（细胞生物学专业论文）外源水杨酸对喜树幼苗中喜树碱含量的影响.pdf

摘要 喜树碱( c a m p t o t h e c i n ，c p t ) 是我国特有树种喜树( c a m p w t h e c aa c u m i n a t a d c 鲫峨) 中的一种有独特抗癌活性的单萜吲哚类生物碱。水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ，s a ) 是植物生化防御系统中一种重要的信号分子。本文在探讨了提取植物中s a 最佳条件的 基础上，将s a 以喷洒叶片和灌根两种方式施于喜树幼苗，通过高效液相色谱测定内源 s a 含量和喜树碱含量的动态变化，得到了以下结果： 1 、外源s a 处理幼苗均使直接旋加的器官和茎皮中s a 的含量迅速的升高，并且少 部分游离态s a 可能以转化为结合态s a 的形式储存起来，但储存的数量有限。游离态 s a 含量下降的较快，而结合态s a 则始终保持较高的含量。根处理后，叶中s a 含量也 有较大的提高；但叶处理后，根中却无明显变化。 2 、外源s a 叶处理诱导了喜树幼苗幼叶中的喜树碱含量明显提高，上部成叶中采 样后期有少量上升，下部成叶中喜树碱含量比较稳定，而根中在采样初期有少量上升 外源s a 处理根，并未导致幼叶中喜树碱含量变化，成叶与根中喜树碱含量变化也较复 杂，时高时低。但采样后期( 第1 2 天) 不同器官中的喜树碱含量均呈升高趋势。 关键词喜树喜树碱外源水杨酸 a b s t r a c t c a m p t o t h e c i n ( e r r ) i sa na n t i - c a n c e rt e r p e n o i di n d o l ea l k a l o i d i tw s sm a i n l yc x 臼盈c 眙d f r o m 蝴t h e c aa c m n n 坦t aw h i c hi san a t i v et r e eo fc h i n a s a l i c y l i ca c i di sa n 佃叩o n a m s i g n a lm o l e c u l a ri np l a n tc h e m i s t r yd e f e n c es y s t e m a ni m p r o v e de x 灯a e t i o nm e t h o do f e n d o g e n o u ss a l i c y l i ca c i dw s se s t a b l i s h e d a n do nt h eb a s i so ft h a t , v a r i a t i o no fs a l i c y l i ca c i d a n dc a m p t o t h e c i nc o n t e n ti nc a m p t o t h e c aa c u m i n a t ao r g a n sw a si n v e s t i g a t e d a f t e ft h e t r e a t m e n tt h r o u g hl e a v e so rr o o t s w i t hs a l i c y l i ca c i d t h er e s u l t sa 砖a sf o l l o w s ： 1 e x o g e n o u ss a l i c y l i ca c i dt r e a t m e n tc o n t r i b u t e dt oa ni n c r e a s eo fs a l i c y u ca c i dc o n t e n ti n t r e a t e do r g a na n ds t e m s o m eo ff r e es a l i c y l i ca c i dm a yb et r a n s f o r m e di n t oc o n j u g a t e d s a l i c y l i ca c i df o rs t o r a g e ，b u tt h ea m o u n tw a sl i m i t e d t h ec o n c e n t r a t i o no ff r e es a l i c y l i c a c i dd e c r e a s eq u i c k l y , w h i l ec o n j u g a t e ds a l i c y l i ca c i dk e p tah i g hl e v e lf o ral o n gt i m e w h e nt h es e e d l i n g sw e r et r e a t e dt h r o u g hr o o t s ，t h ec o n t e n to fs a l i c y l i ca c i di nl e a v e sa l s o g o te n h a n c e ，b u tw h e nt h es e e d l i n g sw e r