（环境科学专业论文）黄土地区石油污染土壤的微生物修复技术试验研究.pdf

量、接种量、添加h 2 0 2 、营养物质添加对混合系降解率影响的研究结果表明：在相同 时间条件下( 处理时间为7 d ) ，混合菌系对延安炼油厂原油的降解最适降解条件为：接种 量为5 m l ，p h 在6 0 5 7 6 2 ，原油浓度为3 ，温度在3 6 左右，营养物质c ：n ：p 为7 5 8 o 3 ，表面活性剂采用十二烷基苯磺酸钠，添加量为0 5 ，电子受体h 2 0 2 的加 入量为1 5 。通气量为六层纱布混合体系原油降解效果最好，7 d 时间土壤中的原油去 除了接近一半，即降解率达到4 7 以上。 4 、动力学实验：混合菌系在最佳条件下，1 2 0 d 的时间里，对原油的降解率达到了 8 0 2 ，即使土壤中污油减少了4 5 ，效果显著；通过对混合系a c d 3 降解原油反应过 程的动力学曲线拟合结果可知，石油污染物在微生物降解反应的初期符合一级动力学方 程，后期符合零级动力学方程，总体反应过程符合m 0 n o d 一级动力学模型。 关键词：石油污染土壤混合菌群微生物生物强化生物修复 a b s t r a c t t h ee x p l o i t a t i o n 趾du t i l 娩a t i o no fp e t r o l e u mi i ln o n h w e s tl o e s sa r e ah a sal o n gh i s t o r yo f m o r et h 锄9 0y e a r s d l i l et ol a r g ea e r ao fo i lf i e l d 卸dn u m e r o u so i lw e u s ，t h e r ea r el a 略e q u 柚t i t ya s t e p e t r o l e u mh y d r o c a r b o ni n t l l e p r o c e s so fp e t r o l e u mp r o d u c t i o n ，s t o r a g e ， t 砌s p o n a t i o n ， r e f i n e m e n t ， p r o c e s s i n g 锄du s e m lo ft l l i sc a nc r e a t eo i lp o l l u t i o ni nl 鹕e a r e a ，w h i c hc a u s e st h e 胁i ln a t u r a l le n v i r 0 啪e n tt ob eo r i 酉n a l l yw i c k e d b e c a u s et h i sk i i l do fd i e s e lo i lh a sr e l a t i v e l yh i g hb i o l o 舀c a lt o x i t y 觚dt h er e s i d u ei s r e l a t i v e l yp e m 锄e n t ，p e o p l es h o wm o r e 柚dm o r ea t t e n t i o no nh o w t 0r e m e d i a t et h ep o l i u t e d e n v i r o 衄e n t b i o r e m e d i a t i o no f p e s t i c i d e s c o n t a i i l i n a t e de n v i r o 姗e n t ，w l l i c he x p l o i t s t h e a b i l i t yo fo r g a i l i s m st od e 芦a d e 锄帕rd e t o x i f yo r g a n i cc o n t 锄i n a t i o n ，h a sb e e ne s t a b l i s h e d 勰 觚 e f f i c i e n t ，e c o n o m i c ，v e r s a t i l e ，a i l de n v i f o 砌e n t a l l ys o u n dt r e a t m e n t d e c 0 n t 锄i n a t i o n0 f p o l l u t e ds i t e si i lo u rc o u n t r ) rw i t hb i o r e m e d i a t i o nh a sr c c e i v e di i l c r e a s i n gi n t e r e s tr e c e n t l y 1 1 l i sp a p e rt h e o i la sat y p i c a lp o l l u t a l l t s ，f r o mi 弼e d e g r a d i n gb a c t e r i aw h i c hh a v e b e e ni