（生物医学工程专业论文）基于荧光猝灭效应的光纤葡萄糖生物传感器的研究.pdf

武汉理工大学硕士学位论文 萄糖和氧的对应关系可以实现对葡萄糖溶液的检测。研究了该传感器的传感 特征、晌应时间、检测范围、传感器的稳定性和重复性等相关性能参数，得 到以下结果：葡萄糖溶液与滞后相移有较好的线性关系，检测的最适p h 值 在6 0 7 0 之间；检测范围是5 0m g , c u 5 0 0m g d l 灵敏度较高，响应时间为 3 0 s e c 左右：传感器的可以保持良好活力1 0 周；对传感器进行的重复性测试 表明本传感器的相对偏差为5 9 尚可基本满足临床检测需要。 关键词：葡萄糖光纤生物传感器醋酸纤维素薄膜荧光猝灭氧光极 i i 武汉理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t f i b e r o p t i cb i o s e n s i n gt e c h n o l o g yi s an o v e l i n t e r d i s c i p l i n e ，i th a s aw i d e a p p l i c a t i o np r o s p e c ti nm e d i c a ls c i e n c e ，b i o l o g i c a le n g i n e e r i n g ，f o o di n d u s t r i e s a n de n v i r o n m e n t m o n i t o r i n g a sf o r t h ed e t e r m i n a d o no fd d u c o s ei nt h ef i e l do f c l i n i c a ld i a g n o s i sa n dp r e c l i n i c a lm e d i c i n e ，e s p e c i a l l yi nt h ed i a g n o s i so fd i a b e t i c p a t i e n t s ag l u c o s e s e n s o ri sc o n s i d e r e dt ob e v e r yd e s i r a b l e n 硷e x i s t i n g t r a d i t i o n a lm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f g l u c o s e h a v es u c hd e f i c i e n c i e sa sl o w s e n s i t i v i t yo rs l o wr e s p o n s et h a tc a l l tm e e tt h en e e do fp r a c t i c a lu s e t h e r e f o r e ， i t sn e c e s s a r yt od e v e l o pam e t h o df o rf a s td e t e r m i n a t i o no f g l u c o s e i nt h i st h e s i s ，w eh a v ed o n ep l e n t yo fe x p e r i m e n t so n d e v e l o p i n gaf i b e ro p t i c g l u c o s eb i o s e n s o rb a s e do nf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gt o r e a l i z ef a s td e t e c t i o no f g l u c o s e o u rm a i n w o r k sa r e ： 1 n l cc a t a l y t i cp e r f o r m a n c eo ff r e eg l u c o s eo x i d a s e ( g o d lw a ss t u d i e da n d s o m eb a s i cp r o p e r t i e so fg o ds u c ha sb e s tp hf o rc a t a l y t i cr e a c t i o n , b e s tb u f f e r c o n c e n t r a t i o na n do p t i m i u o a t e m p e r a t u r e w e l ea c q u i r e d 2 s o m es u b s t r a t e si n c l u d i n gc e l l u l o s ea c t a t e ，m i c r og l a s s b e a d s o p t i c a lf i b e r , s 0 1 g e ls y s t e mf o rg o d i m m o b i l i z a t i o nw e r es t u d i e da n dt h ep e r f o