（发酵工程专业论文）高产d阿拉伯糖醇酵母菌株的筛选及其发酵条件的研究.pdf

摘要 摘要 d 邛可拉伯糖醇作为木糖醇发酵不可替代的中间体，备受人们的关注。本文研究核心 是筛选一株性能良好的菌株，能够发酵葡萄糖高产d 阿拉伯糖醇，讨论d 一阿拉伯糖醇 发酵的主要影响因素，进行了分批发酵与补料分批发酵的扩大实验，从而为将来的工业 化生产做一些基础性工作。主要研究内容包括以下方面： 确定了菌株初筛过程中底物葡萄糖和产物d 阿拉伯糖醇的分析检测方法。采用纸 层析的方法成功的分离了底物与产物，从而能快速简便的检测底物的消耗与产物生成的 情况，定性测定菌株初筛发酵液中是否含d 阿拉伯糖醇。采取高效液相色谱法对底物 和产物进行定量测定。所确立的分析方法对发酵葡萄糖生产d 阿拉伯糖醇菌株的筛选 提供了较好的指导。 从3 7 8 株耐高渗酵母中通过初筛、复筛得到一株可高效转化葡萄糖生成d 阿拉伯 糖醇的酵母4 0 2 7 3 7 ，产物d 一阿拉伯糖醇的浓度为7 3 8 2 l ，底物葡萄糖的转化率达 3 6 9 1 。根据常规形态鉴别，生理生化实验测定，以及i t s 区域核酸序列同源性比较分 析，证实该菌株属于d e b a r y o m y c e sh a n s e n i i ( 汉逊德巴利酵母) ，该汉逊德巴利酵母已保 存于中国高校工业微生物资源数据平台，保藏编号为c i c i my0 5 0 4 。 以酵母c i c i my0 5 0 4 为出发菌株对底物葡萄糖发酵d 阿拉伯糖醇进行单因素实 验。分别讨论发酵种子、底物葡萄糖、氮源、酵母膏、培养基初始p h 值、温度及装液 量等对其发酵影响，结果表明，培养基中所添加的酵母膏以及发酵过程中的溶氧对其发 酵影响较大，同时培养基中过量的氮源不利于d 阿拉伯糖醇的合成，培养基的初始p h 值在酸性条件下既利于茵体的生成又利用产物的合成。初步确定培养基和培养条件为： 2 0 0 l 葡萄糖，2 9 l 尿素，3 9 l 磷酸二氢钾，2 5 9 l 七水硫酸镁，1 0 9 l 酵母膏，初始 p h 值为3 ，装液量为2 0 m l d 2 5 0 m l 摇瓶，3 0 ，1 5 0 r m i n ，接种量为5 。在此的培养 条件下发酵1 2 0 h 得到产物d 阿拉伯糖醇的浓度为1 0 5 4 1 9 l ，底物转化率为5 2 7 。通 过单因素实验得到发酵条件下产物浓度较筛选时提高3 0 l ，底物转化率提高了4 2 8 。 在摇瓶发酵单因素研究的基础上，进行1 5 l 发酵罐的放大培养。研究d 阿拉伯糖 醇的分批发酵和分批补料发酵。结果显示，分批发酵得到d 阿拉伯糖醇浓度为6 4 0 9 l ， 底物转化率为3 3 9 ；分批补料发酵得到d 阿拉伯糖醇浓度为1 2 5 9 l ，底物转化率为 3 7 5 。分批补料发酵所得到d 邛可拉伯糖醇浓度较高，为工业化生产d - 5 可拉伯糖醇奠定 基础。 同时对c i c i my0 5 0 4 分批发酵数据建立菌体生长、底物消耗和产物生成的动力学 模型，将模型预测的理论值和发酵实验值进行了比较，得到模型的置信区间为8 8 ，表 明该模型能较好地反映了实际的发酵过程，对实际简单分批发酵具有一定的指导意义。 关键词：d 阿拉伯糖醇、葡萄糖、汉逊德巴利酵母( d e b a r y o m y c e sh a n s e n i i ) 、 影响因素、放大培养、动力学模型 a b s t r a c t a b s t r a c t d a r a b i t 0 1r e c e i v e sp e o p l e sa t t e n t i o na si n t e r m e d i a t e so fx y l i t o lf e r m e n t a t i o n w h i c h c a n tb er e p l a c e d t h eo b j e c t i v eo ft h i sw o r kw a st os e l e c tas t r a i nw h i c hb a dt h ea b i l i t yo f f e r m e n t a t i o no fg l u c o s ei n t od a r a b i t 0 1 i td i s c u s s e dp r i m a r yf a c t o ro fd a r a b i t o lf e r m e n t a t i o n b a t c hf e r m e n t a t i o na n df e db a t c hf e r m e n t a t i o nw e r es t u d i e d i tw a sb a s i cw o r ka st h e d a r a b i t o li n d u s t r i a lp r o d u c t i o ni nt h ef u t u r e t h em a i n l yr e s e a r c h i n gc