（预防兽医学专业论文）鹅副粘病毒HN及F基因在昆虫杆状病毒表达系统的表达.pdf

摘要鹅副粘病毒( g o o s ep a r a m y x o v i r u s ，g p m v ) 与新城疫病毒( n e wc a s t l ed i s e a s ev i r u s ，n d v )基因核苷酸同源性来看，g p m v 与n d v 属于同种病毒，g p m v 是n d v 的一个变异，而不是个新种病毒，是n d v 毒株在水禽上引起发病，且病毒毒力加强。但是，g p m v 与传统的n d v 又有不同，差异主要在血凝素一神经氨酸酶蛋白( i - i n ) 及融台蛋白( f u s i o n p r o t e i n ，f )上，常规的n d v 疫苗不能提供有效的保护，因此从分子生物学水平上对该病进行研究具有重要的意义。i - i n 和f 蛋白是g p m v 诱导体液免疫的重要靶抗原，在抗病毒免疫中起着重要作用，无疑h n 和f 基因己成为研制g p m v 基因工程苗及免疫监测试剂的首选基因。本试验根据g e n b a n k 所发表的h n 及f 基因的c d n a 序列，利用p r i m e r 5 0 软件，参照昆虫细胞杆状病毒表达系统的质粒图谱，设计引物，以本实验室所保存的p m d l 8 t - h n 及p m d l 8 t - f 阳性质粒为模板扩增出h n 及f 基因，分别命名为p m d l 8 - t - g p m v - h n 及p m d l 8 t - g p m v - f 。将其克隆至昆虫杆状病毒转移载体p b l u e b a c h i s 2 a 的x h o l 和o r i 之间的多克隆位点上，分别命名为p b l u e g p m v - h n 及p b l u e g p m v - f 。纯化该重组质粒并与杆状病毒共转染s f 9 昆虫细胞，4 d 后获得重组病毒，名为p 1 。将经过3 轮蚀斑筛选纯化，p c r 鉴定获得重组病毒，分别命名为r b v h n 及r b v - f 。将重组病毒反复扩毒3 次，获得高浓度的重组病毒名为p 3 ，接种s f 9 单层细胞上，4 d 后收获病变细胞，经s d s - p a g e 电泳鉴定，表达f 蛋白分子量约为6 0 k u ，表达i - i n 蛋白分子量约为6 6 1 c u ，与理论值相符。表达产物l - i n 蛋白的w e s t e r nb l o t 和d o t - e l i s a 结果表明其可与鸡抗g p m v 血清发生特异性抗原反应，证实所表达的f i n 蛋白有较好的反应原性。本研究将株的f i n 及f 基因利用昆虫杆状病毒表达系统中表达，并获得了i - i n 主要抗原位点基因的表达，对g p m v 的基础性研究、预防控制和病毒诊断试剂研制奠定重要的物质基础。关键词：鹅副粘病毒；h n 基因；f 基因：重组杆状病b a c u l o v i r u se x p r e s s i o no ft h eh na n dfg e n e so fg p m va b s t r a c tg o o s ep a r a m y x o v i r u s ( g p m v ) i sh o m o l o g o u sw i t hn e wc a s t l ed i s e a s ev i m s ( n d v 、a tag r e a ts i g n i f i c a n c e ，g p m vw a sr e v e a l e dt ob eav a r i a n to fn d vb u tn o tan e wv i r u s o n es t r a i no fn d vi n f e c tw a t e r f o w la n dt h ev i r u l e n c ew a se n h a n c e d h o w e v e r , g p m vw a sn o ta b s o l u t e l yd i f f e r e n tw i t hn d v , h e m a g g l u t i n i n - n e u r a m i n i d a s e ( h n ) a n df u s i o np m t e i n ( f ) p r o t e i nw e r em u t a n ta n dr e s u l ti nt h ei n v a l i d a t i o no ft r a d i t i o n a lv a c c i n e t h e r e f o r e ，t h es t u d yo nt h ev i r u sa tm o l e c u l a rd e g r e ew a so fg r e a ts i g n i f i c a n c e h na n dfp r o t e i n sw e r et h ep r i m a r yt a r g e ta n t i g e n so fh u m o r a li m m u n er e s p o n