（动物学专业论文）中缅树鼩分子标记方法的建立及其遗传多样性分析.pdf

删蚴 y 1 7 7 5 7 石。 ( 三) 实验方法1 9 二、实验结果2 0 ( 一) 微卫星d n a 多态性的检测2 0 ( 二) 群体的遗传多样性的分析2 1 ( 三) 微卫星座位的等位基因大小判定、测序及序列比对2 2 三、讨论2 5 ( 一) 种群遗传多态性的度量2 5 ( 二) 微卫星座位的序列分析2 6 小结2 7 参考文献2 9 论文综述3 2 附录4 3 致谢4 6 研究生简历4 7 1 3 5 9 9 9 9 o 2 2 3 3 6 6 8 8 8 8 ，l，1，1，j 1工11，11 中国医学科学院北京协和医学院硕上研究生毕业论文 摘要 树嗣作为新兴的模式动物之一，因其在进化地位上与灵长类动物亲缘关系较为 接近，且体型小，易驯养，繁殖能力强，以及存在诸多自发性疾病等特性，可作为 某些人类重大疾病研究的动物模型，在医学生物学上已呈现出广泛的应用前景。目 前，树踟己被应用于病毒、神经、免疫、肿瘤和社会生物学的研究，表现出对其应 用研究多于基础研究的状态，遗传背景研究就更为少见，不利于实现实验动物标准 化。本研究结合不同遗传标记方法的优点，分别采用黜廿d ( r 觚d o m 锄p l i f i e d p o l y m o r p l l i cd n a ) 和微卫星d n a 两种分子标记方法分析中缅树鼢种群的遗传结构 并评估其遗传多态性，为开展树昀繁育工作与实现实验动物标准化提供一定的理论 基础和遗传检测方法。 针对目前树鼢基因组信息未知，可供参考的遗传信息匮乏等问题，首先通过建 立树询砒”d 遗传标记分析方法，了解树鼢种群的遗传多样性。采用p c r 技术对 4 0 条随机引物进行优化，筛选出能有效用于树晌群体遗传分析的凡心d 位点，对 4 8 只树嗣个体的基因组d n a 进行p c r 扩增；应用p o p g e l l e1 3 2 与凡心d i s t a l l c e p a c k a g ev e r s i o n1 0 4 等软件进行数据处理并分析树嗣的群体遗传特性。2 0 个扩增效 果理想的& 廿d 引物在4 8 个树晌个体中共检测到1 1 3 个位点，平均每个引物可扩 增出5 6 5 个位点，其中多态位点数为6 9 个( 占6 1 1 ) 。树购种群个体间的遗传相 似系数平均为0 8 3 0 7 ，个体间遗传距离在o 0 9 o 2 7 之间，平均遗传距离为o 1 6 9 3 。 雄性群体的遗传多态度( h o ) ( 0 1 8 6 4 ) 略高于雌性群体( o 1 4 7 0 ) ，平均遗传多 态度( h p o d ) 为o 1 6 6 7 ；树铜遗传多态度所占的比例在群体内为4 8 2 9 ，而雌、雄 群体间为5 1 7 1 。n j 法进行聚类分析得出t 1 5 、t 3 3 和t 4 7 号树嗣个体聚类成一 大类，其余4 5 只树铜个体聚成另一大类，雌、雄个体呈相互交叉现象。实验结果 表明，本研究的树嗣群体具有较好的遗传多样性，实验所筛选的2 0 条随机引物和 建立的凡”d 标记方法可有效用于树韵种群的遗传结构分析和遗传变异监测。 为了进一步研究中缅树趵种群的遗传背景，结合微卫星d n a 标记具有高度的 多态性、共显性遗传、易于p c r 稳定扩增等特点，参考国外学者从其它种类的树踟 分离的少数微卫星座位引物，建立微卫星遗传标记方法分析树购种群的遗传多态 性，并与r a p d 方法得出的结果作相互验证。通过利用1 1 个微卫星座位对6 0 只中 缅树踟进行p c r 扩增及1 2 非变性( 中性) 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测微卫星d n a 的扩增产物，筛选出9 个能扩增出清晰、稳定条带的微卫星位点，并计算其等位基 因数、等位基因频率、多态性信息含量( 尸，c ) 、基因杂合度等指标。9 个微卫星基 因座共检测到5 1 个等位基因，平均等位基因数为5 6 6 6 7 。t g 2 2 座位的杂期望合度 值( 日) 最高，为o 8 9 3 6 ，最低为t g l 的o 5 0 4 2 ，平均期望杂合度为o 7 6 4 8 。各微 卫星座位的多态信息含量值( 尸，c ) 在o 4 9 8 5 o 8 8 9 6 之间，平均值为o 7 5 8 8 ，表 明该树晌种群具有较高的遗传多样性。选取6 个微卫星基因座的p c r 扩增产物进行 中国医学科学院北京协和医学院硕上研究生毕业论文 序列测定分析，出现( a c ) n 或( a c ) n 的完全和不完全的核心序列；各座位同源性比对 的变化范围为7 5 9 3 。