（果树学专业论文）软件辅助柑橘染色体的核型与带型分析.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使秽 学位论文 一7 年月伪 是否保密 如需保密，解密时间 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：刁j 噜 时间：2 叼年舌月脂日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 撇黼鲐哺译 摊名：妞汀 签名日期：2 蝴7 年6 月僧日签名日期：芦石月莎日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 目录 摘要l a b s t r a c t 3 缩略词表5 第一章文献综述6 1 分子细胞遗传学研究进展。6 1 1 常规核型7 1 2 显带技术。7 1 3 面积核型8 1 4 光谱核型8 1 5 原位杂交技术。8 1 5 1 基因组原位杂交9 1 5 2d n a 纤维荧光原位杂交( f i b r e f i s h ) 9 1 5 3 三维荧光原位杂交( 3 d f i s h ) 9 1 6 染色体微切割与微克隆。9 2 远缘杂种及其后代的染色体行为1 0 2 1 染色体消除10 2 2 染色体加倍1 l 2 3 染色体区域分布1 l 2 4 染色体组分开1 l 3 柑橘染色体研究进展1 2 3 1 染色体核型与数目1 2 3 2 染色体带型1 2 3 3 荧光原位杂交1 2 3 4 染色体切割1 3 4 本研究的目的和内容1 3 第二章不同种属柑橘细胞染色体的核型与带型分析1 4 1 材料与方法1 4 1 1 材料1 4 1 2 试剂与设备1 4 1 3 方法15 1 3 1 材料准备与染色体制备1 5 1 3 2 荧光染色及观察照相。1 5 1 3 3 图像分析1 5 2 结果与分析1 6 2 1 染色体数目。l6 2 2 染色体核型17 2 2 1 四季橘染色体核型1 7 2 2 2h b 柚染色体核型1 8 2 2 3 红橘染色体核型。1 9 2 2 4 金柑染色体核型2 0 2 2 5 枳壳染色体核型2 l 2 3 染色体2 d 立体观察2 2 2 4 染色体d a p i 荧光图2 4 2 4 1 四季橘染色体带型2 4 2 4 2h b 柚染色体带型2 6 2 4 3 红橘染色体带型2 8 2 4 4 金柑染色体带型3 0 4 5 枳壳染色体带型3 2 3 讨论3 4 3 1 染色体计数意义3 4 3 2 四季橘、金柑、h b 柚、红橘和枳壳的核型进化关系3 4 3 3 生物学软件在细胞遗传学中的应用3 5 3 4 显带机理3 6 3 5 显带技术的应用3 6 3 6 柑橘染色体荧光显带技术与分子细胞遗传学识别3 7 参考文献3 8 致 射4 3 软件辅助柑橘染色体的 摘要 柑橘是世界重要的果树之一。其资源丰富，品种繁多。染色体的核型与带型分 析是一种能有效鉴定柑橘品种的分子细胞遗传学方法。本实验旨在研究不同属间柑 橘染色体的遗传差异，从中寻找到具有属间特有的标记性染色体，为柑橘杂种鉴定 奠定基础；为柑橘属植物的系统分类、进化趋势、保护和杂交育种研究积累必要的 细胞学资料。通常，前人根据肉眼可见的c m a + 条带数目与其在染色体上分布位置 将柑橘的染色体分为5 7 种有限类型，而本研究在前人的基础上，采用m i c r o m e a s u r e 与i m a g e p r op l u s 生物学图像软件对四季橘( c i t r u sm a n d u r e n s i sl o u r ) 、金柑 ( f o r t u n e l l ac r a s s i f o l i as w i n g l e ) 、枳壳( p o n c i t r u st r i f o t i a t a ( l ) r a f ) 、红橘( cr e t i c u l a t a ) 和h b 柚( cg r a n d i s ) 进行精确的染色体核型与带型结构分析。测定每条染色体_ 1 2 d a p i 荧光强度的变化( 从短臂到长臂) ，得到荧光波动图，量化荧光强度的变化，因而检 测到每条染色体的特异性。主要研究结果如下： 1 对四季橘、金柑、枳壳、红橘、h b 柚根尖分生区细胞中的染色体进行染色计 数观察。选取分散良好的体细胞分裂相5 0 个，统计染色体数目。表明四季橘、金柑、 枳壳、红橘、h b 柚中具有1 8 条染色体的细胞，分别占其总数的7 8 、8 4 、6 8 、 8 0 、7 0 。其余细胞染色体数目从1 6 2 l 条不等，呈不恒定状态。 