（生态学专业论文）五氯酚残留的酶联免疫检测方法建立研究.pdf

摘要 本文合成了两种针对目标检测物五氯酚的半抗原( h i 和h 2 ) 。其中半抗原h 2 采用对羟基四 氯氢醌作为合成反应起始物质制各半抗原。该半抗原合成设计方案在国内外五氯苯酚免疫研究中 鲜有相关报道，并且在本实验中取得了良好的实验结果。两种半抗原均采用活性酯法偶联牛血清 白蛋白( b s a ) 制各免疫原( p c p i - b s a 和p c p 2 b s a ) ；并分别免疫动物取得了抗血清( r 1 和 r 2 ) ：抗血清r l 间接竞争e l i s a 检测效价为1 ：8 0 x 1 0 4 ，抗血清r 2 间接竞争e l i s a 检测效价 为l ：1 6 x l0 4 。 建立了抗血清r l 和r 2 的五氯酚间接竞争e l i s a 标准抑制曲线，其中抗血清r 2 取得了较 好的特异性和灵敏度，抑制中浓度为i c 5 0 = 4 2 n g m l 1 ，最低检测限i c l o - - 0 0 6 8 n g m l 7 1 ，标准曲 线的线形范围为0 1 9 9 3n g m l - 。 抗体r 2 与结构类似物的交叉反应率为对五氯硝基苯：2 4 7 ；六氯苯：1 7 9 ： 2 ，3 。4 ， 6 - 四氯苯酚：2 2 2 ：其它氯苯类物质如2 ，4 - d 、p c b s 等均 i o k d a ) 的，有免疫原性的大分子载体蛋白偶联，这也 是人 ：= 完全抗原合成的关键所在。 常用来作为舍成农药人工抗原的载体蛋白有牛血清蛋白( b s a ) 、卵清蛋f a ( o v a ) 、钥孔血蓝蛋 白( k l h ) 、人血清蛋白( i a s ) 及人工合成的多聚赖氨酸( p l l ) 。其中k l h 价格比较昂贵，但免疫 原性较好。最常用的是牛血清蛋白质( b s a ) ，b s a 不但物化性质稳定，不易变性，价廉易得， 而且它的赖氨酸含量相对较高，分子内有许多自由氨基，并且在不同的p h 值和不同的离子强度 下都能保持较大的溶解度i 在含有机溶剂状态下( d m f 、二甲基甲酰胺等) 都能和半抗原进行交联， 并且在交联后仍保持可溶状态。近年来有研究报道用人 二合成的多聚肽( 最常用的是多聚赖氨酸) 作载体，也可显著增加半抗原的免疫原性。多聚肽自身免疫原性很差但可以增加半抗原的免疫性， 有利于机体产生特异性更高的抗体，且具有比b s a 更多的自由氨基( 与相当分子量的多聚赖氨酸 的自由氨基数约是b a s 所含数目的1 0 倍) ，可以大大提高载体蛋白质与半抗原的偶联比率，从而 增加产生针对性抗体的可能性 7 7 3 s 。 农药半抗原需要具有能与载体蛋白进行偶联的反应基团。这些基团可以是羧基一cooh ， 氨基一nh2 ，羟基一oh 等。部分农药半抗原具有这些反应基团就可以采用相应的方法与载体 蛋白偶联了。但如果半抗原本身不带有用于偶联的反应基团，或虽有活性基团但这些基团对维系 待测物的免疫特性和特征结构十分重要，或直接与大分子载体连接后半抗原的特征结构易受载体 的局部微化学环境或空间位阻的干扰，影响机体免疫系统的识别等这些情况，就需要根据分析的 目的和免疫学理论，重新设计、合成模拟原待测物的半抗原【7 9 即j 。 1 2 4 半抗原与载体蛋白偶联的关键因素 f o r i a 等人认为个理想的半抗原应该具有待测物的特征结构。适宜的连接臂和可与载体蛋 白进行偶联的功能基团这三个特征，三者缺一不可。因此半抗原的设计原则是尽可能保留原待测 物的特征结构，在此前提下，引入合适的连接臂和功能基团m 1 。连接臂是用来将载体蛋白与半抗 原分子连接起来的连接分子，它可以是几个碳链，也可以是某种具有分子长度的一个或多个官能 团。其目地是在半抗原分子连接到载体蛋白分子上以后能够突出半抗原分子的特征结构即免疫决 定簇，使抗原决定簇不会被火分子蛋白表面结构屏蔽，从而能使抗原受体能够产生针对性的抗体。 8 中国农业大学硕士学位论文第一章引言 但近年来也有人认为连接臂会对免疫检测产生影响，因为会出现抗体对带有连接臂的半抗原的亲 和力很强，但对待测小分子物质却不发生识别的清况。这时应该采取免疫原与包被原采用不同的 连接臂或者用相同的连接臂与不同的农药结合位点连接的方法来克服p “。 连接臂的长度也是一个重要的影响因素。连接臂并不是越欧越好，一般认为3 6 个为宜， 如果过长，会因氢键或疏水作用导致半抗原分子发生折叠，反而使半抗原与载体蛋白靠得过近， 导致蛋白屏蔽其特征基团：而连接臂过短时，会因载体空间位阻影响免疫系统对半抗原的识别。 但并不是所有清况都如此，如j o h n s o n 等和薛小平等分别用4 个碳原子和1 个碳原子的连接臂合 成同一种有机磷类农药半抗原，但最后他们得到的抗体效价相差却不明显p x 。 过去有许多研究者直观的认为联接到蛋白分子上的半抗原数目越多可能得到针对性的抗体 的机会就越多或者抗原抗体的亲和力也越强。但现有的研究发现当载体蛋白上覆盖的半抗原分子 过多，可能不利于载体与淋巴细胞的表位结合，因而可能阻止载体蛋白产生针对性抗体。有研究 者认为偶联比在3 4 5 ：1 时较为合适，但也有研究者认为免疫原性较强的偶联比应在1 0 2 0 ：l 。 