结果表明，筛选的9 个微卫星基因座具有较丰富的遗传 中国医学科学院北京协和医学院顾士研究生毕业论文 a b s t r a c t a so n eo fe m e 嘻n ga 1 1 i m a lm o d e l s ，1 r e es l 鹏w sh a v eb e e l l 印p l i e dw i d e l yf o r b i o m e d i c a lr e s e 卸c h t h e s ea i l i m a l sa r ep h y l o g e n e t i c a l l yc l o s et 0p r i m a t e si ne v 0 1 u t i o n d u et os o m ec h a r a c t e r i s t i c sw e r ee xh i b i t e d 丘o mm et r e es h r e 、，s u c ha ss m a l ls i z e ，e a s y t 0d o m e s t i c a t i o n ，g o o dr 印r o d u 胡o na b i l 咄s p o n t a i l e o u sd i s e a s e sa n de x p 硎m e l l t a l a i l i m a lf o rh b vh c vi n f e c t i o n t r e cs l l r e w sh a v eb e e i l 印p l i e d 蠡) rl o t so f 咖d i e s i n c l u d i i l gv i r o l o g y ，n 吼i r o l o g y ，i m m m l 0 1 0 9 y o n c o l o g y 锄ds o c i a lb i o l o g ya n ds o o n h o w e v p e o p l es h o w e dm o r e i i l t e r e s tt 0t l l e mi n 也ea p l p l i e dr e s e a r c ht h 锄m ea m m a l i t s e l e s p e c 硼y ，n l e r ew e r er a r es 砌i e sa b o u tt h e i rg e f l e t i cb a c k g r o u n d ，s ot 1 1 a tt r e e s h r e w sw e r el i i 】1 i t e dt op e r f i o 肌s t a i l d a r d i z a t i o na r l da p p l i c a t i o na se x p 甜m e n t a la 1 1 i m a l h e r e ，w eu s c dr e s p e c t i v e l y 黜心d ( r a i l d o ma i t l p l i f i e dp o l y m o r p l l i cd n a ) a n d i i l i c r o s a t e l l i t ed n am a r k e r st oa l l a l y z eg e l l e t i cs t l l - l c t u r eo ft h e r r e es h r e w s ( 死华搬砌 b p 肠豫p c 而拥e 门s 括) p o p u l a t i o 玛a l l d 鼯t i m a t e di t sg e i l e t i cd i v e r s i t y t h e 铆om o l e c u l a r m a l ( e r sc o u l dp r o v i d em et 1 1 e o r e t i c a lb a s i sa i l d g e i l e t i cd e t e c t i v em e t l l o d sf o rl l st 0 p r o m o t et h es t a n d a r d i z a t i o no fl a b o r a t o 巧a i l i i i l a lo f 7 r r e es h r e w s f o rm el a c ko ft r e es h r e wg e i l e t i ci n f o 肌a t i o na i l d1 1 i 】- l c n o 、ng e i l o m e ，w eh a dt o e s 讪l i s ht l l er a p dg e n e t i cm 破e r st ou 1 1 d e r s t a l l dm eg e n e t i cd i v e r s 埘o ft h ct r e e s h l w sp o p u l a t i o n 4 0r a n d o mo l i g o 姗c l e o t i d ep r i m e r sw e r ef i l l s t o p t i i i l i z e d t l l e i lm e 研m e r s ，w i me 艉c t i v e l ya n a l y z i n gn l e1 慨s h r e w sr a p d1 0 c i ，w e r eu s e df o rp c