（植物学专业论文）古尼虫草液体深层发酵及化学成分的研究.pdf

古尼虫草液体深层发酵及化学成分的研究 摘要 本文以产于湖南浏阳市的古尼虫草【c o r d y c e p sg u n n i i ( b e r k ) b e r k 及深层发酵的古尼虫草菌丝体为实验材料，利用菌种分离技术，液体深层 发酵、p c r 、柱层析、纸层析、紫外、红外光谱技术和化学反应等手段， 对古尼虫草菌丝体液体发酵培养条件及部分化学成分进行了研究，主要包 括以下内容：古尼虫草液体种子培养基及培养条件的筛选，发酵罐深层发 酵生长曲线的测定，古尼虫草子座和古尼拟青霉( p a e c i l o m y c e sg u n n i i ) i t s 序列的分析，菌丝体多糖的分离纯化及结构测定，古尼虫草的碱涪 生多糖、 甘露醇的提取方法及含量研究，获得了如下结果： 1 优化筛选出了古尼虫草菌丝体最适液体种子培养基和最佳培养条 件，培养基配方为：豆汁2 0 、蛋白胨1 、葡萄糖2 、硫酸镁1 、 磷酸二氢钾o 5 、磷酸氢二钾1 ；用三因素四水平的正交试验，获得 其最佳培养条件：2 6 。c ，转速1 5 0r m i n ，p h 6 ，5 ，时间以5d 为宜。 2 测定了古尼虫草菌丝体发酵罐深层发酵的生长曲线，确定发酵周期 以6 6h 为宜，并根据其生长规律，将其分为四个典型生长时期：生长延迟 期、对数生长期、稳定生长期及衰老期。 3 运用p c r 技术研究了古尼虫草子座和菌丝体的完整的i t s 区 ( r r s l + 5 8 s + i t s 2 ) ，两者的p c r 扩增产物电泳图谱及整个碱基序列完全 一致，i t s l 为2 0 7b p ，5 8 s 为1 5 7b p ，1 t s 2 为2 0 2b p ，可证明本文分离得 到的古尼虫草菌丝体，确为古尼虫草的无| 生型古尼拟青霉；比较了古尼虫 草子座、菌丝与冬虫夏草的i t s 序列，并认为它们具有较近的亲缘关系。 4 古尼虫草菌丝体经热水浸提、醇析、脱蛋白，得到粗多糖，再经 d e a e - 5 2 纤维素柱层析纯化得到纯多糖c g - 1 ，经紫外光谱，柱层析等证 明其为单一成分，纸层析表明其单糖组分为葡萄糖，用高碘酸反应证明其 糖基是以( 1 6 ) 位糖苷键型缩合，红外光谱结果显示c g - 1 具多糖特征 吸收峰，为( 2 1 一吡喃型葡聚糖。 5 用四因素三水平的正交试验确定了以3 5 。c ，加5 倍量的0 7 5 m o l l 的n a o h 溶液浸泡提取古尼虫草菌丝体5h ，为碱溶性多糖的最适提取方 法，从每克菌丝体中提取的多糖最高可含4 1 9 2m g 。 6 古尼虫草发酵菌丝体含有丰富的甘露醇，在每克干菌粉中含量为 6 0 m g ，每克古尼虫草子座中含量为6 1 m g ，每克僵虫体含量达1 0 5m g 。 关键词：古尼虫草，古尼拟青霉，液体发酵，i t s 序列，多糖，甘露醇 s t u d i e so nt h e l i q u i d f e r m e n t a t i o na n d c h e m i c a lc o n s t i t u e n t so f c o r d y c e p sg u n n i i a b s t r a c t 1 1 1 el i q u i df e r m e n t a t i o na n dp a r t i c a lc h e m i c a lc o n s t i t u e n t so f c o r d y c e p s g u n n i if i u i t b o d i e sc o l l e c t e df r o ml i u y f m g h u n a na n di t sc u l t u r e dm y c e l i u mw e r e s t u d i e d b y m e a n so ft i s s u e i s o l a t i o n ，l i q u i df e r m e n t a t i o n ，p c r , c o l u n