s ea g a i n s tv i r u s h na n dfp r o t e i n sh a v eb e c o m et h ep r e f e r r e dg e n e sf o rp r o d u c t i o no fg e n e t i c a l l ye n g i n e e r i n gv a c c i n ea n dp a t h o g e nd i a g n o s i s i nt h i sr e s e a r c h ，o n es e to fp r i m e r sw a sd e s i g n e db a s e do nt h es e q u e n c eo fh na n dfg e n eo fg p m vo fg e n b a n ka n dt h es e q u e n c eo fe u k a r y o t i ct r a n s f e rv e c t o rp b l u e b a c h i s 2 au s i n gp r i m e r5 0 h na n dfg e n ew a sa m p l i f i e df r o mp m d l 8 - t - h na n dp m d l 8 - t - fr e s p e c t i v e l ya n dd e s i g n a t e da sp m d l 8 - t - g p m v - h na n dp m d l 8 - t - g p m v - f t h e yw e r el i g a t e di n t ot h et r a n s f e rv e c t o rp b l u e b a c h i s 2 aw i t hx h o la n de c o r ir e s t r i c t i o ns i t e s ,a n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r ed e s i g n a t e da sp b l u e - g p m v - h na n dp b l u e - g p m v - ec o t r a n s f e c t i o no fs f 9i n s e c tc e l lw a sp e r f o r m e du s i n gp u r i f i e dr e c o m b i n a n tp l a s m i d sa n db a c m i d - n b l u ed n a r e c o m b i a n tv i r u sn a m e dp 1w a sr e c o v e r e d4 da f t e rt r a n s f e c t i o n a f t e r3s e r i a lp a s s g e so fp l a q u ea s s a ys c r e e nf o l l o w e db yp c rc o n f i r m a t i o n ，t h er e c o m b i n a n tv i n _ l sw e r ed e s i g n a t e da sr b v - h na n dr b v - ea f t e r3p a s s a g e so fp r o p a g a t i o no ft h er e c o m b i n a n tv i r u s ，h i g h - t i t e rv i r u sn a m e dp 3w a su s e dt oi n o c u l a t es f 9c e l l sf o l l o w e db yh a r v e s ta f t e r4 d t h efa n df i np r o t e i n sw e r ec o n f i r m e dt ob e6 0 k ua n d6 6 k ui nl e n g t hw h i c hw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h es p e u l a t e ds i z ea sj u d g e db ys d s - p a g es e p e r a t i o n h np r o t e i nc o u l db es p e c i f i c a l l yr e c o g n i z e db yc h i c k e n - a n t i - g p m va n t i b o d i e sa si n v e s t i g a t e db yw e s t e r nb l o ta n dd o t - e l i s aa s s a y s a l lt h er e s u l t sp r o v e dt h eb e t t e rr e a c t i o n o g e n i c i t yo fh np r o t e i n i nt h i sr e s e a r c