o n t e n t sa r eb l o w t h em e t h o df o rt h ea n a l y s i sa n dd e t e r m i n a t i o ng l u c o s ea n dd a r a b i t o li nt h ef i r s t s c r e e n i n go fs t r a i n sw a ss t u d i e d w i t hp a p e rc h r o m a t o g r a p h y , t h es u b s t r a t ea n dt h ep r o d u c t w e r es e p a r a t i o n s u c c e s s f u l a c c o r d i n g t ot h ed i f f e r e n tt r a n s p o r tr a t i oo fg l u c o s ea n d d - a r a b i t 0 1i nd e v e l o p i n gs o l v e n t t h ef e r m e n t a t i o nf l u i dc o n t a i n e dd a r a b i t 0 1o rn o t t h eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o u l dp r e c i s ed e t e r m i n a t i o nt h ep r o d u c t sa n ds u b s t r a t e t h ea n a l y s i sm e t h o dp r o v i d e dt h eg o o di n s t m c t i o nf o rt h ed a r a b i t o lf e r m e n t a t i o nf r o m g l u c o s e o n ey e a s ts t r a i n ，w h i c hw a si s o l a t e df r o m3 7 8o s m o p h i l i cy e a s t s ，w a sf o u n dt ob ea b l et o u t i l i z ed g l u c o s ee f f e c t i v e l y t h ec o n c e n t r a t i o no fd - a r a b i t o li s7 3 8 2 9 l ，a n dt h es u b s t r a t e c o n v e r s i o nr a t eo fg l u c o s ei s3 6 91 o nt h eb a s i so fa s s i m i l a t i o np h y s i o l o g i c a lt e s t sa n d m o l e c u l a rb i o l o g yt e a s t ，a l lo ft h ed e t e c t i o nl e dt ot h ei d e n t i f i c a t i o no fy e a s ts t r a i na sas t r a i n o fd e b a r y o m y c e sh a n s e n i i g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e ro fl t sn u c l e o t i d es e q u e n c ew a s e fl9 6 8 0 9 t h es t r a i nw a ss u b m i t t e dt ot h ec u l t u r ea n di n f o r m a t i o nc e n t r eo fi n d u s t r i a l m i c r o o r g a n i s m so fc h i n au n i v e r s i t i e sa n dt h ec o r r e s p o n d i n gs e r i a ln u m b e rw a sc i c i m y 0 5 0 4 t h ed e b a r y o m y c e sh a n s e n i io b t a i n e dw a st a k e na st h ef u r t h e rr e s e a r c hs t r a i n i nt h e r e s u l to ft h i sr e s e a r c h ，i td i s c u s s e ds e e d ，s u b s t r a t eg l u c o s e ，n i t r o g e ns o u r c e ，y e a s te x t r a c t ， i n i t i a lp ho fc u