m c h r o m a t o g r a p h y , t l ca n ds p e c i n t mt e c h n o l o g y , w h i c hi n c l u d i n gf i d d l i n go f c u l t u r ec o n d i t i o no fc g u n n i i ，d e t e r m i n i n gt h eg r o w t hs u r v e yo ft h es p a w n , a n a l y z i n gt h ei t ss e q u e n c eo fc g u n n i ia n dp a e c i t o m y c e sg u n n i i , s e p a r a t i n g ， p u r i f i c a t i o na n ds t r u c t u r a la n a l y z i n go fp o l y s a c c h a r i d em y c e l i ao fcg u n n i i ， e x t r a c t i n go f a l k a l is o l u b l ep o l y s a c c h a r i d ea n dm a n n i t o la n dt h e i rc o n t e n tt h e r e s u l ts h o w e da sb e l o w ： 1 l eo p t i m u m l i q u i d f e r m e n t a t i o nm e d i u mo f c o r d y c e pg u n n i iw a sp o t a t o j u i c e2 0 ，p e p t o n e1 ，g l u c o s e2 ，m a g n e s i u m s u l f a t e o 1 ，p o t a s s i u m d i h y d r o g e np h o s p h a t e0 0 5 d i p o t a s s i u mh y d r o g e np h o s p h a t e o 1 t h e o p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n so fcg u r m w a si n v e s t i g a t e db yt h eo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t i nt h r e ef a c t o r sa n df o u rl e v e l s ，t e m p e r a t u r ew a s2 5 2 6 ，r o t a t i o n r a t e1 5 0 r m i n ，p h 6 5a n dc u l t u r ep e r i o d5d a y s 2 f o u r t y p i c a lg r o w t hp e r i o d si n t h es p a w n o f l i q u i df e r m e n t a t i o n w e r e s t u d i e d ：t h ep e r i o do fg r o w t hh e s i t a t i o n ，t h er a p i dg r o w t hp e r i o d ，t h eg r o w t h s t e a d yp e r i o da n d t h eo l dp e d o d w e g o t ab e s tf e r m e n t a t i o n p e r i o d o f 6 6h o u r s 耵t 3 t h ei n t e r n a lt r a n s c f i b e ds p a c e r ( i n c l u d i n gi t s l ，i t s 2a n d5 8 sr d n a g e n