et r e a t e dt h r o u g hl e a v e s ，t h ec o n t e n to fs a l i c y l i c a c i di nr o u t sk e p ts t i l l 2 e x o g e n o u ss a l i c y l i ca c i dt r e a t m e n tt h r o u g ht h el e a v e sr e s u l t e di no b v i o u si n c r e a s eo fc p t i ny o u n gl e a v e s w h i l et h ec o n t e n to fc p ti nu p p e rm a t u r el e a v e si n c r e a s e di nl a s t s a m p l i n g ( d a y1 2 ) ，t h ec o n t e n to fc p t i nl o w e rm a t u r el e a v e sd i d n tc h a n g e d , a n dt h e r e e x o g e n o u ss a l i c y l i ca c i dt r e a t m e n tt h r o u g ht h er o o t sm 血tr e s u l ti nv a r i a t i o no fc p ti n y o u n gl e a v e s t h ev a r i a t i o no fc p tc o n t e n tw a sc o m p l e xi nt h em a t u r el e a v e sa n dr o o t s c o n t e n tg e ti n c r e a s e di nl a t t e rs a m p l i n g ( c l a y1 2 ) i na l lt h eo r g a n s k e y w o r d sc a m p t o t h e c aa c u m i n a t a ，c a m p t o t h e c i n , e x o g e n o u ss a l i c y l i ca c i d 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壅i 垦挂些盘堂或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：多、舞。矗 签字日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘i 垦盎些盘鲎 有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权盘韭盎些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：羲蔽在 签字日期：年 月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 翩躲陌啼 电话： 邮编： 1 绪论 1 1 植物的次生代谢 1 绪论 1 1 1 植物的次生代谢及其产物 植物的次生代谢是相对于初生代谢而言的，这个概念最早是由l c 6 s s c l 予1 8 9 1 年明 确提出的，是指那些由植物体内有机化合物的主要代谢途径( 初生代谢) 衍生而来，最 终合成一些具有种、属特异性的有机化合物的代谢过程，这些化合物称为次生代谢产 物。与维持细胞生命活动所必需的初生代谢产物不同，次生代谢产物( 也称次生产物、 次生物质) 是指植物中一大类对于细胞生命活动或植物生长发育正常进行并非必需的小 分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织和生长发育期的特异性。次生 代谢产物是代谢的最终产物，除了极少数之外，大部分不再参加代谢活动。 植物次生代谢产物结构迥异，种类繁多，包括酚类、黄酮类、香豆素、木质素、生 物碱、糖甙、萜类、甾类、皂甙、多炔类、有机酸等。分类方法也不一，一般可归为酚 类化合物、萜类化合物、含氮有机物三大类。 1 1 2 生物碱 生物碱是一组结构各异的低分子量的含氮有机物，在植物长期的生态环境适应过程 中，可以抵御动物、微生物、病毒及其他植物的攻击。 约有2 0 的植物生产生物碱，目前已知结构的生物碱就有约1 2 0 0 0 种，它们都由氨 基酸或腺苷酸衍生而来【1 1 。生物碱绝大部分分布在植物中，且大多分布于双子叶植物 中，尤以毛莨科、防己科、罂粟科、马钱科、茄科、茜草科、豆科植物中较多。一些生 物碱集中在某一部分或某一器官中，如黄柏的树皮、三颗针的根皮；而另一些分布在植 物体的不同部分，如喜树全株均含喜树碱( c a m p t o t h c c i n ，c p t ) 。在植物不同的生长阶 段所含生物碱的含量和种类也可能有差异。有些多年生植物，在幼时生物碱可广泛分布 于各器官中，但随着生长年限而逐渐集中于某一器官中，如黄连根茎中小檗碱的含量， 可随植株生长年限而增加8 9 ；有些植物如麻黄，春季时生物碱含量较低，到8 、9 月含量就迅速增加，以后又逐渐下降。