（动物学专业论文）南方鲇prlcdna克隆、组织分布和原核表达载体的构建.pdf

西南大学硕士学位论文摘要 南方鲇p r l 。c d n a 克隆、组织分布和原核表 达载体的构建 动物学专业硕士研究生余必先 指导教师张耀光教授 摘要 2 0 0 6 年3 月至2 0 0 8 年3 月，用壬m p c r 和r a c e 技术克隆了南方鲇催乳素( p i 的c d n a 全长序列，并通过r t p c r 方法研究了南方鲇p r l 的组织分布，同时成功构建了南方鲇 p e t - 2 8 p r l 重组质粒。 南方鲇p r l c d n a 全长1 2 3 5 b p ，包括9 0 b p 的5 非编码区( 5 u 1 r ) ，6 3 9 b p 的蛋白质编码 区即开放阅读框( o r f ) 和5 0 6 b p 的3 端非编码区( 3 u t r ) ，真核生物保守的a a t a a a 加尾信号 位于p o l y ( a ) 上游2 2 b p ，多聚腺苷酸( p o l y a ) 尾巴由1 7 腺苷酸( a ) 组成。开放阅读框编码由2 1 2 个氨基酸残基组成的p i u 前体，经i f o 姗a x2 0 0 3 软件包的v e c t i 阿n t is u i t e9 程序预测其分子 量约为2 3 k d a ，等电点( p i ) 为8 1 9 。s i g n a l p 预测该p r l 前体包括由2 6 个氨基酸残基组成的信 号肽和1 8 6 个氨基酸残基组成的成熟肽，成熟肽含有4 个半胱氨酸残基组成两个二硫键，当 p i 也前体合成后，通过跨膜转运出膜，信号肽被酶切后释放出p r l 的成熟分子。 南方鲇p r l 推导的氨基酸序列相似性分析发现：南方鲇p r l 与印度囊鳃鲇和斑点叉尾鲴 的p r l 的相似性分别为8 9 2 和9 1 5 ，与其他硬骨鱼类p r l 的相似性为5 1 o _ 7 7 6 ，与 两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类p r l 的相似性为2 7 9 一3 1 6 ，与人类p r l 的相似性为2 9 1 。系统进化分析表明，本研究克隆的南方鲇p i 也和鲇形目鱼类已经克隆的印度囊鳃鲇和斑 点叉尾鲴的p i 也基因聚在一起，构成一个单系群，这与预期结果一致。 胙p c r 研究南方鲇p r l 在各部脑、消化道各段、肝脏、胰腺、脾脏、肾、性腺、心脏， 以及皮肤、肌肉、垂体等2 0 种组织表达的结果表明，p r l 在垂体表达量最高，其次为精巢、 卵巢、端脑、间脑、中脑、小脑、延脑和嗅囊，肝脏、胰脏、肾、肌肉、心脏p i 也低量表达， 胃责门部、胃体、胃幽门部和肠的前、中、后各段均无p i 江的表达。与已有工作不同的是， 研究南方鲇p r l 基因的组织分布时扩大了取材范围，并对各器官作了更细致的区分，在此基 础上首次发现p i 也基因在嗅囊表达。p r l 基因在嗅囊中表达暗示p i 也可能具有至今尚未被发 现的新的功能，这为目前p r l 功能研究这一热点问题提供了新的线索。 本研究在得到南方鲇p r l c d n a 序列的基础上，通过设计带有酶切位点的引物，p c r 扩 增得到的产物经t a 克隆测序证明为编码南方鲇p r l 成熟肽的目的序列。将1 a 克隆构建的重 组质粒与表达载体p e t 2 8 同时双酶切，酶切产物用t 4d n a 连接酶连接后转化大肠杆菌d h 5 旺 感受态细胞，成功构建了体外表达催乳素蛋白的重组质粒p e t 2 8 p i 也，并将该重组质粒转化 原核表达工程菌b k ，感受态细胞。该原核表达载体的构建为进一步研究南方鲇p r l 的生理功 能及其在水产养殖业的应用奠定了坚实的基础。 关键词：南方鲇催乳素( p r l ) c d n a 克隆组织分布原核表达载体 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t c i o n i n g o fp r l - c d n a ，t i s s u ed i s t r i b u t i o ni ns o u t h e r n c a t f i s ha n dc o n s t r u c t i o no fp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n1 厂e c t o r m 旬o r ：z 0 0 1 0 9 y a t h o r ：y _ ub i x i a n s u p e r v i s o r ：z h a n gy a o g u a n g a bs t r a c t f 如mm a r c h ，2 0 0 6t om a r c h ，2 0 0 8 ，廿1 e 如1 1 l e n g 廿lo fs o u l e n lc a t f i s hp r l c d n aw 笛 c l o n e dw i m 吐1 em e m o d so fr t - p c ra i l dr a c e a l l dm ep i 己lt