（环境科学专业论文）荧蒽对微小小环藻的毒性及其生物降解初探.pdf

摘要 综合本研究结果可以得出：荧葸对微小小环藻毒性作用明显，其9 6 h - e c 5 0 值 为0 2 p p m ；微小小环藻对荧葸具有很强的降解能力。因此，用藻类进行荧蒽的毒 性、降解机理实验及污染原位修复都具有进一步研究的价值。 关键词：荧蒽，微小小环藻，毒性，生物降解 路宁宁荧蒽对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 i i a b s t r a c t t o x i c i t yo f f l u o r a n t h e n ea n di t sb i o d e g r a d a t i o n b ya l g ac y c l o t e l l ac a s p i a m a j o r ：e n v i r o n m e n t a l s c i e n c e n a m e ：l n n i n g n i n g s u p e r v i s o r ：a s s o p r o f l i u y u a b s t r a e t f l u o r a n t h e n e ( f l u o ) i s o n eo faf o u r r i n gp o l y c y c l i c a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s ( p a h s ) ，a n d i s p r e s e n t o nt h el i s to f12 9a n d6 8 p r i o r i t yp o l l u t a n t s b l a c kl i s t s e s t a b l i s h e db yt h eu se n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na g e n c ya n dp e o p l e r e p u b l i co f c h i n a ，b e c a u s eo fi t st o x i c i t y , m u t a g e n i c i t ya n dc a r c i n o g e n i c i t y i nr e c e n ty e a r s ，t h e a m o u n to ff l u oi na q u a t i ce n v i r o n m e n ti si n c r e a s i n gw i t ht h ea n t h r o p o g e n i cd i s c h a r g e a st h ep r i m a r y p r o d u c e ri na q u a t i ce c o s y s t e m ，a l g a e a r eg o o dk i n d so ft e s to r g a n i s m s f o rb i o a s s a y sb e c a u s eo f t h e i rs e n s i t i v i t yt ot o x i c i t ya n db i o d e g r a d m i o nt op a h s o nt h eb a s i so f b i o l o g i c a li n v e s t i g a t i o nt ot i d a lw a t e ri nf u t i a nm a n g r o v e ，a st h e d o m i n a n ts p e c i e s ，c y c l o t e l l ac a s p i a ( c c a 6 p i a ) w a si s o l a t e da n dp u r i f i e da st e s t o r g a n i s m t od e t e r m i n e ：( 1 ) t h et o x i c i t yo ff l u ot oc c a s p i a ；( 2 ) t h eb i o d e g r a d a t i o no f c c a s p i at of l u ou n d e rt h ep u r ec u l t u r e s i nt o x i c i t ye x p e r i m e n t ，f l u ow a ss e ti nt h e f o l l o w i n gf i v ec o n c e n t r a t i o n s ：0 1 ，o 15 ，0 2 ，0 2 5 ，a n d0 3 p p m ，a m o n gw h i c ho 2 p p m w a st h e9 6 h - e c s 0 f o u rp a r a m e t e r sw e r ec h o s ea st h et o x i c i t yi n d i c a t o r s ：a l g a lg r o w t h r a t e ( u ) ，c h l o r o p h y l la ( c h l a ) c o n t e n t s ，m o r p h o l