植物的种子营养丰富，但为了避免动物的过度取 食，许多植物的种子也会贮存一些生物碱等毒性物质。如豆科类植物种子的生物碱含量 很高；羽扇豆属植物、蓖麻属植物和猪屎豆属的一些种能够积累高达干物质重6 的生 物碱【2 1 。 1 2 喜树碱 1 2 1 喜树和喜树碱 喜树碱最早于1 9 6 6 年，从我国特有的木本植物喜树( c a m p t o t h e c aa c u m i n a t a 东北林业丈学硕士学位论文 d e s c n e ) 的提取物中分离得到【3 j 。喜树是我国所特有的一种多年生亚热带高大阔叶落叶 乔木，属于蓝果树科( n y s s a c e a e ) 。喜树属。 从结构上看，c f t 是一种喹啉类生物碱( q u i n o l i n ea l k a l o i d s ) ，但从生物合成的途径 看，c f r 是一种修饰的单萜吲哚类生物碱( m o n o t e r p e n o i di n d o l e a l k a l o i d s ，t i a s ) 。c p t 具有较高抗癌活性，但由于其副作用明显，发现后段时阃未能实现临床应用直到 1 9 8 5 年，h s i a n g 发现其通过抑制拓扑异构酶i 来发挥细胞毒性的独特的抗癌机理。而重 新得到广泛的重视 4 1 。目前，一系列高效低毒的c p t 衍生物已被合成，甚至被美国 f d a 批准临床应用。第一代c p t 类药物i r i n o t e c a n 与t o p o t e c a n 主要用于治疗卵巢癌、 结肠癌和肺癌，据估计仅2 0 0 3 年市场份额就达到1 0 亿美元，目前有十几种第二代c p t 类药物正处于临床试验阶段嘲。这些半合成的衍生物由天然c p t 加工而来，照此估计， 每年将需要2 i 0 k gc p t 作为原材料来生产c p t 衍生物 6 1 。 1 2 2 喜树碱的分布 1 2 - 2 1c p t 的科属分布 相近物种常具有相似的次生代谢物质，因此次生代谢物质的存在或缺失亦可作为是 否具有相同祖先和相近亲缘关系的一种标志。特别是近4 0 年，次生代谢物质分布已被 借鉴应用于分类学而发挥了潜在的价值1 7 1 。但很奇怪许多次生代谢产物同时出现在植物 界许多毫不相关的科，c p t 就是其中一例。 c p t 最早从珙桐科( n y s s a c a e ) 喜树属植物喜树( c a m p t o t h e c aa c u m i n a t a ) 中分离 得到，l is h i - y o u 在喜树同属植物c o w r e y a n a 和cy u n n a n e n s s 中亦发现c f r 的存在 i s 。随着研究的不断的扩展，陆续发现茜草科( r u b i a c e a e ) 蛇根草属( o p h i o r r h i z a ) 也 同时存在3 种植物含有c p t 或其衍生物：o p h i o r r h i z am u n g o s 、o p h i o r r h i z ap u m i l a l 9 】、 o p h i o r r h i z af i l i s d p u l a b o ! 。除茜草科外，龙胆目( g e n t i a n a l e s ) 还有夹竹桃科 ( a p o c y a n a c e a c ) 植物海木狗牙花e r v a t a m i ah e y n e a n a l n l ，胡蔓藤科( g e l s e m i a c e a e ) 植 物m o s t u e a 拥m 伽函f 1 2 1 均含有c p t 。以上植物同属a s t e r i d s ，均不同程度含有c p t 的现 象比较可以接受，然而与其亲缘较远的蔷薇分支( r o s i d s ) 茶茱萸科( 1 c a c i n a c e a e ) 植物 m e r r i l l i o d e n d r o nm e g a c a r p u m 、p y r e n a c a n t h ak l a i n e a n a 、臭假柴龙树( n o t h a p o d y t e s f o e t i d a ) ( 以前称为m a p p i af o e t i d a ) 、厚叶假柴龙树( mc o l l i n a ) 、海桐假柴龙树( m p i t t o s p o r o i d e s ) 、海南假柴龙树( o b t u s i f o l i a ) 、毛假柴龙树( mt o m e n t o s a ) 、簿叶假柴 龙树( mo b s c u r a ) l 切中亦发现c p t 的积累。 特定结构的次生代谢产物有时甚至出现在进化上亲缘较远的植物中，这表明该次生 代谢产物合成途径中酶的基因可能产生于进化过程的早期。而且这些基因在演化过程中 并未丢失。而是可能“关闭”，并在之后的某一点重新“打开”r ”。 1 2 2 2c p t 的器官分布 以上植物均含有c p t ，但多数含量极低，未受到人们重视。