i s s u ed i s t r i b u t i o nw 髂d e t e c t e di nt h e s o u n l e mc a t f i s he x 乜a p i t u i t a 叮t i s s u ew i 也也em e 吐l o do fr t _ p c 飞舔w e l l 觞p r o k a r y o 缸ce x p r e s s i o n v c c t o ro f p r lw a ss u c c e s s 向1 l yt ob ec o r 坞缸u c t e d t h e 触l l e n g 也o f 吐l es o u t h e mc a t f i s hp r l c d n ai s1 2 3 5 b p ，i i k l u d i n g5 - u 1 心a n s l a t e d r e 舀o n ( 9 0 b p ) ，叩e nr e a d i l l g 五阻m e ( 6 3 9 b p ) a i l d3 一帅心a n s l a t e dr e g i o n ( 5 0 6 b p ) t h e r ei s a c o n s e r v a 伽ea a l a a ap o l y a d e n y l a t i o ns i 驴a 1w a sl o c a t e d2 2b a s1 】p s t e a mo fn l ep o l y ( a ) 僦 f 0 册e dw i m1 7 b p 1 1 1 eo p e nr e a d 洫g 触n ec o d e s2 1 2a i l l i n oa c i d s ( 刎i 坞m o l e c u l a rw e i g h ti sa b o u t 2 3k d a ，孤di t si s o e l e c t r i cp o 硫( p i ) i s8 1 9 、7 v r h i c hw e r ep r e d i c t i o n e db ym ev e c t o rn t ls u i t e9 p r o g r a m m eo fi i l f o r m a ) 【2 0 0 3 t h ep r e c u r s eo fp r li n c l u d e sap 毗a t i v es i 弘a lp e p t i d ea i l dam 砷 p e p t i d eo f18 6 砚r e s i d u e sw 雏p r e d i c t e db ys i g n a l pm w l l i c h 吐l e r ea r ef 0 u rc y sr e s i d u e st 0f o 】t 、o d i s u l f i d eb o n d s a f t e rt l l ep r e c u r s ew 勰s y n t h e s i z e d ，m es i 驴a lp e p t i d ew 舔c l e a v e d 锄dt l l em a n l r e p 印t i d ew a sr e l e a s e d t h ep u t a t i v c 锄血l oa c i d ss i m i l a r i t ) ，a n a l y s i so fs o u t h e mc a t f i s hp i 也i n d i c a t e d ：t h es i i l l i l 撕锣 b e 抑e e n 廿l es o u n l e n lc a t f l s hp r l 锄ds t 面g i n gc a t f i s h sw a s8 9 2 ，锄dm es i l 锄撕t ) ，b e m e e l l 龇 s o u m e mc a t i f i s hp r l 锄dc h 她n e lc a t f i s h sw a s91 5 t h es i m i l a r i t yb e t w e e nm es o u t l l e mc a 伍s h p r la i l dm eo t l l e rt e l e o s t s i s51 o 一7 7 6 ，a 1 1 dm e nc o i n p a r e dw 池跏p l l i b i a l l s ，r 印t i l e s ，a y e s ， a n dm 锄m a l i a si s2 7 9 一31 6 a n dm es i r i l i l 撕t ) ，b e t w e e n l es o u t l l e mc a t f i s hp r l 龃dh u m 卸 p r li s2 9 1 p l l y l o g e i l e t i ca n a l y s i ss u g g e s t e dm a tt l l es o u t l l 锄c a _ t f i s hp r l ，s t i l l g i n gc a t f i s ha l l d c h a i l n e lc a t f