r a m p l i 丘c a t i o n t h er e s u l t sw e r ea 1 1 a l y z e dw 曲p o p g e i l e1 3 2a 1 1 d & 廿d i s t a i l c ep a c k a g e v e r s i o n1 0 4s o 胁a r ef o rm ep o p u l 撕o ng e n e t i cc h a r a c t 耐s t i c so ft l l et r e es l 鹏w s a t o t a ln u m b e ro f1 1 3 毗心dl o c ii n2 0p 砥c t 毗谨d 面m e r sw e r ed e t e c t e d ，锄d6 9o f 1 13s i t e sw e r ep o l y m o r p l l i c ，锄o l l i l t i n gf o r61 1 t l l ea v e r a g eg e n e t i cs i l i l i l 撕t ) ，i n d e x a 1 1 dt 1 1 ea v e r a g eg e n e t i cd i s t a i l c ew e r eo 8 3 0 7a n d0 16 9 3r e s p e 嘶v e l y ，i i l d i d u a lg e n e t i c d i s t 龃c eb e 呐e 阻o 0 9 0 2 7 g e n e t i cd i v e r s i t yw a u s0 18 6 4 ( m a l e ) a i l do 1 4 7 0 ( f i e m a l e ) r e s p e c t i v e l y ，w i m 锄a v e r a g co f0 16 6 7 p 枷t i o no fg e i l e t i cv 撕a t i o ni n d i c a t e dt h a t 4 8 2 9 w a sd i s t r i b u t e dw i t l l i np o p u l a t i o 玛a n d5 1 7 1 b 咖e e i lm a l ea n d 矗锄a l e p o p u l a t i o n s c l 璐t e ra i l a l y s i sb yn j 缸优s h o w e dm a tt 15 、t 3 3a n dt 4 7i n d i v i d u a l sw e r e c l a s s i f i e di n t oo n el a r g e 舯u p ，a n o l e rg a t l l e r e db yt h er e s t a tt h es 锄et i m e ，廿l e r ew 雒 硫e r c r o s s 锄o n gm a l e 锄d 触l a l ei n d i 、，i d 砌s 1 h er e s u l t sa l s oi n d i c a t e dt h a tt h et r e e s h e w sp o p u l a t i o nh a dh i 曲e rg 肌e t i cd i v e r s i 哆，a n dt h es e l e c t e d2 0p r i m e r so f 凡 d w e r ea v a i l a b l et oa i l a l ) ，z em eg 饥e t i cd i v e r s 埘a n dm o i l i t o rm eg e n e t i cv a r i a t i o no fm e t r e es h r e w sp o p u l a t i o n w i m 吐l ea d v a n t a g e so ft h el l l i c r o s a t e l l i t ed n a m a l 【e r ，s u c h 弱h i 曲p o l y m o 印h i s m ， c o d o m i n 孤ti n h e r i t a l l c e ，锄dp c r 锄p l i f i c a t i o ne a s i l ya i l ds t e a d i l y ，w ee s 诎l i s h e dt h e 3 h i g l l e s t0 8 9 3 6 ，n l el o w e s tf o rm et g lo fo 5 0 4 2 ，m ea v 哪eo fo 7 6 4 8 t h e p o l y m o 印l l i s mi n f o m a t i o nc o n t e i l t ( p i c ) o f9m i c r o s a t e l l i t el o c i 眦g e d6 o mo 4 9 8 5t 0 0 8 8 9 6 ，w i t ham e a no f0 7 5 8 8 ns h o w e dm a tt