6 0 0 6 7 0 l i r a 的红光波段正处于血红蛋白的一个吸收峰的“斜坡”区域( 图1 5 ) ，因 此，当波长为6 0 0 6 7 0n m 的红色激光照射到血液时，尽管其吸收率比较小，也会发 生引起电子跃迁的吸收过程。通过吸收的累积，也能够产生可观的生物刺激效应。 1 2 国外血液荧光光谱研究情况 国外临床上，红细胞原卟啉( 包括原卟啉和锌卟啉) 的检测过去常用于红细胞 疾病中：因为血红素合成的减少的疾病( 如缺铁) i s , t 9 、慢性疾病1 2 0 ) 、铅中毒口1 1 、 红细胞生成原卟啉症圈、球蛋白生成紊乱( 如地中海贫血综合症) 2 3 , 2 4 1 、h b c 和h b e 紊乱等疾病阱, 2 6 , 2 7 。以前曾报道的萃取过程方法各有不刚烈脚1 。 还有用近紫外光( 4 l o a m ) 激发自体荧光被用于检查口腔癌患者，有8 5 发现有 卟啉类荧光光谱网。研究卟啉的方法除了荧光法外还有人提出用液相色谱法同步对锌 卟啉和原卟啉定量口们。之后有人用液相色谱法，荧光光谱法和血液分光光度计三种方 法研究血液中锌卟啉浓度在正常人和暴露在铅环境工人的统计比例【3 1 1 。美国纽约爱因 斯坦大学c h e r tq 等人用荧光光谱法在红细胞溶血液中检测锌卟啉，原卟啉和 荧光的血红素降解产物，图1 6 给出的荧光光谱在改造基因时，可用作血红蛋白合成 与血红蛋白稳定性生物标志p 羽。 射o 硒，i ，的 6 + 1 0砌 囊蜮岫融獬曲嘲m 抽畸 图1 63 6 5 n m 激发h b e 基因改造鼠血溶血液荧光光谱 同时，也有怀疑荧光法检测血液的准确度的报道，s i e sc w 等人，对9 个 n o n - p r 5 9 w 突变病人的血浆进行荧光扫描，没有检测出潜在的多样卟啉症1 。 蚤薯_-萋毫蒜叠蔓o誊誊i口露 冉 ， 硕士论文 血液的r a m a n 光谱和荧光光谱几种新现象研究 1 3 国内研究状况 国内对于血液的荧光法研究主要用于检测不同病情下荧光光谱的变化，希望找到 一种既快速又准确的诊断方法。研究发现，激光诱发荧光光谱用于诊断结肠癌 3 4 1 有一 定临床价值。临床上用锌原卟啉来评价铁的营养状况口5 , 3 6 1 和辅助诊断铅中毒p 7 3 町。有 报道正常人及乙型肝炎患者血浆标本的荧光光谱存在显著差异 3 9 1 。采纳经验函数，能 够施行恶性肿瘤的临床筛查 4 0 l 。吴敏等人利用波长为4 8 8 0 r i m 的氩离子激光诱导血 清的自体荧光，发现肾病患者血清的荧光峰位虽然较健康人的有红移趋势，但符合率 不够高【4 1 1 。临床的血样采集方法大多采用穿刺取样法，这种方法虽然己经非常成熟。 然而，现代医学的发展使无刨诊断及治疗成为人们积极探索的目标国内于常青等人 通过比较皮肤和血液的激光诱导荧光光谱特征，探索用激光诱导荧光光谱技术在体表 进行无创血液成分分析的可行性 4 2 1 。孟继武等人对人体皮肤浅表组织内血液中的卟啉 进行无创荧光检测。对人耳垂皮肤浅表组织内血液进行了荧光分析，结果同p p 水 溶液的荧光谱一致咿j 。 伴随着弱激光照射疗法在我国多个城市用于临床，围绕激光波长的选择、功率大 小的要求及照射方式等问题，让我国许多从事物理光学、光化学、光生物学研究的学 者和医生们找到许多共同课题。临床上应用的h e - n e 激光和半导体激光波长范围在 6 3 0 n m 8 9 0 n m 之间，功率一般为几毫瓦到几十毫瓦。降雨强等人为研究弱激光照射 对人血液携氧能力的影响及机制，用荧光仪分别测量了h e - n e 激光照射前后正常血 液及其组分( 血浆、红细胞) 的荧光光谱，得出h e - n e 激光照射可影响血液的携氧能 力【“1 。