s o l a t e df b mo i l - c o n t 锄i n a t e ds o i l ，s c r e e n i n 岛i s o l a t e d4e 伍c i e n td e 伊a d a t i o no ft h e a d v a n t a g e so fb a c t e r i a s ，b yr a n d o mi i l i x i n ga n do p t i m i z i l l gt h e m ，g e tag r o u po fg o o dm i x e d g r o u po fb a c t e r i aw i t ht l l e 伊e a t e s ti n c r e a s ei nt h el e v e lo fd e g r a d a t i o ns y s t e mi nt h ea c t i v i t y 趾dd e 伊a d a t i o no fc o m p e t e n c y - b a s e d ，n a ti si n t e m a lr c s e a r c h - h o wt om a x i m ：i z et o s t r e n 百h e nt h ec a p a c i t yt h e i ro w no f 目旧u po fb a c t e r i a ；a n ds t u d yt h ei m p a c to fm i x e d 掣o u p s o fb a c t e 血d e 铲a d a t i o no ft h en u t r i t i o n a lc o n d i t i o n s 趾de n v i r o 啪e n t a lf a c t o r sp i l o t ，7 n l e nt 0 c h o o s et h em o r ei m p o r t a n to ft h ef o u rc o n d i t i o n so r t h o g o n a lt e s tt 0d e t e r m i n em i x e d 毋o u po f b a c t e r i a st h eb e s t g r o w t hc o n d i t i o 嬲 卸dt h eb e s tn u t r i t i o n a l c o n d i t i o n s ，f i n a l l y ，u n d e r d e g r a d a t i o no ft h eb e s tu n d e rt h ec o n d i t i o n s ，0 i p t i m a lg r o u po fd e 伊a d i n gb a c t e r i ac a r r i e do u t k i n e t i ce x p e r i m e n t s f r o me x t e m a lf a c t o r st oc o n s i d e r - h o wt om a k ep o l l u t a n t sc 0 n d i t i o n s 柚de n v i r o m n e n t a lc o n d i t i o n sm o r cs u i t a b l ef o rb a c t e r i a ld e 孕a d a t i o n ，i n - d e p t h ，s y s t e m a t i c s t u d yt h ei m p a c to ft h em i c r o b i a ld e 铲a d a t i o n0 ft h ei m p a c to ff a c t o r s ，e n v i r o i u i l e n t a l c o n d i t i o n sa i l de n h 趾c e dt e c l l i l o l o g y i nt l l i ss t u d y ，p o l l u t i o nc o n d i t i o n so fs i m u l a t e dt e s tm e t h o dw h i c hl a s t e d1 8 0d ，m a d e2 2 6 s e t so fd a t a ，t h e 锄a l y s i s0 fa c c e s st ot h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n s ： 1 i d e n t i f yp e r f o m a n c ed e 铲a d a t i o no fi n d i v i d u a lb a c t e f i a ：s c r e e n i n go fo i ld e 铲a d i n g b a c t e r i ae f f i c i e n t l ya b ，c 