e ) o f n u c l e a rr i b o s o m a ld n af r o mt h es l r o m aa n d m y c e l i u mo fc g u n n i i w e r e a m p l i f i e db y m e a n so fp c r t e c h n o l o g y t h e p c r p r o d u c t s e l e c t r o p h o r e t i cp a r e r n s a n dn u c l e o t i d es e q u e n c ew e r e c o m p l e t ec o n c o r d a n t ，t h e s e q u e n c e so f i t s lw a s 2 0 7 b p i ns i z e ，5 8 sw a s1 5 7b pa n di t s 2w a s2 0 2 b p t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ea s e x u a l s t a g e o fcg u n n i iw a st h ei s o l a t e d m y c e l i u m ，n a m e l yp a e c i l o m y c e sg u n n i i t h es e q u e n c e so fc o m p a r i s o ni t so f s t r o m aa n d m y c e l i u mo f c g u n n i ia n dc o r d y c e p s s i n e n s i s ，s h o w e dt h a tt h e yh a d ac l o s e p r e d e s t i n e dr e l a t i o n s h i p 4 c r u d ep o l y s a c c h a r i d ew a so b t a i n e df r o mt h ec u l t u r e dm y c e l i u mo fc g u n n i ib y e x t r a c t i o nw i t hh o tw a t e ra n d p r e c 蛐i t a t e db y a l c o h o l ，t h e p r o t e i n s i i li t w a sr e m o v e d b ys e v a g em e t h o d ，i n d i v i d u a lc o n s t i t u e n tc g - 1w a si s o l a t e da n d p u r i f i e db yd e a e - 5 2c h r o m a t o g r a p h y i t sh o m o g e n e i t yw a sv e r i f i e db yu v s c a na n d c h r o m a t o g r a p h y ，t l cs h o w s t h a tc g - 1w a s c o m p o s e db yg l u c o s eo n l y t h er e a c t i o no f p e r i o d i ca c i ds u g g e s t e dt h a tt h es u g a rr e s i d u eb ei n t e r l i n k e db y1 _ 6b o n d s t h er e s u l to fi r s p e c t n m a s h o w st h a tt h e r ew a st y p i c a l c h a r a c t e r i s t i c a b s o r p t i o np e a k so fp o l y s a c c h z a i d e sa n daq p y r a n o g l u c a ni i