l l et r e es h 聊sp o p u l a i i o nh a dh i g l l e r g 既e t i cd i v e r s i t ) ，b e s i d e s ，m e 锄p l m e dp c rp r o d u c t so f6s e l e c t c d l i c r o s a t e l l i t el o c i w e r es e q u e n c e d a r e rs e q u e n c i n g ，w ec o u l d 丘n dt h a tm em o t i fo fm i c r o s a t e l l i t cl o c i w e r em a i l l l ym a d eo ft h ep 能c ta i l di m p e r f e c t ( a c ) no r ( a c ) ns h o r tt 觚d e mr 印e a t t h e s e q u e i l c eh o m o g e i l e i t yv a r i e d 矗的m7 5 t o9 3 t h er e s u l t si n d i c a t e d l a tm es e l e c t e d9 m i c r o s a t e l l i t e1 0 c iw i mh i 曲g e n e t i cp o l y m o 印h i s mc o u l db eu s e dt 0a i l a l y z et h eg e l l e t i c d i v e r s i 够o fm e 1 r e es h r e w sp o p u l a t i o n t h e s er e s u l t ss h o w e d l a tt l l e1 r e es h r e w s p o p u l a t i o nh a dh i 曲e rg e i l e t i c p o l 珊。咄i s m h e r e ，t 、) l ，og e i l e t i ct e s t i n gm e t h o d si i l c l u d i n gr a p d 锄dm i c r o s a t e l l i t e d n a g e n e t i cm a k e r sh a db e e i le s t a b l i s h c dr e s p e c t i v e l y ，砒l i c hc o u l db ea p p l i e dt o a 1 1 a l y z em eg e n e t i cs t n l c t l 鹏o ft h et r e es h r e w sp o p u l a t i o na i l de s t i m a t et h e i rg e n e t i c d i v e r s 咄1 1 1 et r e es 1 1 r e w sw i t hah 砷p 0 1 y n l o r p h i s mf a c i l i t a t et 0m ep r o p a g a t i o no f a i l i m a lb r e e d i n g ，b u ti fw ew a n tt ou s ew i d e l yt h et r e es h r e w sf o rb i o m e d i c a lr e s e a r c h ， w em u s tp r o m o t et h ep r o c e s so fs t a l l d a r d i z a t i o no fl 曲o r a t o r ya n i m a l st o 锄s u r e c o n s i s t e i l c ya i l dr e l i a b i l 时o f e x p 耐m e l l t a lr c s u l t s k e yw o r d s ：t r e es 1 1 r e w ；r a p d ；g e l l e t i cm a r k c r ；g e l l e t i cd i v e r s i 哆；m i c r o s a t e l l i t e d n a ；s e q u e n c i n g 4 中国医学科学院列e 京协和医学院硕士研究生毕业论文 前言 树驹( 聊口砌6 p 肠嚣一，t r e es h r e w ) 作为新兴的医学实验动物模型之一，是一种 形似松鼠的小型哺乳动物。最早于1 7 8 0 年被西方学者w e l i s 发现于远离越南南部大 陆的p u l oc o 妣岛，最初专用属名来源于马来语“t u p a i a ，意为松鼠。但其具有 松鼠类所没有的完整的齿式，并不是真正的松鼠n 1 。食虫目动物进化到原始的树铜， 而后就有了灵长目动物，表明了树铜是食虫目与灵长目之间的分水岭窿1 。