锄dd ，d u r i n g3 dt i m e ，t 0f c d u c co i lp o l l u t i o ni l lt h es o i l1 5 a r o u n d ，t h a ti s ，d e g r a d a t i o nr a t e sw e r e2 4 1 9 8 1 ，2 2 5 5 柚d2 6 4 3 ，t h ee f f e c ti sm o r e s a t i s f a c t o r y i i lc 0 n t r a s tt h et e s tr e s u l t s0 ft h er e m 0 v a l0 ft h e0 i lp o l l u t i o nb e t w e e nt h ea d d i t i o n o fd e g r a d a t i o no ft h eb e s ta d v a n t a g co fb a c t e r i ad 柚dn o ta d d i t i o na d v 觚t a g eb a c t e r i a l d e 伊a d a t i o no fi i l d i g e n o u sm i c r o o r g a n i s m s ，t h r o u g h o u tt h e4 0dm o i l i t o r i n gt e s t st h er e s u l t s o fr e m o v a lo fp o l l u t a l l t sl i l 汜o i lf o rt h ea d d i t i o no fd e g r a d a t i o no ft h eb e s ta d v 肌t a g eo f b a c t e 南dt h 肌n o ta d d i t i o na d v 柚t a g eb a c t e r i a ld e g r a d a t i o no fi n d i g e n o u sm i c r o o 唱砌s m s i n c r e a s e db y2 5p e r c e n t ，n a ts p e c i f yt h e r ei so b v i o u se 肌c t so ft h ea d v a n t a g co fd e 铲a d i n g b a c t e r i ad e g r a d e d0 i lp o u u t a n t s 2 t h es t r e n 酵h e n i n go fb a c t e r i a ：b a c t e r i ao fc o m b i n a t i v et e s t ，a c c e s st ob e t t e rt h e e f f i c i e n c yo ft h ed e g r a d a t i o no fm i x e db a c t e r i a a c d - 3 ，a t3dt i m e ，d e 伊a d a t i o no ft h eo i li n s o i lw a s 2 5 ，t h a ti s ，t h ed e 伊a d a t i o n m t er e a c h e d3 9 6 7 p e f c e n t ，t h a l l f a t eo ft h e s i n 酉e d e 莎a d a t i o nh l c r e a s e sb y1 5p e r c c n t ，t h r o u g l l 皿1 r e ef a c t o r sf o u rl e v e l so fo n h o g o n a l t e x t ，、张g e tm i xo fb a c t e r i a st h eb e s tm t i 0o fi l l o c u l a t i o ni sa ：c ：d = 1 ：4 ：1 3 t h es t r e n 舀h e n i n go fc 0 n d i t i o n s ：t h es t u d yr e s u l t so fd i f 诧r e n tc o n c c n t r a t i o no f 伽d e o i l ，d i 虢r e n ts u r f a c t a n t 觚dd i f f e r e n ta d d i t i v ec o n c e n t r a t i o n ， d i f 托r e n tt e m p e r a t u r e ，p hv a l u e ， v e n t i l a t i o nv o l u m e ，i i l o c u l u mc o n c e n t r a t i o n ，a d d i t i v eh 2 0 2 ，a d d i t i v e 硼t r i e n t s 觚ds oo n i m