荣康泰等人研究了不同载体蛋白制备对氧磷人工抗原发现各种载体分子量不论是否接近，最佳 结合比都不尽相同，因此有人建议针对不同的半抗原应采用不同的偶联比进行比较从中选择最 佳免疫效果的偶联比m ”。 偶联点的选择也很重要。对于农药分子来说，特别是小分子农药半抗原，连接臂原子团会对 农药分子电子云的正常空间排布产生影响，如果这种影响使免疫决定簇的电化学性质也发生改 度，将直接导致免疫活性的改变。因此在进行半抗原合成时偶联点应尽可能的距农药分子的特征 结构远。另外，如果偶联点与分子的特征结构( 如n h 2 、- n 0 2 、c o o h 、o h 、苯环或杂环等) 相 距较近，则不利于特征结构的暴露，免疫系统对特征结构的识别难度也会加大忡j 。 此外，免疫动物的种类，免疫使用的佐剂用量，和免疫的实验方法的方法也会影响到高效价 和高亲和力抗体的获得。 1 2 5 多克隆抗体和单克隆抗体的制备 抗体可分为多克隆抗体和单克隆抗体两类。直接免疫动物，从血清中分离得到的抗体称为多 克隆抗体。多克隆抗体是动物血液中多种b 淋巴细胞增殖分化形成浆细胞并持续分化的具有不同 选择性和亲和力的抗体，它可以是针对不同抗原决定簇的。 而由b 淋巴细胞分化形成的浆细胞产生的针对抗原某一决定簇有特异性免疫反应的抗体，称 为单克隆抗体。1 9 7 5 年k o h l o r 和m i l s t e i n 最先利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了单克隆抗体”， 之后在各国研究者的共同努力下单克隆抗体技术已经发展成了一整套完善的技术，可以连续不断 地进行特异性和亲和力均保持恒定的单克隆抗体的制各。与多克隆抗体相比，制备单克隆抗体对 免疫原的纯度要求没有那么严格，而且免疫原的用量也少的多。但对免疫动物的要求较严格。 而相对于单克隆抗体，多克隆抗体直接从动物血清中提取，免疫分析特异性比效稳定，抗体 取得也相对方便。但是缺陷在于抗体不均一，批间存在差异。而用杂交瘤技术获得的单克隆抗体， 则特异性强，均质性好。但是单克隆抗体制各成本较高，有时特异性比理论要低。有些单克隆抗 体会产生交叉反应，不能区分含有相同表位的各种抗原。而且单克隆抗体对冷凉、解冻、口h 变 化和其它物理因素变化的敏感较多克隆抗体强，这对纯化带来了困难。现将单抗隆抗体与多克隆 9 抗体的比较结果列于表1 - 1 。 表卜1 单克隆抗体与多克隆抗体的比较删 t a b l 1c o m p a r i s i o no fc h a r a c t e rb e t w e e nh c a b sa n dp c a b s 特征 单克隆抗体 一童塞堕垫笪 1 3 农药残留免疫分析方法研究进展 免疫分析由免疫反应系统和检测系统两部分组成，在免疫反应系统中，各种免疫分析方法的 基本原理是样的，即抗原抗体反应。但是在检测系统中，根据标记物的不同可以将免疫分析 分为不同的类别：荧光免疫分析( f l a ) 、放射免疫分析( r 1 a ) 、化学发光免疫反析( c l i a ) 和 酶免疫分析( e n ) 。 1 3 1 荧光免疫分析 荧光免疫分析属于光学( 荧光) 检测分析方法的一种。但原理稍有不同，它是将特异性抗体 标记上荧光素，制成荧光标记抗体，与抗体结合后，在荧光检测器上检测荧光强度从而判定抗原 或抗体含量。它是7 0 年代在定位荧光抗体技术上发展起来的定性定量检测方法。荧光免疫分析 还包括别一种方法，它利用在化学反应中释放大量自由能产生激发态中间体，当这种激发态中间 1 0 体由高能级回到低能级时，就会向外界发射能量，以荧光方式向外界辐射，利用发光信号检测仪 包括单管测量仪或自动化测量仪器测量光子产生量的方法进行免疫分析。发光免疫分析以标记方 法的不同还可分为直接标记和酶标记两种方法。包括时间分辨荧光免疫测定( t r - f i a ) 、荧光偏 振免疫分析( f p l a ) 、底物标记荧光免疫分析( s l f i a ) 、定量荧光免疫分析测定和均相荧光免疫 测定等1 8 9 1 。 1 3 2 放射免疫分析 放射免疫分析是免疫分析最经典的方法之一。用放射性同位素标记抗原( 或抗体) ，与相应 的抗体( 或抗原) 结合，然后测定游离或结合物的放射性强度。再通过相应的分析、计算方法获 得测量结果。放射核素是指原子能自发地产生成分或能级的变化然后变成另一种核素，变化时 伴有射线的放射。放射性核素依衰变方式分为n 、1 3 、t 三种。目前常用于免疫标记的放射性核素 是1 3 型h 3 和y 型i ”。 i 3 3 酶免疫分析 酶标记免疫分析是将特异性抗体或抗原标记上酶，制备酶标抗体或抗原，酶标抗体和抗原既 有抗原抗体反应特性，当加入酶底物时又可被酶底物催化激活，显色。酶免疫分析就是利用酶与 相应底物反应，通过显色的强度来间接反映抗原抗体的抑制程度，进行定性或定量。 均相免疫分析方法是指抗原抗体反应后不需要分离结合的和游离的酶标记物，便可直接用于 测定的方法。而异相法则与之相反，需将反应后结合的与游离的酶标记物进行分离才能进行测定。 