o g y o fc e l l s ，a n d s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( s o d ) a c t i v i t y ，a n dw e r em e a s u r e di ns i xd a y s t h er e s u l t ss h o w nt h a t ( 1 ) t h et o x i c i t yo ff l u ot oc c a s p i aw a so b v i o u s ；( 2 ) t h ea l g a lg r o w t hr a t ea n dt h ec h l a c o n t e n t sd e c r e a s e dw i t ht h ee l e v a t e df l u oc o n c e n t r a t i o n s ；( 3 ) a b n o r m a l i t yr a t eo fc e l l s 路宁宁荧葸对徽小小环藻的毒性及其生物降解初探 i i i a b s t r a c t a n ds o d a c t i v i t yi n c r e a s e dw i t ht h ee l e v a t e df l u oc o n c e n t r a t i o n s i nb i o d e g r a d a t i o n e x p e r i m e n t ，f l u ow a ss e ti nt h ef o l l o w i n gt h r e ec o n c e n t r a t i o n s ：0 1 ，0 2 ，a n d0 3 p p m a n d b i o d e g r a d a t i o nr a t ew a sc h o s ea st h ei n d i c a t o ra n dm o n i t o r e da tt h ef i r s ta n ds i x t h d a y s t h ed a t as u g g e s t e dt h a t ：( 1 ) t h ep h y s i c a ld e g r a d a t i o nr a t eo ff l u ow a s5 8 6 ；( 2 ) t h e b i o d e g r a d a t i o nr a t e o ft h ef i r s ta n dt h es i x t h d a yw a sa b o u t3 5 a n d8 5 ， r e s p e c t i v e l y ；( 3 ) t h eb i o d e g r a d a t i o na b i l i t yo fcc a s p i at of l u ow a ss t r o n g ，t h eh i g h e r t h ef l u oc o n c e n t r a t i o n s ，t h eh i g h e ro ft h ea b s o l u t ea m o u n to ft h ed e g r a d a t i o nb yt h e a l g a i nc o n c l u s i o n s ，( 1 ) t h et o x i c i t yo ff l u ot oc c a s p i aw a s o b v i o u sa n dt h e9 6 h e c 5 0 w a so 2 p p m ；( 2 ) t h e b i o d e g r a d a t i o na b i l i t y o fcc a s p i at of l u ow a ss t r o n g s o ， r e s e a r c h e so nt h et o x i c 时o ff l u ot o a l g a ea n dt h em e c h a n i s m sc o n c e r n i n ga l g a l b i o d e g r a d a t i o na n da l s ot h ei n s i t ur e m c d i a t i o no f t h eo r g a n i cp o l l u t a n t sa r ew o r t ht o s t u d y f i t h e r k e y w o r d s ：f l u o r a n t h e n e ( f l u o ) ，c y c t o t e l l ac a 5 p i a ，t o x i c i t y , b i o d e g r a d a t i o n 路宁宁 荧葸对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 i v 全文缩略词( l i s to fa b b r e v i a t i o n s ) 全文缩略词( l i s to f a b b r e v i a t i o n s ) 类胡萝h 素 过氧化氢酶 化学需氧量 叶绿素a 微小小环藻 溶解氧 美国环保署 荧蒽 气相色谱 半效应浓度 多功能氧化酶 不可见效应浓度 过氧化物酶 多环芳烃 定量结构一活性关系 