p a c tt h em i x e db a c t e r i a ld e 伊a d a t i o n r a t es h o wt h a t ：u n d e rt h es 锄et i m ec o n d i t i o n s q f o c e s s i n gt i m ef o r7d ) ，0 p t i m u mc o n d i t i o n sf o r t h em i x e db a c t e r i a lt od e 伊a d et h e 伽d e o i l f 硒my 锄趾r e f i i l e r ya r e ：t h eb e s tc o n d i t i o n so fm i x e db a c t e r i a ls y s t e mt od e 伊a d ec r u d eo i l a r ci n o c u l u mc 0 n c e n t r a t i o nf o r5m l ，p hi sf r o m6 0 5t o7 6 2 ，c r u d eo i lc o n c e n t r a t i o n0 f3 p e r c e n t ，t h et e m p e r a t u r ea r o u n d3 6 ，n u t r i e n t sc ：n 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c r d - o r g a i s m s b i o l o g i c a i e n h a n c e db i o 聆m e d i a t i o n v 论文独创性声明 本人声明：本人所呈交的学位论文是在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的成果。除论文中已经注明引用的内容外，对论文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本论 文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集体已经公开发表的成 果。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 论文知识产权权属声明 年月日 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归 属学校。学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的 学术论文或成果时，署名单位仍然为长安大学。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 年月 日 年月日 长安大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 研究目的和意义 土壤是生态环境的重要组成部分，是人类赖以生存的主要资源之一，特别是对于我 国有十三亿人口的农业大国，土壤资源显得尤为重要。 随着石油工业的迅速发展和石油产品广泛使用，世界范围内的土壤石油污染日趋严 重，据统计，全世界每年约有8 0 万吨石油进入环境。2 0 0 1 年，美国存有的3 0 0 万个地 下储油罐中发生泄漏的约为5 0 万个【1 】；英国3 0 以上的加油站及几乎所有的化工厂、 炼油厂等均存在严重的油类污染；荷兰迄今为止记录的石油污染场地有十万处之多；我 国有面积达数十万公顷的石油开采区和化工区，含油废水任意排放及石油开发过程中的 各种事故也造成了严重的土壤石油污染【2 1 。统计表明，平均作业一口井残留在地面的落 地油约1 t ，目前，我国石油企业每年产生落地油约7 0 0 万吨，一般井场周围污染半径在 1 0 0 0 2 0 0 0 m 之间，井口周围5 m 范围内为最严重污染区，地面呈黑色，经雨水冲刷污 染范围还会不断扩大。尤其在西北黄土地区，近二十年来，不断发现并开发大型油田， 其中著名的有长庆油田、玉门油田、土哈油田及塔里木盆地的油田等。这些油田及相关 的炼油厂在增大石油及其产品产量的同时，又给周围水体及土壤带来严重污染。 研究发现，石油污染将干扰污染环境生物群落的正常生理、生化活动，破坏化学信 息联系，使生物的生长和繁殖受到严重损害【3 1 。例如当海水中含油0 o l m g l 时，鱼在2 4 h 内就会产生油臭味。污染严重的区域，还会造成一些抗性弱的物种死亡，其生态系统的 恢复需要十年以上的时间。一些石油烃类进入动物体内后，对哺乳类动物及人类有致癌、 致畸、致突变的作用。土壤的严重污染会导致石油烃的某些成分在粮食中积累，影响粮 食的品质，并通过食物链，危害人类健康1 4 1 。因此随着国民经济迅速发展和环保要求的 提高，石油污染土壤的治理是我们面临的一大挑战。 为了消除土壤中的石油污染，科学工作者正在进行广泛研究，积极寻求安全、可靠、 经济有效的治理方法。