r m a n c eo ft h e i m r n o b i i i z e do o dw e r e c o m p a r e d r e s u l t s s h o w e dt h a tc e l l u l o s ea c t a t e m e m b r a n ec a nm e e tt h en e e d so f f u t u r ef i b e ro p t i cg l u c o s es e n s o ra p p l i c a t i o n s 3 s y s t e m a t i cr e s e a r c hw a sd o n e o nt h ep r e p a r a t i o no fc am e m b r a n e sf o rg o d i m m o b i l i z a t i o n c am e m b r a n e sw e r ep r e p a r e db yd u m p i n ga n ds a l tl e a c h i n g m e t h o d sa n dg o dw e r ei _ w l i t l o b i l i z e do nt h e s em e m b r a n e s p e r f o r m a n c eo f i m m o b i l i z e dg o ds h o w e dt h a tc am e m b r a n e sp r e p a r e db ys a l tl e a c h i n gh a d b e t t e rp e r f o r m a n c eb u tl o w e rr a t eo ff i n i s h e dp r o d u c t s ，w h i c hm e a n st h a tt h i s m e t h o d sc a nn o tb e p u ti n t om a s s p r o d u c t i o nb u to n l y f o rl a b o r a t o r yu s e s 4 t h es t r u c t u r eo fc am e m b r a n e s ，i m m o b i l i z a t i o na n dr e a c t i n gc o n d i t i o n sa l e t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r so ft h ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dg o d c o v a l e n tb i n d i n ga n d c o v a l e n t - c o u p l i n gm e t h o d sw e r ee m p l o y e da n dt h e e f f e c t so fa c t i v i t yo fg o d m e m b r a n e sw e r ec o n t r a s t e d t h ew h o l ei m m o b i l i z i n gp r o c e s sa n dw a ss t u d i e d a n do p t i m i z e di n c l u d i n ge f f e c t so fa c t i v a t i n gc o n d i t i o n s ，g l u t a r a l d e h y d e ( g a ) ， a l b u m i no fb o v i n e s e r n l t l ( b s a ) ，g o dl o a d i n g ，e t c r e s u l t s s h o w e dt h a t l l i 武汉理工大学硕士学位论文 c o v a l e n t - c o u p l i n gi st h eb e s tw a y t oi m m o b i l i z eg o d 5 _ w ed e v i s e daf i b e ro p t i cg l u c o s eb i o s e n s o rb a s e do nf l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g c e l l u l o s ea c e t a t e ( c a lw a sc h o s e na ss u b s | l r a t ea n d r u c o p v ) 3 c 1 2 a sf l u o r e s c e n c e d y e f l u o r e s c e n c ew a sb o mb ye x i t e di i g h tf r o ml e d ( 4 1 6 n m ) v i ab i f u r c a t e d f i b e ro p t i cb u n d l e sr e a c h i n gt h es e n