i s hw e r ec l u s t e r e di no r 峙g r o u p ，a r df 0 彻e dam o n o p h y l e t i cg r o u p t h er e su _ hi s i d e 碰c a lw i mt l l ee x p e c t a b l er e s u l t t h er t _ p c r ，也ep r lg e n ee x p r e s s i o nr e s u l ti na b o u t2 0t i s s u e si n c l u d e de v e 哆p 砒o f 也e b m i l l ，e v e 巧s t i o no ft 1 1 ed i g e s t i v e 缸粥t ，l i v e r ，p a j l c r e a t i cg l a i l d ，s p l e ，l 【i d r 】e y ，g o n a d ，h e a n ，s k i n ， 邛盼s c l ea r l dp i t i l i t a r yi n d i c a t e d ：i r lg e n ew a se x p r e s s e d1 l i g h e s ti np i t u i t a 巧，m e nt e s t i s ，o v a r y ， t e l e n c e p h a l o n ，d i e n c 印h a l o i l s ，m e s e r l c e p h a l o n ，c e r e b e l l u m ，n l e d u l l ao b l o i 峪a t a 姐do l f a c t o 巧s a c ，柚d e x p r e s s e dl o wl e v e li i ll i v e r p 锄c r c a t i cg l a n d ，s p l e e n ，k i d i l e y ，h e a dk i d i l e y ，h e a na n di n u s c l e ，b u tw 觞 n o te x p r e s s e di i lc a r d i a c ，h e l i c o b a c t e r g 弱t r i c ，f 1 0 r e g u t ，加j d g u t ，l l i n d g u t t h ed i 丘e r e n c eb e t w e e nt l l i s s t u d ya i l de x i s tr e s e a r c h e si s 吐l a tm o r et i s s u e sw a u su s e dt os t u d yt i s s u ee x p r e s s i o no fp r l ，a n de a c h o 培a nw a sd i v i d e di n t od i 丘b 嘲l tp a n sm o r ee x a c n ym a ne v e rb e f o r e o n 廿l i sb 勰i s ，t l l es o u m e m i t 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t c a t f i s hp r lg e n ee x p r e s s i o nw a sd e t e c t e di no l f a c t o r ys a ca tt h e 翻s tt i m ew h i c hs u g g e s t e dm a tp r l w i l lh a v es o m en e wf h n c t i o n st 0b ef o u n d i tc a np r o v i d en e wc l u ef o r l eh o ti s s u eo fp r l 觚c t i o n i i e s e a r c h o n 廿l eb 髂eo fp r l c d n a 如l l1 e n g mo fs e q u e n c e ，m es e q u e n c i n gr e s u l tp m v e db y i ac l o n i l l g a n ds e q u e n c i i l gm d i c 锄葩t h a tm e 觚l p l i 矗e ds e q u e n c ei sm et a r g e ts e c l u e n c ew h i c hc o d e d 也em a t u r e p 印t i d eo f 吐l es o u 也e mc a t f i s hp r lt h r o u 曲d e s i g n 协gp r i r n e fw i t l le n 矽m t i cd i g e s t i v es i t e 锄dp c r a n p l i f i e dt h et a r g e ts e q u e n c eo f 仕l em a n 聪p e p t i d eo fs