2 核型研究显示：四季橘体细胞染色体核型公式为2 n = 2 x = 1 8 = 1 6 m ( 2 s a t ) + 2 s m ， 第3 对为近中部着丝粒染色体，其余均为中部着丝粒染色体，第1 对染色体短臂上带 有随体，核型类型为l b ；金柑染色体核型公式为2 n = 2 x = 1 8 = 1 8 m ，无随体，均为中部 着丝粒染色体，核型类型为l a ；枳壳染色体核型公式为2 n = 2 x = 1 8 = 1 6 m + 2 s m 第6 对为 近中部着丝粒染色体，其余均为中部着丝粒染色体，无随体，核型类型为1 b ：红橘 染色体核型公式为2 n = 2 x = 1 8 = 1 6 m ( 2 s a t ) + 2 s m ，2 号染色体为近中着丝粒染色体，其 他全为中部着丝粒染色体，7 号染色体短臂上有随体，核型类型为1 b ：h b 柚体细胞 染色体核型公式为2 n = 2 x = 1 8 = 1 6 m + 2 s m ，第7 对为近中部着丝粒染色体，其余为中部 着丝粒染色体，无随体，核型类型为2 b 型。根据s t e b b i n s 的核型分类方法与l e v i t z k y 的核型对称原理推断，以上五种物种的核型类型都较原始且核型对称性较高，其中 金柑最原始，依次为红橘、枳壳、四季橘和h b 柚。 3 利用i m a g e p r op l u s 软件对前中期染色体进行带型定量分析，获得了每条染 色体上从短臂到长臂，包括随体上d a p i 荧光强度的变化图。纵座标表示d a p i 荧光强度的灰度水平，横座标表示荧光在染色体上的相应位置，同时也反映了 染色体的相对长度。不同的染色体对应了不同的曲线。综合所得的荧光波动图 与肉眼观察结果，绘制出的染色体组带型模式图显示：四季橘、金柑、枳壳、 红橘、h b 柚分别有8 、4 、5 、1 0 、7 条暗带。部分染色体具有相似的带型，同 时，每一种属都具有代表自身特征的染色体标记。 4 本实验构建了染色体的2 d 立体图，图片中可清晰直观地观察到染色体表面粗 糙的立体形态，效果相似于共聚焦显微镜拍摄结果。清晰的染色体形态，为基因在 染色体上的定位与拷贝数的观察、基因图谱的构建等工作奠定了基础。 关键词：柑橘；染色体；核型；染色体条带；d a p i ；m i c r o m e a s u r e ：i m a g e p r o p l u s 2 一 k a r y o t y p e a n db a n d i n gp a t t e r na n a l y s i so fc h r o m o s o m ei n c i t r u sb ys o f t w a r e a b s t r a c t c i t r u si so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf r u i tc r o p si nt h ew o r l dw i t ha b u n d a n tg e n e t i c r e s o u r c e s c h r o m o s o m ek a r y o t y p ea n db a n d i n gs t y l ea n a l y s i si nc i t r u si sa ni m p e r a t i v e c y t o g e n e t i c a lm e t h o df o rc i t r u sv a r i e t yi d e n t i f y i n g i np r e s e n tr e s e a r c h ，i n v e s t i g a t i o n s w e r ec a r r i e do u tt os t u d yt h e g e n e t i cd i v e r s i t y o fd i f f e r e n tc i t r u s ，i n c l u d i n gh b p u m m e l o ( c i t r u sg r a n i d sc v h i r a d ob u n t a n ) ，h o n g j u t a n g e r i n e ( cr e t i c u l a t a ) ，t r i f o l i a t e o r a n g e ( p o n c i r u st r i f o l i a t a ) ，m e i w a k u m q u a t ( f o r t u n e l l ac r a s s i f o l i a ) a n dc a l a m o n d i n ( c m a n d u r e n s i sl o u r ) f i n d i