陈荣等人研究表明在6 3 2 s i a mh e - n e 激光诱导下，不同血液在6 7 0 、7 3 0 和9 8 1 r i m 附近出现三个荧光峰。荧光强度在一定范围内与照射激光功率呈线性变化关系；随着 激光照射时间的增加，三个峰位上的荧光强度下降，8 m i n 后趋于稳定值【4 5 】。 光动力疗法( p h o t o d y n a m i et h e r a p y ，p d t ) 是一种国内外正在研究发展中的治疗恶 性肿瘤的新技术于常青等人利用血红蛋白在5 7 8n m 处有吸收峰以及在光动力疗法 治疗鲜红斑痣过程中病变区血液含量减少的特性，根据测得的含有光敏剂的皮肤层激 光诱导荧光光谱，计算了皮肤层光敏剂的荧光强度随时间的变化关系【4 6 j 。s t a d l e r 等 研究波长为6 6 0 衄激光照射对淋巴细胞增殖的影响，发现激光照射可促进淋巴细胞 增殖，而在此过程中，血红蛋白的作用是至关重要的【4 7 】。 由于生物的复杂性，至今仍然没有完备的理论可以解释光与生物的相互作用。我 们实验室几年来在血液的荧光光谱研究领域，针对各种激发光源初步讨论了光与生物 组织相互作用的物理机理。 5 硕士论文血液的r a m a n 光谱和荧光光谱几种新现象研究 一r l 嗽 _ - - - _ 唰 舶 烈f 螂 0 带 ，掌l 、n 4 拗、舷 - t a _ - _ _ 覆1 肌磐 5 ：k 茹播：签嚣。瓴 杉 l 蛾。耋：猁强孰_ 图1 74 0 7 n m l e d 诱导的不同浓度的全血溶液荧光光谱 高淑梅等人根据多种波长可见光诱导的小白鼠全血荧光光谱，如图1 7 【4 8 】所示， 进而对其产生机理和谱线特胜进行了研究，其结果对l l l i t 和l i f s t 中治疗光波长 的选择具有参考价值。对5 3 2 n m 激光激励血液中红细胞产生荧光的物理机理进行了 研究 4 9 1 。当使用波长为5 3 2 n m 的低强度半导体激光抽运n d ：y a g 倍频激光照射血 液中的红细胞时，激光将使红细胞上不对称的c c 键或c - n 键发生非谐振吸收而断 裂，形成未成对电子，由于该种电子的产生而形成的新的荧光团在后续激光的作用下 受激跃迁而产生荧光。波长为4 0 7 r i m 的光激发不同浓度离体红细胞可以产生较强的 荧光光谱，并从理论上对这种红移现象的产生机理进行了分析 5 0 l 。还用可见波段、不 同波长的舡+ 激光激发同一浓度红细胞溶液、血红蛋白溶液产生荧光光谱，认为主 要是血红蛋白中存在的卟啉类荧光团的贡献，显示了激光与普通光对生物大分子存在 明显不同的作用特性 5 t , 5 2 骆晓森等人的研究表明不同波长光与血液相互作用的过程有所不同，因而对血液 的生物效应也会有所差异 5 3 1 ；通过使用5 3 0 r i m 波长的光和h e - n e 激光6 3 2 8 r i m 诱发 血液的荧光光谱对比分析，认为相互作用的过程有所不同，因而对血液的生物效应也 会有所差异m j 。 彭长德等人用4 0 8 r i m 的l e d 诱导不同浓度人稀释血液的荧光光谱，提出了 5 5 6 n m 谱峰不是某一荧光团所产生的特征峰，而是由吸收所造成的假峰的观点；讨论 了激励光散射中心波长偏离激励光中心波长现象的原因，研究结果对光诱导生物组织 自体荧光诊断技术有一定参考价值 5 5 1 。 6 摹吾兽。芑_ 硕士论文 血液的r a m a n 光谱和荧光光谱几种新现象研究 2 荧光光谱的理论基础 2 1 光对生物组织作用 光对生物组织作用的主要形式有：生物组织对光的散射、吸收和辐射【5 6 5 7 1 。而生 物组织受光照后发生辐射的必要条件是存在能吸收这些光的分子。