活性氧物质 超氧化物歧化酶 c a r o t e n e ，c a r c a t a l a s e ，c a t c h e m i c a l o x y g e nd e m a n d ，c o d c h l o r o p h y l la ，c h l a c y c l o t e l l ac a s p i a cc a s p i a d i s s o l v e do x y g e n ，d o e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n a g e n c y , e p a f l u o r a n t h e n e ，f l u o g a s c h r o m a t o g r a p h y , g c m e d i a ne f f e c tc o n e e n t r a t i o n ，e c 5 0 m i x e d f u n c t i o no x i d a s e s m f 0 n oo b s e r v e de f i e c tc o n c e n t r a t i o n n o e c p e r o x i d a s e ，p o d p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s p a h s q u a n t i t a t i v es t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ，q s a r r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s r o s s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d 路宁宁荧葸对微小小环藻的毒性投其生物降解初探 v 全文图列( l i s to ff i g u r e s ) 全文图列( l i s t o f f i g u r e s ) 图1 - 1 荧葸结构 f i g 1 1c o n f i g u r a t i o n o f f l u o r a n t h e n e 图2 - 1 福田红树林采样布点 f i g 2 1s a m p l i n g p o i n t si nf u t i a nm a n g r o v e 图3 - 1 微小小环藻 f i g 3 - 1c y c l o t e l l ac a s p i a 图3 - 2 微小小环藻生长曲线 f i g 3 2g r o w t h c u r v eo f c c a s p i a 图3 3不同丙酮浓度下微小小环藻生长曲线 f i g 3 3g r o w t h c u r v eo f c c a s p i au n d e r d i f f e r e n ta c e t o n ec o n c e n t r a t i o n s 图3 4 不同丙酮浓度下微小小环藻生长速率曲线 f i g 3 4g r o w t h r a t ec u r v eo fc c a s p i au n d e r d i f f e r e n ta c e t o n ec o n c e n t r a t i o n s 图3 5 不同荧葸浓度下的微小小环藻生长曲线 f i g 3 5g r o w t h c u r v eo fc c a s p i au n d e r d i f f e r e n tf l u oc o n c e n t r a t i o n s 图3 - 6 微小小环藻在不同浓度荧蒽作用下的生长抑制率 f i g 3 6 g r o w t hi n h i b i t i o nr a t eo fc c a s p i a u n d e rd i f f e r e n tf l u o c o n c e n 订a t i o n s 路宁宁荧蒽对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 v i 全文图列( l i s to ff i g u r e s ) 图3 7 微小小环藻在不同浓度荧蒽作用下的生长曲线 f i g 3 7g r o w t h c u r v eo fc c a s p i au n d e r d i f f e r e n tf l u oc o n c e n t r a t i o n s 图3 8 微小小环藻在不同浓度荧蒽作用下的生长速率 f i g 3 - 8g r o w t h r a t eo fc c a s p i a u n d e rd i f f e r e n tf l u oc o n c e n t r a t i o n s 图3 - 9 不同浓度荧蒽作用下的微小小环藻的生长抑制率 f i g _ 3 9g r o w t h i n h i b i t i o nr a t eo fc c a s p i a u n d e rd i f f e r e n tf l u oc o n c e n t r a t i o n s 图3 1 0 微小小环藻在不同浓度荧蒽作用下的叶绿素含量 