传统的物理化学处理方法常常需要建设固定的处理设施，投加化 学药剂，在处理运行过程中还需要温度、压力、电力供应等条件，处理成本高，同时还 会造成二次污染。我国很多油田以往对井场废弃泥浆、落地原油、油泥等污染源的处理 主要是采取风干、挖坑掩埋的方法或是将这些废弃物堆放在以防渗布为衬的泥池中，这 些方法都很难使污染物从环境中降解除去【5 】，而且物理和化学方法费用较高不符合我国 国情。8 0 年代以后，生物修复技术迅速发展起来，其处理成本约为传统的物理化学方法 的1 3 1 5 。该技术由于其具有处理成本低、没有二次污染、处理条件温和等良好的技 第一章绪论 术特点，受到广泛重视并得到飞速发展，已经成为目前国内外环境治理技术的研究热点， 有望成为十分有前景的环境污染治理的替代技术。 但由于石油烃中含有大量的h o c s ( 有机污染物) ，特别是含有粘性高、稳定性好， 生物可利用性低的高分子有机物，多环芳烃类，严重限制了生物修复的效果和速度，面 对挑战，生物处理研究工作者的选择是在处理过程中强化生物降解，提高生物降解的速 率，这也是环境工程中的重要理论和实践问题。解决问题的根本方法是通过各种强化措 施优化降解环境，强化降解条件，提高微生物的降解能力和降解速度，从而更有效去除 污染物，修复污染环境【6 9 】。 本文正是在这样的背景下，以长期被石油污染的土壤为菌源，在课题组李春荣以原 油为唯一碳源，筛选、分离出高效的石油烃降解菌中，选出四株降解效果好的菌株，通 过初步复配石油降解实验分析后组成优势混合菌群，协调它们之间的关系确定最佳投菌 量配比。并比较了不同环境因素条件( 温度、投菌量、p h 、h 2 0 2 投加浓度、表面活性剂、 通气量、营养物质、污染浓度等等) 下生物强化处理石油污染土壤的效果，并从单因素 中筛选出4 个石油烃降解的主要影响因素，协调它们之间的关系。探讨了石油迁移转化 对各种土壤物理化学条件和其它环境因素改变的敏感程度，并找出了各重要影响因素的 重要性和最佳水平。从而更全面，更系统，也更切实际地寻求石油污染土壤生物修复的 高效降解生物和生态条件，以达到最佳治理效果。以期为西北黄土地区石油污染环境的 生物修复提供一定的理论参考和科学依据。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 生物修复技术 ( 1 ) 生物修复的概念 生物修复主要是指依靠生物( 特别是微生物) 的活动使土壤或地下水中的污染物得 以降解或转化为无毒或低毒物质的过程。它主要是利用土壤中特定的微生物、根系分泌 物、菌根和超富集植物等降解或吸收积累在土壤中污染物，实现污染土壤修复的目的。 原来生物修复单指利用微生物降解与转化机制来治理有机污染物，植物修复技术的发展 极大地丰富了生物修复的内涵。因此，广义的生物修复包括植物修复和微生物修复两部 分，有时也包括土壤动物修复。 植物修复技术是通过自然生长的植物或遗传工程培育植物及其根际微生物群落来 吸收、挥发或稳定土壤环境的污染物质，从而修复污染土壤的技术。植物修复技术主要 是利用植物本身特有的吸收能力富集污染物、转化固定污染物以及通过氧化还原或水 2 长安大学硕士学位论文 解反应等生物化学过程，使土壤环境中的有机污染物得以降解，使重金属等无机污染物 被固定脱毒；与此同时，还利用植物根系特殊的生态条件加速土壤微生物的生物量和潜 能，从而提高对土壤有机污染物的分解作用。此外，利用某些植物特殊的积累与固定能 力可去除土壤中某些无机污染物。 微生物修复技术也称之为环境生物技术，主要通过生物技术对人为造成的环境污染 进行医治、恢复、纠正和修补，包括微生物处理方法和过程。微生物能利用污染物作为 碳源和能源，从而达到对污染物的分解和矿化的目的；遗传学和分子生物学的方法能改 善微生物的降解能力；通过实验科学手段，创造微生物生长的良好环境条件，使微生物 技术能够通过一系列过程有效地消除污染，净化环境，将已被破坏的生态平衡重新加以 修复。它是生物修复处理石油污染的重要方法 与物理化学方法相比，生物修复技术的主要优点为：成本低，仅为传统物理化学 修复方法的3 0 5 0 ；生化治理的最终产物是c 0 2 和水，无二次污染；处理效果 较好，处理后的b t x ( 苯、甲苯、二甲苯) 总浓度能降为o 0 5 o 1 m 以甚至低于检测限； 对原位生物修复而言，可就地处理，既节省了处理费用，又不破坏植物生长所需要的 土壤环境。 然而，由于受生物特性的限制，生物修复技术还存在着许多局限性【1 0 】。微生物不 能降解污染环境中的所有污染物，污染物的难生物降解性、不溶性常使生物修复难以完 成；特定的微生物只能降解特定的化合物类型，化合物的形态一旦变化就难以被原有 的微生物酶系降解；微生物活性受温度等环境条件的制约；当污染物浓度太低不足 以维持一定数量的降解菌时会残留在土壤中。 生物强化技术即是针对上述局限性，通过采取一系列措施，尽可能地消除制约因素 的影响，从而达到强化生物修复的目的。 ( 2 ) 微生物修复机理研究 已知降解石油的微生物共有7 0 属2 0 0 余种。