能吸收相应可见光 和紫外光的物质分子称为生色团( c h r o m o p h o r e ) ，其中有一些能发射荧光的就称其为 发光团或荧光团( f l u o r o p h o r e ) 。发光是激发态的一种外部表现，分子的能量状态与 分子的结构以及分子的运动形式有密切关系。研究分子激发态可以反映分子( 或大分 子) 的构象特点及变化，也可了解光对生物组织的作用过程及光产物的形成等等。在 光对生物组织的作用中，所有的过程都有感受光的生色团参与这些生色团往往是色 素与蛋白质的复合物。 2 2 光致发光的基本理论 2 2 1 光子能量与分子结构 2 2 1 1 光子能量与光化学过程 紫外光与可见光都是电磁辐射的一部分。从量子理论可知光辐射出的光子能量为 h v ( 单位为e v ) ，其中h 为普朗克常数，v 为光波频率。即波长较短的光波中光子能 量较大，波长较长的光波中光子能量较小。该波长的光子被生物组织吸收后将转变为 分子的振动能热能，所对应的生物效应主要是热效应。从可见光开始都可进行光化 学反应，但波长愈短其热效应愈小。 2 2 1 2 分子轨道与键能 一个化学键占有的分子轨道，是由这个分子中的原子占有的轨道重叠形成。当两 个原子轨道的重叠是沿着结合两个原子的原子核连线，它们的重叠所形成的就是a 键 ( 或叫叮轨道) ，a 键上的电子与分子结合得很紧密若是两个原子轨道的重叠是垂 直于沿着两个原子核之间的连线时，就是冗键。兀键相对。键是弱的相互作用。有 些分子会有一套兀轨道形成并覆盖在一系列的原子上，这种丌轨道就叫做非定域的兀 轨道，如共轭环状结构。 在分子轨道模型中，除了组成分子化学键的低能量分子轨道外，每一分子还与一 系列高能量分子轨道缔合，这些轨道在平常是未被占有的，叫做空轨道。当分子中的 电子获得足够能量时可提高到这些轨道，所以叫反键轨道，通常加表示，即o 与矿 等。 在共轭体系中，最高能量的。或丌轨道与矿之间的能级差是随共轭结构范围的 7 硕士论文血液的r a m a n 光谱和荧光光谱几种新现象研究 加大而减小的。因此可知，苯吸收的光波长在2 8 0n l n 附近，类葫萝i - 素吸收的光波 长在4 5 0n n l 附近，而一些卟啉化合物则吸收的光波长在6 0 0n n l 附近。 在生物学中，含有碳原子和杂原子的兀共轭体系的离域化具有特别重要的作用， 它往往是决定生物分子在能量传递、吸收与发射中的重要因素。实际上与活体的基本 机能有关的生物分子几乎都由兀共轭体系组成。如细胞中三种基本的结构成份核酸、 蛋白质和高能磷酸物都是共轭分子；核酸中嘌呤和嘧啶碱基都是共轭杂环；蛋白质的 2 0 种氨基酸残基中四种芳香氨基酸残基都是共轭体系，它们在传递能量方面具有重 要作用。蛋白质中的肽链也是一个具有兀共轭作用的片断。此外，细胞色素的血红素 辅基、卟啉、苯醌、类胡萝卜素、视黄醛、黑色素等等都是共轭体系可见生命的基 本表现和高度共轭体系之间存在有着密切的关系。 2 2 1 3 分子能级 一个分子的总能量等于其电子能级能量、振动能级能量和转动能级能量之和。后 三种能级对应的能量范围分别为：1 4 2 0c v ，0 0 5 ie v 和0 0 5 0 0 0 3 5e v 。由于转 动能级的能级及能级差很小，所以在考虑可见光和紫外光辐射时往往不需讨论转动能 级。分子和原子一样有其特征的分子能级图，因而也可产生具有特征的分子光谱。 每一分子的电子态都有一套振动能级，对于非线性分子，振动能级数是3 n - 6 ，其 中片是分子中的原子数。在生理温度下，多数分子与周围环境处于平衡状态，所以是 处于基态的最低振动能级。分子吸收光能后可处于电子和振动态的混合态，若跃迁达 到上一电子态中的许多振动能级，就形成宽谱带吸收光谱。