f i g 3 1 0c h l a c o n t e n t so f c c a s p i au n d e rd i f f e r e n tf l u oc o n c e n t r a t i o n s 图3 1 1微小小环藻在不同浓度荧蒽作用下的形态变化 f i g 3 1 lm o r p h o l o g yo f cc a s p i au n d e rd i f f e r e n tf l u oc o n c e n t r a t i o n s 图3 1 21 0 m g m l 标准蛋白曲线 f i g 3 1 2s t a n d a r dc u r v eo f1 0 m g m lp r o t e i n 图3 1 30 1 m g m l 标准蛋白曲线 f i g 3 1 3s t a n d a r dc u r v eo f 0 1 m g m lp r o t e i n 图3 - 1 4 微小小环藻在不同浓度荧葸作用下的s o d 酶活性 f i g 3 1 4s o da c t i v i t yo fc c a s p i au n d e rd i f f e r e n tf l u oc o n c e n t r a t i o n s 路宁宁荧葸对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 v i l 全文表列( l i s to ft a b l e s ) 全文表列( l i s to f t a b l e s ) 表1 1 部分多环芳烃的结构及物理化学性质 t a b l e1 - l ：s t r u c t u r ea n d p h y s i c a l - c h e m i c a l p r o p e r t i e so f s o m e p a h s 表2 1 野外实验参数选择与分析方法 1 a b l e2 1p a r a m e t e r sa n d a n a l y s i sm e t h o d s o f f i e l de x p e r i m e n t s 表2 - 2g c 炉温升温程序 t a b l e2 - 2p r o g r a m so fg co v e n r a m p 表3 - 1 福田红树林近岸水域藻类密度及种类组成 t a b l e3 - 1d e n s i t ya n ds p e c i e sc o m p o s i t i o no f a l g a ei nf u t i a nm a n g r o v ew a t e r 表3 2两采样点水样分析结果 t a b l e3 - 2 a n a l y z e d r e s u l t so f t w o s a m p l i n gp o i n t s 表3 - 3f 2 改良培养基配方 t a b l e3 - 3n u t r i e n tc o m p o s i t i o no f m o d i f i e df 2m e d i u m 表3 - 4 荧葸对微小小环藻毒性实验设置 t a b l e3 - 4e x p e r i m e n t d e s i g no f f l u ot o x i c i t y t oc c a s p i a 表3 5 微小小环藻第一天降解荧蒽的实验结果 t a b l e3 - 5f l u ob i o d e g r a d a t i o nb yc c a s p i ad u r i n gt h ef i r s td a y 表3 - 6 微小小环藻第六天降解荧葸的实验结果 t a b l e3 - 6f l u ob i o d e g r a d a t i o nb yc c a s p i ad u r i n gt h es i x t hd a y 路宁宁荧蒽对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 v i i i 第1 章前言 1 1 选题背景 第1 章前言 随着科学技术的发展和人民生活水平的提高，环境污染成为人们最为关心的 问题之一。目前，环境污染的特征之一就是有机污物的污染。由于工业生产、交 通运输、农业生产等人类活动向环境中排放了大量的有机污染物，因此，环境有 机污染日益得到人们的重视“1 。多环芳烃( p o l y c y c l i c a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s ，p a h s ) 是一大类广泛存在于环境中的有机污染物，它来源于陆地和水生植物、微生物的 生物合成，森林、草原的天然火灾，以及火山活动，构成了p a h s 的天然本底值 ”1 。p a h s 的人为污染源很多，主要是由各种矿物燃料( 如煤、石油、天然气等) 、 木材、纸以及其它含碳氢化合物的不完全燃烧或在还原条件下热解形成的。1 。 大量数据表明，每年有数十万吨石油产品和原油从炼油厂和石化厂的废弃物 中排放到世界范围的海洋环境中，海洋生物正遭受着越来越严重的p a h s 污染， 据报道，目前在海水鱼和淡水鱼体内都发现了p a h s 4 1 。