o u t h e mc a t f i s hp r l d o u b l ee n z y m a t i c d i g e s t e dm er e c o m b i r m ttp l 投m da i l de x p 咒s s i o nv e c t o rp e l 2 8 ，a n dp 嘣f i e dt 1 1 et a r g e ts e q u e n c e a 1 1 dp e t 2 8w i m g e le x 缸c t i o n ，a n dl i n k e dt h et 鹕e tf m g m e n ta i l dp e t 2 8w i n lt 4l i g a s et of 0 衄 r e c o r n b i n a l l tp l a s m i dp e ，r - 2 8 一p r l ，l e nt l 啪s f 0 珊e dp l a s m i dp e ，r 2 8 一p r li n t oc 伽叩e t e n tb a c t e d a d h 5 a ，a i lo ft l l e s ep r o c e s s e sc o n s 缸u c t e dt l l er e c o m b i n 龃tp l a s m i dp e t 2 8 - p r ls u c c e s s m l l yw h i c h e x p r e s s e dp i 也i nv i n d ，m e n l er e c o m b i n a n tp l a s r i l i dp e t - 2 8 一p r lw a st r a n s f b m e di n t oc 伽叩e t e n t b k l t h es u c c e s s 缸lc o n s m l c t i o no fp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp r o v i d e dab a s i cw o r kf o r 如r 吐l e r s t u d yp h y s i o l o g i c 缸n c t i o na n da p p l i c a t i o no n 也ea q u a c u l t u r eo f n l es o u n l e mc a t f i s hp r l k e yw b r d s ：j 5 w 距，搿s 班e r 诫d 栉口f 括c h e n ；p r o l a c t i n c d n a ；t i s s u ed i s t r i b u t i o n ； p r o k a i y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r u i 缩略词 一_ _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ l _ _ _ _ - - - _ l - _ _ - _ - _ _ - _ - _ - _ _ _ 一 缩略词英文全称中文名 称 a m p 锄p i c i l l i n 氨苄青霉素 b p c 口 d e p c d e d t a f s h h gc s f g h i l i p t g k a n k d a l h m l n o r f p c r p l p r l p r i r 印m s t a b t 矗s x g a l 3 u t r b a s e p a i r c a l fi n t e s t i n a lp h 0 s p h a t a l s e d i e t h y lp y u l 0 c a r b o n a t e d 2 l y e t h y l e n e d i a m i i l et e t r aa c e t a t e f 0 1 1 i c l e s t i m 【u l a t i n gh o m o n e h o u r 蓼a n u l o c y t ec 0 1 0 n y - s t i m u l a t i n gf a c t o r 笋o w m h o r r n o n e i n t e r l e l lk j n i s o p r o p y l 恤。