在多数情况下，溶液中的 生物分子的吸收光谱是由没有多少“结构”的宽吸收带组成，这些无结构的吸收带是许 多重叠振动跃迁的包沿。 2 2 2 分子的激发态 分子吸收光能后可使其能量提高 的一种状态叫做激发态。分子能态与 分子的结构及分子的运动形式有密切 关系。研究分子激发态可以反映分子 ( 特别是大分子) 的构象特点及其变 化，也可了解光对生物损伤和失活的 详情及光生物的形成等。 表示分子的激发态可用势能曲 线，也可用能级，图2 i 给出了反映激 发态与激发态间进行能级跃迁而引起 一些光物理变化过程示意图。 图2 1 分子激发态的能级图及光物理过程 图中l 一5 是内转换过程。6 是一种系间交叉 8 硕士论文血液的r m n a n 光谱和荧光光谱几种新现象研究 图中以s 表示单线态，t 表示三重态，下脚0 表示基态；下脚l 与2 分别表示最 低激发态与较高激发态。波折线表示内转换，向上的直线表示了吸收过程，而向下的 直线代表了发光( 包括荧光与磷光) 过程，水平直线t l s o 则是系间交叉。 弛豫是从非平衡态向平衡态的转化当分子处于激发态，由于有较高能量不稳定， 就要将多余能量释放，转入较低激发态或基态，这个过程也是弛豫或叫激发态的衰变 过程。激发态的弛豫主要有两种：一是辐射弛豫，该过程会发光；二是非辐射弛豫， 过程中不发光，多余能量以热能形式释放。 1 非辐射弛豫 非辐射弛豫又有内转换与系间窜跃两种。当分子吸收光子后从基态跃迁到激发 态。若从基态的零振动能级跃迁到最低激发态的零振动能级，称之为o - 0 跃迁。而从 s o 激发到s l 的较高振动能级，就会发生弛豫振动，在1 0 d 4 - - 1 0 4 2 秒内将振动能量释放 到周围介质中而到达s l 的零振动能级，这种弛豫过程称为内转换。 无辐射衰变的另一途径是向三重态的跃迁，即系间窜跃( 交叉) 。这时高能粒子将 其激发能无辐射地传递给相邻分子，或是把激发能用于某一化学反应，很多生物反应 都涉及一种或多种这样的过程。当分子激发到单线激发态而发射出的是磷光时，必然 有系间窜跃存在 2 辐射弛豫 辐射弛豫包括荧光与磷光。已到达s l 的零振动能级的分子返回到基态的不同振 动能级过程中，如果将能量以向外辐射光子的形式释放，此辐射弛豫就叫荧光，常发 生在1 0 9 1 0 - 6 秒内。若分子从最低三重态向外发射一个光子并返回基态，该辐射弛 豫叫做磷光( 1 0 2 1 0 2 s ) 。 2 2 3 荧光光谱及其特点 任何发荧光的分子都具有两个特征光谱，荧光激发光谱( e x c i t a t i o ns p e c t r u m ) 和 荧光发射光谱( e m i s s i o ns p e c t r u m ) 。它们是荧光分析法进行定性和定量分析的基本参 数和依据 5 8 , 5 9 6 0 。 2 2 3 1 荧光激发光谱 固定合适的发射波长与狭缝宽度，改变激发光的波长，测量荧光强度的变化。以 激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光物质的激发光谱。激发 光谱是不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。激发光谱的形状 与测量时选择的发射波长无关，但其相对强度则与所选择的发射波长有关。发射波长 固定在其峰位时，所得激发光谱强度最大。荧光测定中，通常把激发光谱中最大的峰 值波长选用激发样品，因为这可避免较短波长由于光子能量较大，而使样品产生光分 解。 9 硕士论文 血液的r a m a n 光谱和荧光光谱几种新现象研究 2 2 3 2 荧光发射光谱 与激发光谱密切相关的是荧光光谱。