由于多环芳烃的潜在毒性、 致癌性及致畸诱变作用5 3 ，对人类健康和生态环境具有很大的潜在危害，已引起 各国环境科学家的极大重视。美国环保署( e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na g e n c y , e p a ) 更是在八十年代把十六种未带分支的多环芳烃确定为环境中的优先污染物，我国 也把多环芳烃列入环境污染的黑名单中“1 。 荧蒽( f l u o r a n t h e n e ，f l u o ) 为一种四环的杂环芳烃，在由燃烧产生的p a h s 污染 物中含量最高，因而常被作为环境遭受p a h s 污染的指示化合物”3 ，其化学结构如 图卜l 所示。它同大多数p a h s 一样，具有毒性、致突变性和潜在致癌性。1 ，美 国e p a 所公布的1 6 种优控多环芳烃和我国提出的6 8 。埽十优先污染物黑名单中都 包含该物质。 大量数据表明，世界上一些发达地区的河口地带，不论是底泥还是水体，都 检测到了荧蒽的存在，且含量较高。例如，美国查尔斯顿港河口附近的荧葸含量 是所有p a h s 污染物中含量最高的“；英国亨伯河口底泥中荧蒽的平均含量为 路宁宁荧蒽对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 第1 章前言 4 2 0 n g g 干重，斯凯尔特河河口底泥中荧葸的平均含量为8 4 1 6 n g g 干重。我国 厦门西港及其附近海域水产养殖区沉积物中检测到的p a h s 均以四到六环为主， 且都以荧葸的含量为最高“1 。所以f l u o 在环境中的去除和降解问题已成为当今环 境研究中的前沿课题“1 。 荧慈化学结构 图1 1 荧葸结构 f i g 1 - 1c o n f i g u r a t i o no f f l u o r a n t h e n e 多环芳烃理化性质不相同，反映出的生物降解性也各不相同。一般来说，多 环芳烃的生物降解性随苯环数量的增加而降低，三环以下的易于降解，四环以上 的较难降解“。荧葸作为一种四环的杂环芳烃，其生物降解性介乎其间，因而具 有典型意义。 藻类作为水生生态系统的初级生产者，种类繁多，有许多是世界性种类。它 广泛存在于各种水体，生长繁殖迅速，不仅对毒物的毒性作用敏感“，而且大量 资料显示，藻类具有降解多环芳烃的能力。m b e r t 【“i 等人曾做过统计，目前世界 范围内已找到对萘具有降解能力的藻共1 7 种，涉及四个门类，它们是：颤藻 o s c i l l a t o r i a s p ，原型微鞘藻m i c r o c o l e u sc h t h o n o p l a s t e s ，念珠藻n o s t o cs p ，鱼腥 藻a n a b a e n as p ，a g m e n e l l u m q u a d r u p l i c a t u m ，c o c c o c c h l o r i se l a b e n s ，隐球藻 a p h a n o c a p s as p ，小球藻c h l o r e l l as o r o k i n i a n a ，小球藻c h l o r e l l aa u l o t r o p h i c a ，杜 氏藻d u n a l i e l l at e r t i o l e c t a ，衣藻c h l a m y d o m o n a sa n g u l o s a ，裂片石莼u l v a f a s c i a t a ， 细柱藻c y l i n d r o t h e c as p ，双眉藻a m p h o r as p ，菱形藻n i t z s c h i as p ，舟形藻 n a v i c u l as p ，紫球藻p o r p h y r i d i u mc r u e n t u m 对菲具有降解能力的藻共两种，它们 是：颤藻o s c i l l a t o r i as p 和a g m e n e l l u mq u a d r u p l i c a t u m 。对荧蒽具有降解能力的 藻有一种，为绿藻门的栅藻s c e n e d e s m u ss u b s p i c a t u s 。本研究将选择深圳福田红树林 地区的优势藻种为实验藻种，考察在纯培养条件下荧蒽对它的毒性及其对荧蒽的 降解，在发展生物降解理论和有机废水生物处理应用两个方面都具有重要意义。 路宁宁荧葸对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 2 第1 章前言 1 2 国内外研究现状与进展 多环芳烃中苯环连在一起的方式有两种【1 5 】：一种是非稠环型的，即苯环与苯 环之间各由一个碳原子相连，如联苯，联三苯等；另一种是稠环型的，即两个碳 原子为两个苯环所共有，如萘、蒽等。不论是哪种连接方式，由于均具有苯环结 构，所以大多数p a h s 性质相似，例如具有极低的水溶性、蒸汽压和较高的辛醇 一水分配系数等。基于此，下面将展开以荧蒽为重点的、国内外对多环芳烃的研 究现状与进展的综述。 1 2 1 有机物理化性质与其毒性的研究 多环芳烃的理化性质和毒性会随苯环数目的增加而表现出有规律的变化，例 如苯环数目越多，水溶性越小，熔点越高，生物可降解性越低，毒性越大等。