l c ( 1 5 t h e o p t i m a l e x t r a c t i v et e c h n o l o g yo f a l k a l is o l u b l ep o l y s a c c h a r i d ef r o m m y c e l i u mw a sd e t e r m i n e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n ti nf o u rf a c t o r sa n dt h r e e l e v e l s ，t h et e m p e r a t u r ew a s3 5 。c ，m a r i n a t e di n5m u l t i p l ev o l u m e0 7 5m o f l n a o hs o l u t i o nf o rsh o u r s am a x i m u me x t r a c t i o no f4 1 9 2m g gh a sb e e n o b t a i n e d 6 t h e r ew a s p l e n t y o f m a n n i t o li nt h ec u l t u r e d m y c e l i u m o f c g u n n i i ， i v t h es u mo f m a n n i t o lw a s6 0 m g g ，t h es d ：o m a w a s6 1m g g ，t h es c l e r o t i , n nw a s 1 0 5 m g g k e yw o r d s ：c o r d y c e p sg u n n i i ，p a e c i l o m y c e sg u n n i i ，l i q u i df e r m e n t a t i o n ， i t s s e q u e n c e ，p o l y s a c c h a r i d e ，m a n n i t o l v 引言 虫草是一类十分重要的药用真菌，是寄生于昆虫体上的真菌与其寄主 昆虫形成的虫菌复合体，按目前分类系统隶属于子囊菌门( a s c o m y c o t a ) ， 核菌纲( p y e n o m y c e t e s ) ，麦角菌科( c l a v i c i p i t a c e a e ) ，虫草属( c o r d y c e p s ) 。 据统计，到目前为止，国内正式报道的虫草菌共有6 0 余种”j ，大多具有长 而直立、有柄的棍棒状子座，子座上密布可孕的子囊壳。冬虫夏草作为一 种名贵的中药材，以全草入药，现代医学认为其主要功效为保肺肾、补精 髓，化痰止咳，多用于肺肾两虚症，中医多用来治疗肺结核，老人畏冷、 咳嗽、衰弱，产妇及老人贫血，遗精，阳萎，自汗盗汗，腰膝酸痛，神经 衰弱，病后久虚，咯血吐血，慢性肾炎等吲。具有药用价值的虫草菌包括： 冬虫夏草( c o r d y c e p ss m e n s 西) ，蛹虫草( cm i l i t a r i s ) ，亚香棒虫草( c h a w k e s i i ) ，蝉花( cs o b o l i f e r a ) ，巴西虫草( cb r a s i l e n s i s ) ，古尼虫草 ( c ，g t l n n # ) 等。这些虫草的化学成分及药理作用与冬虫夏草相似，可替 代冬虫夏草入药，但另外一些则有毒副作用，不可入药h 。 1 药用虫草真菌的化学成分 1 1 虫草多糖类 虫草属真菌的子座、僵虫体、菌丝体及发酵液中均含有多糖，李晓明 等对冬虫夏草发酵液中多糖研究表明，其组分摩尔比为甘露糖：半乳糖：葡 萄糖= 1 1 5 ：o 8 5 ：1 【4 】。m i y a z a k i 等研究发现冬虫夏草子座经热水提取的水 溶陛胞外多糖c s 1 ，是一种高分支半乳甘露聚糖，由含甘露糖原和含有分 支的半乳糖低聚物组成【5 】。k i h o 测得另一种多糖c t - 4 n ，分子质量为 2 3 0 0 0 d a ，是一种含少量蛋白质的半孚l - l t 露聚糖【6 】。