一p d g a l a c t o s i d e k a n a m y c i n k i l od a l t o n l u t e i n i z i n gh o r m o n e m i n u t e o p e nr e a d i n g 丘锄e p o l y m e r a s ec h a i l lr e a c t i o n p l a c e n t a ll a c t o g e i l p r o l a c t i n p r o l a c t i nr e c 印t e r r o t a t i o np e rm i m l t e s e c o i l d t o b a c c oa c i dp y r o p h o s p h a e t r i s s h y d r o x y m e t h y l 锄i n o m e m 趾e 5 - b r o m o 4 一c h l o r 0 3 一i n d o l y l - p - d g a l a c t o s i d e 3 一砒l t r a n s l a t e dr e 百o n 碱基对 牛小肠磷酸酶 焦磷酸二乙酯 天 乙二胺四乙酸 滤泡刺激素 小时 粒细胞集落因子 生长激素 自细胞介素 异丙基b d 半乳糖 卡那霉素 千道尔顿 黄体刺激素 分钟 开放阅读框 聚合酶链式反应 胎盘催乳素素 催乳素 催乳素受体 每分钟转数 秒 烟草酸焦磷酸酶 三羧甲基氨基甲烷 5 溴4 一氯。3 吲哚d - d 半乳糖苷 3 非编码区 5 u t r5 u i 灯a n s l a t e dr e 百o n5 非编码区 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 ， 学位论文作者：么拿、划签字日期：肿年易月他日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密 期限至 学位论文作者 签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期： 电话： 邮编： 西南大学硕士学位论文文献综述 1 文献综述 促乳素( p r 0 1 a c t i n ，p i 之l ) 又名催乳素、生乳素，是腺垂体催乳素细胞( l a c t o t r o p ) 分泌的一种多肽激素，属于g h p 刚卯u s l 蛋白家族。s t r i c k e r 和g r u e t e r ( 1 9 2 8 ) 在 兔子体中发现一种能刺激乳汁分泌的垂体因子【，础d d l e 等( 1 9 3 3 ) 研究确认这种垂 体因子是一种激素，能够刺激鸽子的嗉囊生长，因此他们把这种激素命名为催乳 素( p r o l a c t 哟【2 1 。随后，更多的研究发现这种激素在脊椎动物不同物种中普遍存在 且功能有差别。由于催乳素来源和功能都具有多样性，b e m 和n i c 0 1 1 建议将催乳 素命名为“万能激素”【3 】。1 9 7 2 年n i c 0 1 1 和b e m 首先总结了许多催乳素的功能【4 5 】， 他们将这些功能分为5 大类8 5 种不同的作用，这五大类分别是：生殖调控、渗透 压调节、生长调节、被覆物生长和催乳素与固醇类的协同作用。随着研究的深入， 催乳素的作用已经超过3 0 0 种【6 】，这个数字超过了所有的其他垂体激素功能的总 和。p r l 新功能的发现促使重新对它的功能进行分类，b o l e f e y s o t 等( 1 9 9 8 ) 将其分 为6 大类：水和电解质平衡调节、生长和发育的调节、内分泌和代谢调控、大脑 和行为的调控、生殖调控、免疫与保护的触发【6 】。国内对动物催乳素的研究起步较 晚，主要集中在催乳素及其受体的多态性与动物繁殖、泌乳的关系。在人类医学 方面，催乳素的研究主要集中在以下几个方面：催乳素与乳腺增生、乳腺癌的关 系及其在治疗方面的应用；高催乳素血症的机制及其治疗；催乳素与妇女生殖及 子宫异位症等妇科疾病的关系与治疗方案的制定；催乳素与初乳分泌时间和泌乳 量的关系；催乳素与免疫系统疾病的关系及其治疗；催乳素与癌症的关系及催乳 素对脑发育和智力的影响。鱼类p r l 功能研究的重点在渗透压调节方面。现就催 乳素基因的分子结构，各种生物学功能和蛋白质结构的研究状况进行阐述。 1 1p r l 的结构 p i 也是一种螺旋束蛋白激素【7 ，8 1 ，编码g h p 砌卯l s l 蛋白家族的基因从同一 个祖先基因通过基因倍增进化而来【9 】o 其中催乳素的化学结构与生长激素十分相 似，两者的同源性在4 0 左右，但化学结构和分子量在各种动物有所不同。 人类基因组中编码催乳素的基因是位于6 号染色体上的一个单基因，大小为 1 0 k b ，包含5 个外显子和4 个内含子1 0 。13 1 。p i 也基因转录的调控是由两个独立的 启动子区控制，大约有5 k b 区域指导p r l 在垂体特异性表达，另外一个上游启动 子区负责p r l 垂体外表达【1 4 ”】。人类催乳素c d n a 由9 1 4 个核苷酸组成，开放阅 读框为6 8 1 个核苷酸编码2 2 7 个氨基酸，分为2 8 个氨基酸的信号肽和1 9 9 个氨基 酸成熟肽，分子量约为2 3 k d a 【1 6 】。 大鼠p i 也与人、猪、牛等p r l 氨基酸顺序的一系列化学和生物学特征极为相 似。大鼠催乳素( r p r l ) 基因主要在腺垂体的催乳细胞和乳腺生长激素细胞中表达， 两南人学硕士学位论文文献综述 其基因位于1 7 号染色体短臂上( 1 7 p 1 2 ) ，大小为1 0k b 左右，同样包含5 介外显子 和4 个内含子，现已初步鉴定出一些顺式作用元件和转录因子，其顺式作用元件 位于5 旁侧区域内，形成两个彼此独立的结构域，即4 2 2 + 3 3 之间的近端启动子 序列，1 8 3 1 1 5 3 0 之间的远端增强子元件。 