s o rh e a dw h i c hw a si m m e r g e di n g l u c o s e s o l u t i o n t h e nt h e1 i f et i m eo ff l u o r e s c e n c ew h i c hw a sd y n a m i c a l l yq u e n c h e db y m o l e c u l a r o x y g e n w a sm e a s u r e dw i t han o v e l “l o c k i n p h a s ea m p l i f y i n g t e c h n o l o g y t h ep e r f o r m a n c e o ft h es e n s o rw a s i n v e s t i g a t e di n c l u d i n g r e s p o n s e ( 1 e s s t h a n3 0 s ) ，a n a l y t i c a lr a n g e ( 5 0 m g d lt o5 0 0m g d 1 ) ，r e p e a t a b i l i 吼b e s t p hr a n g e ( b e t w e e n6 ，0 t o7 o ) a n dl i f e t i m eo ft h es e n s o r ( a tl e a s t10w e e k s ) ，e t c r e p e a t a b i l i t yt e s t ss h o w e dt h a tt h er e l a t i v ed e v i a t i o no ft h i sg l u c o s es e n s o ri s 5 9 w h i c ht u r n e do u tt ob ed e s k a b l ef o r p r e c l i n i c a lu s e k e y w o r d s ：g l u c o s e ，f i b e ro p t i cb i o s e n s o r , c e l l u l o s ea c e t a t e ( c a ) m e m b r a n e ， f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g ，o x y g e n o p t r o d e i v 武汉理工大学硕士学位论文 第一章绪论 当今社会是信息化的社会，信惠技术对社会发展和科技进步起决定性的 作用。现代信息技术的基础是信息的采集、传输和处理，相对应为传感技术、 通信技术和计算机技术。而作为现代信息技术三大核心技术之一的传感技术， 处于信息采集系统的最前沿，它的性能将直接影响整个信息系统准确性和正 确性。 光纤传感技术是上世纪7 0 年代末随着光纤的实用化和光通信技术的发 展而形成的。自从1 9 7 0 年美国康宁公司成功研制处世界上的第一根实用化的 传输损耗为2 0 d b k m 的石英光纤以来，在短短几十年中，光纤通信迅速发展 成为通讯领域的一大产业。然而在光通信过程中，由于光纤易受到温度、压 力等环境因素的影响，而导致光强、相移、频率等光波参数的变化，这对通 信应用是不利的，但却因此而构成了一种新的信息交换的基础，并演绎出一 门全新的技术光纤传感技术。光纤传感技术是一门多学科性技术，可以 测量多种物理量、化学量和生物量，具有广阔的发展前景。 近年来，基于生物识别元件的光纤传感器引起科学研究人员的极大兴趣， 这是由于其在高灵敏性和高选择性的化学分析的发展中有着非常重要的作 用。根据定义：光纤生物传感器是一种集成化的器件，它能够利用生物识别 元件( 生物化学受体如：酶、抗体、核酸、细胞等) 对被分析物来进行定量 或半定量的分析，是一种具有高度选择性的现代化分析仪器。其中，生物识 别元件和换能器有直接的空间接触，它通过光学换能器捕捉目标物与敏感基 元之间的反应，然后将反应的程度用离散或连续的数字电信号表达出来，从 而得出被分析物的浓度。 1 1 光纤生物传惑器简介 光纤生物传感器是指以光学换能器为基础的生物传感器，主要由产生信 号的敏感元件、光学换能器( 又称为“光极”) 和信号处理仪器等几部分组成。 光纤生物传感器的光极多种多样，如吸收光谱、反射、折射率变化、荧光、 磷光、散射、消失波和表面等离子共振( s p r ) 等各种形式”。按照生物受 l 武汉理工大学硕士学位论文 体元件的性质分，光纤生物传感器可分为五大类 2 1 ，即酶传感器、免疫传感 器、核酸传感器、细胞器或全细胞传感器和仿生受体传感器。 光纤生物传感技术则是一门新兴的交叉学科，它是在生物工程和各种技 术学科相互渗透的基础上发展起来的，主要涉及到l 临床医学、生物化学、材料 科学、微电子学和光学等多门学科。由于基于“光极”的光纤生物传感器具 有探头直径小，信息传输容量大，能量损耗低和抗电磁干扰能力强等重要优 点，在医学l 临床、生物工程、食品工业、环境监控乃至军事等方面有广泛而 巨大的应用前景。 