细菌有2 8 个属，霉菌3 0 个属，酵母 1 2 个属。目前，有关石油及其污染物的微生物降解方面的研究常有报道，土壤中最主要 的降解细菌有：假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、无色杆菌属( a o l a m o b a o t e r ) ，不动杆菌属 ( a c i n e t o b a c t e r ) 、产碱杆菌属o u c a l i g e n e s ) 、节杆菌属o 缸o l o b a o t e r ) ，芽抱杆菌属( b a c i l l u s ) 、 黄杆菌属( n a v o b a c t e r i u m ) 、棒杆菌属( c o r y n e 蠡r i n s ) 、微杆菌属( m i c r o b a c t e r i u m ) 、微球菌 属( m i c r o c o c c u s ) 、放线菌属( a o t i i l o m y o e t e s ) 、诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 、分枝杆菌属 ( m y c o b a c t e r i u m ) 等。在大多数土壤环境中，上述这些细菌是主要的石油降解菌。其中， 3 第一章绪论 最常见的是假单胞菌，它对短链及长链烷烃、芳烃均能降解，而且能使烷烃彻底降解l l 。 真菌有：曲霉属( 舡p e r 百l l u s ) 、毛霉属( m u c o r ) ，镰刀霉属( f u s a r i u m ) 和青霉属( p e n i c i l i u m ) ， 木霉属( r n i o h o d e 咖a ) 和被抱霉属( m o n i e r e l l a ) 。酵母菌有假丝酵母属( c 锄d i d a ) ，红酵母属 ( r h o d o t o m l a ) 、球拟酵母属( t o r u l o p s i s ) 和酵母属( s a c c h a r o m y l e s ) 。其中以假丝酵母应用最 为广泛。 研究表明，微生物暴露于油类污染的环境，通常在初期并不能降解污染物，而是在 一个相当长的暴露过程中培育自身的降解能力，经过一定的适应过程后，才能降解污染 物【1 2 】。降解质粒的出现是微生物适应污染物质的一种反映。其适应性的可能机制有以下 几种：特定性酶的诱导和抑制；基因突变产生新的代谢群体；有机体的选择富集。 各种不同的有机污染物能否被降解取决于微生物能否产生响应的酶系，酶的合成直 接受基因控制。有机物降解酶系的编码多在质粒上，携带某种特殊有机物基因的质粒称 为降解质粒。降解质粒的出现是微生物适应难降解物质的一种反映。微生物的适应性为 有机物污染的修复提供了可能。 一般来说，石油烃进入微生物细胞可分为两个阶段，第一阶段是烃类从油相转移到 微生物细胞表面，第二阶段是烃类通过细胞壁与膜进入细胞内。在第一阶段即烃类的转 移阶段中，由于石油烃几乎不溶于水，所以微生物降解烃类时有水相、烃相、空气相和 微生物相同时存在，是一个很复杂的体系【1 3 l 。国外对此体系的研究主要集中于油相的烃 如何转移到细胞表而，提出了几种模式【1 4 】。目前比较公认的有三种：微生物细胞摄取 溶解在水相中的烃类；微生物与比细胞大的烃类颗粒直接接触，进而进行摄取；微 生物与比其小得多的被溶解、似溶解的烷烃接触，进行摄取。由于长链烃类在水中很低 的溶解度，第一种模式存在的比率不高。在第二种模式中细胞可以附着的油滴表面积和 细胞表面的疏水性是关键因素【1 5 】。第三种模式是某些微生物可以通过产生生物表面活性 剂，促进烃类乳化，使其被动扩散进入细胞内，从而被降解【1 6 】。在第二阶段中，国内外 学者主要关注的是细胞壁在烃类渗入中的作用。这是由于烃降解酶属于胞内酶，催化脂 肪族烃降解的最初三个反应的酶是与膜结合的，在膜中进行旧。 在好氧条件下，有机物类物质进入降解微生物的细胞后，通过同化作用被降解，这 是一个非常复杂的过程。简单的说，可用下式表示： 有机物类物质+ 生物+ 0 2 + 营养源一c 0 2 + h 2 0 + 副产物+ 细胞体 在微生物修复石油污染土壤的具体修复过程中，微生物对石油污染物的修复机理一 般受到的物理状态、油的化学性质及土壤中油的污染浓度等影响： 4 长安大学硕士学位论文 石油污染物的物理状态 石油碳氢化合物的生物降解与其在环境中的存在状态有很大的关系。在环境中成水 溶液状态的碳氢化合物更容易降解，没有溶入水中的石油碳氢化合物，只有在油与水的 界面处的化合物分子才能与微生物细胞接触，再加上不同表面张力的影响等，可被生物 降解的概率就很多。 石油中的化学组成 石油中所含各种烃类，从最简单的c 1 化合物至复杂的几十个碳原子的固体残渣， 只要条件合适，均可被微生物代谢降解，但微生物对石油中不同烃类化合物的代谢途径 和机理是不同的，难易程度和降解速度也是有区别的。