因此，许 多学者认为，树晌在分类学上属哺乳纲，有胎盘类，是一个独立的目，称为攀铜目 ( 跏，z 沈，2 删。据y a t e s 报道口1 ，攀嗣目的主要特征是背毛为一致的橄榄绿色或橄榄 褐色，腹毛为灰白色或灰黄色：颈侧有条纹，是区别树铜种属的重要标志；4 足毛 色与背部相似，5 趾发达具强而锐利的爪；具有小而简单的盲肠；颧弓完整，有一 个小的圆孔；听泡不扩大；眼眶上的眶后突发达，且与颧突相遇而形成骨质眼眶环； 聘骨无大型孔；耻骨与坐骨左右形成1 公分软骨结合部，鼓骨包已形成；前臼齿3 3 ， 自齿3 3 ；脚不特别伸长；前后腿接近等长；中型吻，纤细而突出，吻基不能自由活 动n 1 。目前，攀铜目共有2 科5 属2 0 种，而我国的树嗣只有一个属晦1 一 大多数树嗣种类属热带动物，主要分布在热带和亚热带，如东南亚的印度恒河 北部、泰国、马来西亚、印度尼西亚、越南、缅甸和菲律宾等地，以及我国云南、 贵州、广西和海南等3 ，生活于热带雨林，季雨林，灌丛地带和次生林等地，有时 出入于农舍园宅，行动灵活，在土堆挖洞作穴，亦有的在树上筑巢。树昀行动灵活， 有较好的视力和嗅觉以及远比食虫类发达的脑颅。树购是一种野生的昼行性哺乳动 物，与大多数白天活动的哺乳类如松鼠、猴类、长臂猿等一样，主要在白天活动， 活动高峰在清晨和黄昏。树驹是杂食性动物，喜食昆虫、蜂蜜及甜的水果。鉴于其 肉食性强，笼养时须注意有足够的蛋白质饲料；营养缺乏或低下时体重减轻，毛无 光泽，易患疾病而死亡。树询性成熟时间约为6 个月，怀孕期4 3 5 0 天，繁殖能力 强，胎仔为1 5 只，每年2 9 月为生殖季节。实验室饲养时宜雌雄分居，交配时合 笼，怀孕时分笼将雌性转到繁殖笼内，分娩育仔。树嗣属于四足型运动，急速弹跳 式跑动，很象松鼠，对外界刺激高度敏感，如长时间受惊吓，处于紧张状态时，体 重下降，睾丸缩小，嗅腺发育受阻，当嗅腺缺乏时，母嗣产后吃仔生育力散失哺7 1 。 中国现野生树嗣仅有1 个种一中缅树嗣，6 个亚种，昆明地区主要分布的是滇西亚种 ( 聊口蛔b p 肠，z g p ，fc 锄f ，z p 疗s 西) 。 随着生物医学的深入发展而高等的灵长类动物资源日趋减少和枯竭，分布广且 数量多的树晌逐步引起了学者们的广泛关注，世界卫生组织( w h o ) 曾呼吁用树晌代 替数量日趋减少和濒危的非人灵长类动物隋1 。由于树嗣特殊的分类地位和体型小， 易驯养，繁殖能力强，新陈代谢等生理特征和解剖结构比犬、鼠等动物更接近于非 人灵长类动物，以及存在诸多自发性疾病如乳腺癌哺1 、自发性糖尿病阳3 和自发性鳞 5 中国医学科学院北京协和医学院硕十研究生毕业论文 状细胞癌n 们等特性，可以替代或减少一些灵长类动物的使用，作为某些人类重大疾 病研究的动物模型，在医学生物学上已呈现出广泛的应用前景n ，尤其在丙型肝炎 动物模型研究方面能够替代濒危的黑猩猩显示出巨大潜力，成为研究的热点。目前， 树嗣己被应用于神经、消化、泌尿、病毒、免疫、肿瘤、营养和生理代谢等医学生 物学研究以及运动生理、急慢性压力的影响和应激等社会生物学的研究。树嗣因大 脑较发达，多被用于神经系统方面的研究，如对大脑皮质的定位，嗅神经、纹状体 颞皮质，小脑核闭的形态，小树嗣的小脑发育、视觉系统、神经血管的研究；神经 节细胞识别能力，口腔粘膜感觉末稍研究：神经系统的多肽、应激等研究。神经介 质方面有作乙酰胆碱、五羟色胺、肾素、血管紧张素等的研究。消化系统方面用于 进行胃粘膜、下颌牙床、胆石症的研究。泌尿系统方面用于交感神经对肾小球结构 的作用，肾功能衰竭等研究。病毒方面用于甲型肝炎病毒( h b v ) 、乙型肝炎病毒 ( h c v ) 和隐性病毒如疱疹毒、腺病毒等方面的研究；另外，树胸在自然条件或实 验室条件下能感染人的疱疹病毒。而我国对树鼢的研究早见于教研学和动物学方 面，应用于医学方面较晚。1 9 7 5 年最先用于代替恒河猴作为小儿麻痹方面的试验未 能成功。此后用于研究鼻咽癌e b 病毒，初步取得某些结果，将e b 病毒注进肠系膜 淋巴结能使淋巴组织增生，用树购鼻粘膜细胞作培养后接种e b 病毒取得较好的结 果。树嗣作为甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒的肝炎模型分别取得了一定的阳性结 果，且以树嗣作为轮状病毒的腹泻病理模型已获得成功。为了了解树鼢社会行为学， 有些学者曾对树嗣2 4 小时活动规律进行了密切观察。在营养代谢方面，由于树嗣血 中高度密度脂蛋白成份占血脂总量的6 0 7 0 ，比例较高，已用于探索抑制动脉粥 样硬化发病机理的研究；在高胆固醇膳食下，树嗣容易形成胆结石，为高脂血时胆 固醇排出途径提供客观依据。此外，部分学者还用树询进行了化学的致癌方面研究， 特别是黄曲霉毒素致肝癌的研究等n 。 在树嗣的遗传背景方面研究极少，尤其对具有丰富资源的中缅树嗣滇西亚种遗 传背景研究还是空白，基础研究滞后于应用研究，不利于实现实验动物标准化和科 学地解释相关的实验结果。本研究通过建立凡廿d 和微卫星d n a 两种遗传标记方法 分析中缅树嗣种群的遗传结构和遗传多样性，为今后树昀的繁殖、育种和开展生物 医学研究提供一定的理论基础和遗传检测方法。 