光纤生物传感器诞生于2 0 世纪八十年代，是在电化学生物传感器的基础 上发展起来的，从9 0 年代初开始，各类光纤生物传感器的研制开发成为生物 传感器的发展热点，在光纤生物传感器的组成部分方面( 分子识别系统、换 能器系统、传感膜基质和传感动力学等) 的研究不断涌现新的成就。许多生 物元件，如受体，抗原、抗体、酶、核酸、d n a ，微生物，动植物组织和细 胞等，都成功的用与传感器的分子识别系统，通过荧光、磷光、消失波，化 学和生物发光等信号进行检测，灵敏度已达较高水准p 1 1j 。光纤生物传感技 术的蓬勃发展使之成为光纤传感技术的一个重要分支。 1 1 1 光纤生物传感器的原理 光纤生物传感器的原理分成两个部分：( 1 ) 生物功能物质的分子识别： 光纤生物传感器的原理是以生物功能物质的分子识别为基础的，用固定化的 生物活性物质和底物作用进行分子识别【1 2 1 。例如：酶是一种高效的生物催化 剂，酶传感器就是基于酶促反应来进行生物识别的， 酶+ 底物_ 酶底物中间复合物_ + 产物+ 酶 ( 1 ) 由于酶分子具有一定的空间构型，只有当底物的结构与酶的一定部位上 的构型吻合时，才可能发生酶促反应。细胞器、微生物及动物组织等是分子 集合体，结构比较复杂，其识别功能亦复杂。 ( 2 ) 传感器的信号转换：简单的说，就是光换能器，又称“光极”。经 过分子识别后产生的生物信号经过换能器将生物信号变成光信号，然后再经 2 武汉理工大学硕士学位论文 过光电转换装置转化成电信号( 数据) 输出。如图1 所示 被测物 生物受体( 分子识别 光极 电信号 图1 光纤生物传感器的原理 1 1 2 光纤生物传感器的基本结构 光纤生物传感器其主要组成部分是光导纤维( 光纤) 、光源、光电元件， 产生信号的敏感元件和处理信号的辅助仪器两部分组成的，其中敏感元件是 仪器的核心。就光纤生物传感器而言，它的敏感元件主要由两部分组成：敏 感基元和光换能器。 敏感基元指的是对目标物进行选择性作用的生物活性单元。最先被使用 的是具有高度选择催化活性的酶。酶或是以物理方法( 包埋、吸附等) ，或是 以化学方法( 交联、聚合等) 固定在传感器的敏感膜中，然后以光极作为换 能器测定酶催化目标物反应所生成的特定产物的浓度，从而间接地测定目标 物的浓度。随着物理检测手段的引入，人们已成功地把抗体、d n a 聚合物、 核酸、细胞受体和完整细胞等具有特异选择性作用功能的生物活性单元用作 了敏感基元【l4 】。 换能器指的是能捕捉敏感基元与目标物之间的作用过程，并将其表达为 物理信号的元件。本文所讲到的“光极”就是光学换能技术，主要有：表面 等离子共振技术( s p r ) 、内反射光谱法、荧光猝灭技术、m i r 光纤光谱法、 消失波法( e v a n e s c e n tw a v e ) 、基于散射原理的散射法、傅立叶转换红外光谱 法( f t i r ) ，荧光偏振法等【l “。 3 武汉理工大学硕士学位论文 对于利用光导纤维本身具有的某种敏感特性或功能的光纤生物传感器而 言，光纤既光的传输媒介，又是敏感元件，此类传感器直接将主要生物活性 单元固定在光纤上，靠被测对象调制或影响光纤的传输特性( 如相位、偏报 光面，反射等) ，来达到检测目的，结构更简单。 1 1 3 光纤生物传感器特点 光纤生物传感器有其特有的特点【婚1 7 】：( 1 ) 光纤及探头均匀可微型化， 生物兼容性好，加之良好的柔韧性和不带电的安全性，使之特别适用于生物 和临床医学上的实时、在体检测。 ( 2 ) 光纤传输功率损耗小，传输信息容量大，抗电磁干扰，且耐高温、 高压，防腐蚀，阻燃防爆，使之可用于远距离遥测和某些特殊环境的分析。 ( 3 ) 可采用多波长和时间分辨技术来提高方法的选择性，可同时进行多 参数或连续多点检测，以获得大量信息。 ( 4 ) 适当选择生物化学试剂及其固定方法，可检测多种物质，灵活性很 大。 ( 5 ) 不需要电位法的参比电极。当用廉价的光源照射样品时，成本可大 大降低。 ( 6 ) 在大多数情况下，光纤生物传感器不改变样品的组成，是非破坏性 分析。 1 。2 光纤葡萄糖传感器的研究进展 1 2 1 光纤葡萄糖传感器的研究背景 人体血液中的各种化学成分一直是评价人体健康状况的重要信息。而血 糖水平则是衡量新陈代谢水平的重要指标之一。据w h 0 1 9 9 7 年报告，1 9 9 5 年全球有1 2 5 亿的糖尿病患者，仅中国就有糖尿病患者2 0 0 0 多万人，而且 现今世界糖尿病的发病率有急剧升高的趋势，预测到2 0 2 5 年世界糖尿病患者 将猛增至2 9 9 亿。糖尿病已跃居世界上发病率和病死率最高的五大疾病之一 武汉理工大学硕士学位论文 ”。糖尿病的并发症不仅影响患者的生活质量，严重者还可致死、致残。由 此可见，实行对糖尿病患者血糖水平的监测，寻求糖尿病的有效疗法成为人 类面临的一个严峻课题，对检测手段的研究和相关仪器的开发则毫无疑问是 医用检测技术的焦点之一，对于葡萄糖快速灵敏的检测在临床检验中具有十 分重要的意义。人体的正常血糖水平为8 0 - 1 2 0 ( m g d 1 ) ，当人的空腹血糖水 平高于1 3 0 r e a d l 时则被成为高血糖症( h y p e r g l y c e m i a ) ，血糖高于1 6 0m g a l 时则出现尿糖【l 。