异相法又包括固相法和液相法两种方式，固相异相法用固相载体分离结合的与游离的酶标记物， 而液相异相法于液相中分离即可检测。近年来，新的免疫分析方法不断涌现，如流动注射免疫分 析、试纸条免疫分析、微脂粒放大免疫分析等。这些方法要么简化了游离抗原与结合抗原的分离， 要么实现加速抗原抗体达到平衡所需反应时间，在农药残留分析领域得到了普遍的重视与广泛的 应用，使免疫分析更加简单化、自动化和现场化。 1 4 免疫测定新技术 1 4 1 流动注射免疫分析 流动注射免疫分析是上世纪9 0 年代中期出现的一种新型免疫分析方法( f 1 1 a ) 。它是将流动 注射分析与免疫分析联用的免疫分析方法。其中均相f i i a 技术无需分离反应体系直接在线测 定抗原抗体结合的物理特性，简化了操作。而非均相f i i a 方法可利用蠕动泵驱动反应缓冲液从 反应基质中将未反应的标记物和反应体系中的杂质与反应物分离，从而消除了基质的影响。另一 方面，由于非均相f i i a 采用固相载体颗粒直径较小，因此可以大大提高载体比表面积提高反 应速率；并且流动液增加了抗原抗体间仅靠扩散作用的结合机会。因此非均相f i i a 具有很好的 发展前景。近年已有许多关于固相非均相f i l a 检测操作快捷化、小型仪器自动化、提高灵 敏度和重现性及与自动化控制技术和传感器技术相结合的研究报道问世 g l l 。 中国农业大学硕士学位论文 第一章引言 1 4 2 免疫传感器 免疫传感器是生物传感器的一种，其原理与其它类型传感器原理相同，是将抗原或抗体固定 在传感器基体上，利用蛋白质分子( 抗原和抗体) 携带的大量电荷、发色基团等在抗体和抗原结 合时会产生物理、化学、光化学等变化而转变成可检测的信号后与适当的信号转换器相连接，经 信号放大或其它方式进行检测。目前免疫传感器常见有电化学免疫传感器、压电免疫传感器和光 学免疫传感器。但无论哪种传感器都面临着可用于检测的抗体较少，固定后抗体和稳定性很差， 因此应用受到制约1 9 2 1 。 i 4 3 脂质体免疫分析 脂质体免疫分析法( l i a ) 是类通过脂质体溶解释放内含标记物来指示抗原抗体的反应的 免疫分析技术。脂质体是一种生物模拟膜，由磷脂分子或其他类脂分子在水相中自发形成的和一 种密闭的双分予单层或多层囊泡。而生物膜上的囊泡能包裹水及其中的标记溶质( 染料或酶) 。 具有很高的信号放大作用。且脂质体表面还可以连接抗原或抗体分子，当抗原抗体发生特异生结 合反应时，生成的抗原抗体复合物会使膜表面的补体被激活，从而导致脂质体溶解，释放出的标 记物量与膜表面的抗原抗体结合物的量成正比，据此建立了脂质体免疫分析法 9 3 1 。此方法也具 有高敏感性，强特异性，均相，快速的特点。 1 4 4 克隆酶供体免疫分析 克隆酶供体免疫分析( c e d l a ) 也是一种新型均相免疫分析测定技术。c e d i a 中使用基因 工程技术获得目标酶的多个独立的蛋白片段取其中一个片段作为酶供体片段( e n z y m ed o n o r ， e d ) ，取另一个约占酶氨基酸序列的9 7 的片段作为酶受体片段( e n z y m ea c c e p t o r ，e a ) 。e d 与 e a 在独立存在时无酶活性，但两个片段可自动装配成亚基并聚合后显示酶的功能，根据这个原 理，利用标记e d 的目标分析物或抗原与抗原或抗体结合后不会再与e a 结合形成功能酶，对待 测样品中未结合待铡物质的e d 标记物进行酶与底物的显色反应，从而实现对目标物更精确、更 灵酶的检测。 1 4 5 免疫亲和层析 免疫亲和层析( i m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ) 是将免疫学原理与色谱分析技术相结合的 项技术。它是将抗体固定于合适的基质上，利用抗原抗体的特异性反应来分离和纯化分析样品中 的互补免疫物质；并且可以利用抗原抗体的可逆性反应使层析柱再生的一项技术。免疫亲和层析 可用于样品中提取目标分析物，然后与色谱相连进行分析，其实质是免疫色谱分析技术。这样使 得仪器分析前处理简单，便于从复杂样品中提取净化和富集目标分析物，提高检测灵敏度1 9 4 , 9 ”。 1 2 中国农业大学硕士学位论文第一章引言 1 5 研究对象及要主要工作 国外对于氯酚类农药残留的免疫检测技术近十几年来发展迅速。1 9 9 5 年，美国国家环境保护 总署( e p a ) 出版了p c p 免疫检测技术革新评估报告。至今e p a 己经批准了十几种五氯酚e l i s a 检测试剂盒的生产。p a t r i e i a n o g u e r a 等利用e l i s a 方法，研究了环境中氯酚类物质的检测，发现 如果把2 ，4 ，6 一三氯酚作为目标物，采用抗体包披的直接e l i s a 法敏感性要好子用酶标记抗原 包被的间接法。该方法可以用于预警环境中氯酚类物质的存在1 9 6 l 。之后，p a t r i c i a n o g u e r a 等人制 各p c p 的多克隆抗体取得了成功。经免疫动物得到的抗体半抑制率1 5 0 = 2 9 9 9 - l ，平均i5 0 = 5 0 a g l 。