h ，h na n dfp r o t e i n so fg p m v j s 1 9 7 g os t r a i nw e r ee x p r e s s e dw i t hb a c u l o v i r u se x p r e s s i o ns y s t e m t h ee x p r e s s i o no ft h ea n t i g e n i cs i t e so fi - i np r o t e i nw a sc o n f i r m e d t h er e s u l t so ft h i ss t u d yp r o v i d e dd a t af o rf u n d a m e n t a lr e s e a r c ho ng p m v , p r e v e n t i v ec o n t r o la n dv i r u sd i a g n o s i s k e yw o r d s ：g o o s ep a r a m y x o v i r u s ：h ng e n e ；fg e n e ；r c o m b i n a n tb c u l o v i m si lc a n d i d a t e ：z a n gy u t i n gs p e c i a l i t y ：p r e v e n t i v ev e t e r i n a r ym e d i c i n es u p e r v i s o r ：w a n gj u n w e i坝i 研究生学位论文独创声l 孵o 使用授权书独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得( 洼；童旦遗直基焦壶塞挂型直疆的! 奎拦豆窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：武氆日期：抑年5 月f 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位：羲吞哆导师签名：坛启日期：知卯年彳月，曰醐：7 引刖咽近年来，在我国的华东及华南地区，出现以鹅消化道病变为主要特征的具有高度发病率和死亡率的烈性传染病，病原鉴定表明，该病是由副粘病毒引起的，命名为鹅副粘病毒( g o o s ep 猢y x o v 油s g p m v ) ( 王永坤等，1 9 9 8 ) 。从g p m v 与新城疫病毒( n e w 髓s l l cd i s e a s ev i m s , n d v ) 基因核苷酸同源性来看，g p m v 与n d v 属于同种病毒，g p m v 是n d v 的一个变异，而不是一个新种病毒，是n d v 毒株在水禽上引起发病，且病毒毒力加强( 刘光磊等，2 0 0 3 ) 通过系统研究，g p m v 的1 0 1 位为k ，1 2 1 位氨基酸为v ，这与n d v 基因型相一致，所以将g p m v 列入基因型型n d v 中。1 1 鹅源新城疫概述1 1 1 流行病学根据报道，传统的n d v 一般不感染鹅，即使感染也不发病。任涛等( 2 0 0 0 ) 曾用国内n d v标准强毒株f 4 8 e 8 攻击2 8 日龄的鹅，发现n d v 强毒株对鹅的发病率和死亡率均为0 国外至今未见n d v 感染鹅发病的报道。我国发生的鹅源新城疫，在流行病学和病理变化方面不同于任何一种己知鹅的传染病，这是n d v 对鹅具有致病性的一个新发现，也是对养禽业的又一个新威胁。其发生原因可能是：n d v 在环境中强大的免疫压力下基因发生变异，从而使病毒的毒力和宿主嗜性发生改变，我国家禽饲养量大、品种多，部分地区水禽( 鸭、鹅) 与陆禽( 鸡) 混养，这种环境促使n d v 在毒力及宿主源性方面发生变化，导致n d v 的抗原性和基因型处在不断的演变之中，从而造成我国新城疫的防控形势严峻。王永坤等( 2 0 0 1 ) 调查了本病的流行特点，发现本病主耍通过呼吸道和消化道传播，其流行没有明显的季节性，各品种、年龄( 3 3 0 0 日龄) 鹅均易感。钱忠明等( 1 9 9 9 ) 对本病的流行病学和血清学进行了研究，发现本病群体内发病率和死亡率很高。1 0 日龄以内的雏鹅发病率和死亡率均达1 0 0 ，平均发病率和死亡率分别为2 7 7 和1 8 2 ，种鹅感染后产蛋迅速下降。张洁等( 2 0 0 0 )对本病的感染途径进行了研究，发现不同感染途径( 点眼、滴鼻、口服，肌注、皮下注射)都可使鹅1 0 0 发病，但死亡率不同1 1 2 临床症状及病理变化万洪全等( 2 0 0 0 岔0 0 2 ) 研究了本病的临诊症状和病理学变化，发现患鹅主要以消化系统、呼吸系统、免疫系统和神经系统的症状和病变为特征，且自然病例与人工感染病例基本一致；病鹅精神不振，羽毛蓬松，常蹲地，食欲减退或废绝，拉稀，体重迅速减轻，种鹅产蛋下降或停止，但饮欲增加，多数病鹅初期拉白色稀粪，其后粪便呈水样，暗红色，黄色或墨绿色；出现症状1 - 2 d 后出现瘫痪，有些病鹅从呼吸道发出咕咕声，1 0 目龄左右患鹅有张口呼吸、甩头、咳嗽等呼吸症状。