几 种典型p a h s 的理化性质见表1 一l 所示。 表1 - 1 部分多环芳烃的结构及物理化学性质 t a b l e1 一l ：s t r u c t u r ea n d p h y s i c a l c h e m i c a lp r o p e r t i e so f s o m ep a l - i s 1 6 】 许多证据显示，一些p a h s 可以诱发啮齿类动物乳腺肿瘤的发生。其作用机 制是：p a h s 代谢成具有活性的中间代谢物以后，可以和d n a 共价结合，从而发 路宁宁 荧葸对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 第1 章前言 挥它们的致癌作用“”。另外需要特别指出的是p a h s 中的许多物质，例如荧蒽、 菲等，在紫外线或自然光照射下能够产生很高的光致毒性。p a h s 具有光致毒性， 是因为它们在进入生物体后，在生物组织中形成了光敏分子。这种光敏分子是在 p a i l s 吸收了紫外线或自然光的能量后形成的，往往以活性很高的单线态或三线 态存在。被光敏分子结合的能量传递给生物组织中的氧，产生活性氧物质 r o s ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) ，如单氧化物或超氧化物。r o s 是潜在氧化剂，它 们能对生物组织造成氧胁迫，从而致毒“。光致毒性的产物主要有苯醌、羟基苯 醌和安息香酸等。经光修饰以后的p a h s 的水溶性增加，不仅更容易被水生生物 吸收，而且由于活性、毒性都有所增大，对植物、原生动物、无脊椎动物都有毒 一畦“”2 “。 1 2 2 水生生物毒理学研究 近年来，用q s a r ( q u a n t i t a t i v es t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ) ，即定量结构 一活性关系方法研究表明：有机化合物对水生生物的毒性大小主要由两个环节所 决定：一是化合物在生物体内的富集能力；二是毒性物质与受体物质发生相互作 用的能力。这两个环节均由有机物的分子结构决定。多环芳烃的多苯环结构使这 类物质具有非常稳定的特性，加之较高的辛醇一水分配系数决定了其在水一有机 相共存的体系里，必然极易吸附到有机相表面，完成从水到有机相的富集过程。 有关多环芳烃对水生生物致毒效应的研究国内外已有许多报道”4 ”3 ，对荧蒽 的毒性研究也在深入，例如荧蒽对水蚤“、鱼类。、片脚类。、寡毛类。“、多毛 类动物的毒性都有过报道。把藻类暴露于荧蒽，一般会导致叶绿素的迅速降低， 细胞和无机组成的变化，如m n 和k 的减少，其结果往往造成蛋白质水平下降， 碳水化合物和类脂物增高“。 1 2 3 不同生态系统水平上的研究进展 目前有关多环芳烃毒理学的研究，已经在各个生态系统层次上展开。 路宁宁荧蒽对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 第1 章前言 分子生态毒理学研究污染物及代谢产物与细胞内大分子，包括蛋白、核酸、 酶的相互作用，找出作用的靶位或靶分子，并揭示其作用机理，从而对在个体、 种群或生态系统水平上的影响作出预报。彭金良3 0 1 等通过对普通小球藻体内类 胡萝h 素( c a r o t e n e ，c a r ) 、超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 、过 氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 、过氧化物酶( p e r o x i d ed i s m u t a s e ，p o d ) 的研究，证 明了旺一萘酚可通过活性氧或其它过氧化产物造成对普通小球藻的伤害，也证明 了c a r 、s o d 、c a t 、p o d 清除活性氧，维护藻细胞正常生理功能是藻细胞抗逆 境胁迫的重要途径之一。 种群、群落生态毒理学的研究也较多。e s t e rs e p i c 3 1 1 等人以栅藻( s c e n e d e s m u s s u b s p i c a t u s ) 、假单胞菌( p s e u d o m o n a s p u t i d a ) 和甲壳动物佚型蚤d a p h n i a m a g n a ； t h a m n o c e p h a l u sp l a t y u r u s ) 为测试生物，研究了荧蒽及其降解产物对它们的生理 毒性。结果表明：荧葸对藻类的毒性较大，但降解( 代谢) 产物的毒性却相对很 小，只有荧葸的1 1 0 0 0 1 3 0 0 0 。对细菌而言，荧蒽及其初级代谢产物的毒性较 小，但中间产物的毒性却很大：荧葸及其降解产物对甲壳动物都有毒性，但毒性 大小有所差异。 1 2 4 降解机理研究现状 多环芳烃在水环境中的降解途径，主要有光氧化降解、化学氧化降解和生物 降解。其中，光降解是多环芳烃的重要降解方式【3 2 。在多环芳烃的生物降解机理 研究中，比较成熟的是菌类的降解 3 3 , 3 4 1 ，各国科学家已经对三环以下( 包括三环) p a h s 的微生物降解进行过大量、深入的研究，并得到了关于降解速率、降解途 径、降解酶系的详尽资料“j ，目前普遍认为其降解实质是：污染物质进入细胞以 后通过双加氧酶形成顺式结构产物。