交叉反应除对2 ，4 ，5 ，6 - 四氯酚较高c r ( ) = 9 4 ，对于其它1 5 种结构类似物， c r ( 基本控靠8 在0 5 以下。a n g e lm a u i e i r a 等人建立了较为完善的p c p 环境检测的e l i s a 方法，并且对e l i s a 检测方法检测条件进行了筛选，检测限达到o 1 n g m l 。p7 】。n i c h k o v am ， g a l v er 等用e l i s a 方法测定尿中2 ，4 ，5 - 三氯酚，在水样，尿样和血清中的检测限分别达到o 0 7 ， o 2 6 a n d 0 8 9 9 l 1 i ”。然而在我国，目前对p c p 的酶联免疫吸附分析研究尚未见报道，我国也 已将五氯酚列为环境优先检测有机污染物质之一。我国城镇污水处理厂污染物排放标准g b 1 8 9 1 8 2 0 0 2 中规定，城镇污水处理厂排放五氯酚污染物浓度不得高于o 5 m g l - 】，我国 g h z b l 1 9 9 9 地表水环境质量标准中规定地表水i 、i i 、i i i 类水域有机化学物质特定项目五氯酚 含量标准值为0 0 0 0 2 8 m g - l 。郑明辉教授等人对洞庭湖地区污染区的监测表明五氯酚的污染在部 分地区水体中的含量已远远超过上述标准。而五氯酚作为农药在我国南方大面积地区长时间大剂 量持续施用后，其对环境和人体的危害和长期存在的潜在影响急需探明，然而我国对大区域多流 域环境激素类有机污染物质的空间运移和储积转化规律尚缺少相关的基础数据。 因此本项研究拟利用酶联免疫吸附技术的经典方法用免疫化学方法制备针对五氯酚的特异 性多克隆抗体，并且建立适合我国具体国情的五氯酚e l i s a 检测方法。主要工作如下 1 0 1 , 1 0 2 i ： 1 )合成以五氯酚为目标检测物质的的半抗原，并将它与载体蛋白偶联制各免疫抗原和包被 抗原； 2 ) 制各五氯酚的兔多克隆抗体； 3 )建立五氯酚的间接竞争e l i s a 检测方法； 4 )研究五氯酚e l i s a 检测方法的影响因素； 5 )用己建立的五氯酚e l i s a 检测方法对多水体代表水样进行五氯酚的添加回收实验并与 气相色谱方法进行比较。 中国农业大学硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 材料与试剂 第二章材料与方法 牛血清白蛋白( b s a ) 卵清蛋自( o v a ) 弗氏完全佐荆 弗氏不完全佐剂 h r p 标记羊抗兔酶标_ 二二抗( 1 ：5 0 0 i ：1 0 0 0 ) 五氯硝基苯 五氯苯酚 2 一氧苯酚 2 ，5 一二氯苯酚 2 ，4 ，三氯苯酚 2 ，3 。4 ，6 一四氯苯酚 扣溴丁酸 四氯氢配 3 一溴丙酸 n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) n 。n - 二环己基碳二亚胺( d c c ) 二甲基甲酰胺( d m f ) 磷酸氢二钠( n a 2 h p 0 4 ) 磷酸二氢钠( n a i l 2 p 0 4 ) 丙三醇 无水硫酸钠 碳酸钾 碳酸钠 碳酸氢钠 t w c c n 一2 0 邻苯二胺( o p d ) 3 0 h 2 0 2 平醇( 色谱纯) 乙腈( 色谱纯) 丙酮 石油醚 无永乙醇 氢氧化钾 s i g m a 公司( 美国) s l g m a 公司( 美国) s i g m a 公司( 美国) s i g m a 公司( 美国) 军事医学科学院 a l d r i c h 公司( 美国) 北京市昌平石鹰化工厂 北京丰特斯化工材料有限公司 北京丰特斯化工材料有限公司 北京丰特斯化工材料有限公司 北京丰特斯化工材料有限公司 北京丰特颠化工材料有限公司 北京丰特斯化工材料有限公司 上海化学试剂公司 s i g m a 公司( 美国) s i g m a 公司( 美国) 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 广州天马精细化工厂 北京金龙化学试剂有限公司 北京化工厂 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 j e 京化学试剂公司 中国农业大学硕士学位论文 第二章材料与方法 五氯酚农药标样 农业部环境保护科研所 六氯苯农药标样农业部环境保护科研所 新西兰大耳白兔 北京海淀兴隆实验动物养殖厂 透析袋( 最大允许透过分子量 6 0 0 0 )欣经科生物技术公司 9 6 孔酶标板厦门怡美新 e l i s a 测定所用试液： ( 1 ) 包被缓冲液( o 8 5 m o l l 、p h 9 6 的碳酸缓冲液) ：n a 2 c o s l 5 船，n a h c 0 3 2 9 3 9 ，加蒸 馏水至1 0 0 0 m l ； ( 2 ) 封闭液：p b s 加入1 明胶； ( 3 ) 洗涤掖( p b s t ) ：含o 1 t w e e n - 2 0 的o 0 1t o o l l ，p h 7 4 的p b s ( v ) ； ( 4 ) 0 o lm o l 。