研究表明，对于胰岛素依赖型( i 型) 糖尿病人而言，严 格控制其血糖水平在正常的生理水平有利于降低其长期并发症的发作程度。 因此，长期监测血糖以控制饮食和胰岛素的注射量，维持正常的血糖水平是 非常必要的。 另外，在食品工业上，特别是在工业发酵的过程中，往往需要很好的控 制发酵底物和产物的水平，最常见的是控制母液中葡萄糖的水平，那么就需 要能够快速有效且精度高的葡萄糖生物传感器阵列来进行实时在线监测。 自从1 9 6 2 年世界上第一台由氧电极组成的葡萄糖传感器问世以来【2 ，人 们对基于氧电极的电化学葡萄糖传感器进行了广泛的研究。随后的二十年间， 人们对葡萄糖传感器特别是电化学的葡萄糖传感器进行了大量系统而广泛的 研究，涉及到固定化方法、膜的组成、电极的修饰、反应池的设计等方面。 特别是在传感器的传感膜制备和检测方法等方面进行了改进。然而，电化学 葡萄糖传感器仍然存在不少缺陷。例如，由于这类传感器是基于电化学原理， 传感层必须在液态环境下工作，这就使传感膜很容易损坏，导致传感器的使 用寿命较低。再如，由于传感器的电信号很弱，并且容易受外部电、磁场影 响，使传感器的使用范围受到限制，尤其无法在恶劣环境中使用。还有，由 于这类传感器检测葡萄糖时必须使氧电极达到电化学平衡，故使其响应速度 较慢。电化学葡萄糖传感器的这些缺陷，制约了它们在实际中的应用。直到 二十世纪八十年代随着光通讯技术的飞速发展，人们开始尝试把光学换能器 ( 光极) 引入生物传感器的研究中来，于是人们又开始了对基于光极的葡萄 糖传感器进行研究，揭开了光纤生物传感器的研究序幕。从八十年代末开始， 人们对光纤葡萄糖传感器进行了大量的研究，希望使之商品化以取代基于电 化学的葡萄糖传感器。 茎竖望三奎堂堕圭堂垡笙奎 1 2 2 光纤葡萄糖传感器的原理及其分类 人们研究的光纤葡萄糖传感器，其原理绝大多数都是基于葡萄糖与氧气 之间的酶促反应： 葡萄糖+ 0 ，马葡萄糖酸+ 何：o ： ( 1 ) 这是个耗氧反应，据此可以通过检测氧气的消耗量，或者检测过氧化氢 的生成量来实现对底物的测定。由检测对象的不同光纤葡萄糖传感器可以分 成两大类，即： ( 1 ) 通过检测过氧化氢的生成量来实现葡萄糖含量测定：陕西师大的 章竹君 2 i - 2 2 等人利用葡萄糖的酶促反应生成过氧化氢，用流动注射化学发光 法测定生成的过氧化氢，继而实现对底物的测定。 鲁米诺+ h ，o ，兰型马h y ( 2 ) 该法利用葡萄糖通过固定化酶柱后转化生成的过氧化氢和化学发光液作用而 发光，通过测定光强的变化来测定葡萄糖含量。他们对1 0 m g l 的葡萄糖溶 液进行1 1 次平行测定，相对偏差3 8 检测下限为o 1 r a g e ，此光纤葡萄糖 传感器寿命大约半个月。 m e n m d a k u m o ”1 等人也是通过利用流动注射化学发光法来实现对工 业发酵过程中肉汤中的较低浓度的葡萄糖的监测，其检测限为0 1 5 m g l ， 传感器寿命大约是1 8 0 2 0 0 小时连续使用。 ( 2 ) 通过检测耗氧来测葡萄糖含量：此类传感器的原理是在酶促反应体 系中加入定的荧光试剂，由于分子氧对荧光有猝灭作用，不同浓度的氧气 对荧光的猝灭效果也不同，则利用耗氧使得荧光强度发生变化，从而实现对 底物的检测。s d em a r c o s 冽等人就是利用分子氧的荧光猝灭原理设计出了 一种将葡萄糖氧化酶固定在溶胶凝胶体系中的光纤葡萄糖传感器。他们将用 荧光黄衍生物标记过了的葡萄糖氧化酶固定在溶胶凝胶阵列中，然后与不同 浓度的葡萄糖溶液反应检测到不同的荧光强度。该传感器的检测限是 1 0 0 1 0 0 0 m g l ，寿命为半个月。同样的m a m nm f 】等人也设计出了基于“氧 光极”的光纡葡萄糖传感器。 6 武汉理工大学硕士学位论文 1 。2 3 光纤葡萄糖传感器的研究进展 对于光纤葡萄糖传感器来说，一种性能良好的敏感膜及经过优化的反应 条件对传感器的寿命、灵敏度和精度的提高具有重要的实际应用价值。对此 人们从各个角度进行了大量的研究工作。 在使用“氧光极”的方面，人们试用了很多种荧光试剂，最早使用此方 法的是w j l 龟a n gt r e t 廿l a k 2 s 和他的合作伙伴，他们利用十环烯作为荧光指示 剂，然后将之溶于甲苯中，与预聚的硅树脂、聚酯等混合并聚合，然后再经 过一些处理步骤作成荧光试剂膜并讨论了加入的十环烯的量以及荧光膜的厚 度与所产生的荧光光强的关系。环糊精，氨基荧光素也是一种好的荧光指示 剂而被用于氧光极体系的构建，后来由于钌( i i ) 的配合物作为荧光试剂具 有高的荧光效率和稳定性而被研究人员普遍采用，a l e x a n d e r 还特地对钉( i i i ) 和锇( 1 3 i ) 的配合物在葡萄糖的酶促反应中的动力学进行了研究 2 7 1 , 发现荧光 效率和稳定性 r u ( b p y ) 2 c 1 2 + 【o s ( p h e n ) 2 c 1 2 + o s ( 4 ，4 一m e 2 b p y ) 2 c 1 2 + o s ( 4 ，7 m e 2 p h e n ) 2 c 1 2 + 。 在制各固定化的葡萄糖氧化酶膜方面，固定方法有物理包埋法、共价结 合法、交联法等。