n go u tt h es p e c i e ss p e c i f i cm a r k e rc h r o m o s o m e sw i l lf a c i l i t a t e h y b r i di n d e n t i f i c a t i o na n dp h y l o g e n i cr e l a t i o n s h i pr e c o n s t r u c t i o n ，a sw e l la sg u i d i n gt h e b r e e d i n go ff r u i tc r o p s u s u a l l y ，c i t r u sc h r o m o s o m e sa r ed i v i d e di n t o5t o7t y p e s ， a c c o r d i n gt ot h ev a r i a t i o ni nn u m b e r sa n dp o s i t i o no fc m a + b a n d s t h ea n a l y s i so f k a r y o t y p e a n db a n d i n gs t y l eo ft h e s ef i v e s p e c i e s e x a c t l yb y t h es o f t w a r eo f m i c r o m e a s u r ea n di m a g ep r op l u s ，s e to u tt h ei n t e n s i t yv a r i e t yo fd a p if l u o r e s c e n c e a l o n gt h ec h r o m o s o m e ( f r o ms h o r ta r m t ol o n ga r m ) ，g a i n e dt h ef l u c t u a t eg r a p h t h em a i n r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t od e t e r m i n et h ec h r o m o s o m en u m b e r s ，f i f t yd i v i s i o nc e l l sf r o mt h es h o o ta p i c a l m e r i s t e m so fg e r m i n a t e ds e e d sw e r eo b s e r v e di ne a c ho ft h e5s p e c i e s t h ep e r c e n t a g eo f c e l l sp o s s e s s i n g18c h r o m o s o m e si nc a l a m o n d i n ，m e i w a k u m q u a t ，t r i f o l i a t eo r a n g e ， h o n g j u t a n g e r i n ea n dh bp u m m e l or a n k i n g7 8 ，8 4 ，6 8 ，8 0 ，7 0 r e s p e c t i v e l y c h r o m o s o m e si nt h er e m n a n tc e l l sw e r er a n g i n gf r o m16t o21 2 t h ek a r y o t y p ef o r m u l ao fc a l a m o n i d ni s2 n = 2 x = 18 = 16 m ( 2 s a t ) + 2 s m ，e x c e p t c h r o m o s o m e3i ss u b m e t a c e n t r i cc h r o m o s o m e ，t h eo t h e r sa r em e t a c e n t r i cc h r o m o s o m e ， a n das a t e l l i t ei sn e a rt h es h o r ta r mo fc h r o m o s o m el ；m e i w a k u m q u a t sf o r m u l ai s 2 n = 2 x = 18 = 1 8 m ，a l lc h r o m o s o m e sa r em e t a c e n t r i cc h r o m o s o m ew i t h o u ts a t e l l i t e i ti s c l a s s