华巍巍等从采自青海玉 树的天然虫草中分离得到的虫草头孢菌菌丝体的胞内多糖中，还发现含有 山梨糖和岩藻糖等单糖f 7 1 。y a m a d a 等人从大团囊虫草中得到的种水溶性 葡聚糖c o 1 ，分子质量为4 1 2 0 0 0d a ，由( 1 3 ) 连接的1 3 _ d - 吡喃葡萄糖 组成骨架【引。古尼虫草无性型古尼拟青霉菌丝体中多糖的总含量约为1 ， 胞外多糖是讲相对分子质量为2 0 0 0 0d a 左右的葡聚糖，胞内多糖则含5 个组分，其中两个分子质量为5 0 0 0 0d a 和1 0 0 0 0d a 的多糖也是葡聚糖例。 蛹虫草菌丝体培养液中提取的水溶性粗多糖经分离纯化，得到一种含有少 量蛋白的半乳甘露聚糖c i v i - i ，分子质量为2 7 0 0 0d a ，糖组成摩尔比为半 - 孚l n ：甘露n - - - 6 ：5 z o l 。 1 2 氨基酸类 不论是天然虫草还是人工虫草菌丝，均含有丰富的氨基酸1 2 j 。张甲生 等人的研究结果显示，柞、桑蛹虫草与冬虫夏草3 种虫草中1 7 种游离氨基 酸总量分别为每1 0 0 克中含有4 2 5 5 7m g 、1 6 0 8 5m g 和1 8 7 5 5m g ，比王浆 高1 9 6 8 倍，其中1 1 种人体必需、半必需氨基酸和1 0 种药用氨基酸含 量较高1 。蛹虫草含有1 8 种氨基酸，种类齐全，且含量很高，每1 0 0 克 中总量可达l11 4 5m g 。每种氨基酸含量也较高，最高的是谷氨酸和天门冬 氨酸，其中人体必需的8 种氨基酸含量较高，比例适当【1 2 】。孟祥贤等检测 了古尼虫草子座、僵虫体、菌丝体中1 7 种氨基酸的含量，并且表明菌丝体 中氨基酸的含量最高1 1 3 1 。 1 3 糖醇和甾醇类 1 9 5 7 年c h a t t e r i j e e 等报道从中国虫草分到甘露醇( d - m a n n i t 0 1 ) 1 4 1 ， 冬虫夏草虫草酸( 即d - 甘露醇) 的含量大约为7 2 9 c j ，不同生长期 的冬虫夏草子座中甘露醇的含量不一样。从冬虫夏草及人工虫草发酵物中 共分离鉴定到9 个甾醇及其衍生物，其中包括麦角甾醇、麦角甾醇过氧化 物、胆固醇、6 谷甾醇 16 】等。从人工虫草中分离得n a 3 麦角甾醇、胡萝卜 甙、菜油甾醇、二氢菜籽甾醇旧。苏亮等首次从人工虫草头孢菌丝体中分 离得到黄豆醇b ( s o y a s a p o g e n o l b ) 1 8 1 。 1 4 核苷类化合物 至今已从虫草及发酵菌丝中分离鉴定有1 1 个核苷类化合物，是其活性 成分。包括腺嘌呤、腺昔、尿嘧啶、尿苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷、胸腺 嘧啶【1 9 、2 0 1 。在5 0 年代自蛹虫草人工培养液的菌丝分离出虫草素 ( c o r d y c e p i n ) ，化学结构为37 一脱氧腺苷( 3 ，- d e o x y a d e n o s i n e ) 2 1 o1 9 9 4 年解军等首次用高效液相色谱法( 玎) l c ) 直接定量测定了正品冬虫夏草中 虫草素的含量阱1 。姜泓等从人工蛹虫草子实体中分离出n 6 甲基腺苷 ( n 6 - m e t h y l a d e n o s i n e ) ，0 5 _ 乙酰基虫草素( 0 5 - a c e t y l c o r d y c e p m ) ，柑一 1 3 一 ( 乙酰胺甲酰) 氧乙基】，腺苷( n 6 - o 【p ( a c e t y l c a r b a m o y l o x y ) 】e t h y l ) a d e n - o s i n e ) 2 3 o 邢振荣等采用h p l c 法分别确定了四川产冬虫夏草中尿嘧 啶、尿苷、腺嘌呤、脱氧腺苷等核苷类成分的存在，并测定了它们各自的 含量 2 4 】。虫草不同部位的核苷类化合物含量不同，西藏产冬虫夏草水溶性 核苷成分主要集中在子座部分，僵虫体部分含量甚低【2 j 。 