a o j u r lw u 2 8 】等用溶胶凝胶技术固定葡萄糖氧化酶， r u ( d p p ) 3 ( d s ) 2 作为荧光试剂来制作敏感膜，从丽对葡萄糖进行检测，对传感 器的综合性能进行了测试，其线性范围为o 0 6 3 0 m m o l d m 3 , 在p h 5 8 ，温度 低于4 0 。c 下可以工作，重复性和稳定性( 保存9 个月) 良好，其他物质的存 在对传感器无干扰。但是这种传感器响应时间较长，需要5 8 分钟，不能满 足临床在体检测的需要，可能的用途是在食品和饮料中葡萄糖的检测。 w o l f g a n g t r e t t n a k 冽尝试把葡萄糖氧化酶固定在尼龙6 - 6 上，采用十环烯作荧 光试剂来制成敏感溶液进行检测，得到的线性范围是o 1 2 0 m m ，传感器的工 作范围是p h 4 7 ，5 ，但是他设计的光纤葡萄糖传感器仍然响应比较慢( 1 6 分钟) 。l i nl i 和他的合作者【3 田用聚羟乙基甲基丙烯酸脂作为基体材料固定葡 萄糖氧化酶，荧光指示剂r u ( p h 2 p h e n ) 3 c 1 2 用光聚合法固定在活化好的玻璃光 纤上，对葡萄糖溶液测试取得了不错的效果，响应明显加快( 9 2 8 s ) ，检测 限为o 6 m m ，但是传感器的稳定性却明显很差，只能使用2 天。m a r t i nm f 将g o d 固定在蛋壳上，把荧光试剂 r u ( d p p ) 3 ( 4 一c l p h ) 4 b h 固定在硅胶和硅树 武汉理工大学硕士学位论文 脂中，对光纤葡萄糖传感器的各方面性能如溶解氧的含量、温度、口h 值、缓 冲溶液浓度以及一些干扰因素进行了详尽的研究，随着葡萄糖溶液中溶解氧 的增加，检测范围也随着增g h 该传感器的工作最佳温度在2 1 5 。c ，温度太 高可使酶失活；传感器的工作p h 范围较宽，为4 1 0 之间；最佳缓冲溶液浓 度为1 0 0 r e t o o l d i n 3 ；稳定性也比较好，可以工作3 5 个月，重复性很好。该 传感器不受其他物质的干扰，在饮料样品的检测中效果不错，不过也存在响 应比较慢的缺点( 5 分钟) 。另还有人直接将葡萄糖氧化酶固定在多孔光纤上， 取得了不错的效果。 人们对不同检测方法进行了研究。有人用流动注射发光法测定葡萄糖的 光纤传感器口”“，虽然该法具有灵敏、迅速、准确、重复性好等优点，由于 流动注射法本身需要用发光液和辅助液，虽然研究人员用化学发光法检测尿 糖和血糖1 3 ”，但是只能进行离体检测或在发酵工业中应用，在临床在体检测 上没有用武之地。更多的是根据荧光猝灭效应来实现检测葡萄糖含量的光纤 传感器【3 4 。扪，因为这类光纤葡萄糖传感器能够把敏感基元固定在膜或者直接 固定在光纤上，所以这种传感器有希望被应用于医学临床在体检测上。 在多组分测量方面也取得了一定进展，最容易实现的就实现氧气和葡萄 糖双重检测日剐，由于这种传感器本身就是在氧光极的基础上加一层酶膜，所 以检测到的葡萄糖的浓度实际是由溶液中耗氧所反应的。还有人设计了同时 测量葡萄糖和果糖( 双组分测量) 的光纤生物传感器口”。r o s e n z w e i g 等人对 光纤葡萄糖传感器的尺寸效应与传感效果之间的关系的研究p ，作者把葡萄 糖氧化酶和荧光试剂通过共价法固定在光纤上，然后测试葡萄糖溶液，发现 随着传感探头直径的减小，光纤所接收到的荧光光强也减小，但是检测限可 以达到1 0 “5 m o l ，而且响应时间非常短，只需要2 s ，其检出限高出一般光纤葡 萄糖传感器5 6 个数量级，很有实用前景。d a g o u g h 3 9 等人对光纤葡萄糖 传感器阵列的研究对实现利用光纤葡萄糖传感器对糖尿病人血糖的监控起到 了推动作用。 另外l h e i n e m a r m 4 0 j 等人还设计了一种无创连续在体监测的光纤葡萄糖 传感器，其原理是基于葡萄糖特有的中红外区( m i r ) 的光谱吸收，不同浓 度的葡萄糖溶液，对于通过的某一波长光的吸收不同导致通过的光强的衰减 呈一定关系变化。由于该法需要价格昂贵的光谱仪，故在实用化和产品化方 r 武汉理工大学硕士学位论文 面会遇到很大困难。 1 2 4 光纤葡萄糖传感器的市场背景 目前，用于医疗上的葡萄糖传感器的市场非常广阔，1 9 9 6 年世界生物传 感器市场为$ 5 0 8 ，0 0 0 ，0 0 0 ，2 0 0 0 年世界生物传感器市场则激增为大约 $ 1 5 ，0 0 0 ，0 0 0 ，0 0 0 ，而葡萄糖传感器的市场则占了8 5 以上，其中a b b o t t ( m e d i s e n s e ) ，b o e h r i n g e r ( r o c h e ) ，b a y e r , l i f e s c a n ( i n v e r n e s sm e d i c a l ) 这四家公 司占据着葡萄糖传感器的主要市场，且葡萄糖传感器的样式五花八门，有单 组分测量的钢笔型、游戏机型、以及手机型的，也有用于多组分测量的遥控 器型，还有用于连续在线监测血糖的手表型的。中国还没有出现很成熟的产 品，只有研究人员曾经报道过一种家庭用便携式快速血糖仪，但无具体产 品。虽然目前市面上有这许多检测血糖浓度的仪器，但大多数是基于电化学 的葡萄糖传感器，此类葡萄糖传感器仍然存在不少缺陷，制约了它们在实际 中的应用。