发病后期，有扭头、转圈、劈叉等神经症状，部分鹅头肿大，眼流泪，多数在发病后3 - 5 d 死亡，也有少数急性发病鹅无明显症状而在1 2 d 内死亡，甚至有的健康鹅在吃食时突然死亡。患鹅皮肤郁血，食道黏膜，特别是下端有散在芝麻大小灰白色或淡黄色结痂，易剥离，剥离后可见紫色斑点或溃疡。肝脏肿大、郁血、质地较硬，有数量不东北农业人学农学硕卜学位论文等、大小不一的坏死灶。脾脏肿大、郁血，有芝麻大的坏死灶。胰腺肿大，有灰白色坏死灶-腺胃黏膜水肿增厚，乳头难于辨别，黏膜下或表面出现大小不一的白色坏死或溃疡，部分病例腺胃及肌胃充血、出血。盲肠扁桃体肿大，明显出血。十二指肠、空肠、回肠，结肠黏膜有淡黄色或灰白色芝麻大至豌豆大痂块，剥离后呈出血面或溃疡面。直肠和泄殖腔黏膜也具有与肠道相同的病交。肾脏肿大，色淡，输尿管扩张，充满白色酸盐。大脑、小脑有时充血、水肿。1 1 3 防疫措施目前关于鹅源新城疫的免疫问题学术界存在两神观点：一种观点是应用传统新城疫常规疫苗预防鹅源新城疫。曹殿军等( 2 0 0 0 ) 的研究发现，所有疫苗均能产生抗不同基因型n d v流行株的抵抗力，分析认为n d v 是保守性较高的r n a 病毒，其流行毒株的变异虽然在一定程度上提高了疫苗交叉保护的阈值，但目前尚未出现完全不保护的现象；李文良等( 1 9 9 9 )报道用鸡n d i 系苗对发病鹅群紧急接种，可有效地控制鹅源新城疫。另一神观点是对鹅源新城疫应用鹅副粘病毒分离株制备的灭活苗进行免疫和紧急接种。钱忠明等( 1 9 9 9 ) 研究发现用l a s o t a 活疫苗免疫的雏鹅不能抵抗鹅副粘病毒的攻击，用新城疫疫苗预防鹅源新城疫效果不佳；张忠群等( 2 0 0 2 ) 研制的鹅副粘病毒弱毒疫苗对雏鹅的免疫保护力达1 0 0 , 丁牡等( 2 0 0 1 ) 应用鹅副粘病毒n a - 1 株制备的油乳剂灭活苗免疫雏鹅具有良好的保护力。王永坤等( 1 9 9 8 ) 应用我国首次发现并分离鉴定的鹅副粘病毒研制出油乳剂灭活苗从免疫结果看，疫苗在免疫后第7 天即产生抗体( 平均掌9 ) ，1 5 天达到2 67 ，3 0 天可达到妒，最高达到2 “，4 5 天后仍维持较高水平( 才以上) ；从免疫保护试验看，免疫后1 5 天，用强毒攻击，未免疫组全部发病，而免疫组全部保护；从区域性中试调查结果来看，在江苏等地使用的5 0 0 余万毫升鹅副粘病毒苗均安全、有效，能较好的控制鹅源新城疫的流行，特别是在控制雏鹅的死亡率及降低种鹅死亡率和发病率上效果显著；从紧急免疫效果看该苗紧急接种发病鹅群4天后即停止死亡，保护率可达8 3 3 3 ，进一步证明鹅副粘病毒灭活苗具有良好的保护力，能有效地控制鹅源新城疫的流行和发生。驯化的g p m v 弱毒株疫苗和应用g p m v 进行新型疫苗的研究目前还未见报道。1 1 4 诊断研究进展鹅副粘毒病的诊断可以根据流行病学、临诊症状和病理变化做出初步诊断。确诊必须进行病毒分离。全面的g p m v 诊断应当包括病毒检测、病毒特性分析、流行病学三个方面。前两个方面是疫病确诊所必需的，第三方面对于病毒来源以及它们传播方式的了解则是疫病防制的关键所在。在g p m v 的诊断上，除常规的生物学特性试验外，单克隆抗体技术和分子生物学技术也应用于该病的诊断上。1 1 4 1 常规生物学试验g p m v 没有毒力相关的特征性症状，必须在分离到病毒并测定毒力后才能确诊。传统的毒力测定方法是最小致死量致死鸡胚平均死亡时间( m d t ) 、一日龄雏鸡脑内接种致病指数( i c p i ) 和6 周龄非免疫雏鸡静脉接种致病指数( i v p i ) 和空斑形态法，虽能测定毒力却无2法确定病毒的来源和扩散情况。随着o i e 将n d v 毒力的分子鉴定技术纳入n d 诊断当中，传统的诊断方法已不再适应疫病防治的需求。1 - 1 4 2 单克隆抗体( m c a b ) 技术m c a b 具有能检测抗原表位上单个氨基酸的改变这样细徼抗原性变异的特点，单一的或一组m c a b 可用于病毒鉴定、分型，排谱和抗原性分析。目前m c a b 己在g p m v 的血清型区分、特异性快速鉴定和流行病学研究等领域得到有效利用。李玉峰等( 2 0 0 0 ) 通过s d s p a g e发现g p m v 与传统n d v 在f 蛋白上具有一定的抗原性差异，其f 蛋白约为6 0 k u ，应用该g p m v 制备针对这条特异性多肽的单抗仅对g p m v 呈阳性反应，而对经典n d v 不反应，以此区分g p m v 与传统n d v ；扬州大学研制的单抗酶联试剂盒能对活鹅泄殖腔样品进行g p m v的快速诊断和强弱毒区分而无需进行病毒分毒和生物学试验，具有广阔的应用前景。1 1 4 3r t - p c r 技术能快速准确地对g p m v 进行全方位的诊断并且可以直接对感染组织和含毒屎囊液进行检测能在数小时内鉴定出病毒并做出毒力测定。由于其灵敏度高，特异性好，且能够区分强弱毒，目前r t - p c r 技术已经单独或结合其它分子评估技术在g p m v 的检测、鉴定和特性分析方面得以应用k h o 等( 2 0 0 0 ) 建立了一种快速、灵敏( 是常规p c r l 0 0 倍以上，病毒r n a 检出阌值为1 0 - 1 0 0 f g ) 、以通用引物去检测所有禽源a p m v - 1 毒株的r t - 套式p c r 酶联炱疫吸附试验技术( 用显色系统代替了电泳方法。