目前仅喜树、臭假柴龙 树具有较高水平的c p t 含量。受产地、种源、采样和分析条件不同的影响，不同学者 1 绪论 得到的结果亦略有差异。c p t 最早是从我国特有植物喜树中发现的，随后人们又从喜树 中提取出多种c p t 衍生物。喜树由于其丰富的c p t 含量，成为了目前市场上c p t 及其 衍生物产品获取的主要天然资源。人们对喜树中c p t 的分布规律进行了广泛深入的研 究和总结1 1 4 1 喜树中全株均含有c p t ，但各器官含量差异较大有报道喜树枝、根中 c p t 的提取得率分别为干重的0 0 4 2 、0 0 5 1 1 1 5 1 。c p t 含量最高的器官是幼叶，达到 了干重的o 4 ，分别是种子与树皮( 两种c p t 的最初采集器官) 中含量的1 5 倍和2 5 倍【1 6 1 ；但随着幼叶的逐渐成熟，c p t 含量却显著下降，从茎尖开始，叶片1 分别是叶片 3 、叶片5 、叶片7 、叶片9 、叶片1 1 中c p t 含量的1 5 倍、2 6 倍、4 3 倍、5 2 倍和 6 3 倍：而且三年生喜树叶片中，c l r r 含量在生长季每月下降1 1 ；喜树枝条中也存在 幼嫩的枝条c p t 含量高的现象，1 年生、2 年生和3 年生喜树的当年枝的c p t 含量高于 老枝、但4 年生喜树未发现此现象”。 臭假柴龙树是继喜树之后发现的又一富含c p t 的植物，其体内还含有喜树中未发 现的较高水平的9 甲氧基c p t 。臭假柴龙树中c p t 含量之高甚至超过了喜树，因此成 为了大规模生产c p t 的最方便、前景最好的来源1 1 8 1 。臭假柴龙树树皮中具有较高水平 的c p t ，分别含有千重0 2 7 的c p t 和0 i i 的9 甲氧基c p t ，随后是根、茎、叶， 其中根c f r 含量是叶片的2 6 倍，而树皮的c p t 含量是叶片的4 5 倍，这与喜树叶片中 较高的c p t 含量形成鲜明对比。批如b 砌口中亦发现未成熟组织c p t 含量较高的现象： 未成熟种子c p t 含量达到了0 3 2 ，是成熟种子的2 倍。臭假柴龙树种子中子叶的 c p t 含量最高，而未成熟种子的子叶中c p t 和9 _ 甲氧基喜树碱含量更是分别达到了 0 4 2 和0 1 8 ，成熟种子中子叶的c p t 含量分别是根和叶片的1 6 倍和4 5 倍【1 9 1 。 短小蛇根革因其在组织培养上c p t 的高产量，近年来也受到极大的关注。在短小 蛇根草的花芽、幼叶和根中有较高的c p t 含量，而成叶中c p t 含量远远低于幼叶。这 与喜树比较相似，在生长或繁殖的幼嫩器官中有较高的c p t 积累，以抵御昆虫和病菌 的侵害【捌。 c p t 及其前体的转运和储藏的精确机制仍未清晰。虽然茎、叶片中具有较高的c p t 含量，l o p e z m e y e r 等认为，茎和叶片并不是c p t 的合成器官，而根很可能是c p t 的 合成器官，并通过某种方式转运到茎和叶片。y a m a z a k i 等1 2 1 l 在研究c p t 合成的关键 酶异胡豆苷合成酶( s t r i c t o s i d i n cs y n t h e s i s ，s t r ) 的活性时，也发现编码该酶的 m r n a 只在植物体的局部表达来合成a 吓，然后转运到其它组织或器官。该不溶性化 合物的一种可能的转运机制是转化为水溶性的形态葡萄糖苷，例如c h a b o s i d c ，然后 运输至植物的其它部分例。 1 2 2 3c p t 的细胞水平分布 对喜树幼枝发育过程中c p t 含量和定位研究发现，两类分泌结构是c p t 的主要积 累部位。一类是幼茎和幼叶表面的单细胞腺毛，另一类是幼茎及幼叶内部由1 2 层细 胞包围而成的分泌道i 冽。 在细胞水平，c p t 已被定位于喜树幼叶的叶肉和亚栅栏层、成叶的栅栏和栅栏层下 东北林业大学硕士学位论文 细胞层中。在亚细胞水平，c p t 被定位于幼叶和成叶的液泡中。 1 2 3 喜树碱的代谢途径 1 2 3 1 色胺的合成 目前对植物体内t i a s 的代谢途径已有较丰富的认识，大致轮廓可归纳为图1 - 1 。碍i 哚色胺( t r y p t a m i n e ) 与类萜次番木鳖昔( s e c o l o g a n i n ) 在异胡豆苷合成酶( s t r i c t o s i d i n e s y n t h a s e ，s t r ) 的作用下生成t i a s ( 包括c p t ) 的共同前体异胡豆苷，丽异胡豆苷进 一步生成的生物碱因植物种类而异。由异胡豆苷到c i t 的途径很短，只有不到1 0 步 l 。 色氨酸合成的重要性不仅在于从初生代谢上为植物的蛋白质合成提供色氨酸，还在 于在次生代谢上为c p t 、长春碱等单萜吲哚类生物碱提供前体一一色胺。早期的以放射 性同位素标记前体的饲喂实验证明色胺部分完全被嵌入c p t 分子【矧。色氨酸的生物合 成一般是指从分枝酸到色氨酸的过程，其代谢途径已基本清楚。