磷酸盐缓冲液( p b s ) ；n a c l 8 0 9 ，k h 2 p 0 4 0 2 9 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 2 9 6 9 ，加蒸 馏水至1 0 0 0 m l 调节p h 至7 4 ； ( 5 ) 稀释液：含o 1 t w e e n 2 0 ，o 1 明胶的o 0 1m o l l ，p h 7 4 的p b s ( w v ) ； ( 6 ) 底物缓冲液( p h 5 0 的磷酸柠檬酸缓冲液) ：0 2 m o l l - t n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ( 2 8 4 9 l 1 ) 2 5 7 m l ， o 1m o l l 1 柠檬酸( 1 9 2 9 l “) 2 4 3 m l ，加蒸馏水5 0 m l ； ( 7 ) o p d 底物使用液( o d 4 9 2 。) ：o p d 2 0 0 m g ，底物缓冲液1 0 0 m l ，3 0 的h 2 0 2 4 0 p l ；( 现用 现配) ( 8 ) 终止液：2 m o l l - 。h 2 s 0 4 。 2 2 主要仪器设备 微量加样器 d g 3 0 2 2 a 酶联免疫检测仪 紫外可见分光光度计4 0 6 0 磁力搅拌器 分光光度计7 2 2 型 电热恒温水浴h h 一8 b r u k e rd p x 3 0 0 型核磁共振仪 高速冷冻离心机m i k r 0 2 2 r 旋转蒸发仪z q f 8 5 a 自动纯水蒸馏器s z _ 一9 3 f d 1 冷冻干燥机 l d 4 _ _ 2 a 低速离心机 低温冰箱 医用三通管 h p 5 8 9 0 气相色谱仪 分析天平( 十万分之一) t h e r m o l a b s y s t e m s 芬兰 华东电子管厂 p h a r m a c i al k bb i o c h r o m 瑞典 上海沪系分析仪器厂 上海分析仪器厂 常州国华仪器厂 芬兰 德国 上海医械专机厂 上海亚荣生化仪器厂 北京博医康技术公司 北京医用离心机厂 日本s a n y o 欣经科生物技术公司 美国 湘仪天平仪器厂 中国农业大学硕士学位论文第二章材料与方法 m 1 旋涡混合器g l 一8 8 b江苏海门麒麟医用仪器厂 有机合成玻璃仪器( 标准磨口) 玻璃注射器l m l ，2 m l ，5 m l 2 3 实验方法 2 3 1 半抗原的合成 2 3 1 1 半抗原( h 1 ) 五氯苯氧丁酸的合成 ( 1 ) 合成路线 c c h +b r c h 2 c h 2 c h 2 c o o c h 2 c h 3 k o h h 2 c h 2 c h 2 c 0 0 c h 2 c h 3 c 天津玻璃仪器厂 金坛市注射器厂 c k 2 c 0 3 h 2 c h 2 c h 2 c o o h ( 2 ) 实验步骤 准确称取五氯苯酚1 1 4 9 ，无水k 2 c 0 3l o g 于1 0 0 m l 无水丙酮中，充分搅拌使其溶解。加 入1 4 4 94 - 溴丁酸乙酯后，通入氮气，使体系升温，并搅拌回流1 6 小时。冷至室温后，静置3 天。 过滤除去k 2 c 0 3 。滤液减压除去溶剂，将所得的剩余物溶于5 0 m l4 的k o h 甲酵溶液，然后加 热回流l 小时。冷至室温后减压除去甲酵溶剂，将剩余固体溶于5 0 m l 水中，用6t o o l - l 1 的盐酸 酸化至p h 为6 ，析出白色沉淀。过滤析出的沉淀于空气中干燥，然后用无水乙醚重结晶，得到 白色固体。1 hn m r 及”cn m r ( c d c l 3 ) 确证为产物。 2 ，3 1 2 半抗原( h 2 ) 对羟基四氯苯氧丁酸的合成 ( 1 ) 合成路线 6 中国农业大学硕士学位论文 第二章材料与方法 k 2 c o s h 2 c h 2 c h 2 c o o h ( 2 ) 操作步骤 向2 5 0 m l 圆底三口烧瓶中加入丙酮溶剂约1 0 0 m l ，在氮气保护下，加入3 9 ( 1 2 1 5 r e t 0 0 1 ) 四氯对二苯酚和1 0 9 ( 7 2 5 r e t 0 0 1 ) 碳酸钾搅拌使尽量溶解将1 5 8 9 ( 8 i m m 0 1 ) 4 一溴丁酸乙 酯溶于少量丙酮中，逐滴加入到反应液中开始加热回流，大约1 2 h 。 经薄层液相色谱( t l c ) 检测，反应完全减压脱去丙酮溶剂。反应物用5 0 m l 去离子水溶 解，再加入3 0 r a l 乙酸乙酯，充分振荡，静置分层，保留水相。在水相中加入稀盐酸溶液调节p h 至3 ，用乙酸乙酯5 0 m l x 2 萃取水相，合并有机相，有机相用5 0 r a l 水洗涤，脱去溶剂，得到粗 品对羟基四氯苯氧丁酸乙酯。 将制得的粗品对羟基四氯苯氧丁酸乙酯0 5 9 加入反应器中。加入1 0 的氢氧化钠溶液 l o m l ，再加入2 0 m l 甲醇溶液，在3 8 下加热回流4 h ，进行脱酯化。经t l c 检测反应完成后， 脱去溶剂，经柱层析分离得到目标产物。 