无论是异氧菌、自养菌还是细菌，降解反应 的控制步骤也几乎雷同。关于真核生物对p a h s 的降解主要集中在真菌上，目前 已经分离得到1 8 种对多环芳烃具有降解能力的真菌【h 。真核微生物对p a l l s 的降 解机理普遍认为是：首先用单氧酶系统把p a h s 物质代谢成芳烃氧化物，然后在 酶的作用下继续代谢成反式一双氢二醇。 路宁宁荧蒽对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 第1 章前言 大多数研究表明，藻类能够有效地降解多环芳烃类物质。c e m i g l i a 等系统研 究了海洋颤藻o s c i l l a t o r i as p s t r a i nj c m 和a g m e n e l l u mq u a d r u p l i c a t u ms t r a i n p r - 6 对萘、联苯、1 或2 一甲基萘的生物降解，结果表明3 种物质均能被有效降 解。n a r r o 等研究了a g m e n e t l u mq u a d r u p t i c a t u ms t r a i np r - 6 对菲的生物降解。“。 但是藻类降解多环芳烃的机理并不完全同真核生物相似，例如，w a r s h a w s k l 3 6 】等 人研究了羊角月牙藻s e l e n a s t r u mc a p r i c o r n u t u m 对苯并 a 芘b a p 的代谢产物及其 相应的酶系统，结果发现真核生物绿藻对b a p 的代谢是通过双加氧酶系统完成的， 这与细菌有很大的相似性：而u k i r s o 和n i r h a 3 7 1 对优控多环芳烃b a p 在褐藻、 红藻、绿藻以及轮藻中生物富集和转化的研究表明，对b a p 的解毒过程来说，藻 体中最重要的酶系统是氧一联苯酚氧化酶、细胞色素p 4 5 0 和过氧化物酶。 水生生物对p a h s 的降解还受多种因素的影响，包括温度、p h 、水体的组成 成份、曝气程度、营养状况等【38 1 。很多研究表明，营养盐的添加在高分子量p a h s 的生物降解过程中起到了非常重要的作用【3 ”，尤其是氨氮，对于盐沼带高分子量 p a h s 的降解至关重要 4 0 , 4 h 。 1 2 5 有机物污染原位修复 生物技术在环境领域的应用已有多年历史，其中较早的有活性污泥法处理工 业废水以及近2 0 年来发展起来的的生物修复技术。目前，应用生物降解原理治理 被污染的环境所具有的潜在优势得到了广泛认可。它不仅经济、安全，而且所能 处理的污染物阈值低，残留少，其应用前景看好“。例如，“活性藻”方法是由 m c g r i f f 于7 0 年代初提出的废水处理方法，通过人工强化培养高浓度藻类，能有 效地富集和降解有机氯、氮、磷等多种有毒难降解物“。但是应用藻类来修复水 环境中多环芳烃( 尤其是荧葸) 的污染，未见报道。 1 2 6 降解动力学模型的研究 微生物是降解有机污染物的主要生物成分，其降解过程一般符合m o n o d 一 路宁宁荧蒽对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 6 第1 章前言 级反应动力学方程( - d c d t = k n ，c ：有机物浓度；t ：时间：k ：一级反应动力学 常数；n ：微生物浓度) 。但藻类对有机污染物的降解是藻类除具有光能无机营养 外还具备的兼性化能有机营养功能作用的结果。因此，尽管藻类和微生物都能降 解有机污染物，但降解机制是不同的，而这种差异必然反映在它们降解有机污染 物动力学上的不一样。根据参考文献，藻类降解有机污染物的动力学方程可以表 示为： 一d c d t = k n r 其中，k ：二级反应动力学常数；n ：藻细胞浓度；r ：藻生长速度。 将r = d n & 代入上式积分后得到： c = 一i 2 k n 2 + c o 运用上述方程，分别通过实测藻细胞浓度的平方( n 2 ) 与有机物浓度( c ) 之间的一元线性回归，得到参数k 和c o 。阎海h 4 1 等通过斜生栅藻降解邻苯二甲 酸酯类和苯酚的实验，验证了上述藻类降解有机污染物的动力学方程。 但是实验证明，多环芳烃及其代谢产物对藻类的生理毒性及藻类对它们的降 解都具有种类特异性，不同藻类对不同多环芳烃的降解能力和情况也不同，因而 可能造成降解动力学方程上的差异。 1 3 研究内容、目的及意义 1 3 1 研究内容 据报道。3 ，海洋中多环芳烃的污染呈现出随海水深度加大和离海岸距离增加 而减小的趋势，所以海岸、海湾的污染往往是最严重的；藻类品种繁多，有些种 类被列为i s o 标准藻种，例如，绿藻门栅藻属的ss u b s p i c a t u s 和 c u p r i c o r n u t u m 3 1 1 等，很多科学家都以此为测试材料开展各种研究，便于同类结果 的比较；而本地种则具有i s o 标准藻种所无法比拟的对当地环境的指示、适应性 等特点，因而更加具有实际应用价值。基于以上两方面的考虑，本研究决定从深 路宁宁荧葸对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 第1 章前言 圳福田红树林近岸水域分离培养出本地优势种，并应用其开展荧蒽的生物毒性及 生物降解研究。 