哺乳动物p r l 分子的一级结构包含有6 个c y s ，这些c y s 之间形成3 个二硫 键，末端形成特有的二硫环【”1 。氨基酸序列相似性在哺乳类中从灵长类之间的高 相似性9 7 变化至啮齿类之间的低相似性5 6 。大鼠和小鼠等啮齿动物的垂体 p i 也由1 9 7 个氨基酸组成，绵羊、猪、牛和人类却由1 9 9 个氨基酸组成分子量为 2 3 k d a 的一条多肽链。 关于p i 也的二级结构的研究表明5 0 的氨基酸链由c 【螺旋组成4 个反向平行 的螺旋结构，而其他部分则由环组成【1 8 1 。三级结构虽然较早就可以预测，但是关 于p r l 的三维结构，都是通过相似性模型预测方法来进行模拟【l9 1 ，基于p r l 和其 他螺旋束蛋白激素的结构相似性。根据现有的三维结构模型，p r l 包含4 个0 【一螺 旋，呈两两反向平行。 哺乳动物p r l 虽然有3 0 0 多种功能，但并不是以一种形式存在。垂体中主要 以2 3 如a 的多肽链存在。哺乳动物包括人类，已经描述了一些催乳素的变体形式。 它们主要以3 种方式形成变体：选择性剪切( a l t e r l a t i v es p l i c i n g ) 、蛋白酶切 ( p r o t e 0 1 y t i cc l e a v a g e ) 和转录后修饰( p o s t t r a l l s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n s ) 【2 0 】。选择性剪切 产生1 3 7 个氨基酸的p r l 变体分布在垂体前区，已经有详细的描述【2 1 1 。蛋白酶解 会产生1 4 k d a 、1 6 k d a 、2 2 k d a 的p r l 变体，1 4 k d a 、1 6 k d a 短肽常常联合发挥作 用。虽然p r l 变体在垂体和血清中发现较多，研究的也较多，但要详细了解这些 片段的功能还需要更多的研究。除了上述两种方式产生p r l 短肽变体，p i 也翻译 后的修饰也会产生p i u 变体，如二聚化、多聚化、磷酸化、糖基化、硫化以及脱 酰胺作用【2 2 】。 1 2p r l 的合成部位 p r l 虽然最初是在垂体里发现的，而且发现垂体确实合成p r l ，但更多的研 究发现，不只有垂体才能合成p r l ，垂体外还有许多器官组织也可以合成p r l ， 比如脑、胎盘、羊膜、子宫内膜、子宫、乳腺以及免疫系统等，现分述如下。 1 - 2 1 垂体前叶 垂体前叶存在一种细胞，能够合成和分泌p r l 。1 9 6 4 年h e r l a n tm 最先用常 规染色和光学显微镜观察描述了p r l 分泌细胞。这些细胞被命名为泌乳细胞或促 乳细胞，它们依据动物的性别和生理状态不同分别组成垂体前叶2 0 一5 0 的细胞 群。随着科技的进步，通过免疫细胞化学技术在大鼠、小鼠和人类的垂体前叶确 2 西南大学硕十学位论文 文献综述 认泌乳细胞存在。从系统发生上看，泌乳细胞是由依赖p i t 1 因子的垂体细胞系衍 生而来，同时衍生来的还有促生长细胞和促甲状腺细胞。关于泌乳细胞形态和分 布在大鼠已经描述的非常清楚【2 3 】，它们的形状既不是多面形也不是多角形的不规 则细胞，有时又呈圆形或卵圆形。 1 2 2 脑 f u 】( e 等( 1 9 7 7 ) 首先观察到脑中产生p r l ，他们发现在下丘脑的轴突末端细胞 有p r l 免疫反应发生【2 4 1 。后来很多学者做了大量工作，发现在整个脑部以及脊髓 都有p r l 产生。同样经过免疫反应发现在很多哺乳动物下丘脑的大部分区域的细 胞中发现了p r l ，然后又经过多种方法证明是由下丘脑自身合成。将雄性大鼠垂 体切除，对p r l 在大鼠下丘脑细胞中的免疫反应结果没有影响，将雌性大鼠垂体 切除这种免疫反应减弱但不消失，这充分证明下丘脑自身合成了p r l 【2 5 1 。 1 2 3胎盘、羊膜、子宫内膜和子宫 胎盘除了行使母婴物质代谢转运功能，还有一系列内分泌功能，在内分泌产 物中，胎盘乳素( p l a c e n t a ll a c t o g e 璐，p l ) 在大鼠、小鼠、仓鼠、奶牛、猪和人类的 胎盘上都有发现。大鼠的胎盘产生一系列难以分清的催乳素类似蛋白0 r 0 1 a c t i n l i k e p r o t e i n s ，p l p ) 。这些胎盘乳素和催乳素类似蛋白已经明确区分为：p l i ，p l i i ， p l i m ( m o s a i c ) ，p l i v ( v a r i a i l t ) 【2 6 2 7 1 ，或p l p a 、p l p - b 、p l p c 、p l p d 、p l p e 、 p l p f 和p l p g 【2 8 2 9 1 。至于羊膜产生胎盘乳素类似激素和垂体催乳素在人类没有 差别，而大鼠则不同。p l p 的一个新成员p l p j 被发现在怀孕早期由子宫内膜产 生。另外未孕子宫能产生催乳素也已经证明。 1 2 4 乳腺 乳腺表皮细胞中也能检测到催乳素的存在。