2 3 2 半抗原与载体蛋白的偶联 2 3 2 1 活性酯法制备免疫原 2 3 2 1 1 半抗原( h 1 ) 五氯苯氧丁酸与载体蛋白的偶联( p c p i - b s a ) ( 1 ) 合成路线 c i c i 骂陬c i 岫n h 1 7 b s a 。0。 o 。0。 一 0 oc 心 chc co 中国农业大学硕士学位论文第二章材料与方法 ( 2 ) 操作步骤 称取3 0 m g 五氯苯氧丁酸，2 4 3 m g d c c ，1 3 9 m g n h s 溶于l m l 无水d m f 中。室温下搅拌反 应1 8 小时。将反应液离心( 5 0 0 0 r p m ，1 0 m i n ) ，弃去沉淀，得到上清液为活性酯溶液。 称取2 0 m gb s a ，溶于l m l 碳酸盐缓冲液( o 0 5 m o l l 、p h 9 5 ) 中，缓缓搅动中，逐滴加 入1 0 0 a l 活性酯溶液。缓缓滴加，约- - d 时加完。然后于室温下继续搅拌反应4 小时。然后将反 应液装入透析袋中用p b s ( 0 0 1 t o o l l ，p h 7 4 ) 透析。每6 小时换液一次1 0 0 0 m l 次一。共 换液5 6 次。透析后离心，弃去沉淀，上清液于4 保存。 2 3 2 1 2 半抗原( h 2 ) 四氯对羟基苯氧丁酸与载体蛋白的偶联( p c p 2 ，b s a ) ( 1 ) 合成路线 + h 0 一 n h s 术啷卜 ( 2 ) 操作步骤 称取四氯对羟基苯氧丁酸3 3 4 r a g ( o ，o l m m 0 1 ) ，轻轻搅动溶丁1 4 0 t , t l 无水d m f 中，使半抗 原浓度达到7 5 m m o l l 。加入2 3 p l 浓度为5 0 m g - m l 1 的n h s ( o 0 1 m m 0 1 ) 和5 0 1 u l 浓度也为 5 0 m g m l 。的d c c 溶液( o 0 1 m m 0 1 ) 。轻轻搅动反应体系，室温下反应3 5 小时。离心( 5 0 0 0 r p m ， 1 0 m i n ) ，弃去沉淀，得到上清液为活性酯溶液。 称取1 7 r a g b s a ( o 2 5 p m 0 1 ) ，溶于l m l 碳酸盐缓冲液( o 0 5 m o l l 、v h 9 5 ) 中，缓缓搅动 中，逐滴加入1 0 0 p l 活性酯溶液。缓缓滴加，约- d , 时加完。然后于室温下继续搅拌反应过夜。 然后将反应液装入透析袋中，用p b s ( 0 0 1 t o o l l ，p h 7 4 ) 透析。每6 小时换液一次1 0 0 0 m l 次 一。共换液5 6 次。透析后离心。弃去沉淀，上靖液为免疫原。4 c 保存。 2 3 2 2 氯甲酸异丁酯法制备包被原 2 3 2 2 1 五氯苯氧丙酸制备包被原p c p l - o v a ( 1 ) 合成路线 1 8 。臼。 a 1 坠 。q。 一 筘 c 中国农业大学硕士学位论文 第二章材料与方法 + o “ c 嚏 t r i - n - b u t y l a c f c o c l 二二 、锱 导 言 c 鸭 咖c k 竺 i n 。m ( 2 ) 实验操作 准确称取1 3 5 5 m g 五氯苯氧丙酸溶解到2 0 0 p l d m f 中，然后在4 c 搅拌下加入5 0 1 t l 三正丁 胺，反应半个小时，再加入2 5 1 1 l 氯甲酸异丁酯搅拌反应1 个小时。 称2 0 m g o v a 溶解到t 5 m l 碳酸盐缓冲液( o 0 5m o l l ，p r l 9 6 ) 中，在4 搅拌下逐滴加入 1 0 0 p l 第一步反应液，半个小时加完，继续4 搅拌反应过夜，反应液装入透析袋用p b s ( o 0 1 m o t l ，p h 7 4 ) 透析，每4 小时换液一次，共换液8 次。透析后离心，弃取沉淀，上清液 冷冻干燥，4 c 保存。 2 3 22 2 五氯苯氧丁酸( h 1 ) 制备包被原p c p i 一o v a ( 1 ) 合成路线 羚纛。删 a十o c 宁o c ：h 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 6 删 a 玲口a 伞泠口a 簿 一馨 中国农业大学硕士学位论文第三章结果与分析 3 4 3 小结 间接竞争e l i s a 检测方法一般具有较高的检测灵敏度和较宽的检测范围，因此是e l i s a 检 测方法中优先考虑到的方法。在e l i s a 检测中，衡量所制各的抗体优劣除了效价( 滴度) 以外， 对目标检测物的特异性结合能力强弱则是关系到e l i s a 检测是否具有较高的灵敏度和检测效果 的决定因素。间接竞争e l i s a 检测方法中抗体与待测物质同时竞争固相载体上包被原结合位点 如果体系中抗体与包被原的亲合性过强，就会导致同抗体结合的待测物质减少，检测的灵敏度也 就降低了，因此包被抗原的选择直接关系到e l i s a 检测方法的建立。 本文中，抗血清r 1 针对包被原p c p l o v a 和p c p l - o v a 的效价并没有明显的差异，但从五 氯酚检测的灵敏度来看，采用前者作为抗血清r 1 的包被原较后者要好，这正说明选择与免疫原 的半抗原存在差异的包被原有助于间接竞争e l i s a 检测灵敏度的提高。 