一般来说，c 1 0 c 1 8 范围的直 链化合物较易分解，烯烃最易分解，烷烃次之，芳烃较难，多环芳烃更难，脂环烃类对 微生物作用最不敏感，至今只发现个别菌株能利用它。在烷烃中，c 1 c 3 化合物如甲 烷、乙烷、丙烷只能被少数具有专性的微生物所利用。石蜡可被微生物降解，但含碳原 子3 0 个以上者则较难，部分原因是因其溶解度小，表面积小的缘故。正构烷烃比异构 烷烃易降解，直链烃比支链烃易降解。在芳香烃中，苯的降解极难。要比烷基代苯类及 多环化合物慢得多。由于微生物种类和酶种类的多样性以及化合物化学结构的复杂性 ( 不对称性) ，同一化合物的生物降解途径是不同的，有时存在两种甚至两种以上的降解 途径。 1 ) 烷烃的微生物降解途径 高级烷烃起始的生物降解途径可能有三种：通过单端氧化生成一元梭酸；经过 双末端氧化生成二元梭酸；经过末端氧化生成醇类，然后再生成酮类。其中以途径 最为常见，其具体步骤是先由一个末端开始通过单加氧酶的作用生成一种伯醇，然后通 过两步脱氢作用先后生成醛和脂肪酸。 2 ) 烯烃的微生物降解途径 大多数烯烃比芳烃、烷烃都容易被微生物利用。微生物对烯烃的代谢主要是产生具 有双键的加氧氧化物或环氧化物，最终形成饱和或不饱和的脂肪酸，然后再经嘶化 进入三梭酸循环而被完全分解。 3 ) 环烷烃的微生物降解途径 脂环烃类的生物降解是环烷烃被氧化为一元醇，在大多数研究的细菌中环烷醇和环 烷酮通过内脂中间体的断裂而代谢。大多数利用环己醇的微生物菌株，也能在一些脂环 化合物中生长，包括环己酮、顺( 反) 2 环己烷和2 ，2 羟基环己酮。烷基取代的脂环化 5 第一章绪论 合物可能被氧化的两个位置是侧链和脂环上，化合物的性质，微生物的属种和其他因素 都将影响反应的初始位置。 4 ) 芳香烃的微生物降解途径 芳香烃是重要的石油组分，是修复土壤污染应优先控制的污染物。其代谢机理为芳 香烃由加氧酶氧化为儿茶酚，二轻基化的芳香环再氧化，邻位或间位开环。邻位开环生 成已二烯二酸，再氧化为b 一酮已二酸，后者再氧化为三梭酸循环的中间产物琥珀酸和 乙酞辅酶a 。间位开环生成2 羟已二烯半醛酸，进一步代谢生成甲酸、乙醛和丙酮酸。 以上反应见下图1 1 。 c h 3 + o ， - - = - - + 翎3 一i i 一0 0 h o c 0 0 h c o o h c o a h o o c c h j c h 2 c o o h 蜞h e h s 老 图1 1 芳香烃的微生物降解途径 污染物浓度 土壤中污染物浓度过高是生物修复的一个关键性问题，特别是当污染的生物有效性 或生物可利用性很高，就不太利于生物修复的进行。即使一些化学品在低浓度下可以被 生物降解，但在高浓度下它们对微生物有毒。毒性作用的产生将阻止、减缓代谢反应的 速度，阻止刺激污染物迅速移动的新生物量的快速增长。所以过高的污染浓度就会严重 影响生物修复的效果。 土壤环境中污染物浓度过低也是生物修复的一个问题。当污染物浓度降低到一定水 平时，微生物的降解作用就会停止，这时，微生物就无法进一步将污染物质去除。在微 生物降解过程中，并非微生物的生物量越多越好，过量的生物量会使过程发生挤压和阻 塞，从而不利于生物降解的发生。 石油污染也如此，石油浓度过高会抑制微生物的活性。d i b b l e 等报道，当向土壤中 6 o o o o o + - 魏 一玎吼一能 +一铭 ， 一( 琢 长安大学硕士学位论文 添加油泥使土壤中烃浓度达到1 2 5 5 时，土壤的呼吸强度增大，当烃浓度达到1 0 时，土壤的呼吸强度不再增大，当烃浓度达到1 5 时，土壤的呼吸强度下降，表明油浓 度太高会抑制微生物的活性。j e n s o n 等研究了含油废弃物与土壤的质量百分比在0 3 0 时，油的浓度对生物降解活性的影响，发现浓度为5 时，0 2 的吸收率最高，这与 d i b b l e 等的研究结果一致【1 剐。 1 2 2 生物修复的强化技术 ( 1 ) 生物强化技术产生的背景 生物强化技术( b i o 卸g m e n t a t i o n ) ，又叫生物增强技术，该技术的主要原理是基于天 然系统的微生物并非全都有效，或以需要的浓度存在。为了提高生物降解反应器中微生 物的降解能力，利用投加外源微生物来保持并强化反应器中存在微生物的活性，从而提 高生物降解效果。目前，外源微生物培育主要通过三方面实现：通过长时间驯化、富集、 筛选、培养获得一定降解能力的微生物群体；从特定环境中分离纯化得到某些具有特定 降解能力的微生物；通过基因工程手段来改造微生物，以使其具有特定降解能力。即生 物强化技术利用的微生物来源可分为三大类型：土著微生物、外来微生物和基因工程菌。 生物强化技术产生于二十世纪7 0 年代中期，8 0 年代以来在水污染治理、污染土壤 的修复及大气污染的治理中得到广泛的研究和应用【1 9 l 。该项技术产生初期是因为一些废 水处理厂的突发事故，如菌体大量死亡，或受到有毒有害难降解有机物的冲击，导致水 处理系统中活性污泥大量死亡，或是原有系统的处理能力不足，使治理后的废水达不到 排放标准，于是直接向原有处理系统中投加高效菌种以挽救系统，使其恢复正常，改善 出水水质【掣。