灵敏度提高1 0 倍以上) ；曹殿军等( 2 0 0 0 )建立了直接从组织瘸料中检测并同时鉴定出a p m v - 1 强弱毒株的r t - p c r 技术；王永坤( 2 0 0 0 ) ，严维巍( 2 0 0 0 ) 、赵文华 2 0 0 2 ) 等应用r t - p c r 技术对多株g p m v 的f 基因重要功能区片段进行扩增和测序，并采用基因型分类法，在分子基础上对g p m v 毒株的基因型做出鉴定；刘禄等( 2 0 0 3 ) 依据a p m v - 1f 基因裂解位点的核苷酸序列与其毒力的相关规律，分别设计合成了四条寡核苷酸引物，建立了一个可快速检测所有a p m v - 1 并可鉴别强弱毒株的r t - p c r 技术；邹健等( 2 0 0 2 ) 在分析g p m v f 基因序列的基础上，设计三条引物，建立了一种新的多重r t - p c r 方法，能区分g p m v 与传统n d v 。1 1 4 4 核苷酸序列分析在g p m v 的诊断中，应用核苷酸测序技术对r t - p c r 扩增出的包括裂解位点区在内的f基因片段或p c r 产物的阳性克隆进行核苷酸序列测定和分析，根据强弱毒株f 蛋白裂解位点区1 1 2 - 1 1 7 位a a 的不同组成和排序来预测和确定g p m v 的毒力类型，将强弱毒株区分开来。并通过对测得的和己发表核酸序列进行遗传系谱分析，可以发现病毒的遗传变异，对病毒加以分型和进行流行病学研究。目前在g e n e b a n k 上公布的g p m vf 基因核苷酸和推导的氨基酸序列共有1 3 个，全部来自中国，其中有一个g p m v 基因组序列，有5 个f 基因全序列，7个f 基因部分序列。随着核苷酸序列测定技术的不断完善，计算机数据库中g p m v 基因序列的不断积累和相对较短序列同样具有代表性的证实，g p m v 系统发育进化树分析的研究将取得显著成绩。31 1 4 5 抗多肽抗体法是一种分子水平的强弱毒株鉴定方法，不仅可以用于野毒致病性分析和定型，还可以用于疫苗株的筛选和疫苗产品的安全性鉴定，具有较高的实用价值。目前其在g p m v 的诊断中的应用正在研究中。1 2g p m v 生物学特性鹅副粘病毒( g o o s ep a r a m y x o v i r u s , g p m v ) 属于副粘病毒科，副粘病毒亚科，腮腺炎病毒属，禽l 型副粘病毒( a v i a np a r a m y x o v r u s - 1 , a p m v - 1 ) 中的成员。g p m v 颗粒为单股r n a ，大小不一，形态不正有囊膜，表面有密集的纤突结构，病毒内部包裹着呈螺旋对称的核农壳，平均直径为1 2 0 - 2 6 0 n m ( 王永坤，1 9 9 8 ) 核衣壳被一个来源于细胞质膜的脂质膜包被，膜内侧是m 蛋白、膜外侧是h n 和f 两个病毒糖蛋白，核衣壳内有l n p 、p 三种结构蛋白包裹着的基因组r n a ，核衣壳内的病毒基因组是负单链r n a ，约1 5 k b 长，9 5 以上是编码区，共编码6 种结构蛋白和3 6 k u ，3 3 k u 非结构碱性蛋白，其基因顺序是3 - n t - p m - f - h n l - 5 7 。分别编码核衣壳蛋白( n u c l e o c a p s i dp r o t e i n , n p ) 、磷酸化蛋白( p h o s p h a t ep r o t e i n , p ) 、基质蛋白( m a t r i xp r o t e i n ，m ) 、融合蛋白( f u s i o np r o t e i n , f ) 、血凝索- 神经氨酸酶( h a e m a g g l u t n i no n e u r a m i n d a s e 。h n ) 和高分子量蛋白( l a r g ep r o t e h l ) 等6 个主要多肽。其中h n 、f 蛋白是两种糖基化蛋白，位于囊膜外表面，分别形成大、小纤突，是重要的宿主保护性抗原。而f糖蛋白也是决定病毒毒力的主要因素，是毒株的重要分类依据。g p m v 抵抗力较弱，在日光、腐败、干燥的环境中易于死亡，绒毛尿囊液中的病毒在冻结条件下可以存活一年以上，但在低温、阴湿条件下生存较久。常规消毒药可以杀死病毒( 吴力力，1 9 9 8 ) 。由于该病毒的h n 蛋白能结合红细胞的表面受体，因此可以凝集红细胞，由此特性可以用h a 和m 试验作为本病毒引起疾病的诊断方法( 刘华雷，2 0 0 0 ) 。刘华雷等( 2 0 0 0 )根据国际上规定的毒力判定标准最小致死量致死鸡胚平均死亡时间( m d t ) 、一日龄雏鸡脑内接种致病指数( i c p i ) 和6 周龄非免疫雏鸡静脉接种致病指数( 1 v p i ) 三项判定指标对y g 9 7 1 、y g 9 7 - 2 、h g 9 7 三株病毒做了毒力试验，表明三个毒株均具有n d v 速发型相类似的毒力，属于强毒力的毒株。