i f i e da s1ak a r y o t y p ea c c o r d i n gs t e b b i n s ；t r i f o l i a t eo r a n g e sk a r y o t y p ef o r m u l ai s 2 n = 2 x = 18 = 16 m + 2 s m ，c h r o m o s o m e6i ss u b m e t a c e n t r i c ，a l lo t h e r sa r em e t a c e n t r i c c h r o m o s o m e ，w i t h o u ts a t e l l i t e a n di t i sc l a s s i f i e da s1bs t y l ea c c o r d i n gt os t e b b i n ； k a r y o t y p ef o r m u l ai n h o n g j u t a n g e r i n ei s2 n = 2 x 。18 = 1 6 m ( 2 s a t ) + 2 s m c h r o m o s o m e2 i ss u b m e t a c e t r i cc h r o m o s o m e ，t h eo t h e r sa r em e t a c e t r i c ，a n dc h r o m o s o m e7h a sas a t e ll i t e a r o u n dt h es h o r ta i m i ti sc l a s s i f i e da s1b k a r y o t y p e h bp u m m e l o sk a r y o t y p ef o r m u l a i s2 n = 2 x = l8 = 16 m + 2 s m ，c h r o m o s o m e7i ss u b m e t a c e t r i cc h r o m o s o m e ，t h eo t h e r sa r e m e t a c e t r i c ，a n dw i t h o u ts a t e l l i t e t h ek a r y o t y p ei s2 b a l lt h e s ef i v es p e c i e sb e l o n gt ot h e d r i m i t i v es p e c i e si nt h ec i t r u se v o l u t i o nb e c a u s eo ft h e i rs y m m e t r yc h a r a c t e r a n d m e i w a ，k u m q u a t i st h ee a r l i s to r i g i n a l t h en e x ta r er e dt a n g e r i n e ，t r i f o l i a t eo r a n g e ， c a l a m o n d i n ，h bp u m m e l oc o m p l i a b l y 3 b a s e do nt h er e s u l t so ff l u o r e s c e n c ef l u c t u a n tg r a p ha n dn a k e d e y eo b s e r v a t i o n ， b a n d i n gp a t t e r n si np r o m e t a p h a s ec h r o m o s o m ew e r ea n a l y z e ，a n d t h ei d i o g r a mw e r e d r a w na m o n gt h es a m p l e so fc a l a m o n d i n ，m e i w a k u m q u a t ，t r i f o l i a t eo r a n g e ，h o n g i u t a n g e r i n ea n dh bp u m m e l o ，a n dt h eb l a c kb a n d i n gn u m b e r sa r e8 ，4 ，5 ，1 0 ，7r e s p e c t i v e l y 4 i np r e s e n tr e s e a r c h ，t w o d i m e n s i o n a li m a g i n go fc h r o m o s o m ew a sc o n s t r u c t e d t h er o u g hf i g