现阶段的生物强化技术通常是指在生物处理系统中投加具有特定功能的微 生物、营养物或基质类似物来改善和优化原有处理系统的处理效果，促进目标物质的去 除效果。 ( 2 ) 生物强化技术的作用机理及特点 1 ) 高效菌直接作用 通过驯化、筛选、诱变、基因重组等技术得到具某种降解特性的微生物，使其能够 直接降解目标物质，并以其为主要碳源和能源生长。如果原处理系统不含有这种微生物， 投加一定量的该菌种可以针对性且有效的去除目标物，如果原处理系统中存在少量的这 种微生物，采用投加高效菌的方法就可以大大缩短微生物驯化所需要的时间，不需要延 长原来水力停留时间而达到较好的去除效果。如s e l v a r a t n a m f 2 1 】等通过在活性污泥中投 加苯酚降解菌p s e u d o m o n a sp u t i d aa t c c l l l 7 2 提高了对苯酚的去除率，系统在4 0 天内 7 第一章绪论 一直保持9 5 1 0 0 的苯酚去除率；而没有进行生物强化的对照组，苯酚的去除率很 快降到4 0 左右。c h a m b e r s 【2 2 】用投加高效菌的方法处理牛奶废水，分别用于延时曝气、 曝气塘和氧化沟三种不同系统，都提高了b o d s ，c o d c r 的去除率。h u n g 【冽等人用该方 法处理马铃薯废水，可使1 o c ( 总有机碳) 去除率达到9 8 。 2 ) 微生物共代谢作用 对于一些有毒有害物质，微生物不能以其为碳源和能源生长，但在其它基质存在下 能够改变这种有害物的化学结构使其降解。如以甲烷、芳香烃、氨、异戊二烯和丙烯为 主要基质生长的一些菌可以产生一种氧化酶，这种酶可以共代谢三氯乙烯( t c 助。许多 有毒有害有机物质的降解是通过共代谢途径进行的。例如在氧化塘处理焦化废水的研究 中，投加生活污水后，焦化废水的c o d c r 去除率大大提高，主要是由于生活污水中含 有多种营养元素，提高了生物的活性，起到了共代谢作用。s t e 骶n s e n 【2 4 】等在研究无机营 养对生物降解苯胺和己内酞胺的作用时发现，如果介质中不加入无机营养物磷，则苯胺 根本不能被矿化；如果介质中加入一定量的磷，则底物就能被降解。但是共代谢机制成 功地用在生物增强系统中并不多见。 3 ) 微生物菌株质粒转移作用 许多微生物对污染物的降解是由质粒编码并控制，而质粒在微生物之间容易实现水 平转移交换，在对生物强化技术的某些研究中，将高效菌作为质粒的供体加入到活性污 泥系统中，以期望通过投加菌和固有菌之间的基因转移，使固有菌具有某方面的降解特 性【2 5 - 2 7 1 。 生物强化技术用于环境污染物的治理具有如下特点：操作简单，因地制宣，应用 灵活。采用生物强化技术一般是在原来的污染物处理系统及设备基础上，根据需要投加 高效菌，一般无需构建新的设备装置，且采用生物强化技术的时间和地点可以根据污染 物存在和出现状况而定，应用比较灵活。针对性强，见效快。针对污染物处理系统出 现的各种不同情况及所要达到的目标，向系统中投加具有特殊作用的菌种，针对性比较 强，且能够很快达到对污染物去除或系统改善的目的。 1 2 3 生物强化技术在石油烃污染环境修复中的应用 石油污染生物修复技术的应用开始于1 9 8 9 年美国消除阿拉斯加泄漏石油的污染 f 矧。阿根廷1 9 9 2 年1 0 月曾在p u e n or o s a l e s 集敖地施用肥料，靠土著微生物清除了7 0 0 t 罐的泄漏；科威特科学家采用微生物技术成功地对污染地的石油进行了降解【2 9 1 。虽然石 油污染生物修复技术已经取得显著成就。 8 长安大学硕士学位论文 但在石油污染修复过程中，由于石油烃中含有大量的h o c s ( 有机污染物) ，特别是 含有粘性高、稳定性好，生物可利用性低的高分子有机物，多环芳烃类，严重限制了生 物修复的效果和速度，因此，目前关于微生物修复技术的研究和应用几乎都要采用一些 强化措施提高生物修复的效率。所谓生物强化修复是指在生物修复系统中通过投加具有 特定功能的微生物、营养物或采取其他措施，以期达到提高修复效果、缩短修复时间、 减少修复费用的目的【删。 近几年发展起来的关于微生物修复过程中的各种强化方式，主要有通过调整外在的 环境因素来改变石油烃的特性，或提高土著微生物酶的活性，来提高石油的降解率。如 添加表面活性剂1 3 1 1 ，增加土壤n p 含量，水分含量，加氧化剂或翻耕土壤提高微生物的 供氧条件【3 2 】等；也有研究表明可通过分离、富集可降解石油烃的高效降解菌株接种到被 污染土壤中【3 3 - 3 4 】提高降解效率，缩短污染土壤的恢复时间；与其它治理方法联用也是当 今研究和实践的一个热点问题，如电动力学技术加强原位微生物修复技术，这种方法可 以有效辅助微生物及营养物质在土壤中的输送和扩散，具有高度定向性，可节约处理费 用，提高降解效果【3 5 矧。鉴于本论文研究的主要问题，下文仅就菌种( b i o s t i m u l a t i o n ) 和 环境条件强化石油微生物修复技术的有关