保持激发光的波长和强度不变，然后扫描发 射波长，以荧光强度对照着荧光波长画成的曲线称为该物质的荧光光谱。即荧光光谱 是指某一激发波长引起物质发射不同波长荧光的相对强度。荧光光谱的形状与激发波 长的选择无关( 个别化合物例外) 。但当激发波长选在远离激发峰的地方，荧光强度 低。 2 2 3 3 荧光光谱特点 尽管几乎所有的物质都有吸收光谱，但不是所有的物质都发荧光。产生荧光必须 具备一定的条件：该物质分子必须与照射光有相同的本征频率，即能吸收激发光的光 子并从基态跃迁到激发态：该物质必须具有较高的荧光效率。照射光越强，被激发到 激发态的光子越多，产生的荧光越强，检测的灵敏度越高。 荧光光谱具有以下特点： 1 荧光发射光谱与激发波长无关，吸收谱可以有几个吸收带，荧光发射仅对应从 s l 的最低振动能级到s o 各振动能级的跃迁。 2 斯托克斯位移，因受激分子在上升和下降的过程中损失了一部分能量，所以荧 光的波长总比激发光的波长稍长即相对吸收光谱和激发光谱，荧光光谱总是出现在 更长的波长处激发峰位与荧光峰位间的波长差是一个表示分子发光特性的物理常 数，称为斯托克斯位移( s t o k e ss h i f d 。它表示分子回到基态前，在激发态寿命期间 能量的消耗。此位移常用2 1 式表示，单位是厘米d ( c m 1 ) 。 斯托克斯位移= 1 0 7 ( 士一士) ( 2 1 ) 式中：k 和a 。分别是校正后的最大激发波长和最大荧光波长，单位是纳米。 3 吸收光谱与发射光谱呈镜像对称关系。 当激发光只能将分子激发到第一激发态的各振动态时，吸收光谱的结构反映第一 激发态的各振动态的情况。当分子由该激发态向电子基态的各振动态跃迁发射荧光 时，荧光光谱结构反映它基态的各振动态跃迁概率。因此，镜像主要来源于基态中各 振动能级的分布与第一激发态的各振动态分布相类似和相互跃迁的几率也相近。 多原子分子特别是生物大分子具有很复杂的能级结构，能级的数目随分子中原子 数目的增加变得非常多，所以生物大分子的荧光光谱不再有线系的外观，因而这种镜 像关系也很难看到。 2 3 荧光光谱的主要参量 荧光分析能给出的信息与测量方式有关，可根据实验目的来选择。常用的基本参 数有： 1 0 硕士论文血液的r a m a n 光谱和荧光光谱几种新现象研究 2 3 1 荧光强度与荧光量子产额 荧光强度是荧光分析的最基本参量，指在一定仪器条件下，所测得的荧光强弱。 它和光源强弱( 功率) 、激发与发射波长及单色器的缝宽，样品及其浓度，探测器的 灵敏度等有关。因此实际测得的荧光强度只是一个相对量，作图时，可用任意单位表 示一般都用测得强度和标准样品在相同测量条件下，测得的强度之比来表示。 荧光量子产额( f l u o r e s e e n c eq u a n t u my i e l d ) 也称荧光效率或量子效率，它表示 物质发射荧光的本领，指发射光子数与吸收光子数的比值，是荧光测定的基本参数之 一在大分子构象的研究中尤为重要。若用代表荧光量子产额，则有 口：茎塾茎垄塑坌三墼：垄塾垄三鍪 。 激发态的分子数吸收光子数 ( 2 2 ) 式中：9 值与物质本身性质和溶剂有关，对于发强荧光分子，比如荧光素，其量 子产率在某些情况下将接近于1 ，而无明显荧光的化学物质其伊值则接近于零；同一 物质的伊还和激发波长有关，比如奎宁o 1 m o l l 硫酸溶液2 5 0 c 下，以3 1 3 眦光激 发时的p 值为l ，而以3 4 5 姗光激发时妒值为0 9 8 。此外，妒值还与温度有关，一般 温度高时，9 值下降，这种现象称为温度猝灭( t e m p e r a t u r eq u e n c h i n g ) 根据l a m b e r t - b e e r 定律，吸收前后的光强( 光子数) 为而与厶则 1 ：i , 1 0 一删 ( 2 3 ) 式中：s 为摩尔消光系数；c 为样品浓度；，为光程；删称为光密度。 