一方面通过从血液里吸取p r l 、 另一方面动物泌乳期间乳腺表皮细胞能自身合成p i 也。乳腺催乳素m r n a 在大鼠 乳腺表皮细胞中的合成也通过免疫反应得以证实【3 0 】。乳汁中的p i u 一部分通过血 液循环吸收来自垂体分泌的p r l ，这一点为放射性标记研究所证明：通过放射性 标记垂体的p r l ，结果在乳汁中检测到；另一部分则来自于乳腺上皮细胞分泌的 p r l 。 1 2 5免疫系统 大量证据表明淋巴细胞也是催乳素的分泌场所。事实上，与外周淋巴细胞一 样，胸腺和肾脏里的免疫活性细胞也转录出p r l 的倒卧队和释放具有生物活性的 类似垂体p i 也的p r l 【3 1 ，3 2 1 。不仅在鼠科动物发现有人类免疫活性的2 2 k d ap r l ， 3 西南大学硕十学位论文 文献综述 而且不同大小的p i u 变体也已经描述。虽然垂体p r l 分泌调控与淋巴细胞p r l 的分泌调控不同，也有足够的证据表明淋巴细胞含有多巴胺( d a ) 受体，这些受体 有些能调节淋巴细胞p r l 的产生和释放。 除了上述这些器官产生p i 也外，很多学者还建立了p r l 分泌细胞系，也能分 泌p r l ，为研究p r l 分泌提供了一种快捷便利的方式。 1 3p i u 的分泌特点 催乳素的分泌表现出二态现象，即雌雄性别表现出不同的分泌模式【2 0 】，一般 来讲，雌性多以连续模式分泌催乳素，而雄性多以间歇模式分泌，如大鼠就是以 连续模式分泌催乳素【3 3 1 。 首先p r l 分泌呈现出昼夜节律现象，在人类血浆中p r l 的浓度在睡眠状态时 最高而在清醒状态时最低【3 4 1 。近来，通过以自愿者为样品做实验，结果表明p r l 的这种分泌节律在稳定的环境下维持相对稳定，然而女性变化范围比男性的要大 p 5 1 。p r l 分泌昼夜节律在大鼠中同样存在。这一现象是在下丘脑的视交叉上核产 生的。 其次p r l 分泌在动物的不同生殖状态也不同。哺乳期母体受幼体吮吸动作的 刺激p i 也分泌增加，如幼鼠吮吸1 3 1 1 1 i n ，母鼠血液中的p r l 开始增高，吮吸1 0 m i n 达到峰值，哺乳结束后回落到原来水平【3 6 】。动情前期p r l 的分泌处于一个低水平 时期，到了排卵前期p r l 的分泌出现一个快速分泌期，这和促黄体生成激素( l h ) 分泌模式相似，然后出现一个平的延长期和一个延长的终止期【3 7 1 。虽然很多研究 报道了在排卵前期p r l 有一个快速分泌期，而另外一些研究又报道了p r l 在动情 期出现第二个快速分泌期或者在动情前期、动情期或者动情后期p r l 含量出现连 续升高【3 8 】。而交配期，p r l 分泌没有快速分泌期，怀孕期则在交配后的1 0 d 出现 一个p r l 快速分泌期。至于假孕，则在假孕后第1 3 d 出现一个快速分泌期，以后 恢复到原来的水平。 1 4 p r l 的功能 1 4 1 与泌乳相关的功能 长期以来，p r l 一直被认为与乳腺的发育有关，但是随着分子生物学技术的 兴起，对p r l 分泌的神经调节实行靶间断裂，p r l 分泌细胞接收不到分泌的指令 或信号，或者实行p r l 或p r l 受体( p 赳且) 基因敲除，结果发现被p r l 靶间断裂 或p r l 基因敲出的大鼠乳腺正常发育【3 9 1 ，只是乳腺在形态上有一些差别。哺乳期， 泌乳的起初阶段必须要垂体p r l 的参与，如果在这个阶段切除垂体，则乳腺将不 能分泌乳汁。泌乳过程中p r l 刺激一些氨基酸的摄取和乳酪蛋白的合成，葡萄糖 4 西南人学硕士学位论文文献综述 的摄取和乳糖及乳脂的合成【4 0 】。 ， 1 4 2 与黄体相关的功能 p i u 影响黄体的功能因物种和物种的动情周期不同而异。啮齿类p r l 可以在 动物交配后促进黄体生成，也可在没有交配的情况下促进黄体的分解。绝大多数 啮齿类在交配6 d 后，p 弛担当了促黄体生成激素。另外一些啮齿类如仓鼠，p i u 则是和l h 、滤泡刺激素( f 0 1 l i c l e s t i m u l a t i o n gh o 眦o n e ，f s h ) 组成促黄体生成素复 合体，联合促进黄体生成，从而有利于胎儿在子宫着床【4 1 1 。灵长类和狗的p r l 也 和l h 、f s h 一起组成促黄体生成素复合体共同促进黄体生成。在人类，高水平 p r l 禁止滤泡层细胞黄体化类固醇生成。p r 基因敲除也导致黄体功能缺乏、排 卵率低、异常卵子发生以及受精卵着床失败，这些都证明黄体依赖于p r l 【6 1 。 1 4 3 与繁殖行为相关的功能 p r l 影响繁殖行为。人类高水平p r l 和人类的身体和心理活动相关，甚至假 孕。下丘脑腹内侧核上的p 且接受p r l ，从而影响女性或者雌性动物的性行为。 另外p r l 影响动物的繁殖行为表现在抚幼行为方面。在哺乳动物，母性行为研究 已非常广泛。虽然p i 也不直接引起母性行为，但它可以明显缩短母性行为的出现 时间。有学者观察了未怀孕过的小鼠，饲喂孕酮和雌激素1 0 d 表现出母性行为， 而饲喂孕酮、雌激素和p r l ，1 2 d 即表现出母性行为【4 2 】。 