陈金项等( 2 0 0 0 ) 报道g p m v q y 9 7 - 1 株血凝活性能被a p m v - 1阳性血清所抑制；李文良等( 1 9 9 9 ) 报道g p m v j g 9 7 能与阳性血清部分中和，而鹅的康复血清亦可部分中和n d v 标准强度株。可见，g p m v 在抗原上与其它a p m v - 1 存在着交叉反应。g p m v 可以在9 加日龄的鸡胚、鹅胚，及鸭胚的绒尿膜和尿囊腔内生长繁殖，并在3 6 4 8 h 内引起胚胎死亡。胚体全身充血，出血。翅和头部等处严重出血，颈部和胸部皮肽毛孔鲜红出血点，脑部特别是小脑出血严重，并伴发脑炎( 王永坤，2 0 0 1 ) 。血凝及血凝抑制( h a h i )实验结果表明，g p m v 鸡胚、鹅胚尿囊传代毒对鸡、鸭、鹅、鸽、小鼠、绵羊、牛蛙、蛇，山羊和人o 型红细胞均有凝集作用，对猪红细胞可凝，不凝集驴红细胞( 吴力力，1 9 9 8 ) 。但鸭胚接种后，其死胚尿囊液不能凝集鸡、人o 型红细胞( 吴虎，2 0 0 1 ) 。4弓f 言图1 - 1 鹅副粘病毒结构模式f i g r l - 1 s t r u c t u r a l p a t t e r n o f g o o s e p a r a m y x o v i r u s1 3g p m v 致病性分子基础近年来随着分子生物学的发展，人们对g p m v 的分子结构和功能的了解取得了突破性进展，揭示了g p m v 两种具有极为重要的免疫原性糖蛋白，分别为血凝素神经氨酸酶糖蛋白( 删) 和融合糖蛋白( f ) ，它们构成g p m v 囊膜的大、小纤突，是病毒粒子吸附到宿主细胞受体及细胞融合所必需的，对机体产生保护性免疫应答十分重要。1 3 1h n 蛋白及其致病力研究h n 基因是由约2 0 0 0 个碱基构成的，占总基因组的1 3 5 。基因序列中含有一个长的开放阅读框架，一般编码约5 7 7 个氨基酸，推测其分子量约为6 3 b ，与推侧出的非糖基化的h n 分子量非常吻合氨基酸序列分折结果表明有6 个潜在的糖基化位点，主要疏水区靠近n 端，表明i - i n 是以n 端与病毒外膜福连接的，多肽的n 端一侧的极性氨基酸的亲水性分析表明其缺乏裂解信号( m i u a rns ，1 9 8 6 ) h n 蛋白对g p m v 的感染有重要作用，g p m v 的感染可被h n 单抗和特异性h n 糖蛋白抗血清所中和( 1 0 r i orm ，1 9 8 4 ) 。应用单抗研究还表明l - i n 的血凝素和神经氨酸酶位点在抗原性上是独立的( u m i n ox 1 9 8 4 ) 在一些n d v 弱毒株，f i n 蛋自是以非活性多肽前体形式( 1 n o ) 合成的，在体内某些细胞系中被裂解成具有括性的i - i n 蛋白，而在大多数n d v 毒株中没有这种前体副粘病毒的h n 糖蛋白，除了n d v 的u l s t e r ，q u e e n l a n d d 2 6 7 6 外，都不需要翻译后裂解性修饰，这几个毒株在h n 0 蛋白的c 端一侧裂解，对i - i n 的活化和产生是必需的( s c h a p e rum ，1 9 8 8 ) 。s a k a g u c h i 等( 1 9 8 9 ) 对已知的1 3 株n d v h n 序列进行对比，尽管各毒株i - i n 基因全长均为2 0 0 0 k b ，但由于预测开放阅读架长度和终止密码位置的差异，其翻译的多肽长度就不同。根据其多肽长度，i - i n 基因编码区有三个亚型：由于预测开放阅读框架长度和终止密码子位置的差异，其翻译的多肽链长短不一，根据其编码区的多肽长度可将其分为三种亚型，长度5东北农业大学农学硕i ：学位论文分别为1 7 1 3 b p ( i t a 4 5 、a u s 3 2 、m i y 5 1 、h e r 3 3 ，c h f 8 5 、i b a a 8 5 ) 、1 7 3 1 b d ( b e a 4 5 、t e x 4 8 、l a s 4 6 、b 1 4 7 ) 、1 8 4 8 b p ( d 2 6 7 6 、q u e 6 6 、u l s 6 7 ) ，分别编码5 7 1 、5 7 7 、6 1 6个氨基酸。其中阅读框较短的i - i n 基因是由阅读框较长的i i n o 基因c 端发生变异而产生的。这些变异也存在于整个i - i n 基因内，其n 端变异较大，在终止密码子前的变异主要发生在密码子的第三位，而在终止密码子后即基因3 7 端非编码区变异最为厉害，并与密码子位置无关。这些变异与不同毒株的致病性相平行，可能导致不同致病性的变异株的不断产生。研究发现i - i n 0 和l - i n 的差异，是由于编码i - i n 基因的终止密码位置不同所致。u l s ，d 2 6和q u e 等的终止密码在1 9 4 0 - 1 9 4 2 位核苷酸，而m i y 株则在1 8 0 5 1 8 0 7 位核苷酸( g o t o hb ，1 9 8 8 ) ，即延长的i - i n 部分在其c 末端。延长的c 末端含有一个潜在的n 连接糖基化位点。加上多糖侧链和多出的蛋白质部分的分子量可以解释h n 和l - i n 0 之间8 k u 和9 k u 的分子量差异( n a g a iy 1 9 7 9 ) 。