l t u r em e d i u m ，t e m p e r a t u r ea n dl i q u i dv o l u m ea n d o nt od a r a b i t o l f e r m e n t a t i o ni n f l u e n c e ，f i n a l l yi n d i c a t e dt h a ty e a s te x t r a c ti nt h ec u l t u r em e d i u m a sa n dt h e d i s s o l v e so x y g e nh a di m p o r t a n ti n f l u e n c ef o rd a r a b i t o lf e r m e n t a t i o n s i m u l t a n e o u s l yt h e e x c e s s i v en i t r o g e ns o u r c ei nt h ec u l t u r em e d i u md o e sn o tf a v o rt h es y n t h e s i so fd a r a b i t 0 1 t h ei n i t i a lp ho f c u l t u r em e d i u mu n d e rt h ea c i d i cc o n d i t i o nf a v o r st h eg r o w t ho f y e a s ta n dt h e p r o d u c ts y n t h e s i s t h r o u g hr e s e a r c h i n gt h ec u l t u r em e d i u ma n dt h ec o n d i t i o n ，t h ec u l t u r e m e d i u ma n dt h ec o n d i t i o na r e ：2 0 0 9 , l g l u c o s e , 2 9 lu r e a , 3 9 lp o t a s s i u md i h y d r o g e n p h o s p h a t e ，2 5 9 ls e v e nw a t e rm a g n e s i u ms u l f a t e ，lo g ly e a s tp a s t e ，i n i t i a lp h3 ，m e d i a v o l u m e2 0m l ，3 0 ，l5 0 r m i na n dt h ev a c c i n a t i o nq u a n t i t yi s5 t h ep r o d u c td a r a b i t o l c o n c e n t r a t i o ni s10 5 4 1g li n12 0 h o u r su n d e rt h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n a n dt h e s u b s t r a t ec o n v e r s i o nr a t eo fg l u c o s ei s 5 2 7 c o m p a r e s t o s c r e e n i n g ，t h ed a r a b i t o l c o n c e n t r a t i o ne n h a n c e d3 0 9 la n dt h es u b s t r a t ec o n v e r s i o nr a t ee n h a n c e d4 2 8 b a s e do nt h ea b o v eo p t i m u mc o n d i t i o n ，t h ef e r m e n t a t i o ne n l a r g e m e n tw a sp e r f o r m e d w i t hs t r a i nd e b a r y o m y c e sh a n s e n i ii nl5 - l i t e rf e n n e n t o r b a t c hf e r m e n t a t i o na n df e db a t c h f e r m e n t a t i o nw e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fd a r a b i t o lw a s 6 4 0 9 la n dt h es u b s t r a t ec o n v e r s i o nr a t ew a s3 3 9 i nt h eb a t c hf e r m e n t a t i o n i nt h ef e d b a t c hf e r m e n t a t i o nt h ep r o d u c t i o no fd a