1 5 肽类 从冬虫夏草发酵菌丝中分离鉴定了6 个环二肽类化合物，l 甘l 脯环 二肽、l 亮- l 脯环二肽、l - 缬山脯环二肽、l 丙_ l - 亮环二肽、l 一丙- l 广缬 环二肽、l - 苏山亮环二肽( 此成分首次从天然物中得到) 】。姜泓等从人 工蛹虫草子实体中分离出虫草环肽a ( c o r d y c e p e f i d e a ) 2 3 1 。李兆兰等从冬 虫夏草分离的一株中国弯颈霉，产生种多为环孢菌素( c y c l o s p 0 6 _ n ) 的环 状缩羧肽，是免疫剂和抗真菌齐俨l 。 1 6 有机酸类 冬虫夏草中分离到软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸 等多种有机酸和烷烃类化合物【2 。长链脂肪酸化合物包括3 苯基_ 2 丙烯醛、 3 苯基2 丙烯醇、十八烷、十九烷、1 4 甲基十五酸、十六烷酸、3 一十八烯 酸 2 l 。甘油脂肪酸化合物包括4 甲基2 ，6 二( 1 ，1 二甲乙基) 苯酚、十五烷 酸、9 十六烯酸( z ) 、1 4 甲基十六酸、9 - 十八烯酸_ 2 、i i 二十烯霞铲j 。 1 7 维生素类 每1 0 0 克冬虫夏草中含v b l 2 0 1 2 1 1g 、v a 2 9 1 9u g 、v c 1 1 6 0 3u g ， 每1 0 0 克人工培养菌丝含v b l 2 0 2 7p - g ，且含v b l 、v m 、v c l 2 6 】。张显科 等测出蛹虫草含有多种重要的维生素，其中v e 和v b 6 含量最高，v m 和v m 2 也较高1 1 2 j 。 1 8 无机元素 虫草所含微量元素十分丰富，已检出3 7 种元素，而蛹虫草已检出3 6 种，以p 的含量为最高，其次为n a 、k 、m g 、m n 、f e 、c u 、z n 。天然虫 草比虫草菌丝体还多镓、钒、锆3 种1 2 j 。 1 9 其他类 冬虫夏草含有各种多胺，除常见的腐胺、精胺，还有1 ，3 二氨基丙烷 ( d a p ) 、尸胺( c a d ) 、类精胺等对细胞生长与分裂起重要生理生化作用 的物质嘲。张显科等测出蛹虫草含有超氧化物歧化酶( s o d ) 5 8 4 u m g p r o 1 2 1 。 2 虫草属真菌的药理作用 2 1 对免疫系统的影响 在s l e ( 系绕性红斑狼疮) 小鼠中，冬虫夏草中的种化合物h 1 a 可抑制淋巴炎，诱导血浆中抗也- d n a 抗体的产生。冬虫夏革能明显加 快机体对血中胶体炭粒的清除速度【2 引，使大鼠细胞内诱生的i - 1 ( 白细胞 介素i ) 、i f n ( 干扰素) 、t n f ( 肿瘤坏死因子) 的含量显著提高【2 9 、3 0 1 。 定剂量的戴氏虫革和粉被虫草菌丝发酵液可以恢复v 射线辐射损伤小鼠 血清溶血素的水平【3 “。 2 2 对心血管系统的影响 冬虫夏草可明显对抗氯化钡引起的麻醉大鼠心律失常，提高豚鼠心脏 哇巴因中毒的耐受量，使麻醉大鼠和豚鼠，1 1 , 率减慢，并俐氐离体心肌收缩 力嗍，延长移植b 脏生存时间1 33 1 ，促进大鼠血小板凝聚而起止血作用 3 4 1 。 冬虫夏草还能促进骨髓红系祖细胞c f u - e 和b f u 也增殖【3 5 】，抑制血管系 膜细胞的增殖，加快p d f g ( 血小板衍生生长因子) 的编程性死亡啪】。 2 3 抗肿瘤作用 虫草素与腺苷结构相似，可代替腺苷参与肿瘤细胞代谢而直接影响肿 瘤细胞的生长繁殖p 7 1 。蛹虫草和冬虫夏草水提液对人连云黑色素瘤b ，6 细 胞、人白血病h l - 6 0 细胞有较好的抗肿瘤效果 3 8 1 。 24 对肝脏及肾脏的作用 发酵虫草菌丝体对静脉注射p a c n e s t l p s 所致的小鼠急性肝功能不全和 d - d a c t o s a m i n e 中毒性肝损伤均有一定的保护作用【2 j 。冬虫夏草有较好的抗 肝硬化效果，腹水消退时间缩短，使血清h b s a g 转阴网。冬虫夏草可抑制 乙肝患者的透明质酸( h c ) 和前胶原i i i ( p c i i i ) 的水平，从而具抗纤维 化作用h 0 】。