1 4 4作用于精巢 p r l 因其在雌性哺乳动物和哺乳期的作用而备受关注，近年来的研究表明p r l 可以调控动物的精巢。在精巢间质细胞中，催乳素可以维持细胞形态同时提高间 质细胞中l h 的受体数量【4 3 】，而l h 可刺激间质细胞分泌睾酮，睾酮进入生精小管， 进而促进精子的发生。同时p r l 和l h 一起减低芳香化酶的活性，促进类固醇生 成和雄激素产生。在精巢支持细胞中，p i 也可以增加f s h 受体表达。此外，p r l 可以促使精母细胞成熟，加强精子能量代谢，从而提高精子数量和活力。 1 4 5 与免疫相关的功能 p r l 在神经内分泌免疫调节网中扮演着中介角色，免疫系统、神经内分泌相 互交织在一起，共同维护机体的稳态，而p r l 在这个网中起着协调作用。最早证 明p r l 扮演这个角色是c h e n 等( 1 9 7 2 ) 在给p r l 缺陷的突变型侏儒小鼠注射外源 p r l ，结果增强了胸腺的活动【删。随后n a g y 和b e r c z i 发现摘除垂体或者用溴隐亭 ( 一种抑乳药) 来抑制p r l 的分泌导致体液和细胞介导的免疫减弱，注射外源p r l 后免疫活动恢复【4 5 】。另外p i 也还促进淋巴细胞的有丝分裂。白细胞介素。2 ( 几2 ) - 西南人学硕士学位论文文献综述 介导的淋巴细胞激活也需要p r l 参与。 1 4 6 渗透压的调节 p r l 对渗透压的调节功能在哺乳动物了解最少，主要集中在对低等脊椎动物 如鱼类方面的研究，因此也被称为渗透压调节激素。哺乳动物p r l 调节渗透压的 一些功能在p i 也生理功能展望中较早预见。例如p r l 介导的乳腺上皮细胞中水和 无机盐的跨膜运输，在用溴隐亭处理过的兔子乳腺上皮细胞中观察到p r l 降低， 钠离子跨膜运输降低和钾离子跨膜运输增高，类似现象在大鼠中也观察到，在大 鼠乳腺细胞中观察到p r l 促进氨基酸摄取，与p r l 提高小鼠乳腺外移植后摄取非 代谢的a 氨基异丁酸增加的结果一样。p r l 也影响水的跨羊膜转运，几内亚猪和 绵羊p r l 促进水的跨羊膜转运，但是在人类，p i 也却阻止水跨羊膜转运。p r l 与 小肠上皮的水，钠离子，钾离子和钙离子跨膜运输的关系，目前用系统的方法还 没有检测到，但是在孕妇怀孕晚期检测到p i 也增加了小肠电解质的跨膜运输，这 也许是为分娩后泌乳做准备。 1 4 7血管的发生 完整的p i 也和g h 都有血管生成活性，但是天然p r l 的酶切片段如1 6 k d a 的片段却有抑制血管生成作用。毛细血管内皮细胞上有p r l 酶切片段特异性的、 高亲和力的和饱和的结合位点。1 4 k d a 的p i u 酶切片段和1 6 k d a 的片段一样有抗 血管生成活性。对于p r l 酶切片段的抗血管生成活性则可作为肿瘤发生的抑制因 子或者是一个病理效应子。最近有学者发现，天然的p r l 、p l 和g h 都有血管生 成活性。 1 5p r l 的受体( p r l r ) p i 辽，r 是一类单链的跨膜结合蛋白，属于i 型细胞因子受体超家族的一员，这 个超家族包括生长因子，白细胞介素2 ( i l 2 ) 和白细胞介素7 ( i l 7 ) ，促红素及粒细 胞集落刺激因子( g r a n u l o c y t ec o l o n y s t i m u la _ 血gf a c t o r ，g c s f ) 等受体成员【4 6 】，正 如它们各自配体不同一样，p 融且和生长激素受体( g h r ) 虽然序列相似性只有3 0 ，但却有共同的结构和功能特征。每个受体含有一个胞外结构域、跨膜结构域 和胞内结构域【4 7 1 。另外在很多组织中发现了许多p i m 己异构体，这些异构体是在 开始转录时，由不同p 砒r 启动子选择不同起始位点而产生的。虽然它们的长度 和组成上有变化，但是胞内和胞外结构域完全一致，这保证其都能与p r l 相结合。 除此之外，在乳腺上皮细胞中还发现可溶性p i 也结合蛋白，其同样也是p 砌文选 择性剪切的产物，这些可溶蛋白含有p i 也r 胞外结构域的2 0 6 个氨基酸。 6 两南大学硕士学位论文文献综述 1 5 1p r l r 的结构 老鼠和人类p i u r 异构体由2 1 0 个氨基酸组成的胞外结构域，和其他的细胞 因子的序列相似性一致。胞外结构域分为氮端的d 1 区和近膜端的d 2 区，d 1 区和 d 2 区都表现出和i 型纤维连接蛋白的相似性，驱使受体和配体连接如图1 1 。胞 c y s 2 2 和c y s 51 - c y s 6 2 ) 和 图l l 哺乳类两种形式的p r l r ( 引自m a r ce f r e e m a n ) f i g 1 l 1 1 1 et 、v of o n n so fm a m a l i a np f u l r ( a d o p t e d 舶mm a r ce f r e e m a n ) d 2 区的一个( t p r s e r - x t p 卜s e r ) w s 结构( w s ，m o t i f ) 。二硫键和w s 结构对p i u r 的正确折叠和运输都非