r a b i t o lw a s12 5 9 la n dt h ec o n v e r s i o nw a s3 7 5 1 i a b s t r a c t t h ec o n c e n t r a t i o no fd a r a b i t o lw a sg r o w i n g i tp r o v i d e sag o o dp e r s p e c t i v et od a r a b i t o l i n d u s t r y m e a n w h i l ei te s t a b l i s h e df e r m e n t a t i o nk i n e t i cm o d e l si n c l u d i n gs t r a i ng r o w t hm o d e l ， p r o d u c tf o r m a t i o nm o d e la n dm e d i u mc o n s u m p t i o nm o d e l i to b t a i n e dt h em o d e lc o n f i d e n c e i n t e r v a li s8 8 i ti n d i c a t e dt h a tt h i sm o d e lc o u l dr e f l e c tw e l lt h ea c t u a lf e r m e n t a t i o np r o c e s s i th a sc e r t a i ng u i d i n gs e n s ef o rs i m p l eb a t c hf e r m e n t a t i o n k e y w o r d s ：d a r a b i t o l ，g l u c o s e ，d e b a r y o m y c e sh a n s e n i i ，i n f l u e n c i n gf a c t o r ，l a r g e rt r a i n i n g ， k i n e t i cm o d e l s i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：墨豳煎g 日 期：垄里j ：里：容 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名：强龟萌 导师签名： e l 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1d 阿拉伯糖醇的概述 多元糖醇是指糖的还原性羰基经过加氢后生成的一类多元醇，由于加氢作用，这类 多元醇失去了还原性。多元醇主要包括木糖醇( x y l i t 0 1 ) ，山梨糖醇( s o r b i t 0 1 ) ，甘露醇 ( m a n n i t 0 1 ) ，阿拉伯糖醇( a r a b i t 0 1 ) ，半乳糖醇( g a l a c t i t 0 1 ) ，麦芽糖醇( m a l t i t 0 1 ) ，异麦芽糖醇 ( p a l t i n i t ) 等。多元糖醇在机体内的代谢与胰岛素无关，同时又不是口腔微生物的适宜作 用底物而食用不致牙齿龋变，大部分多元醇能量较低，因此是一类重要的功能性食品基 料【。 d 一阿拉伯糖醇作为多元醇的一种，是商业应用中具有较高附加值的新产品。d 邛可拉 伯糖醇是白色晶体，有甜味，旋光度1 3 0 。，熔点1 0 3 ( 2 ，分子式为c 5 h 1 2 0 5 ，分子量1 5 2 1 5 ， 应用于食品、医药j 轻工等方面。它是一种五碳糖醇，是木糖醇和核糖醇的同分异构体， 三者的化学结构如下【2 1 ： h z o h h ，co h h z - c o h ii h o h c d h h 伽h ili h _ ( 1 - o h h 0 一c - h h o _ ( 、_ h l l h _ ( 、- o h h _ ( 、- o h h o _ ( 、- h ll h r c o hh ，_ co hh r c 旬h d 阿拉伯糖醇小糖醇核糖醇 d 一阿拉伯糖醇的应用较广泛。在食品领域，除用作新型高档食品甜味剂外，d 阿拉 伯糖醇用做食品添加剂还可改善酒精饮料的品质、并可用做调制糖浆的基质等。在医药 领域，是合成一些神经药物的中间体，是重要的医药中间体，广泛用于阿拉伯糖胞苷( 阿 糖胞苷) 、阿拉伯糖腺苷( 阿糖腺苷) 、d 核糖、l 核糖、去氧核糖、l 阿拉伯糖及等的合 成原料、中间体。d 一阿拉伯糖醇可以促进植物的生长、可作为运输介质以通过血脑 屏障。如d 阿拉伯糖醇的衍生物1 ，仁二脱氧一1 ，仁亚胺基d 一阿拉伯糖醇是卜 葡萄糖苷酶的抑制剂，可防治艾滋病。另外，在化工方面，d 邛可拉伯糖醇还是高分子发 泡材料合成过程的激活剂，d 阿拉伯糖醇用做显影材料的稳定剂可以使其于高温环境 长期保存，还可增强铝电容器在高温下的可靠性以及提高电解质溶液的黏度。