首先分枝酸在邻氨基苯 甲酸合成酶( a n t h r a n i l a t es y n t h a s e ) 的催化下合成邻氨基苯甲酸( a n t h r a n i l a t e ) 。邻氨基 苯甲酸合成酶有两个亚基，q 亚基( a s a ) 和b 亚基( a s b ) 。以氨为原料，a s a 单独 即可将分枝酸转化为邻氨基苯甲酸。a s b 是作为a s a 的附属品而发挥作用的。目前已 从喜树中克隆出来邻氨基苯甲酸合成酶的q 亚基的两个基因，其中a s a 2 表达水平很 低，而a s a l 的受生长发育调控。而且与喜树中色氨酸合成酶s 亚基( t s b ) 的表达和 a 叮的积累相关。这说明了a s a l 催化了c p t 前体的合成，而且吲哚合成的早期与 c p t 的合成是协同调控的瞄l 。邻氨基苯甲酸随后经过n 一( 5 一磷酸核糖) 一氨基苯甲 酸、烯醇式l 一( o - - 羧基苯氨基) 一1 一脱氧核酮糖一5 一磷酸、3 一吲哚一3 一磷酸 甘油醛等中间体形成吲哚，吲哚和丝氨酸在t s b 的催化下合成色氨酸1 1 4 l 。t s b 的 m r n a 和蛋白已经在喜树的所有器官中发现，而且与c p t 的含量相关。枝条中t s b 在 维管组织最丰富，而根中皮层最丰富。在喜树的幼苗阶段，是c p t 积累的峰值，同时 t s b 也得到极高的表达，这表明了色氨酸的生物合成与t i a s 途径的协同调控【矧。色氨 酸合成后，在色氨酸脱羧酶( t r y p t o p h a nd e c 缸b o x y l a s e ，t d c ) 的催化下形成色胺。因 此t d c 在类萜吲哚生物碱的合成过程中起了连接初生代谢与次生代谢的作用。喜树中 有两个独立的编码t d c 的基因。t d c l 在顶端组织、幼嫩的枝和树皮中有较高的表达， 在这些组织c i t 含量也较高。t d c 2 仅在真菌诱导子和茉莉酸甲酯的处理下表达，但是 该处理却并未影响t d c l 的表达。这说明喜树t d c l 基因可能是正常生长发育过程中化学 防御系统的一部分，而t d c 2 基因是致病菌侵害诱导的防御系统的一部分阿。在d p u m i l a 中发根中也分离出了t d c 的c d n a ，而且推测出o d l d c 与喜树和cr o s e 淞中 的t d c 氨基酸具有较高的一致性，分别达到了7 1 和6 7 【2 l l 。 亚d 誓嚣 邻氮莲苯甲黢 p a t 叶片。游离态s a 在7 2 h 已明显下降，但结合态s a 含量却依然很高。 s a 对喜树碱的诱导作用不是十分明显，幼叶仅在采样后期有少量的增加趋势，成叶与 根中喜树碱含量变化较复杂，时高时低。但采样后期不同器官中的喜树碱含量均呈升高 趋势。 s a 根处理导致了喜树幼苗根中游离s a 迅速升高到极高的水平，但可能仅少部分 转化为结合态s a 储存于根中与s a 叶片处理不同的是，s a 根处理后叶片中s a 含量 也有较大的提高，这可能是由根中运输而来，但含量远低于根中，因此s a 白根向叶片 的运输也可能是有所限制的。至7 2 h 时，叶片中游离态s a 已经明显下降。 外源s a 根处理对喜树幼叶喜树碱含量影响较小，仅在后期有少量升高。这与叶片 处理的结果不同，可能是根中较高的s a 含量，使喜树碱的分配策略上无需优先照顾稚 嫩的幼叶了。采样的中期成叶1 、2 均出现了下降的趋势，但根中并未发现喜树碱含量 增加的现象。采样的后期各器官均出现了喜树碱含量升高的现象，这可能是喜树在高浓 度s a 刺激下的适应性防御策略。 一瓯协商度西黼工j望 日 压度玉j媳蓠激盟扪田l l口丁止霭基正田日h h u魅浓工图随 低瓯蛩一函监照瞻望跏t匿莲d龃虱t匪 声)t暑k日l僵如簿霹冲 东北林业大学硕士学位论文 讨论和建议 i 讨论 植物在长期的进化过程中形成了复杂生化防御系统以抵御病原菌、昆虫的侵害，该 防御系统的信号转导途径亦极其复杂，其中主要是水杨酸信号转导途径和荣莉酸信号转 导途径 6 5 1 。植物次生代谢物质因其对昆虫和抵抗病原微生物的毒性在植物化学防御过程 中也发挥着重要的作用。1 9 8 3 年，r l a o a d e s 和b a l d w i n 两人分别在对糖槭树、杨树和柳 树的研究中发现伤害不仅使自身，而且使邻近树木均会迅速产生抵御伤害的酚类物质， 如水解单宁等【8 1 嘲，之后植物次生代谢的研究就与植物的化学防御研究、植物的伤信号 研究紧密的联系在一起。 喜树碱因其独特的抗癌机制广受关注，但有关喜树碱在其原植物体内的生理功能则 相对较少。目前，非生物因子( 光照、水分、营养等) 影响喜树中喜树代谢的研究已有 大量报道 4 s - 5 , 1 ，还有一些研究表明茉莉酸甲酯等伤信号分子可以提高喜树中喜树碱代谢 关键酶活性及其基因表达，但对喜树碱含量的影响却结果不同5 6 1 ，这可能是由于植物 组织培养细胞中生物碱的合成和积累与细胞分化程度密切相关。本实验通过根和叶片两 种途径对喜树幼苗外源施加s a ，并检测喜树幼苗不同器官中喜树碱含量的变化，结果 表明外源s a 的施加可以诱导喜树幼苗中喜树碱含量的升高。 通过叶片施加方式效果更加明显，其中幼叶中喜树碱含量显著升高。