被吸收光子数l 为 l = 厶一j ( 1 1 0 一韶) ( 2 4 ) 所以，荧光强度f ( 用光子数表示) 应为 f = 矾0 - 1 0 一“) ( 2 5 ) 荧光量子产额与荧光强度是两个不同的概念，9 指发光效率，是一个百分数，而 ，则是发光物质所发射的光子数。 当浓度小时，1 0 一韶l l 一2 3 a c l ，由上式可得 f = 2 3 舛。贸f( 2 6 ) 上式表示f 与c 成正比。但在浓度逐渐增大时，f 增长减慢，最后达到饱和值。 实际上，由于存在浓度猝灭现象，当浓度达到某一值再继续增大时，荧光强度反而降 低。因此用荧光强度测某物质浓度时，必须利用f 与c 成正比的浓度范围。 2 3 2 蜂位和谱带宽度 峰位指激发峰或发射峰的波长，常用符号k 表示。谱带宽度通常用“半宽”表示。 即峰的强度值一半时，其横坐标上的波长宽度。表示谱带宽度的方法还有多种，如用 光谱的有效面积除以峰值高度等。 硕士论文血液的r a m m 光谱和荧光光谱几种新现象研究 2 3 3 荧光寿命 荧光寿命o i f e 血l e ) 又叫荧光的期间，即处于激发态的时问。它也是荧光特性中 的一个重要参量。它不仅在荧光动力学的计算中很重要，而且还能提供其它许多信息， 如二聚体与激发络合物的形成，能量转移和分子内基团与基团距离的测定以及分子的 旋转扩散等。 荧光寿命的定义有很多种，最简单的定义是：当发光过程是符合指数衰减规律时， 去掉激发光后，分子荧光强度降到激发时最大荧光强度的1 e 所需要的时间，用t 表 示。分子从吸收光能到发射荧光之问有一定的时间间隔。同种分子这一时间不完全相 同，即一定时间内，将有一定百分数的激发分子发射光子这与放射性核素的衰变规 律相同。设初始荧光强度为i o ，则经过t 时间后的荧光强度，为 - t ，= 厶口“ ( 2 7 ) 即经过f 时间后，荧光强度降低为原来的i e 。f 值可用专门仪器测定，不同物质 的f 值不同，如人血清白蛋白( 水溶液) 为4 5n s ，色氨酸( 水溶液) 为2 6 n s 等。 事实说明，荧光很难由波长低于2 5 0n n l 的紫外辐射的吸收引起，因为此种辐射 的能量足以使激发态分子发生预离或离解。波长为2 0 0n m 的辐射相当于大约1 4 0 k c a l t 0 0 1 1 ，这一能量可使大多数分子中的某些键断裂。因此，由盯一仃跃迁所产生 的荧光很少看到。实验证明，7 专石跃迁发射荧光要比万- - 4 , 玎跃迁发射荧光更常见 这是由于石- - - h 万跃迁属于电子白旋允许的跃迁，具有较大的8 ，它一般比属于禁阻 跃迁的万一万跃迁的e 大1 0 0 - 1 0 0 0 倍；其次，万。_ 7 跃迁的寿命约1 0 - 7 1 0 - 9 ，比 ，r 哼r 跃迁的寿命1 0 5 1 0 - 7 要短，因此在与各种失活过程竞争，万- - 4 , 7 跃迁更有 利；此外，在石- h 石跃迁过程中，因s 1 与t 1 能级差较大，通过系间窜跃至三重态 的速率常数也较小，这有利于荧光的发射。 2 4 分子结构与荧光的关系 2 4 1 共轭效应 含有低能的石一石跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。大多数未取 代芳香烃类在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程度的增加，荧光峰红移、量子效 率增大。