d 阿拉伯 糖醇还可以用于亲水涂层或颗粒性固体的溶解。因此作为一种新产品备受人们的关注。 1 1 2d 阿拉伯糖醇的生产方法 随着社会的发展和人们生活水平的提高，作为功能性食品添加剂的d - 5 可拉伯糖醇， 由于其可用作低热量非龋齿甜味剂而备受关注，其需求越来越多，主要生产方法有：提 取法、化学合成法及生物、法【引。 江南人! 学硕十论文 自然界中，d 一阿拉伯糖醇多存在于地衣类和蘑菇类中【4 1 ，含量很少，直接提耿不经 济，不但底物昂贵，而且提取困难。目前，国内外的生产主要是化学合成法，即将阿拉 伯糖催化加氢得到d 阿拉伯糖醇，也可将阿拉伯内酯或来苏糖酸还原得到d 阿拉伯糖 醇。该方法直接、副产物少、提取简单但是该方法过程较复杂、生产周期长、设备投资 大、安全要求高、操作费用高、污染较严重、底物来源昂贵等。 鉴于上述两种方法存在的缺点，人们将目光集中在生物法。其中包括生物发酵法和 细胞转化法。生物发酵法主要是利用产d 阿拉伯糖醇的微生物发酵葡萄糖、果糖、蔗 糖、废糖蜜等物质，研究最多的底物主要是葡萄糖，其来源广泛并廉价【5 1 。该方法具有 工艺简单、生产成本低等优点，但是无菌要求高、产量低、副产物多、提取困难等缺点。 细胞转化法，是在发酵的基础上出现的，将微生物培养到一定数量，取细胞加入到碳源 ( 包括葡萄糖、蔗糖等常见糖类) 中利用细胞中的酶系将其催化产生d 邛可拉伯糖醇。该方 法具有转化反应设备与操作要求低、反应液成分单一提取简单等优点【2 】，但其操作复杂。 1 1 3d 阿拉伯糖醇发酵法国内外研究动态 目前，国内外对d 阿拉伯糖醇的研究主要是作为制备木糖醇的中问体。因为木糖 醇具有优良的生理、生化及生物学性质。木糖醇甜度高，溶解热较高，作为甜味剂有口 感清凉的特点，加热不易变色，可使食品保持色泽鲜艳；木糖醇不是微生物代谢的良好 碳源，用于食品生产可食品的保臧期；木糖醇作为人体的营养物质，不能被口腔微生物 利用，并能抑制口腔中多种链球菌、乳酸杆菌的繁贿，有洁净口腔，保护牙齿、防治龋 齿的特殊功能；木糖醇对细胞没有毒性，可以透过细胞膜而成为组织的营养物，可减少 胰岛素的分泌，因此，是糖尿病人的辅助治疗剂和营养甜味剂，被成为“人类新能源”； 木糖醇输液比葡萄糖输液血液成分更稳定，是一种理想的输液剂；木糖醇还是良好的护 肝药物。同时，木糖醇还具备类似甘油和多元醇的许多优异特性，因而广泛用于国防、 医药、化工、皮革、涂料以及食品等行业【6 7 1 。 1 9 6 6 年，o n i s h i 等报道以葡萄糖为底物经d 阿拉伯糖醇到木糖醇的三步发酵法【8 j ， 可以看出由葡萄糖到d 阿拉伯糖醇的发酵法是可行的。随后国内外对d 阿拉伯糖醇的 发酵法产生了极大的兴趣。关于这方面报道很多，许多成果申报了专利1 9 7 1 。 国内，对d - 5 可拉伯糖醇的报道较少。周海平从数株酵母中得到一株高产d 阿拉伯 糖醇的酵母，并对其发酵条件进行研究得到高产d 阿拉伯糖醇的最佳条件取得了具有 参考价值的结果【l 引。贺娟等利用分子克隆技术对产d 一阿拉伯糖醇的酵母进行血红蛋白 基因的表达来提高d 阿拉伯糖醇的产量及底物转化率【l9 1 。蔡莉等分离得到一株利用葡 萄糖发酵产d 阿拉伯糖醇的菌株k o d a m a e ao h m e r i ，首次发现该属酵母能够产d - 5 可拉伯 糖醇【2 0 】。 国外，对该发酵法生产d - 5 可拉伯糖醇研究很多，主要在产d 邛可拉伯糖醇的微生物、 发酵条件及发酵方式上进行研究，目的在于提高产物的浓度以及底物的转化率。其中具 有代表性的为，o n i s h i 等筛选一株利用葡萄糖生成d - 5 可拉伯糖醇的酵母d e b a r y o m y c e s 属，其为d 一阿拉伯糖醇的发酵法开辟了新的方向 8 】。随后，得到很多种酵母能够生产 d 阿拉伯糖醇，包括：p i c h i a 属 2 1 乏3 】、s a c c h 口r a m y c e s 属【2 4 1 、h a n s e n u l a 属【2 5 1 和 2 第章绪论 z y g o s a c c h a r o m y c e s 属【2 6 27 1 。同时，对发酵条件的发酵的影响进行深入的研究，如h a j n y 等分别对d 邛可拉伯糖醇发酵的影响因素温度、碳源、氮源、通气等进行研究，得到发 酵的主要因素，为以后的研究打下有利的基础【2 引。还有一些研究者主要集中于发酵方式 上的研究，h i r o y u k i 等分批发酵过程中采用分阶段来控制温度、氮源及底物浓度，为研 究者提供了可取的经验【3 0 】。此外，d 阿拉伯糖醇的分批发酵、分批补料发酵以及连续发 酵均有研究，还利用分子手段对生产d 阿拉伯糖醇的菌株进行基因工程菌的构建。因 此，国内应该重视d 一阿拉伯糖醇的生产和研究。 1 2 产d 阿拉伯糖醇微生物 1 2 1 微生物代谢途径 微生物代谢产生d 阿拉伯糖醇和木糖醇是经过代谢途径中的磷酸戊糖途径( p p p ) 。 本课题是以葡萄糖为底物，通过d 5 可拉伯糖醇为中间产物，再经过菌体转化将d 阿拉 伯糖醇转化为木糖醇【婚】。