虫草还可减轻大鼠急性肾小管损伤程度，使其损伤提早恢复 4 ”， 还能调整肾衰病人e t ( 内皮素) 、n o ( 一氧化氮) 的平衡，提高s o d 活 性，保护肾功台俨 。 2 5 促进机体代谢的功能 冬虫夏草水提液能使小鼠空腹血糖浓度显著升高，降低血清胆固醇和 甘油三酯的含型4 3 、州，也能增加肝的供血量从而增加缺铁性贫血小鼠的肝 的能量代谢【4 5 】，使肝中葡糖激酶、己糖激酶、葡糖- 6 磷酸脱氢酶活性增强 j ，有效降低血糖和血浆中胰岛素含量，调节糖类代谢，维持全身葡萄糖 平衡分布i 舫j 。 2 6 抗衰老氧化作用 蛹虫草有明显的拮抗0 2 和组织匀浆产生过氧化脂质的作用，对氧自由 基和羟自由基有明显的清除作用 4 7 1 ，也能使红细胞s o d 活力增强，提示冬 虫夏草具有抗衰老作用【4 8 j 。 2 7 对内分泌系统的影晌 冬虫夏草水提液可使幼年大白鼠精囊增大，显示有雄性激素样作用 4 2 j ， 还可激活小鼠间质细胞产生睾酮孕酮，但含h c g ( 人绒膜促性腺激素) 的 间质细胞的睾酮含量却减少【4 9 、o l 。蚕蛹虫草可使血浆皮质醇及睾酮含量增 高，促进正常及去势大鼠性器官的增殖，有肾上腺皮质激素样作用【5 1 l 。 2 8 抗菌作用 冬虫夏草菌丝体及其发酵液中的抗菌物质为广谱陛的，提取液对葡萄 球菌、链球菌、炭疽杆菌、猪出血性败血症杆菌均有抑制作用【2 】。粉被虫 草菌丝体和孢梗束的浸提液对金色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、 枯草芽孢杆菌及嗜热芽孢杆菌有明显的抑制作用【5 2 】。 2 9 抗辐射作用 虫草的一种次生代谢产物n 6 ( 2 羟乙基) 腺嘌呤核苷随 ( 2 - h y d r o x y e t h y la d e n o s i n e ) 】是第一个生物来源的钙离子拮抗剂，并对辐射 有较好的保护作用【5 3 】。孟祥贤等利用古尼虫草菌丝体培养液、菌丝体和子 实体浸提液培养的苏云金杆菌经紫外辐射后，活菌数依次比对照提耐弼。 3 虫草属l t s 序列研究概述 真菌核糖体脱氧核糖核酸( r d n a ) 中的i t s 区( 内转录间隔区 i n t e m a l t r a n s c r i b d e ds p a c e r ) 的序列测定是以d n a 测序技术为核心的分子标 记分子生物学的鉴定方法之一。r d n a 是编码r r n a 前体的基因，是基因 组d n a 中中等重复并有转录活性的基因家族。i t s 区是位于1 8 s 2 8 sr d n a 之问，它包括进化上高度保守的5 8 sr d n a 和包含有r d n a 前体加工信息 的两个间隔区i t s l 、i t s 2 【5 虬。在r d n a 多基因家族成员中，i t s 区是多拷 贝，以串连重复方式出现在一个或多个染色体基因位点上的，该序列较短 ( 1 k b 以内) ，且i t s l 和i t s 2 两侧都有高度保守序列存在，便于设计引 物，使p c r 扩增变得简单易行，也有利于测序【5 “。w h 矗e 等于1 9 9 0 年设计 了一整套真核生物通用扩增引物，所有这些特性有利于p c r 扩增、测序， 最后用p cg e n e 等程序计算序列问相似性【5 ”。 i t s 区具有通过不等交换和基因转变等方式经历快速一致进化的特 性，使得重复单位在基因组内保持了高度的一致叫刈；i t s 区在不同区域 受到的选择压力不同，因而造成单个重复内部的不同保守陛，适合作遗传 标记，进行种群和同属近缘群及种类的系统发育分析。 虫草属真菌是一种复型真菌，具有子囊孢子阶段( 有性型) 和分生孢 子阶段( 无性型) 两种生活形态1 2 。过去依赖形态和生理生化等表型特征 描述鉴定其无性型，易引起意见分歧，甚至出现了疑难问题。但不管是有 性型还是无性型，其d n a 是一致的，d n a 水平上的分子生物学技术如i t s 序列，就为无性型的鉴定提供了准确的依据，也是当前常规鉴定中的一个 有力补充。 