除了加长部分的n 连接糖基化位点外，h n 尚有5 个糖基化位点，各位点均较保守，以d 2 6 和u l s 为例，它们分别位于1 1 8 1 2 0 ，3 4 1 - 3 4 3 ，4 3 3 - 4 3 5 ，4 8 1 - 4 8 3位氨基酸处，另外在其多肽链上尚约有1 5 个半胱氨酸残基，这些残基对维持f i n 的空间结构有重要作用。l - i n 糖蛋白含有复杂的甘露糖含量很高的与天门冬氨酸连接的多糖侧链( s p f i g g sml ( ，1 9 8 6 ) ，糖基化对i - i n 向膜的转运无作用，但对神经氨酸酶的作用是必需的( m o r d s o n tg 1 9 8 0 ) 。上述1 3 株n d v i - i n 蛋白细胞外区有1 2 个完全保守的半胱氨酸( c ) 残基，分别位于1 7 2 ，1 8 6 ，1 9 6 ，2 3 8 ，2 4 7 ，2 5 1 ，3 4 4 ，4 5 5 4 6 1 ，4 6 5 ，5 3 1 和5 4 2 处，这些c 残基对i 矾蛋白的成熟起着重要作用。m c g i n n e s ( 1 9 9 6 ) 以w e s t e r n - b l o t 、免疫沉淀、免疫荧光和蔗糖梯度沉淀等方法对以上各个c 残基突变的蛋白进行定性分析，结果表明不同的c 残基突变，阻断h n 蛋白成熟的不同阶段。c 1 7 2 或c 1 9 6 突变，仅阻断2 3 抗原位点的出现；c 3 4 4 、c a 5 5 、c 4 6 1或c 4 6 5 突变，除抗原位点4 外，阻断所有其他抗原位点的形成；而c 1 8 6 、c 2 3 8 、c 2 4 7 、c 2 5 1 、c 5 3 1 或1 2 5 4 2 突变，阻断所有位点的出现。成熟的i i n 蛋白是由两个二聚体通过二硫键联接而成的四聚体，目前已经将结构依赖性抗原位点的出现，作为衡量糖蛋白成熟的标准( d o n a s ，1 9 9 3 ) ，首先这是因为所有位点随结构成熟的同时出现；其次，位点在折叠蛋白的局部区域内相对独立；第三，在糖蛋白分子成熟时，位点随一系列折叠过程呈有序地出现。在i t n 蛋白第1 1 9 ，3 4 1 ，4 3 3 和4 8 1 位天门冬酰氨上的4 个潜在糖基化位点保守性极好，5 3 8 位则己知c h i b a 和i b e r a g 株无该位点，有报道证实h n 上的第6 个糖基化位点在b e a u d e o ec 株位于第5 0 0 位残基，而在a u s t r a l i a - v i c t o r i a ，i t a l i e n ，h e f t s ，c h i b a ，l b a r a g i 株位于第5 0 8残基处。n d vi - i n 蛋白还具有一些非保守的c 残基，c 1 2 3 参与i - i n 蛋白二聚体形成，该位点突变不能形成共价键连接的寡聚体，表明该残基负责寡聚体分子间的二硫键。在1 3 株n d vi - i n蛋白序列中，只有a v 株获得一个c 6 残基，因该残基位于蛋白的胞质区，一般认为该残基不可能参与共价键的形成。而h n 0 6 1 6 在5 9 6 位尚存一个c 残基。c o l m a n 等( 1 9 9 3 ) 对流感病毒n a ( n e u r a m i n i d a s e ) 蛋白和副粘病毒i - i n 蛋白序列与结构进行对比，认为h n 蛋白分子折叠与n a 极其相似，也呈b 螺旋折叠，内有四呈反向平行的b 股区域6 个，分别以1 ；1 - 1 ；6 表示。n d v h n 蛋白的这六个相对应的区域可能为：8 1 ，1 7 5- 2 2 8 氨基酸( a a ) 残基处，其含有抗原位点2 3 的残基( 1 9 3 ，1 9 4 ，2 0 1 ) ；1 ；2 ，2 3 7 2 8 8 a a6引言处，含有抗原位点3 的a a 残基( 2 6 3 ，2 8 7 ) ；b 3 ，3 1 6 - 3 9 6 a a 处，含有抗原位点3 ( 3 2 1 ) ，位点1 ( 3 4 5 ) ，位点4 ( 3 3 2 ，3 3 3 ，3 5 3 ) 和位点1 4 ( 3 4 7 ，3 5 0 ，3 5 3 ) 的a a 残基；6 4 ，4 0 1 4 4 3 a a处；b 5 4 7 2 - 5 1 5 处，含有抗原位点2 的u 残基( 5 1 3 ，5 1 4 ) ；b 6 ，在5 2 1 至c 末端的氨基酸残基区域内，其含有抗原位点2 的a a 残基( 5 2 1 ，5 6 9 ) 。m c g i n n e s 等( 1 9 9 3 ) 通过脉冲标记追踪试验，证实在感染的c o s 和鸡胚细胞中，新生i - i n 蛋白需在粗面内质网内折叠成熟并出现抗原位点，这一过程需要消耗a t p 。在成熟的h n蛋白7 个抗原位点中( 即位点1 ，2 ，3 ，4 ，2 3 ，1 2 和1 4 ) ，蛋白的折叠先从b 3 开始，折叠过程至少分两步，第一步形成抗原位点4 ，第二步形成抗原位点1 ；b 2 的折叠与上述第二步同时进行，因此位点3 与位点1 同时出现；接着为b 6 折叠，形成位点2 ；最后为b l 折叠，形成位点2 3 。