葡萄糖通过e m p 途径到6 一磷酸葡萄糖酸，进入p p p 途径，转 化为5 磷酸核糖再到核糖，在n a d ( p ) h 依附的阿拉伯糖醇脱氢酶( d h x ) 催化下还原为 d 一阿拉伯糖醇，d 邛可拉伯糖醇转化为木酮糖，这种酶为a r d h 依附n a d h ，木酮糖被木 糖醇脱氢酶( x d h ) 催化为木糖醇1 3 ，同时这条途径的另一条支路会产生甘油、乙酸、乙 醇，这些作为副产物【3 2 】。其葡萄糖生成d 阿拉伯糖醇和木糖醇的代谢途径如图1 1 3 3 1 。 o 6 磷酸葡萄糖酸 图1 1 微生物由葡萄糖经d 阿拉伯糖醇到木糖醇代谢图 f i g 1 一l m e t a b o l i s mc h a r to f m i c r o o r g a n i s mf r o mg l u c o s et ox y l i t o lt h r o u g hd a r a b i t o l 注：图中双线箭头为主代谢途径，椭圆形为主要产物，方框为副产物。d h x 为阿拉伯糖醇脱氢酶； a r d h 为阿拉伯糖醇水解酶；x d h 为木糖醇水解酶 3 江南人! 孑：硕十论文 由上图呵以看到由葡萄糖到d 阿拉伯糖醇为该途径的关键，是得到能发酵葡萄糖 生成d 阿拉伯糖醇的微生物，也是说是山葡萄糖到木糖醇的关键步骤。 1 2 2 产d 阿拉伯糖醇的微生物 采用发酵法生产d 阿拉伯糖醇的主要底物是廉价的葡萄糖，文献报道【3 4 】能够利用 葡萄糖产生d 阿拉伯糖醇的微生物大多是耐高渗酵母。其具体菌株见表1 1 。 表1 1 发酵葡萄糖产阿拉伯糖醇的菌株 t a b 1 - 1t h es t r a i n so f p r o d u c i n ga r a b i t o lf e r m e n t a t i o ng l u c o s e 竺竺竺竺竺婴兰竺兰= ! ! ! ! h a n s e m t l a m e t c h n i k 0 1 4 ，i a e n d o m y c o p s i s h a n s e n u l a d e b a r y o m y c e s h a n s e n u l a ，。发荔： 4 0 0 栅1 恕：啬：鬣裟觜 驰絮一 宅簧i 盅普搿燃裟三嬲 拗唧仰叩4 0 0 h i r o y u k i p r o d u c t i o no f d - a r a b i t 0 4 l7 b 删y r e l l k a t t j i tm e i c i i t a r oi ar e t t l ( a t t l na ji 。l i l 斗，6 ，一。 e n d o m y c o p s i s 咖栅 2 0 0 s a h a 岂燃燃砌r o d u 砒c t i o n 产b 9 y l p 也o l y 删m o r p 乡h a 1 5 0 。j a v i e r 硼氅a n s 帅e n 。u l ? a 阳p 断o l ! y 0 m 唧o r p l l a 帮辩时 打 伊誓 1 5 5h i m s h i c r o m 引p r o g d i u c t i o n 1 8 】o f a n s e n l t u c o s e 、y “的i f r o m 力g i。1 胁删胁a n o m o 胁1 0 0蝴 i ， 微生物分步转1 ：j 鬻i 尊生产椭嗍 2 0 0 蔡莉 1 株产阻阿嚣算株的分离筛 由葡萄糖到d 阿拉伯糖醇的反应式： d g l u c o s e + a t p + n a d ( p ) + + h e o _ d - a r a b i t o l + a d p + p i + n a d ( p ) h + c 0 2 其葡萄糖的理论转化率为8 3 3 。将文献报道的菌种发酵产d 邛可拉伯糖醇的情况比 较见表1 2 所示。 表1 - 2 不同菌种发酵产d 阿拉伯糖醇的比较 t a b i 2t h ec o m p a r i o no fd i f f e r e n ts t r a i n sf e r m e n t a t i o np r o d u c e dd a r a b i t o l 菌种 文献鬻n 祭嫠豁醇底鬻转专赫尹 h a n o m a l a 周海平，2 0 0 0 1 4 04 5 94 5 90 3 1 9 k o h m e r i zr o u x i in i u u 2 7 6 2 4 m r e u k a “矗f a j l 4 7 8 7 h p o l y m o r p h a d s m7 0 2 7 7 p o h m e rn o 2 3 0 d h a n s e n i fa t c c 2 0 2 1 2 e c h o d a t i 蔡莉，等 2 0 0 9 b a d a lcs e t a 1 ，2 0 0 7 n o z a