u r eo fc h r o m o s o m ew a so b s e r v e di nf o c u s t h er e s u l t sr e s e m b l et h ep h o t o s c a p t u r e db yc o n f o c a lm i c r o s c o p e ，w h i c hw o u l db eh e l p f u lf o rp h y s i c a ll o c a t i o n ，c o p y n u m b e r sd e t e r m i n a t i o na n dm a p p i n go fi n t e r e s t i n gg e n e st os p e c i f i cc h r o m o s o m e k e yw o r d s ：c i t r u s ；c h r o m o s o m e ；k a r y o t y p e ；c h r o m o s o m e b a n d i n g ；d a p i ； m i c r o m e a s u r e ；i m a g e - p r o p l u s 4 c m a d a p i d n a f i s h g i s h n o r i p p i s h m t c h r o m o m y c i na 3 色霉素a 3 4 6 - d i a m i d i n o 2 p h e n y l i n d o l e 4 ，6 - 二联脒一2 一苯基吲哚 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n g e n o m i ci ns i t uh y b r i d i z a t i o n n u c l e o l a ro r g a n i z i n gr e g i o n 脱氧核糖核酸 荧光原位杂交 基因组原位杂交 核仁组织区 i m a g e p r op l u s i ns i t uh y b r i d i z a t i o n原位杂交 m u r a s h i g ea n dt u c k e rm t ( 1 9 6 9 ) m t 基本培养基( 1 9 6 9 ) m m m i t h r a m y c i n 5 光辉霉素 第一章文献综述 柑橘属系芸香科柑橘亚科植物，为常绿灌木或乔木，主要分布于热带和亚热带 地区。自2 0 世纪9 0 年代，柑橘成为世界第一大水果以来，全世界柑橘产量保持在l 亿吨左右的水平，年贸易额达至1 j 6 5 亿美元，为第三大国际贸易农产品。中国柑橘产 业在产量增加的同时，品种类型以及结构也在发生巨大变化( 邓秀新，2 0 0 5 ) 。我 国作为柑橘植物起源与遗传变异中心之一，其栽培品种、野生品种、半野生品种等 遗传资源都极其丰富。 自1 7 5 3 年林奈确立柑橘属以来，柑橘的分类研究备受重视，但由于柑橘类植物 芽变频率高、无融合生殖占优势以及柑橘种属间广泛的受精能育性和长期的自然杂 交等特性，导致植株形态多样，亲缘关系复杂，讨论其起源进化相对比较困难。对 于某些物种的确立与否，以及在某些种或属间的亲缘关系上各执一词，因此，有必 要采取更先进的方法，利用染色体的特异标记去研究柑橘类的物种形成与系统演化。 柑橘染色体研究的应用，是从群体、个体、细胞、分子水平探讨理论与应用的 重要环节，是深入研究柑橘生命规律、改良品种的必要前提。在理论探索方面，性 别决定机制、联合复合体的构造、功能和交换、姊妹染色单体的交换、染色体配对 的可能途径、纺锤丝的调控、有丝分裂和减数分裂的机制、染色体形态变异、易位、 倒位、缺失、重复变异等的细胞学证据和遗传效应等都需要进一步研究。对柑橘类 染色体进行深入研究，可以丰富遗传学、分子遗传学的理论内涵与知识体系，揭示 柑橘类植物种类演替、种间进化、种内进化的客观规律。随着上世纪7 0 年代染色体 分带技术的发展，使利用柑橘染色体的特异标记对柑橘属及近缘属的物种形成与系 统演化进行研究成为可能( b e f ue ta 1 ，2 0 0 0 ；c a r v a l h oe ta 1 ，2 0 0 5 ；b r a s i l e i r o v i d a l e ta 1 ，2 0 0 7 ) 。基于前人的研究，我们有可能在染色体进化的水平上获得有关物种 分化机制的一些新认识，并在基因组水平上，为探索不同基因组的分化以及基因组 间关系提供分子细胞遗传学上的新依据，通过此技术完善某些柑橘品种在分类上有 争议、仍不清晰的地方。 1 分子细胞遗传学研究进展 分子细胞遗传学是分子生物学和细胞遗传学交叉孕育而成的一门新兴学科，是 利用分子技术在细胞学水平研究生物遗传现象、对细胞遗传学现象加以分子生物学 解释的新领域。