含大的共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能发光，但数目比芳香 化合物要少的多 绝大多数荧光团含有芳香环或杂环。细胞色素的血红素辅基、卟啉、类胡萝卜素、 黑色素等等都是共轭体系。 2 , 4 2 取代基作用 如苯环上有取代时可使最大吸收波长发生位移并使荧光峰也发生相应的改变，此 1 2 硕士论文 血液的r a m a n 光谱和荧光光谱几种新现象研究 外，也影响荧光效率。芳环上有羧基、羰基或亚硝基等吸电子取代基时常常会妨碍荧 光的发生而给电子取代基一o h 、一n h 2 、一c n 、- - o c h 3 会使荧光强度增加。 2 4 3 平面刚性结构效应 有刚性结构的分子容易发荧光。平面构型或分子刚性增加，荧光增强。这是因为 刚性和共平面性增加，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，即使外转移 能量损失减少，从而有利于荧光的发射此外，当荧光物质被吸附在固体表面上时， 常常也使荧光增强。 2 5 影响荧光光谱峰值位置k 。的因素 荧光分析的主要特点是灵敏度高，但因此也容易受到各种因素的干扰，如样品的 浓度、温度、p h 值以及样品中杂质等。为了得到可靠的结果，实验设计和操作中需 要考虑设法减少这些因素的影响。 2 5 1 环境极性 环境( 如溶剂) 的极性是一个对磊。有重要影响的因素。同一种荧光团在不同极 性的环境中，其无。可能会有所差别一般来说，激发态的极性比基态要强，因此被 激发的荧光团将趋向于与极性溶剂相互作用，使溶剂分子的电子分布会发生变化，偶 极子重新取向，而这又会反过来影响荧光团的基态和激发态能级，减少激发态的能量， 引起发射谱的红移。 2 5 2 溶液的p h 值 如果荧光团为弱酸或弱碱，则溶液p h 值的改变常对厶。有影响。这是因为弱酸和 弱碱分子和其离子在电子结构上有所不同， “ 因而荧光k 也会发生变化。而溶液粘度增 加也可能使丑。产生蓝移。 2 5 3 能量转移 分子之间的能量转移有几种形式： ( 1 ) 当一个激发分子与另一基态分子 发生碰撞时，前者可将能量转移给后者，叫 碰撞能量转移，通常将会引起荧光的猝灭。 ( 2 ) 激发分子将其激发能以辐射形式 释放，本身回到基态，另一分子则吸收此辐 ； i i t i 吨 i i ! w i 或非辐射 ：， f t：t 审 图2 2 荧光团能量转移跃迁示意图 实箭头线表示吸收；虚箭头线表示辐射 硕士论文血液的r a m a n 光谱和荧光光谱几种新现象研究 射光子处于激发，该过程叫重吸收。假如另一分子与激发分子是同一种，则此过程叫 自吸收由于这一过程是一个分子释放光子，另一个分子再吸收，所以此过程又叫一 种辐射能量转移。此时可能引起荧光猝灭，也可能有新的荧光产生。如图2 2 所示， 供体( 荧光团) s 受激发射的光子被受体( 荧光团) a 重吸收，a 又发射荧光光子 ( 3 ) 当两个分子具有相同的激发能量变化( 或受体比供体激发能级稍低一些) ， 且达到一定的距离时，通过两个分子在空间产生的电磁相互作用，供体分子s 可将其 激发能转移给受体分子a ，这就是非辐射共振能量转移。这种能量转移方式相当于两 个偶联的电偶极子的振动，当两个电偶极子的振动频率相同时，相互间就发生共振作 用，从而转移了能量，所以又叫共振能量转移【6 l 】。共振能量转移的分子跃迁也可用图 2 2 表示，供体与受体间激发能级有一小的中不包含光子的发射与再吸收，所以有别 于重吸收，此时两分子很靠近但又不碰撞，所以有别于碰撞转移。 ， 共振能量转移需要有三个条件：一是能量供体与能量受体分子间的距离要在5 1 0n l n 之间；二是供体的荧光光谱必须与受体的吸收光谱要有重叠，重叠愈大转移效 率