抗原位点1 4 的出现随感染的细胞类型而异，在鸡胚细胞中，伴随位点2 出现；而在c o s 细胞中，伴随或正好在位点1 ，3 之后出现。h n 基因序列研究表明毒株之间的预测开放阅读框架长度各有不同，然而i - i n 基因的长度却是相同或极为相似。而且那些不编码前体蛋白h n 0 的n d v 毒株的终止密码子之后的密码序列和编码h n 0 的毒株的相同位置的序列极其相似。这些结果提示我们，只合成i - i n 而无前体f i n 的毒株是由于生产h n 0 的毒株在上游获得了终止密码，缩短了开放阅读框架而进化过来的。i - i n 多肽长度的异质性则是由于h n 基因中第一个终止密码子的位置变化造成的但是a u s t r a l i av i c t o r i a 株的开放阅读框架比其它株还要短一点，它在1 8 5 位点处缺失了一个编码酪氨酸( 伽) 的密码子。通过对已发表的基因序列推测出的f i n 蛋白氨基酸序列的仔细研究发现有以下共同特征，被假定为h n 糖蛋白锚定序列的8 4 5 残基是一个主要由疏水氨基酸构成的区域。在此之前就已有关于流感病毒神经氨酸酶及其他副粘病毒f i n 蛋白n 末端锚定序列的报道，与此相似i - i n 蛋白是一个二聚体，由二硫键连接多肽组成，以n 端插入病毒囊膜，在碱基c 端具有受体结合位点，h n 主要负责病毒粒子与细胞受体( 细胞膜上寡糖链末端的神经氨酸) 的结合，并使之破坏。h n 与受体的结合还使f 蛋白充分接近宿主细胞，从而促进病毒与细胞的融合。h n 与受体的结合部位为a s p - a r g - l y s - s e r - c y s s e t ，位于h n 的2 3 4 - 2 3 9 氨基酸之间，神经氨酸酶活性在h n 的中心，而血凝素位点则靠近c 端。h n 蛋白的主要疏水区在n 端，表明h n 是以n 端与病毒外膜相连接的。关于f i n 糖蛋白的受体识别和神经氨酸酶活性之间的结构与功能的关系的研究已有了一定的进展。f i n 蛋白纤突的末端球状体区有许多保守氨基酸残基，这些氨基酸残基进行位点突变时，h n 糖蛋白失去神经氨酸酶活性和受体识别功能。外源表达或与另一个i - i n 糖蛋白共同表达的神经氨酸酶蛋白能部分获得这些蛋白的受体识别活性。这表明突变引起的h n 蛋白受体识别功能的丧失是由具有检测功能的神经氨酸酶活性的丧失所致。上述研究证明f i n 糖蛋白受体识别功能依赖于神经氨酸酶活性。1 3 2f 蛋白及其致病力研究f 蛋白具有使病毒囊膜与宿主细胞包膜融合，进而导致病毒穿入宿主细胞膜的作用，是病毒毒力的主要决定因素。f 蛋白基因全长1 6 6 2 b p ，单一的开放阅读框编码5 5 3 个氨基酸的多肽，分子量为5 9 k u ( t o y o d a t , 1 9 8 7 ) 7东北农业大学农学硕上学位论文f 蛋白首先是以无活性惰性前体f o ( 5 5 k u ) 的形式存在，此时无融合活性，激活融合蛋白活性的先决条件是一个特异的裂解修饰过程。f 0 在复制时需裂解成f 1 和f 2 后，病毒才具有感染性。裂解作用是在f 蛋白合成后，离开粗面内质网进入高尔基体运输小泡前进行，由宿主细胞蛋白酶调理。裂解f 蛋白的酶是宿主细胞内的胰酶样内蛋白酶和b 羧肽酶，胰酶样内蛋白酶在酶切位点切开肽链，胰酶样内蛋白酶切除存在的氨基酸残基，若裂解失败，就产生非感染性病毒颗粒。强毒株的f 蛋白可被多种蛋白酶修饰，而弱毒株的f 蛋白仅能被胰酶样酶修饰，仅限于上呼吸道和肠道细胞中进行。f 0 被裂解后，产生成熟的具有很强融合活性的f l 和f 2 多肽，两者之问仍以二硫键连接，其顺序为n h z - f 2 - s s f 1 c o o h ，其中f 1 分子量为5 5 k u ，f 2 为1 2 5 k u 。f 0 裂解区域( 1 1 2 - 1 1 7 氨基酸残基) 的碱性残基数量决定f 0 蛋白的裂解能力。要使f 0 有效裂解，则在该区域至少要有一对碱性残基，碱性残基越多，这对各种蛋白酶的修饰越敏感，从而促进裂解。因此f 0 裂解区域的氨基酸序列与毒株的毒力强弱密切相关。强毒株裂解区域的氨基酸序列为1 1 2 r r q - k r r f l ”；而弱毒株相对应的氨基酸序列为g e - k r - q 4 3 r l 1 ”( r 精氨酸，x 为赖氨酸，q 为谷氨酰胺。g 为甘氨酸，f 为苯丙氨酸，l 为亮氨酸) 强毒株的f 蛋白具有被谷氨酰胺分开的两对碱性氨基酸( 亮氨酸或精氨酸) ，因而能在各种细胞系中被裂解。弱毒株以中性氨基酸代替了强毒株中的碱性氨基酸，尤其是1 1 2 和1 1 5 位的碱性精氨酸( r ) 或赖氨酸( k ) 被取代。这种f 0 蛋白不易裂解，没有膜融合活性，以非活性形式编入子代病毒中，因而感染性很低或丧失。f 蛋白有三个强的疏水区。第一个疏水区位于1 - 2 5 氨基酸残基处，为f 蛋白n 端信号肽区( s i g n a ls e q u e n c e ，s s ) 大多数毒株f 蛋白氨基酸的变异都集中在信号肽区( 1 - 2 5 a a ) 内。第二个疏水区位于1 1 7 - 1 4 2 氨基酸残基处，为融合诱导区( f u s i o np e p f i d e ，f p ) ，1 1 7