黜廿d ( r a n d o m 锄p l i f i e dp o l y m o 叩1 1 i cd n a ，随机扩增多态性d n a ) 标记是 w i l l i 锄sj i 别和w e l s hj u 3 1 于1 9 9 0 年研究发明的一种新型遗传标记方法。r a p d 标记技 术是建立在p c r 技术的基础上，用一系列( 通常数百个) 不同的随机排列碱基序列的 寡核苷酸单链( 一般为1 0b p ) 作为引物，对所研究的基因组d n a 进行单引物扩增。 模板d n a 经9 0 9 4 变性解链后在较低温度( 3 6 4 0 ) 下退火，这时形成的单链模 板会有许多位点与引物互补配对，在7 2 下，通过链延伸，形成双链结构，完成d n a 合成。重复上述过程，即可产生片段大小不等的扩增产物，通过电泳分离和显色便 6 中国医学科学院北京协和医学院硕上研究生毕业论文 可得到许多不同的条带，从中筛选出特征性条带。扩增产物片段的多态性反映了基 因组d n a 的多态性。如果基因组在这些区域内发生d n a 片段插入、缺失或碱基突变 就可能导致这些特定结合位点的分布发生相应的变化，从而使p c r 产物增加、缺少 或发生相对分子质量的改变。因此，通过对p c r 产物的检测即可测出基因组d n a 在 这些区域的多态性。进行凡心d 分析时，可用引物的数量很大，虽然对每个引物而 言，其检测基因组d n a 多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测 区域几乎覆盖整个基因组。因此，凡廿d 可以对整个基因组d n a 进行多态性检测。 此外，黜廿d 遗传标记还具有随机引物易得，无需预先知道目的基因组d n a 序列， 标记数量多，易于操作，高灵敏度，材料用量少等优点n4 | 。该技术已被广泛应用于 物种的鉴定n5 1 、分类和遗传多样性研究，包括东方田鼠、长爪沙鼠n 刚等实验动物n 引。 微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) ，又称简单序列重复( s i m p l es e q u c er 印e a t s ， s s r ) 、短串联重复( s h o r tt a n d 锄r 印e a t s ，s t r ) 或简单序列长度多态性( s i m p l es c q u 锄c e 1 c i l 舢p o l y i l l o 印l l i s m ，s s l p ) ，是指以少数几个核苷酸( 一般为l 6 个) 为基本重复 单位组成的简单多次串联重复序列，其长度大多在1 0 0 b p 以内，由核心序列和两侧 保守的侧翼序列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核 心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性口引。它广泛存在于真核生物的基因 组中，平均每1 0 k b 就会出现一个微卫星d n a ( s t r ) 。 不同种生物微卫星基因座的核心序列可能不同，或者相同核心序列在个体间具 有不同的重复次数，因此造成多态性的产生，这种标记也被叫做简单长度多态性或 序列标记的微卫星位点( s e q u e i l c et a g g e dm i c r o s a t e l l i t es i t e s ，s t m s ) n 引。w e b e r 等啪1 根 据微卫星的结构，将其分为三类，即完全的( p 蝴) 、不完全的( i m p e m c t ) 和 复合的( c o m p o u n d ) 微卫星。完全的微卫星是指由不中断的重复单位构成的微卫 星；不完全的微卫星其重复序列中间有3 个以下的非重复碱基，两侧不中断的部分 重复数大于3 ：复合的微卫星则指两类或两类以上的串联重复单位由3 个连续的非重 复碱基分隔开，但不中断的重复单位的重复数不小于5 。微卫星的功能目前尚不甚 明了，但已发现微卫星能参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程，有 自身特异性结合蛋白，还能直接编码蛋白质，是一种非常活跃的碱基序列晗。 因微卫星d n a ( s t r ) 具有数量多、分布广、高度的多态性、共显性遗传、易 于p c r 稳定扩增等特点，在分子生物学与遗传学研究中作为一种主要的分子标记技 术，已被广泛应用于实验动物的遗传多态性分析和质量监测、构建遗传连锁图谱、 数量性状基因座( q t l ) 定位、性状连锁分析、群体遗传结构分析及起源进化等研究 领域。目前，尚未发现有研究人员对中缅树翰进行微卫星d n a 分离及其多样性分析， 本研究利用从马来西亚和泰国树嗣分离得到的9 个可稳定扩增的微卫星基因座对6 0 只树晌基因组d n a 进行p c r 扩增，扩增产物经电泳检测并计算其多态信息含量 ( 腑) 和杂合度等相关指标，分析中缅树鼢种群的遗传结构和遗传多样性。 