本研究主要包括两大部分： ( 1 ) 以深圳福田红树林水域为依托，对其进行布点采样，然后在显微镜下观察 水体中藻类的种类组成，筛选优势种作为实验藻种，并将其分离、纯化。 ( 2 ) 用分离、纯化的藻种进行实验室荧蒽的毒理和生物降解分析研究。 1 3 2 目的及意义 ( 1 ) 提供最新的有关深圳福田红树林近岸水域的水质及藻类资料，筛选出污 染优势藻种： ( 2 ) 得到荧蒽对藻类的毒理数据，为利用藻类监测水环境中的多环芳烃污染 提供理论依据； ( 3 ) 验证藻类具有降解荧蒽的能力； ( 4 ) 通过本研究，提出进一步有价值的研究方向。 路宁宁荧葸对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 第2 章实验内容与方法 第2 章实验内容与方法 2 1 野外实验 2 1 1 研究范围与采样 本研究的采样地点设在深圳福田红树林国家级自然保护区，观鸟亭以西的排 污口附近，东经：1 1 4 0 0 。，北纬：2 2 5 3 。；采样布点如下图所示。 图2 1 福田红树林采样布点 f i g 2 - 1s a m p l i n gp o i n t si nf u t i a nm a n g r o v e 采样区红树植物主要是人工种植的海桑。由于排污水道从林中穿过，此处 底泥表层颜色为深黑色，且散发出刺鼻臭味。林下生物种类繁多，常见招潮蟹出 没。此次进行a 、b 两个点的浮游藻类及水质调查，如图2 一l 所示，采样方法为： 2 0 0 4 年6 月2 5 日低低潮时在a 、b 两点分别固定一个容积为5 l 的笳，并于2 0 0 4 年6 月2 6 日低低潮时取样，现场测定温度、盐度等指标。每点采足水样2 l ，带 回实验室进行其它指标的分析。 路宁宁荧葸对微小小环藻的毒性及其生物降解初探9 第2 章实验内容与方法 2 1 2 参数选择与分析方法 对所采水样立即进行生物及化学分析。所选参数及分析方法见表2 1 。 表2 - 1 野外实验参数选择与分析方法 t a b l e2 - 1p a r a m e t e r sa n d a n a l y s i s m e t h o d s o f f i e l d e x p e r i m e n t s 多样性指数( s h a r m o n - w e a v e r ，1 9 4 9 ) 计算公式： h 7 = 一p i l 0 9 2 p i ( 2 1 ) 其中h7 为种类多样性指数；s 为样品中的种类总数，p i 为第i 种个体数与总 个体数的比值。一般认为，正常环境下，该指数偏高，环境受污染时，指数值降 低。 优势度指数计算公式： d = r n l + n 2 ) n r ( 2 - 2 ) 其中n l 、n 2 为某样点的第一优势种和第二优势种个体数，n t 为该点的总个 体数。一般认为，d 越小，水质越好。 用生物指标进行环境评价时，除以上两个参数外，还涉及均匀度指数、相似 性指数等指标。这些参数之间的关系比较复杂，为了对环境做出真实而又全面的 评价，还需要结合当次监测的物理、化学指标。本研究选取的是温度、d o 、c o d 等指标。 路宁宁荧蒽对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 1 0 第2 章实验内容与方法 2 2 室内实验 2 2 1 藻种分离纯化 藻种分离毛细管清洗技术。 选择几只短玻璃滴管，用镊子夹住滴管的前端，放在煤气灯的外焰上少刻 玻璃变软，此时需迅速移离火焰并同时快速拉丝。按照所要挑取的藻细胞的大小， 掌握用力程度，以使所拉毛细管的口径刚刚适合所要挑取的藻细胞大小。用镊子 把毛细管头端夹断，在管的另一端加上胶吸头。 用滴管吸取少量采集样品( 未经化学品处理过的) 滴在灭菌后的点滴板的凹 陷上，置于解剖铙下观察。如果样品中藻细胞浓度过大，种类繁多，可以用去离 子水先将样品稀释。然后在其他的几个凹陷上滴入去离子水。在解剖镜下观察时， 移动毛细管的细管头在需要挑取的细胞上，小心进入液体，迅速挑取，将挑取出 的细胞放入另一个装有去离子水的凹陷里。用以上方法挑取约1 5 个单细胞，然后 在其他装有去离子水的凹陷里清洗6 1 2 次。每清洗一次，需换一支毛细管。经 过有效清洗，将最后得到的单细胞( 约1 0 个) 放入盛装有培养基的小试管中，并 置于光照培养箱里进行培养。约一周后镜检藻类的生长情况。若试管中除目标藻 外还有其它杂藻生长，可采用上述方法再进行一次分离工作，直到试管中为单一 目标藻种。 藻种纯化倒平板法。 经毛细管清洗得到的藻种虽为单一藻种，但却是藻一菌共存系统，不能达到 实验用藻要求，所以还要采用倒平板法除菌。将琼脂粉放入液体培养基中制成 1 5 一1 8 的固体培养基，湿热灭菌后冷却。当培养基已经变凉但还未凝固的时候 加入抗生素( 1 0 0 单位m 1 ) ，然后倒平板，用得到的单一藻种进行涂布或划线。 将上述培养皿放入光照培养箱进行培养，约4 天后即可得到单克隆的藻体。采用 上述方法，利用所得的单克隆藻体再进行划线，以确保无菌生长。 路宁宁荧蒽对微小小环藻的毒性及其生物降解初探 11 第2 章实验内容与方法 为避免人为的环境污染，遵照实验室安全操作规范，实验过程中所有用到的 藻体( 无论是液体培养基培养的还是固体培养基培养的) ，在丢弃时均