通过对抗血清r 1 和r 2 间接竞争e l l s a 工作条件的筛选结果可以看出，抗体r 1 对五氯酚的 抑制中浓度仅为i c 5 0 = 1 4 0 p g m l ，检测限也仅为i c 2 0 = o 3 5 9 9 m l 一，这说明该抗体与抗原的 亲合力不高，所建立的标准曲线应用范围有限；而抗血清r 2 所建立的标准曲线其抑制中浓度要 远低于r 1 ，i c ，o = 1 6 n g o m l - 1 ，说明抗血清r 2 对目标检测物的特异性及检测灵敏度要远高于r 1 。 因此初步判断抗血清r 1 在半抗原合成上可能仍存在缺陷，其所产生的抗体对目标物质五氯酚的 特异性结合能力有限，并且相信无法通过检测条件的改变来得以有效改善，因此本研究只针对成 功抗体r 2 进行进一步研究。 3 5 抗血清r 2 五氯酚间接竞争e li s a 的影晌因素 3 5 1 离子强度的影响。 样品稀释缓冲液中不同浓度的离子强度用一价的n a + 来评价，影响结果见表3 - 11 及图3 - 9 。 表3 1 1 缓冲液中不同n a c l 含量条件下对五氯研间接竞争e l i s a 的影响 t a b 3 一e l i s ar e s o i t so fp c pi na s s s yb u f f e rh ；t hd j f f s r s n tn s c lc o n t e n t n 。c l 含量至璺! ! 呈鎏垦! ! 璺：竺兰：! ! ! 堕旦里竺 00 3 21 684 02 0 0 1 0 0 05 0 0 0 o 3 10 7o 9 408 4 0 6 805 50 3 60 2 5o 1 81 45 3 ，o o 5 4o 5 104 80 3 6o 2 9o2 1 0 1 501 02 1 a 6 0 0 4 5 o 4 l0 4 lo3 30 2 9o 2 2o 1 60 1 2 3 0 7 1 2 0 4 00 3 50 4 0 0 3 00 3 00 2 1o 2 00 1 26 0 4 3 8 中国农业大学硕士学位论文 第三章结果与分析 o 8 0 6 0 4 0 2 o o0 0 20 0 40 0 60 0 80 1o 1 2 n a c i ( ) 含量 + a m “( 4 9 0 n m ) + l c 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 图3 - 9n a c 含量对五氯酚间接竞争e l i s a 的影响 f l k 3 9i n f i u e n c eo fn a c ic o n t e n to ft h ea s s a yb u f f e ro ne l i s ao fp c p 由表3 - ii 和图3 - 9 可知，随着缓冲液中n a + 离子强度的增加，间接e l i s a 检测的抑制中浓 度在迅速升高，体系显色也在迅速变浅，0 孔与最大浓度孔的差值也在变小，说明样品稀释缓冲 液中离子强度的增加极大的影响了e l i s a 检测液中抗原抗体的特异性结合，使检测的灵敏度降 底；当溶液中n a c i 含量为1 2 时，抑制中浓度升高到6 0 n g m l ，并且体系的显色变的极低。 因此本体系离子强度不能高于3 ，否则对反应的显色和灵敏度均有较大的影响。 3 5 2p h 值对间接e l i s a 的影晌 表3 _ 12 缓冲液中不同p h 条件下对五氯酚间接竞争e l i s a 检测结果的影响 t a b 3 一1 2e l i s ar e s u i t so fp c pna s s a yb u f f e rw i t hd i f f e r e n tp hv a m e p h 值兰堡尘! 塑! 竺：竺! ：! ! 竺竺里堕 1 c ，。( 。g 。l ) 0 3 2i ，684 02 0 01 0 0 05 0 0 0 0 0 5 3 0 6 2 o 7 1 0 8 8 o 8 5 o 7 6 0 7 4 1 00 6 606 50 6 20 5 2 0 4 503 20 2 50 1 94 4 3 p h 值对五氯酚e l i s a 的影响结果见表3 1 0 jg面#v。dhsiio导)|iiiv 剐枷m舯兰!抛；善叭!耋蚴咙拍”竹；号”蚴嘶啷嘶蝴凹弛勰蛇”mn仉m吼吼仉m!耋 8 6 5 6 5 6 7响吣哪咐 啦m 岍m m m 中国农业大学硕士学位论文 第三章结果与分析 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 34567891 0 酸碱度( p h ) + a m “- 4 1 - - i c 5 0 图3 - 1 0 不同p h 条件下对五氯酚间接竞争e l i s 检测结果的影响 f ；g 卜1 0l n f i * n c eo fp i tv a l u ao ft h ea s s a yb u f f e ro ne l i s ao fp c p 溶液中p h 值的大小既可能影响到待测半抗原分子和抗体蛋白的分子结构，又可能影响蛋白 与抗体之间的特异性吸附，因而对e l i s a 的检测是很要的一个影响因素。