目前现有的光纤生物传感器都是国外生产的，其中以美国，英国 和德国为主，国内尚无光纤葡萄糖生物传感器的产品出现。因此，光纤葡萄 糖传感器将具有很大的发展空间和市场应用前景。然而光纤葡萄糖传感器在 大规模开发尚存在着一些问题。虽然光纤葡萄糖传感器的研究时间很长，但 是目前还没有进入产业化阶段，原因很多，其中光纤元件及探头的制造以及 微型化的检测设备是影响光纤葡萄糖传感器实现市场化的主要原因之一。另 外，探头的制造技术仍然是急待解决的问题，实验室容易实现的技术在工业 化生产中则不一定可行。因为它难以进行自动化生产，需要熟练的人工操作， 价格偏贵。 1 3 选题的目的、意义及主要内容 本论文课题为：“基于荧光猝灭效应的光纤葡萄糖生物传感器的研究”， 是由武汉理工大学光纤传感技术研究中心的武汉市科委国际合作项目“光纤 化学与生物传感器的研究与开发”资助的。 传统的葡萄糖的检测方法是基于氧电极的电化学葡萄糖传感器，自从 1 9 6 2 年世界上第一台由氧电极组成的葡萄糖传感器问世以来，人们对此进行 武汉理工大学硕士学位论文 了广泛的研究。随后的二十年间，人们对葡萄糖传感器特别是电化学的葡萄 糖传感器进行了大量系统而广泛的研究，涉及到固定化方法、膜的组成、电 极的修饰、反应池的设计等方面。然而，电化学葡萄糖传感器仍然存在不少 缺陷。例如，由于这类传感器是基于电化学原理，传感层必须在液态环境下 工作，这就使传感膜很容易损坏，导致传感器的使用寿命较低。再如，由于 传感器的电信号很弱，并且容易受外部电、磁场影响，使传感器的使用范围 受到限制，尤其无法在恶劣环境中使用。还有，由于这类传感嚣检测葡萄糖 时必须使氧电极达到电化学平衡，故使其响应速度较慢。电化学葡萄糖传感 器的这些缺陷，制约了它们在实际中的应用。 与电化学的生物传感器相比，光纤生物传感器有其特有的特点：( 1 ) 光 纤及探头均匀可微型化，生物兼容住好，加之良好的柔韧性和不带电的安全 性，使之特别适用于生物和临床医学上的实时、在体检测。( 2 ) 光纤传输功 率损耗小，传输信息容量大，抗电磁干扰，且耐高温、高压，防腐蚀，阻燃 防爆，使之可用于远距离遥测和某些特殊环境的分析。( 3 ) 可采用多波长和 时间分辨技术来提高方法的选择性，可同时进行多参数或连续多点检测，以 获得大量信息。( 4 ) 适当选择生物化学试剂及其固定方法，可检测多种物质， 灵活性很大。( 5 ) 不需要电位法的参比电极。当用廉价的光源照射样品时， 成本可大大降低。( 6 ) 在大多数情况下，光纤生物传感器不改变样品的组成， 是非破坏性分析。 本课题是基于荧光猝灭效应的光纤葡萄糖生物传感器，使用的是光学换 能器( 即“光极”) ，可以改善现有的电化学葡萄糖馈感器的一些缺陷，使之 能够进行快速准确的实时检测葡萄糖的含量，具有较高的临床医学应用和工 业应用价值。另外，荧光式光纤葡萄糖生物传感器的市场前景十分广阔，( 可 望取代传统的电化学葡萄糖传感器) ，国外研究的比较多而国内对此研究较 少，目前国内尚无产品出现，它的研制成功及商品化，能够填补光纤葡萄糖 传感器产品的国内空自，能带来可观的经济效益，符合“科技成果商品化和 产业化”的原则，具有一定的现实意义。 由此可见，选择“基于荧光猝灭效应的光纤葡萄糖生物传感器的研究” 这个课题是具有一定现实意义的：一方面可以推动此项工作在国内的研究， 为中国加入w t o 后医疗器械行业走自主研发之路奠定一定的基础；另一方 面，它的研制成功及商品化将是广大糖尿病患者的福音，具有较高的临床医 学应用价值，且能带来可观的经济效益，符合“科技成果商品化和产业化” 武汉理工大学硕士学位论文 的原则，具有较高的应用价值。 本论文的研究目标：对于基于荧光猝灭原理的光纤葡萄糖生物传感器， 利用比较新颖的锁相放大技术和相移法对弱荧光进行检测，研究并优化敏感 基元的固定化技术以实现对不同浓度的葡萄糖溶液的精确检测。通过选择不 同的固定化方法制备传感探头，确定最佳的固定方法和制备工艺，并探讨方 法、工艺与光纤葡萄糖传感器传感性能的关系，研究可能的影响因素。 本论文的研究内容为： 1 、研究了溶液状态下游离葡萄糖氧化酶的催化特性，对葡萄糖氧化酶 ( g o d ) 固定的载体进行了研究，在载体选择上选择了醋酸纤维素( c a ) ， 玻璃微珠光纤，溶胶凝胶体系等三种载体，比较固定g o d 的效果并选择一种 合适的载体。 2 、选定固定g o d 的载体后，进一步对固定条件和反应步骤进行优化， 找出最佳的固定葡萄糖氧化酶的方法。 3 、荧光试剂薄膜的制备，传感系统构建及测试：将荧光膜和敏感酶膜镀 在丫形光纤束的顶端，丫形光纤束一端连发光二极管，另一端连锁相放大系 统，则构成了光纤葡萄糖传感器，然后把探头放在不同浓度的葡萄糖溶液中 去进行动态和静态测定。 4 、实验数据分析及讨论：( 1 ) 传感器的响应特性( 2 ) 传感器的测量范 围( 3 ) p h 对结果测定的影响( 4 ) 温度t 对结果测定的影响( 5 ) 其他影响 因素( 6 ) 酶膜的稳定性和传感器的重复性( 7 ) 传感器测定的可靠性。 