k ih e t a 1 ，2 0 0 3 j a v i e r ee t a i 1 9 9 0 m o n a c e l l ，e t a 1 1 9 7 1 o n i s h ihe t a l 1 9 6 9 h a j n y gje t a 1 1 9 6 3 8 2 2 8 3 4 8 1 4 1 8 8 4 3 1 5 5 5 7 4 0 6 4 7 7 4 0 7 0 1 4 4 3 3 4 2 4 3 4 1 1 2 8 0 3 4 8 0 7 0 l 0 3 1 3 0 4 4 8 o 1 5 7 0 3 5 4 由上表可以看出，不同菌种之问的产物合成能力相差较明显，生产效率差别较大， 4 住 瑚 m 眵 第章绪论 实际葡萄糖的转化率最多的只有理论转化率的一半，主要是葡萄糖的一部分用来生产 a t p ，用来菌体的生长与代谢。因此，如何提高底物葡萄糖的转化率显得尤为重要。 1 3d 阿拉伯糖醇生产菌的筛选方法 筛选产d _ 5 可拉伯糖醇菌株的方法主要基于d 阿拉伯糖醇的如下特性：d 阿拉伯糖 醇是一种胞外代谢产物，他可以分泌到菌体外的培养基中，与底物葡萄糖混合在一起， 因此只要选择一种方法来分离开底物葡萄糖和产物d 一阿拉伯糖醇，并且能够检测到两 者即可。常见的分离检测方法是层析i ! 去【3 4 , 3 5 】，主要为高效液相色谱法居多，但是作为灵 敏的方法对于菌体的初筛而言具有效率低的缺点，有文献【3 4 表明纸层析可以分离糖、醇 并采用一定的显色方法即可检测到底物和产物，并且具有效率高的优点，因此可以作为 菌体初筛的方法来定性筛选d 阿拉伯糖醇的产生菌。 1 4 影响酵母生产d 阿拉伯糖醇因素 酵母发酵葡萄糖产d 阿拉伯糖醇的调节因子包括：葡萄糖初始浓度、p h 值、氮源、 温度、通气量、菌体浓度、乙酸以及生物素等掣2 3 3 6 j 。 葡萄糖的起始浓度对酵母坐产d 阿拉伯糖醇影响很大，j a v i e r 等发现h a n s e n u l a p o l y m o r p h a 在葡萄糖浓度从2 增加到1 5 时，d 阿拉伯糖醇的产率增加p7 1 。同样的现 象也在h i r o s h i 等发明的专利2 9 8 6 4 9 5 中得以体现。d 阿拉伯糖醇的积累和葡萄糖的关 系是底物发酵液中的渗透压高导致酵母菌体产生一定多元醇来维持自身的代谢p 8 1 ，但是 不同的渗透压所产生多元醇种类和量不同，因此在发酵过程中要控制一定的渗透压。 在葡萄糖发酵时，通常酵母的菌体浓度在1 8 9 l - - 一3 0 9 l 范围内。在一定的菌体浓 度下，一部分用作菌体的生长，一部分用于代谢产生d 阿拉伯糖斟2 1 。低的菌体浓度会 导致发酵时问的延长，副产物的产生，不利于发酵的进行。虽然高的菌体浓度可以发酵 高的起始葡萄糖浓度，产生较高浓度的d - 5 可拉伯糖醇，但是底物葡萄糖的有效利用率 不是很高，要一部分用于菌体的生长，因此在发酵过程要控制菌体在一定的浓度范围内。 细胞问的p h 值对葡萄糖代谢过程和产物的形成也有很大的影响，这表现在酵母发 酵葡萄糖时介质的p h 值对产率影响很大。通常在p h 值为3 0 - - 5 5 酵母生长最好。不 同酵母生产d 邛可拉伯糖醇的最适p h 值不同，对于m e t s c h n i k o w i ar e u k a u f i fa j l 4 7 8 7 来 讲d 邛可拉伯糖醇产率最大的最佳p h 值为5 0 【3 0 l 。 温度也是影响酵母代谢、生长及发酵能力的一个重要参数。酵母最适生长温度为2 5 - 3 0 ，极限温度为o - - 4 7 ，在温度升高时，葡萄糖发酵成d 阿拉伯糖醇会受到 刺激，也有酵母的生长和产物的生产所需要的最适温度不一致，这就需要进行分阶段控 制。h i r o y u k i 等发现m e t s c h n i k o w i ar e u k a u f i fa j l 4 7 8 7 在2 5 - 3 3 下随着温度的升高， d 阿拉伯糖醇的产率增加。微生物的生长和发酵所需的温度可能不同，故在发酵的生长 和发酵阶段来控制不同的温度，使d 邛可拉伯糖醇的产率有一定的提耐3 0 1 。 氧是葡萄糖代谢中的另一个重要参数，氧在葡萄糖的代谢过程中的生理生化作用已 经很清楚，其涉及到能量a t p 及辅酶n a d ( p ) + 的产生。在有氧的情况下，酵母的生物 量较高，但在厌氧条件下，大量的葡萄糖转化为副产物乙醇。一种解释为氧在辅酶的产 5 些塑厶堂堡堡塞 生和葡萄糖的起始利用阶段起作用。d 一阿拉伯糖醇脱氢酶足与n a d ( p ) + 相偶联的。在有 氧的条件下，有大量的n a d ( p ) + 积累，这致使d 一阿拉伯糖醇脱氢酶被激活，因而会导 致d 阿拉伯糖醇的积累。实际上，在增加通气量时e n d o m y c o p s i sc h o d a t i 生产d 一阿拉伯 糖醇的量增加【2 9 1 。同时可还发王见搅拌也会影响转化率，它是通过提高氧的传递速率来影 响溶氧。