近年来，由于分子生物学和生物物理学的发展带动了分子细胞生物 学的发展，分子细胞遗传学研究技术也在不断更新与完善。以下介绍细胞分子遗传 学的发展近况。 6 1 1 常规核型 目前最常使用的是常规核型，其依据染色体的形态和长度进行区分的。在常规 核型中，对于着丝粒的位置来说，采用统一的分类标准进行染色体分类具有很重要 的意义。l e v a n 等于1 9 6 4 年改进了描述着丝粒位置的命名方法。我国的植物学研究大 多参考李懋学等关于植物核型分析标准化建议( 李懋学和陈瑞阳，1 9 8 5 ) 。李 懋学等规定染色体数目一般以体细胞染色体数目为准，染色体形态以体细胞分裂中 期的染色体作为基本形态，规定了染色体长度、臂比、着丝点位置、臂指数、核型 表述格式、核型分类，以及具有小染色体的植物核型分析的问题。陈瑞阳( 2 0 0 3 ) 主持编写的中国主要经济植物基因组染色体图谱收录了我国2 l 科5 9 属2 4 3 种农作 物及其野生近缘植物和核型分析结果，具有重要的理论意义和应用价值。 1 2 显带技术 染色体分带技术是6 0 年代后期发展起来的一项细胞学技术，借助于某些物理、 化学处理使中期染色体显现出深浅不同的带纹，各物种的每一条染色体其带纹的数 目、位置、宽度及深浅都有相对的恒定性( 刘大钧，1 9 9 9 ) 。因此它是染色体识别 的重要依据，鉴定单个染色体和染色体组的有效手段。其中已经应用于植物研究的 显带技术的类型很多，依染料种类和染色条件的不同分为：荧光显带、g i e m s a 显带 和银染显带等。荧光显带包括有q 带( 因荧光染料q u i n a c r i n e 而得名，亮带富含a t 碱 基，暗带富含g c ) 、r 带( 因与q 带相反一r e v e r s e 得名，带纹为富含g c 片段) 和h 带( 因荧光染料h o e c h s t - 3 3 2 5 8 而得名) 等。g i e m s a 显带包括有g 带( 因染料g i e m s a 而得名) 、c 带( 因显示组成型异染色质c o n s t i t u t i v eh e t e r o c h r o m a t i n 而得名) 及n 带 ( 因对核仁组织区一n o r 专一显带而得名) 等。而银染显带也是专显染色体核仁组织 区( n o r ) ，因此也n q a g n o r s 。其中c 带技术在植物中应用最广。虽然目前还未 对显带技术的机制有很清楚的了解，但是不影响其在实际中的应用。该技术是确定 异染色质在染色体上分布的区域，根据带纹在染色体上的位置可区分：着丝粒带、 中间带、末端带、核仁组织区带，带型即根据这些带纹的位置，可正确无误的辨别 出各个染色体，并进一步研究各个染色体与遗传的关系。特别是七十年代中期以后， 细胞同步化和显带技术的改进，人们能得到更长和带纹更加丰富的染色体，这种染 色体被称为高分辨显带染色体。高分辨的染色体分带技术的应用使得人们不仅在染 色体带型细分的基础上，进一步识别和定位染色体，对研究生物的系统发育、群体 的遗传结构以及群体间的基因漂移具有很大的作用。建立某一物种及其亲缘种的染 色体带型图，可以使染色体畸变的研究变得更加容易，也为基因图谱的构建提供了 细胞学的依据。 7 1 3 面积核型 面积核型是根据染色体所占的像素多少来确定核型的方法。u o z u 等( 1 9 9 7 ) 首先 注意到：水稻不同染色体组的大小存在着较大的差异，表现在d n a 含量及染色体的 长度和面积上，染色体组中染色体的总长度及面积和d n a 的含量成正相关。李宗芸 ( 2 0 0 2 ) 利用m e t a m o r p h 软件对水稻有丝分裂中期和粗线期染色体的d a p i 深染区和浅 染区先进行域值标准化，然后根据它们像素的不同测量染色体d a p i 深染区的面积占 染色体总面积的比值，并推定深染区为异染色质区，由此估算出了染色体上异染色 质区所占的比例。研究发现：面积的臂比值变化比长度的臂比值变化要小。表明以 面积为依据较传统的以长度为依据的核型分析可能更加稳定可靠。这一问题需要对 不同时期染色体核型进行大量的统计分析后才能进一步确定。 1 4 光谱核型 光谱核型( s p e c t r a lk a r y o t y i n g ) 分析技术( s c h r s c ke ta 1 ，1 9 9 6 ) 是用不同荧光标 记的特异染色体探针同时与中期细胞染色体进行杂交，然后信号通过干涉仪进行识 别后染色体以干涉图的形式展现出具有不同颜色的每条染色体，它是将荧光显微技 术、f o u r i e r 光谱显微技术和干涉图像处理技术相结合而产生的。