武汉理工大学硕士学位论文 第二章葡萄糖氧化酶( g o d ) 的固定化方法研究 2 1 生物传感膜的特点及研究概况 所谓生物传感膜( b i o r n e m b r a n e ) 就是经过某种工艺过程制备的一类产品， 其中含有被固定在天然的或合成的聚合物上的分子识别元件( 如酶等) ，使包 含某种底物的化学物质与生物传感膜上包含的分子识别元件发生反应。 2 1 1 膜的分类 膜的分类【4 2 】方案目前尚不统一，较通用的膜分类方案如下： ( 1 ) 按成膜所用的材料划分，可分为有机膜( 含高分子膜) 、无机膜、金 属膜、复合膜等。其中应用最多的是有机聚合物薄膜。主要有聚氯乙烯、 聚苯乙烯、葡聚糖、纤维素酯( 包括硝酸纤维素、醋酸纤维素以及纤维 素的衍生物) 等天然或人工合成的各种高分子膜。 ( 2 ) 按膜的功能划分，可分为分离膜、超滤膜、敏感膜、固定化膜、隔 膜、仿生膜、功能膜等。 ( 3 ) 按膜相划分，可分为均相膜和非均相膜。 在生物体内，化学反应及能量交换都是在膜表面进行的，以膜为主的生 物传感器，其生化反应及能量转换也是在膜表面进行的。 2 1 2 生物传惑用膜的特点 由于生物传感器的发展趋势将朝着高精度、微型化、集成化等方向发展 所以生物传感用膜必须满足以下要求 4 3 】： ( 1 )可以重复使用不稳定的分子识别物质； ( 2 )可以直接分析样品； ( 3 ) 分析操作简单； ( 4 )只需微量的样品； 武汉理工大学硕士学位论文 ( 5 ) 除缓冲液外不再需要其它试剂； ( 6 ) 不要求样品的清晰度； ( 7 ) 可以实现自动狈4 量。 我们设计光纤葡萄糖生物传感器是基于如下反应： 葡萄糖+ o ，马葡萄糖酸+ 日，o ， 式中，g o d 为葡萄糖氧化酶。由上式可知，葡萄糖和氧的消耗量成一比 一的关系，而耗氧量的多少与对氧敏感的荧光试剂的光强( 相位) 的变化成 特定的关系，据此可间接地确定葡萄糖的含量的高低。 本研究中所采用的膜必须满足以下要求： ( 1 )含有一定量的活性基团 ( 2 )有良好的生物相容性。这一点可保证酶在固定化后能长期地保持较 高的活性。 ( 3 )有良好的选择透过性，这一点可保证固定化酶及时、快速地与底物 进行反应，并使反应产物及时地脱离固定化酶表面。 2 1 3 几种常见的成膜方法 成膜的方法很多，成膜方法关系着膜的厚度、致密性、均匀度与分子排 列的有序性等性能，常用的成膜方法【4 2 1 如下： ( 1 ) l b 膜法：l b 膜是一种单分子膜，它是将羧基亲水性基团作为头， 烷基键等长的疏水性集团作为尾的分子在水面上以单分子层展开， 在分子间彼此相互作用下，使之进行二维有规律排列之后移到固体 基片上面形成的膜。 ( 2 )核孔膜法：由重离子束在绝缘物质薄膜上打孔和化学蚀刻扩孔而 成的。 ( 3 )化学气相沉积法( c h e m i c a lv a 口o u rd e p o s i t i o n ，c v d ) ：主要原理是 把含有待制薄膜成分中一种以上的气体从储气瓶中导入真空室，然 后加热气体，使其发生化学分解或合成，产生低蒸气压物质，在基 片上析出成膜。 武汉理工大学硕士学位论文 ( 4 ) 电聚合膜法：该法主要用于酶电极生物传感器中酶的固定。其原 理是在电解聚合过程中，导电聚合物某些单元容易被氧化，氧化态 的高分子膜的正电荷常呈分散分布，而许多酶或生物细胞在中性的 缓冲溶液中具有阴离子位点，这使得酶或生物细胞能以离子键与导 电高分子结合，以保持高分子链的电中性。 ( 5 ) 溶胶一凝胶法：该法较成熟，是将金属醇盐与酶或其它蛋白质等 原料配制成均质溶液，在饱和条件下经水解缩聚等化学反应，生成 物聚集成溶胶，再经蒸发干燥转变为凝胶。 ( 6 )倾注成膜法：该法发展较早，简单易行。具体操作是把制膜用的 材料和改性用的材料溶于某一有机溶剂中，混合均匀后，将溶液直 接倾倒于基片上，待溶剂挥发完后，便制得了所要的膜。 ( 7 )盐析法：盐析法是制备多孔性材料的常用方法，其原理是采取某 种方法将材料中含有的盐类去除，从而在材料中形成多孔的状态。 2 2 酶固定化技术 2 2 1 酶与固定化酶的特点 酶( e n z y m e ) ，是生物体产生的具有催化能力的蛋白质，它与生命活动 息息相关。由于酶的存在使生命赖以存在的很多化学反应能在生理条件( 常 温、常压和中性的环境) 下迅速完成。毫无例外，所有的酶皆是蛋白质，常 常是很脆弱、不稳定的高分子量蛋白质，由各种氨基酸通过肽键连接而成的a 酶的催化活性与肽链折叠形成的精密构象有关，在这种特殊的结构中即使出 现微小改变亦可导致变性和失活】。另外，酶的催化作用除具有一般催化剂 的共性外，还有自身的特点：催化效率高、专一性高以及条件温和。 我们知道，酶促反应一般在溶液游离状态下进行，它通常有两个缺点： ( 1 ) 酶在溶液游离状态下其活性易受外界条件的干扰，如酸碱度、离子 强度等，极易失活。 ( 2 ) 酶在使用后难回收，在生物合成、酶法分析过程中消耗很大，代价 昂贵。 1 4 武汉理工大学硕士学位论文 i 司此，人们对固定化酶的兴趣主要集中在它的分析应用方面，国内外学 者对如何使酶固定在各种载体上( 酶固定化技术) 做了大量系统的研究。应 用于生物传感器中的酶固定技术必须满足如下几个条件：( 1 ) 被固定到传感 器上时，被固定的生物成分仍保持很高的生物活性：( 2 ) 在保持结构和功能 不变的同时，生物膜必须和传感器表面保持紧密的联系