虽然还缺少直 接的证据表明喜树碱是一种化学防御物质，但喜树不易招虫害病害的现象、饲喂山羊喜 树叶片导致山羊中毒的报道似乎为喜树碱参与防御提供了佐证【8 蝴j 。喜树幼嫩组织中营 养丰富而又缺少必要的物理防御，喜树在幼叶中积累较高含量的喜树碱形成化学防御。 这似乎就可以理解为什么幼叶中喜树碱含量变化更为明显。施加水杨酸后叶片和茎中游 离s a 含量迅速升高，但下降也很快，2 4 h 后逐渐恢复正常，并且部分游离s a 可能以 转化为结合态s a 的形式储存起来，但储存的数量有限。 而通过根施加的方式效果则不太明显。通过根施加s a 后，根、茎、叶片中内源 s a 含量均显著上升，但喜树碱含量的变化却并不明显。这与以s a 处理洋甘菊 ( m a t r i c a r i ac h a m o m i l l al ) 幼苗的结果完全相反。根处理导致洋甘菊叶片中内源s a 和 香豆素含量的增加，而叶片喷洒既没有导致s a 的积累也未导致香豆素含量的升高1 7 6 1 这可能说明了不同植物对s a 信号应答方式的差异。对喜树根处理虽然导致了叶片中 s a 含量的升高，但浓度远远低于叶片喷洒，可能尚未达到启动喜树碱代谢调整的浓 度。 2 结论和建议 将s a 以喷洒叶片和灌根两种方式施于喜树幼苗，通过高效液相色谱测定内源s a 含量和喜树碱含量的动态变化，得到了以下结果： 喜树叶片s a 含量测定时的最佳提取条件为：以无水乙醇在2 3 c 下超声提取9 m i l l 。 外源s a 处理幼苗均使直接施加的器官和茎皮中s a 的含量迅速极大的升高，并且 少部分游离态s a 可能以转化为结合态s a 的形式储存起来，但储存的数量有限。游离 态s a 含量下降的较快，而结合态s a 则始终保持较高的含量。根处理后，叶片中s a 含量也有较大的提高；但叶片处理后，根中却无明显变化 外源s a 叶片处理诱导了喜树幼苗幼叶中的喜树碱含量明显提高，成叶1 中采样后 期有少量上升，成叶2 中喜树碱含量比较稳定，而根中在采样初期有少量上升。外源 s a 根处理，并未导致幼叶中喜树碱含量变化，成叶与根中喜树碱含量变化也较复杂， 时高时低。但采样后期不同器官中的喜树碱含量均呈升高趋势。 根据本实验的研究结果，建议从以下方面进行改进和下一步研究： 为了研究喜树碱代谢与s a 的关系，除了要对喜树碱和内源s a 含量进行分析之 外，还应检测喜树碱代谢前体物质的转移分配，跟踪其关键酶及其基因的表达。 植物中的伤信号是复杂的、非线性的系统，与植物的次生代谢存在着密切的联系。 而关于喜树特别是喜树实生苗这方面的研究还比较少。为了探寻喜树碱在喜树体内的生 理机制；综合的探讨荣莉酸甲酯、乙烯和s a 等信号分子对喜树碱代谢的影响，也有着 重要的理论研究意义。 3 1 东北林业大学硕士学位论文 j m m 二 i = i il a = = = = 毫兰= = = 参考文献 【1 】h a s h i m o t ot ，y a m a d ay n e wg e n e si na l k a l o i dm e t a b o l i s ma n dt r a n s p o r t c u r r e n to p i n i o ni n b i o t c e h n o l o g y , 2 0 0 3 ，1 2 ) ：1 6 3 - 1 6 8 【2 】沃勒，诺瓦茨基生物碱的生物学及其在植物的代谢作用北京：科学出版社，1 9 8 4 ： 【3 】w a l lm e t * w a n i m c ，c o o kc e , p a l m e ra l l ，m c p h a i la 工s i mg a p l a n ta n t i t u m o ra g e n t s i t h e i s o l a t i o na n ds t r u c t u r eo fc a m p t o t h e c i n , an o v e la l k a l o i d a ll e u k e m i aa n dt u m o ri n h i b i t i f r o m c a m p t o t h e c aa c u m i n a t a ja r i e l c h e ms o c , 1 9 6 6 , 8 s ( 1 6 ) ：3 8 8 8 3 8 9 0 【4 1h s i a n g , y h , h e r t z b e r gr ，h e c h ts ，l i u c a m p t o t h e c i ni n d u c e sp r o t e i n - l i n k e dd n a b r e a k sv i a m a m m a l i a nd n at o p o i s o m e r a s ei jb i o lc h e m , 1 9 8 5 z 6 0 ( 2 7 ) ：1 4 8 7 3 1 4 8 7 8 f 5 】o b e r l i e sn h ，k r o ud j c a m p t o t h e c i na n dt a x o l ：h i s t o r i ca c h i e v e m e n t si nn a t u r a lp r o d u c t s r e s e a r c h j 。