光谱核型分析技术 为核型分析、染色体识别以及染色体结构分析等提供了有力的研究工具，对染色体 研究起到了很大的促进作用。随后减数分裂染色体的光谱核型得以创建( h e n r ye t a 1 ，2 0 0 1 ) 。但是，光谱核型技术的一个缺点就是染色体特异探针的来源，由于现 在的技术条件在很难在很多的生物中建立起分离染色体的体系，因此这就成了该技 术的限制性因素。 1 5 原位杂交技术 原位杂交( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，i s h ) 是用经过标记了的d n a 片段做为探针 ( p r o b e ) 与染色体d n a 进行分子杂交，并通过显微镜直接检测与探针互补的d n a 片段的存在部位。其起始于6 0 年代末期，g a l l 和p a r d u e ( 1 9 6 9 ) 首次应用放射性同位 素3 h 标记核糖体r n a ( r r n a ) 为探针，与一种非洲蛙的细胞核进行原位杂交，检测 出细胞核i 为r r n a 的存在。按其标记种类不同可分为同位素标记和荧光标记的原位杂 交，同位素标记的原位杂交即放射性原位杂交( i s o t o p i ci s h ) 由于分辨率低、检测 繁琐和操作不安全等缺点被荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 所取代，r a y b u m 和g i l l ( 1 9 8 5 ) 首先报道了用生物素荧光标记在小麦染色体原位杂 交的研究。由于检测目的的不同，原位杂交的探针也有区别，先后有基因组原位杂 交( g i s h ，即用植物基因组总d n a 为探针的原位杂交) 和特异序列片段原位杂交( 用 标记了的单拷贝、低拷贝、b a c 和y a c 等特异序列片段为探针的原位杂交) 等。原 位杂交主要应用于基因组结构与进化分析、染色体结构变异、外源染色体检测、基 因的物理图谱构建、基因的染色体定位、基因组空间分布等。近年来，随着分子生 物学及其技术的发展，原位杂交技术得到飞速发展，先后出现了多色原位杂交、d n a 纤维原位杂交、比较基因组原位杂交、三维立体原位杂交、r n a 原位杂交等原位杂 交新技术。 1 5 1 基因组原位杂交 基因组原位杂交( g i s h ) 是二十世纪八十年代发展起来的一项d n a 指纹技术， 最初应用于动物研究( p i n k e l 等，1 9 8 6 ) ，在植物远缘杂种的研究是从l e 等( 1 9 8 9 ) 用黑麦基因组总d n a 鉴别一个具有小麦黑麦互换的面包小麦品种中的黑麦染色体 片段。g i s h 具有分子标记d n a 指纹分析技术所不具有的特点：外源片段鉴定并精确 定位、确定外源d n a 插入位点进行定性甚至定量研究、重复性好等优点。 1 5 2d n a 纤维荧光原位杂交( f i b r e f i s h ) f i b r e f i s h 是在人为拉伸后的染色体或染色质纤维上进行的一种原位杂交技术。 由于染色体的伸展使得d n a 探针在d n a 纤维上的分辨率也大大提高，分辨率的提高 使得这项技术被广泛的应用于人类基因组的研究、物理图谱的构建、染色体异常分 析等方面的研究。自x i n g 等于1 9 9 1 年首次报道t d n a 纤维荧光原位杂交技术后，相 继出现了很多有关f i b r e f i s h 的报道。d e rk n a a p 等( 2 0 0 4 ) 利用f i b r e f i s h 对控制番 茄果实形状的基因s u n 进行了遗传和物理定位。同时d n a 纤维原位杂交技术还在重 叠群( c o n t i g s ) 的构建、e s t s 的定位、填补序列图谱的空缺、估算人类基因组计划 基因序列中存留的空缺大小( h e i s k a n e n 等1 9 9 6 ；d u n h a m 等1 9 9 9 ) 中也有应用j 1 5 3 三维荧光原位杂交( 3 d f i s h ) 实际上是将多色f i s h ( m u l t i c o l o rf i s h ) 与三维分析和观察的方法( 如共聚焦 显微镜和三维重建技术) 相结合而产生的一项技术，它为研究基因组的空间结构和 它们的功能之间的关系提供了手段，如研究基因的表达与染色体的位置关系、生物 体细胞中每条染色体的空间分布、染色体的特异序列与染色体的空间位置关系等。 1 6 染色体微切割与微克隆 染色体微切割和微克隆技术( c h r o m o s o m em i c r o d i s s e c t i o n 和m i c r o c l o n i n g ) 是 随着近十年来分子生物学技术的发展而诞生的一项特异性基因克隆的高新技术，是 在细胞遗传学，尤其是在细胞染色体的基础上发展而来的，是细胞遗传学与分子遗 传学相结合的一项桥梁技术。