7 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生毕业论文 本研究建立的凡心d 和微卫星d n a 两种遗传标记可应用于树嗣种群遗传结构的 分析和评价其遗传多态性，为树嗣的野生动物保护、引种驯化、遗传育种、繁殖、 遗传监测和实现实验动物标准化提供一定的理论依据和遗传检测方法。 研究所全国 经人工驯养 ，雌、雄各 半，分别对树嗣进行股动脉采血2 “，e d t a n a 2 抗凝，2 0 保存。 2 主要试剂及配制 ( 1 ) 微卫星引物引物及其序列( 由北京三博志远基因技术有限公司) ，见表1 。 ( 2 )p c r 反应试剂盒d r 0 0 1 a ( t a q 酶、d n t pm i x 觚e 、1 0 xb u 脓和6 xl o a d i n g b u 蹶) 购自日本t a k a r a 公司。 ( 3 )d l 5 0 0 0 0 刑d n am a k e r( 日本做a r a 公司) ( 4 ) d n a m a l 【e r ( 天根生物科技( 北京) 有限公司) ( 5 ) 红细胞裂解液 ( 6 ) s t e 缓冲液 ( 7 ) t e 缓冲液 ( 8 ) 蛋白酶k ( 德国m e r c k 公司) ( 9 ) i u a s e a ( 北京天根生物科技有限公司) ( 1 0 ) 溴乙锭( e b ) ( 1 1 ) 溴酚蓝 ( 1 2 ) 无水乙醇 ( 1 3 ) 饱和酚 ( 1 4 ) 氯仿 ( 1 5 ) 异戊醇 ( 1 6 ) n a a c 注：主要试剂的配制见附表二 ( 二) 仪器及设备 1 离心机 s i g m a - 2 0 2 m k ( 德国s i g m a ) l a b o 矗玛e4 0 0 r 9 中国医学科学院刚e 京协和医学院硕十研究生毕业论文 2 m y c y c l e rt h e 肌a 1c y c l e rp c r ( 美国b i o - r a d ) 3 水平电泳仪p o w e rp a c 3 0 0 ( 美国b i o - r a d ) 4 g e l d o cx r 凝胶自动成像分析仪( 美国b i o r a d ) 5 恒温水浴锅( 上海医疗器械厂) 6 紫外分光光度计n a n o d r o pn d l 0 0 0 ( 美国n a l l o d r o p ) ( 三) 实验方法 1 d n a 提取 ( 1 ) 红细胞裂解：将冻存的2 “树嗣全血于室温解冻后加入1 5 m l 离心管中，再 加入2 3 倍的红细胞裂解液( 1 5 0 “m o l ln h 4 c l ，1 0 衄0 1 lk h c 0 3 ，1 m o l l n a 2 e d t a ) ，3 7 水浴1o i 】：1 i i l ，3 0 0 呻姗离心5 m i n ，弃掉上清液，重复一次， 直至得到纯净的白色细胞。 ( 2 ) 基因组d n a 提取：按酚氯仿常规方法提取d n a ：向白细胞沉淀物加入3 i i l l s t eb u 缳缸5 0 m m o l ln a c l ，1 嘶m o l lt r i s c l ，1 i n m o l le d l a ) ，悬浮混匀， 加入1 0 s d s3 0 0 “l ，1 5 l2 0 m 咖1p r o t e i n a s ek 5 p lr n a s e a 混匀，3 7 水 浴过夜，以充分消化。用等体积1 ：1 酚氯仿、2 4 ：1 酚异戊醇各抽提一次。 每次3 0 0 0 印m 离心l o r n i n 。将上清液移到新的离心管中，加入1 1 0 的3 m o l l n a a c 和2 倍的无水乙醇，离心沉淀d n a 。再用7 0 乙醇沉淀两次。室温晾 干后，加入适量t e 缓冲溶液溶解d n a 。 ( 3 ) d n a 浓度和纯度测定：用紫外分光光度计在o d 2 6 0 o d 2 8 0 处测量d n a 的 浓度和纯度，当o d 值为1 8 2 o 时，样品进行基因组d n a 稀释至2 0 n p l ， 4 或2 0 保存备用。 2 r a p d 扩增 ( 1 ) 反应体系( 总体积：2 5 “1 ) 反应物 加入量( “1 ) 1 0 b u f j 衙( m 矿+ p l u s ) d n t pm i x t u r e ( 各2 5m m ) 引物( 2 0 岬o l l ) r t 细酶( 5u p 1 ) 模板d n a ( 约2 0 n 斗1 ) d dh ，o 2 5 2 0 2 5 0 2 5 5 1 5 1 0 中国医学科学院列e 京协和医学院硕士研究生毕业论文 ( 2 ) 反应条件 预变性 9 4 变性 9 4 复性 4 0 延伸 7 2 再延伸 7 2 保存 4 三兰) 知次循环 3 m 心d 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测 ( 1 ) 配制2 的琼脂糖凝胶：称取2 9 琼脂糖粉于三角烧瓶中，加入1 0 0 m l 的1 x t a e 缓冲液，微波炉加热4 m i n ，取出稍凉后加入适量溴乙锭( e b ) ，倒入制 胶槽中冷却凝固。 ( 2 ) 上样：取1 0p l 黜世d 扩增产物与适量的上样缓冲液( l o a d i n gb u 髓r ) 混合 后，于凝胶孔中点样；d n am a l ( e r 的上样量为1 0 l 。 ( 3 )电泳：将凝胶与9 0v 电压下电泳4 0 m i i l 。 ， ( 4 ) 凝胶成像：将电泳后的琼脂糖凝胶于g e l d o cx r 凝胶自动成像分析仪下拍 照，保存。 4 数据统计处理 ( 1 ) 结果记录：分别用“1 和“o ”记录某一扩增带的有无，只记录清晰且重复 性好的d n a 条带，统计得出所有位点的原始矩阵。 ( 2 ) 多态位点百分率：通过多态位点数所测位点总数x1 0 0 计算多态位点百 分率。 ( 3 ) 个体间遗传相似系数：根据l y n c h 方法乜2 l ，计算任意两个个体间遗传相似系 数( f ) ：f = 2 n x y ( n x + n y ) ( n x y 一两个个体共享的位点数；n x x 个体的位点 数；n y 叫个体的位点数) ；任意两个个体间的遗传距离p = 1 f ，得到群体内 所有个体两两之间比较的平均值。 ( 4 ) 聚类分析：用弛”d i s t a l l c ep a c k a g ev e r s i o n1 0 4 软件，构建树嗣4 8 只个体 的n e i 曲b o 卜- j o i i l i n g ( n j ) 系统树乜3 1 。 ( 5 ) 群体遗传多态度：参考w a c i l i m 等位们的公式，用p o p g e n e1 3 2 软件进行 s t 眦m o n 多样性指数的相关计算：( a ) 各群体遗传多态度( h o ) h 0 = - x i l n ( x i n ) ( x i 为位点i 在某一群体中出现的频率，n 为此群体检测到的 位点总数) ； ( b ) 平均群体内的遗传多态度( h p o p ) h 旷h 咖( n 为所研究的 群体数) ； ( c ) 所研究种类n 个群体的遗传多态度总量( h 。p ) h 。p = x ( x 为n 个群体的综合表型频率) 。 中国医学科学院北京协和医学院硕上研究生毕业论文 二、实验结果 ( 一) r a p d 扩增结果 经对4 0 条随机引物的筛选，优选出2 0 条扩增重复性好、条带清晰、特异性强 的凡廿d 引物( 见表1 ) 。应用筛选出的引物对4 8 只树鼢基因组d n a 进行了弛廿d 分析。2 0 条随机引物及其多态性结果见表l 和图1 。实验结果共产生1 1 3 个条带， 各引物检测到的r a p d 位点数在3 8 之间，平均每个引物产生5 6 5 个位点。其中， 检测到的多态位点6 9 个，多态位点比率为6 1 1 。 表lr a p d 扩增引物序列及扩增结果 t a b 1t h e s e q u e n c e so fp r i m e r sa n dr e s u i 协o fi 己a p d 1 2 究生毕业论文 ( 二) 遗传距离 4 8 只树鼢进行r a p d 扩增得到的遗传相似系数介于0 7 3 0 9 1 之间，平均为 0 8 3 0 7 ，个体间遗传距离在o 0 9 o 2 7 之间，平均遗传距离为0 1 6 9 3 。这表明个体 之间差异很大( 表2 ) 。 ( 三) 雌、雄群体遗传多样性 用s h a 皿o n 多样性指数量化树嗣雌、雄群体遗传多样性( 表3 ) ，树嗣雌、雄 群体平均遗传多态度( h ) o p ) 为o 1 6 6 7 ，雄性群体的遗传多态度( h o ) 为o 18 6 4 ， 略高于雌性群体的0 1 4 7 0 。由”。p 比值可见，引物s 3 7 和s 1 2 分别检测出群体 内最大和最小的遗传变异分别为0 6 2 8 6 和o 1 2 0 8 ，群体内的遗传变异均值为0 4 8 2 9 。 而雌、雄群体间的差异( 即1 h 0 p h 即值) ，平均为o 5 1 7 l 。因此，有4 8 2 9 的遗 传变异是在群体内检测到的，而其余部分( 5 1 7 l ) 遗传变异存在于雌雄群体间。 s 1 1 2s 1 5 l 图l 部分树嗣个体的r a p d 产物电泳图谱 n g 1e i e c t r o p h o r e t o g r a mo fr a p df r a g m e n t sp r o d u c e db ys 7 ，s 3 7 ，s 3 8 ，s 拍，s l1 2a n ds 1 5 lp r i m e r si ns o m e h e es h r e wi n 洲d u 丑l s 注：t 1 t 1 2 分别代表1 2 只树鹃基因组d m ，c 为空白对照，m l 为d m 分子量标记d l 5 ，俨( t a k 啪) ，m 2 为d n a 分子量标记