从图3 1 0 中可以看出， 缓冲液p h = 7 中性或近中性的时候，体系的检测灵敏度最高，此时体系的显色也更为完全。但当 缓冲液的p h 值从中性附近无论是偏向酸性还是偏向碱性，抑制中浓度都会明显升高，即检测的 灵敏度有所下降；并且随着检测灵敏度的下降，0 孔与最大抑制孔的显色也变浅，使检测的精确 度降低。因此。在进行免疫分析时，反应体系中的p h 值最好为中性或近中性，此时不但检测灵 敏度较高，0 孔与最大抑制浓度的差值也较火，有利用e l i s a 检测的进行。 3 5 3 有机溶济对五氯酚间接竞争e l i s a 检测的影响 许多样品在进行免疫测定时也需要进行相应的前处理，处理过程中所使用的有机溶剂也可能 对e l i s a 检测造成影响。以下对样品提取中常用有机溶剂以乙腈、丙酮和甲醇为代表分析有机溶 剂含量对本实验e l i s a 检测方法的影响。 表3 - 1 3 缓冲液中不同甲醇含量对五氟酚闻接竞争e l is a 检测结果的影响 t a b 3 13e l i s ar e s u i t so fp c pi na s s a yb u f f e rw i t hd i f f e r e n tc o n t e n tm e t h a n e 甲醇含量 至堕! 竺鎏些! 竺：竺兰：! ! 塑竺里竺 i c ，。( n go r a l 1 ) 00 3 2l6 8 4 0 2 0 01 0 0 05 0 0 0 0 0 9 3n 8 908 60 7 00 5 603 60 3 00 2 01 3 4 5 1 0 1 0 9 20 踮0 7 00 5 904 20 3 60 2 91 9 7 1 0 1 1 411 41 0 70 9 208 10 ，6 80 6 10 5 3 3 0 1 2 0 1 2 51 2 3i 1 91 o l0 8 8o 7 00 6 305 43 52 ，ie面口)。”u一 ，眇吣们嘶毗o e_10吼!备ch 中国农业大学硕士学位论文第三章结果与分析 表3 1 4 缓冲液中不同乙腈含量对五氯酚间接竞争e l i s a 检测结果的影响 t a b 3 - 1 4e l i s ar e s u i t so fp c pi na s s a yb u f f e r w i t hd i f f e r e n tc o n t e n ta c e t o n i t r ii e 乙腈含量 不同p c p 浓度( n g m l 1 ) 下的o d 值 0 0 3 21 684 02 0 01 0 0 05 0 0 0 i c 5 0 ( n g m l “) 0 5 l o 0 9 0 11 7 l2 7 2 0 1 3 91 3 9】3 81 2 41 1 61 0 4 0 9 l0 7 78 49 表3 - 1 5 缓冲液中不同丙酮含量对五氯酚间接竞争e l i s a 检测结果的影响 t a b 3 1 5e l i s ar e s u i t so fp c pi na s s a yb u f f e r w i t hd i f f e r e n tc o n t e n ta c e t o n e 丙酮含量 不同p c p 浓度( n 8 m l 1 ) 下的o d 值 o03 2j 684 02 0 01 0 0 05 0 0 0 i c ，o ( n g m l - 1 ) 慨 5 1 0 07 9 0 8 5 0 9 5 0 6 9 0 7 8 0 9 l 2 0 i 2 4 l2 2 i 1 91 0 81 0 20 鼹0 8 20 7 34 6 2 o 5 1 0 1 5 2 0 有机溶剂含量( ) + 甲醇- - b - - 乙腈+ 丙酮 图3 - 1 1 有机溶剂含量对五氯酚间接竞争e l f s a 检测结栗的影晌 f i 9 3 1 1l n f i u e n c so fo r g a n i cs o l v e n tc o n t e n to ft h ea s s a yb u f f e ro l le l f s ao fp c p 从表3 - 3 - - 表3 - 1 5 及图3 - ll 中甲醇、乙腈和丙酮含量对五氯酚间接竞争e l s a 影响的结果 可以看出，有机溶剂的存在对e m s a 检测方法的结果影响很大。随着反应体系中有机溶剂含量的 升高，本底显色均有所升高，抑制中浓度明显增大，说明有机溶剂含量的增加使反应非特异性吸 附增加，e l j s a 检测灵敏度降低。因此在进行样品检测时，除5 以内的甲醇对反应的影响相对 小一些，应尽量减少其它有机溶剂的含量。 4 7 3 4 ” 射 n n n” n n 吼 们斟 c = 饥n嘴嘶兰|州射m n n l竹筛筋 0 l l鲫勰 0 1 l j 上4 6 7 7 2 3 6 5 3 2 3 4 0 0 0引 铊 n n n拈卯弘c ；m 吼船盼佗 o o o站弱 0 o 0醣w 盼 o 0 0 如鼬加蚰蚰如加