n a t 。p r o d 。，6 7 ( 2 ) ：1 2 9 - 1 3 5 【6 】s u d o ，i - i , y a m a k a w a , t y m n a z a k im ，a i m in s a i t oi lb i o r e a c t o rp r o d u c t i o no fc a m p t o t h e c i nb y h a i r yr o o tc u l t u r e so fo p h i o r r h i z a p u m i l a b i o t e c l m 0 1 l e t t 2 0 0 2 ，2 4 ( 5 ) ：3 5 9 - 3 6 3 【7 】w i n km 。e v o l u t i o no fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e sf r o ma ne c o l o g i c a la n dm o l e c u l a rp h y l o g e n e t i c p c m p c c t i v e p h y t u c h e m i s t r y ，2 0 0 3 ，6 4 ( 1 ) ：3 - 1 9 【8 】l is y c a m p t o t h e c al o w r e y a n a , an e ws p e c i e so fa n t i - c a n c e rh a p p y t r e e s ( c a m p t o t h e c ai ) e w 柚s n e ) b u l l e t i no fb o t a n i c a lr e s e a r c h ，1 9 9 7 ，1 7 ( 3 ) ：3 4 8 - 3 5 2 【9 】a i m in ，n i s h i m u r am ，m i w a 丸p u m f l o s i d ea n dd e o x y p u m i l o s i d e ：p l a u s i b l ei n t e r m e d i a t e so f c a m p t u t h c c i nb i o s y n t h e s i s t e t r a h e d r o nl e t t ，1 9 8 9 ，3 0 ( 5 ) ：4 9 9 1 - 4 9 9 4 1 l o a r b a i n , d ，p u t r a , d pa n ds a r g e n t , m v t h ea l k a l o i d so fo p h i o r r h i z af i l 括t i p u l a ，a u s t r a l i a n j o u r n a lo fc h e m i s t r y , 1 9 9 3 ，4 6 ( 7 ) ：9 7 7 - 9 8 5 1 1 g u n a s e k e ms p 。b a d a w im m c o r d e l lg a , f a r n s w o r t hn r c h i t n i sm p l a n ta n t i c a n c c ra g e n t sx i s o l a t i o no fc a m p t o t h e d na n d9 - m e t h o x y c a m p t o t h e c i nf r o me r v a t a m i ah e y n e a n a jn a tp r o d ， 1 9 7 9 , 4 2 ( 5 ) ：4 7 5 - 4 7 7 【1 2 d mj r , c a r d e l l i n aj h ，b o y dm r 2 0 - 0 6 g l u c o p y r a n o s y lc a m p t u t h e c i nf r o mm o s t u e ab r u n o n i s ：a p o t e n t i a lc a m p t o t h e c i np r o - d r a gw i t hi m p r o v e ds o l u b i l i t y j n a t p r o d ，1 9 9 9 ，6 2 ( 1 0 ) ：1 4 2 7 1 4 2 9 【1 3 1 张宪德，柯珉珉，张文毅等从假柴龙树中提取喜树碱中华人民共和国发明专利，申请号： 8 9 1 0 1 2 1 8 1 1 4 】f 围秀峰，戴绍军，王洋，鞠世杰喜树碱代谢的研究进展植物科学进展( 第四卷) ，北京：高 等教育出版社，2 0 0 1 ：2 2 1 - 2 3 2 ， 【1 5 l i u 勾，a d a m sj c c a m p t o t h c c i ny i e l da n dd i s t r i b u t i o nw i t h i nc a m p t o t h e c aa c u