它主要采用微细玻璃针或激光，在倒置显微镜下对特 定染色体或染色体片段进行显微切割、分离，并从分裂相中分离出来，随后进行d n a 体外扩增并克隆到载体中，以构建特定染色体或染色体片段的特异性d n a 文库。这 9 项技术于1 9 8 1 年眭i s c a l e n g h e 等首次建立和应用到果蝇多线染色体的研究，随后微切 割技术和微克隆技术不断的完善。 染色体微切割和微克隆技术主要内容包括：染色体标本制备与目标染色体识别， 染色体微切割、微分离与染色体或染色体片段的收集，染色体d n a 片段的克隆及鉴 定等。其主要应用于染色体结构分析、染色体进化研究、分离重要基因，构建染色 体特异性d n a 文库、基因定位与克隆等研究领域。在植物中，应用它已经成功进行 了柚子( c i t r u sg r a n d i sc v g u a n x i ) 标准染色体核型的创建和单条染色体的分离 ( h u a n g ，2 0 0 4 ) 、燕麦染色体l r 的d n a 文库的建立( z h o u ，1 9 9 9 ) 等。 2 远缘杂种及其后代的染色体行为 通过体细胞融合获得的属间杂种及其后代由于受其亲本双方核质相互作用，其 在胚胎发育以及植株生长等过程中细胞分裂均会受到异种基因组间的影响从而出现 与非远缘杂种不同的染色体行为。染色体消除、细胞分裂周期不同步及染色体落后 等均有相关报道。 2 1 染色体消除 染色体消除( c h r o m o s o m ee l i m i n a t i o n ) 也称染色体消减( c h r o m o s o m ed i m i n u t i o n ) 是指植物远缘杂种胚的发育过程中，一亲本部分或全部或双亲部分染色体发生丢失 的现象。这种现象在植物中最早发现是在栽培大麦( h o r d e u mv u l g a r el 2 n = 1 4 ) 和 它的野生近缘植物球茎大麦( i a b u l b o s o ml ，2 n = 1 4 ) 杂交实验中，杂种胚在经过几个 周期的有丝分裂后，球茎大麦的染色体便会逐步从胚中丢失而消除掉，形成仅剩下 栽培大麦染色体组的单倍体( h o ，1 9 7 5 ) 。染色体消除现象的发生机制还不清楚， 目前有以下几种说法：( 1 ) 形成多极纺锤体以及发生不平衡细胞的消除 ( s c h u l z s c h a e f f e r ，1 9 8 0 ) ；( 2 ) 两个亲本中细胞分裂周期所持续的时间不同，出现 杂种胚中两个基因组在有丝分裂或减数分裂中不同步而引起染色体消除( b e n n e t t ， 1 9 7 6 ) i ( 3 ) 染色体消除受遗传控制，h o 等( 1 9 7 5 ) 认为控制球茎大麦染色体消失 的基因至少3 个，存在于栽培大麦第三染色体短臂和第二染色体的长臂和短臂上。尤 其是第二染色体长臂上的基因，对染色体的消除起着关键作用。但如果球茎大麦染 色体上的基因剂量足够的话，可以抵消这些因子的作用，或以某种方式避免染色体消 除。 在有的杂交组合中则发生部分染色体消除，产生的部分杂种具有一个亲本的单 倍染色体组成和另一亲本的1 至多条染色体或单个至多个基因的渐渗，从而发生异源 基因的导入。 1 0 2 2 染色体加倍 近来研究发现，远缘杂种的染色体加倍现象并不都是染色体组的完全加倍，而 有的是在杂种合子发育或无性繁殖过程中，会发生部分染色体( 组) 的自然加倍， 形成非预期染色体数杂种。汤天泽等( 2 0 0 6 ) 在进行白菜( 2 n = 2 0 ) 与海甘蓝( 2 n = 9 0 ) 远缘杂交并多代无性繁殖后获得染色体数目为2 5 2 8 的属间杂种，他们推测，这是由 于杂种染色体大量丢失的同时也发生部分染色体自然加倍的结果。不减数配子融合 和染色体加倍等均是多倍体形成的主要途径，而多倍性是开花植物的重要进化力量， 被子植物中有多达7 0 的经历过一次或多次的多倍体化，这就意味着弄清植物远缘 杂种不减数配子和染色体加倍现象有着十分重要的意义。 2 3 染色体区域分布 现在研究表明，细胞核是一个区域化( c o m p a r t m e n t a l i z a t i o n ) 的细胞器，并且 单条染色体在细胞核内占据专一的领域( c h r o m o s o m et e r r i t o r y ) ，染色体领域被染色 体间区域( i n t e r c h r o m o s o m a ld o m a i n ) 所分隔( 李再云，2 0 0 5 ) 。同样，在植物远缘 杂种中，来自不同亲本种的染色体在细胞中