j a v i e r 发现h a n s e n u l ap o l y m o r p h a 在转速5 0 0 r m i n - - - 1 0 0 0 r m i n 范围内有利于 d 阿拉伯糖醇的生产。这表明d 阿拉伯糖醇的生产与搅拌转速也就是与通气量相关【3 7 】。 培养基中的成分对酵母生产d 阿拉伯糖醇具有一定的影响，h i r o s h i 在专利2 9 8 6 4 9 5 中证明了氮源也是影响一些酵母发酵葡萄糖生产d 邛可拉伯糖醇的因素之一。当用酵母 膏或者尿素作为氮源时，培养出来的酵母产醇能力最强】。同时多元醇的产率与碳源、 氮源的比值相关，培养基中低的氮源有利于多元醇的生成。 影响菌体生长和产物合成的因素很复杂，需要逐个讨论。 1 5 立题意义 人们生活水平的提高和保健意识的增强，使具有特殊功效的木糖醇倍受人们的关 注。而以前研究的是以木糖为底物，用化学催化法来转化为木糖醇，该方法具有许多缺 点，因此人们从不同的角度来生产木糖醇，以此避免生产过程中的缺点，完善木糖醇的 生产，得到更高的商业价值。从生产木糖醇的底物出发，用廉价易得的葡萄糖来代替昂 贵难得的木糖，经过中问产物d 阿拉伯糖醇来生产木糖醇的生物方法引起人们的重视， 因而得到高浓度的d - 5 可拉伯糖醇是木糖醇生产的关键前提。 菌种是发酵工程的灵魂，是以葡萄糖为原料发酵生产d 阿拉伯糖醇关键之一，同 时高效利用葡萄糖且合成高浓度d 阿拉伯糖醇是目前研究的热点。研究表明，在发酵 葡萄糖生产d 一阿拉伯糖醇研究中，存在产物的浓度并不高一般在5 0 9 l - - - 8 0 9 l ，葡萄 糖的转化率也远远低于理论水平且生产效率不高等缺点，因此，得到高产菌株来提高发 酵能力成为目前研究和丌发的重中之重。本课题f 是基于上述缺点来展丌研究的。 1 6 研究内容 本课题旨在得到能发酵葡萄糖高产d 阿拉伯糖醇的微生物并得到其发酵的主要因 素。课题主要研究内容如下： ( 1 ) 从耐高渗酵母中筛选出一株能利用葡萄糖，且高产d - 5 可拉伯糖醇的酵母作为 实验菌株，并且进行鉴定，作为下一步的前提菌株； ( 2 )以筛选得到的产d 邛可拉伯糖醇的原始菌株作为研究对象，通过对其发酵影响 因素的分析，得到主要影响因素，目的是提高发酵过程的产物浓度和底物转化率； ( 3 ) 在上述研究的基础上，对该菌体进行扩大培养发酵，为d 阿拉伯糖醇工业化 生产奠定基础； ( 4 ) 建立分批发酵的动力学模型，对实际发酵起到指导作用。 6 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 菌种 耐高渗酵母， 2 1 2 主要试剂 葡萄糖 蛋白胨 酵母膏 琼脂 尿素 v m 磷酸二氢钾 七水硫酸镁 苯酚 正丁醇 硝酸银 丙酮 氢氧化钠 酒精 氨水 浓硫酸 三氯乙酸 一飘u 叹 2 1 3 主要仪器 第二章材料与方法 本研究中一t l , 筛选并保藏。 口服 生化试剂 生化试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 山东西王生化科技有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海试剂一厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 j y 2 5 0 2 型电子天平 电热恒温培养箱 恒温干燥箱 高压蒸汽灭菌锅 h y g 1 1 型回转式摇床 s h z 3 型水循环真空泵 高效液相色谱仪a g i l e n th p1 10 0 系列 s h l 0 1l 液相色谱柱 7 2 1 型分光光度计 c r 2 2 g 高速冷冻离心机 s b a 4 0 c 生物传感分析仪 7 上海精密科学仪器有限公司 上海森信实验仪器有限公司 江苏连云港墟沟电器厂 上海申安医疗器械有限公司 上海欣芯自动化设备有限公司 河南省巩义市仪器厂 美国惠普公司 s h o d e x 上海第三分析仪器厂 t h e r m oi e c ，i e cm u e t i r f 山东省科学院生物研究所 江南人学硕：十二论文 梅特勒s 4 0 k 酸度计 15 l 发酵罐 m e t t l e rt o l e d o 浙江新昌德力石化设备有限公司 2 1 4 培养基 2 1 4 1 y e p d 复苏培养基( g l ) ：葡萄糖2 0 ，蛋l h n , 东2 0 ，酵母膏1 0 ，琼脂2 0 ，p h 自然。 2 i 4 2 斜面培养基：同上y e p d 。 2 1 4 3 发酵培养基( l ) ：葡萄糖2 0 0 ，蛋白胨2 0 ，酵母膏l o ，尿素2 ，v b l 0 5 ，磷酸 二氢钾3 ，七水硫酸镁2 5 ，p h 自然。 2 1 4 4 种子培养基( l ) ：葡萄糖5 0 ，酵母膏o 1 ，磷酸二氢钾3 ，七水硫酸镁2 5 ，p h 自然。 2 1 4 5 发酵培养基( l ) ：葡萄糖2 0 0 ( 单独灭菌) 酵母膏1 0 ，七水硫酸镁2 5 ，