m i n a t at r e e s c u l t i v a t e di nl o u i s i a n a c a n a d i a nj o u r n a lo fb o t a n y , 1 9 9 6 ，7 4 ( 3 ) ：3 6 0 - 3 6 5 1 6 l o p e z - m e y e rm ，n e s s l e re l , m c k n i g h tt d s i t e so fa c c u m u l a t i o no ft h ea n t i t u m o ra l k a l o i d c a m p t o t h c c i ni nc a m p t o t h e c aa c u m i n a t a , p l a n t am e d , 1 9 9 4 ，6 0 ( 0 ：5 5 8 - 5 6 0 【l r l u uzj ，a d a m sjc s e e ds o t l r v a r i a t i o ni nc a m p t o t h e c i nc o n c e n t r a t i o n so fn u r s e r y g r o w n 3 2 参考文献 c a m p t o t h e c aa c u m i n a t as e e d l i n g s n e wf o r e s t , 1 9 9 8 ，1 6 ( 2 ) ：1 6 7 1 7 5 【1 8 f u l z e l ed p , s a t d i v er i lc o m p a r i s o no ft e c h n i q u e sf o rt h ee x t r a c t i o l lo ft h ea n t i c a n c e rd r u g c a m p t o t h e c i nf r o m n o t h a p o d y t e s f o e t i d a jc h r o m a t o g r a p h ya ，2 0 0 5 ，1 0 6 3 ( 1 2 ) ：9 - 1 3 1 9 f u l z e l ed p , r a m e s hk s d i s t r i b u t i o no fa n t i c a n c e rd r u gc a m p t o t h e d mi nn a 绕叩优耖f 嚣f o e 础a f i t o t e r a p i a , 2 0 0 5 7 6 ( 7 8 ) ：6 4 3 6 4 8 2 0 y a m a z a l dy ，u r a n o 凡s u d o 珥k i t a j i m a 地t a k a y a m aey a m a z a k im a i m in ，s a i t oi c m e t a b o f i t cp r o f i l i n go fa l k a l o i d sa n ds t r i c t o s i d i n es y n t h a s ea c t i v i t yi nc a m p t o t h e c i np r o d u c i n g p l a n t s p h y t o c h e m i s t r y , 2 0 0 3 ，6 2 ( 1 0 ) ：4 6 1 - 4 7 0 【2 1 y a m a z a k iy ，s u d oi i ，y a m a z a k im ，a i m in s a i t okc a m p t o t h e c i nb i o s y n t h e t i cg e n e si nh a i r y r o o t so fo p h i o r r h i z ap u m i l a ：c l o n i n g , c h a r a c t e r i z a t i o na n dd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o ni nt i s s u e sa n db y s t r e s sc o m p o u n d s p l a n tc e l lp h y s i o l , 2 0 0 3 ，4 4 4 ) ：3 9 5 - 4 0 3 【2 2 】刘文哲，王自芬喜树幼枝的喜树碱积累及其组织内定位植物生理与分子生物学学报， 2 0 0 4 ，3 0 ( 4 ) ：加5 4 1 2 【2 3 c a r t eb kd e b s ce g g e l s t o nd i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fap r e s u m e db i o s y n t h e t i c p r e c u r s o ro fc a m p t o t h e c i nf r o mc a m p t o t h e c aa c u m i n a t a t e t r a h e d r o n