赵锦等【5 8 】以r d n a 的i t s 区为分子指标，采用特异引物l h 2 和d l a 扩 增出了冬虫夏草( 膏陲阶段) 、中国被毛孢( 无性阶段) 、中国拟青霉( 无 性阶段) 、古尼拟青霉( 无陛阶段) i t s l 区的全部序列和5 8sr d n a 的 部分序列。冬虫夏草有性阶i t s l 区共1 8 2b p ，中国被毛孢、中国拟青霉、 古尼拟青霉i t s i 区大小分别为1 8 4 b p 、2 2 3 b p 、2 0 9 b p 。经p c g e n e 和p h y h p 软件分析计算不同种间的遗传距离序数，得出冬虫夏草与中国被毛孢的序 列相似性为9 7 8 ，与中国拟青霉、古尼拟青霉的种间相似性分别为7 2 6 、 7 2 9 9 ，这一结果从分子水平证明了中国被毛孢是冬虫夏草的无性型。 黄勃等确定了2 0 株粉拟青霉的i t s 区序列测定，且根据研究构建的邻 接树推断，粉拟青霉的有性型可能是一种虫草【5 9 1 。 4 虫草发酵研究进展 虫草及其无性型含有丰富的生理活性物质，具有多种药效。一般来说， 虫草菌的活性物质存在于子实体、菌丝体或发酵液中。子实体的获得不仅 牛产周期长，不易大规模工业生产，而且有些虫草蔺目前仍无法人工诱发 子座产生。菌丝体一般通过液体深层发酵生产，生长陕，发酵条件易控制， 真菌细胞在反应器内处于最适温度、酸碱度、氧气和碳氮比等条件下生长， 呼吸作用所产生的代谢废气及时排放，菌丝生长发育迅速，能有目的地获 取高含量的次生代谢产物 6 0 、6 “，这样不仅克服了以上缺点，而且还可以通 过发酵过程的优化控制来定向生产生物活j 性物质，并使得率提高：更重要 的是，产品质量稳定性好，不受原料来源的影响。 世界上最早运用深层发酵技术生产虫草是本世纪5 0 年代初蛹虫革的 发酵，比深层发酵大型食用菌晚4 年。松木繁、i n d i k 、c a r i l l i 等、k n i e f e l 等、吉井常人等均对虫草的液体培养进行了研究。目前已进行工业发酵的 虫草种类有冬虫夏草的无性型中国被毛孢以及从冬虫夏草上分离到的其它 丝孢菌、蛹虫草的无性型蛹拟青霉、蝉花的无j 陛型蝉拟青霉、亚香棒虫草 的无性型霍克斯拟青霉等蹲嗣。 张长铠等将从冬虫夏草上分离到的种棒束孢深层培养的最优条件确 定为：葡萄糖1 5 、麦芽汁1 o 、蛋白胨1 o 、酵母膏0 5 、p h 6 0 、 温度2 39 c 、接种量5 1 0 、摇床转速8 0 9 0r m i n l 6 2 1 。陈传盈等为提高 冬虫夏草深层培养干菌粉得率，蛋白胨和甘露醇的含量，对其培养条件进 行了研究，实验表明：6 的白糖、2 的蚕蛹粉( z k n ) 、1 的酵母粉和 0 - 3 的无机盐添加剂等组成的液体培养基，可获得干菌粉得率4 5 ， 粗蛋白含量 4 3 ，甘露醇含量 8 ，发酵罐小试得到满意结果1 6 5 1 。尚得 静等实验结果表明：冬虫夏草深层培养最适培养条件应为2 4 。c 、2 0 0r m i n 、 p h5 0 左右、接种量5 1 5 ，菌丝生长的最佳氮源为蛋白胨和氨基酸复 合粉，最佳无机盐为磷酸二氢钾，硫酸镁和氯化钙唧】。 江晓路等确定了蛹虫草无性型y 3 液体深层发酵培养基为：土豆汁 2 0 、蛋白胨o 8 、蔗糖2 、磷酸氢二钾o 1 5 、硫酸镁0 0 5 ；培养条 件为温度2 5 2 6 、转速1 2 5r m i n 、接种量为5 、摇床振荡培养4 5 d ， 菌丝平均得率可达1 8 1 6 8 j 。李信等采用二次回归通用旋转组合设计方法发 现，蛹虫草菌丝体液体发酵的最适条件为：接种量6 ( v v ) ，发酵起始 p h7 ，培养基装液量1 0 0 m l 5 0 0l t l l ，发酵温度2 4 2 8 ，发酵周期9 6h 畔i 。 李维光等通过摇瓶单因子和正交试验得出蛹虫草液体培养的最佳条件为： 葡萄糖2 、食用糖1 、酵母膏1 、蛋白胨1 、氯化铵o ，2 、硫酸镁 0 0 5 、氯化钾0 1 r ”1 。 5 真菌多糖的提取、纯化技术 真菌多糖既存在于菌体细胞内，也可以分泌于胞外，它们中绝大多数 都具有调节肌体免疫能力、抗肿瘤与抗辐射等作用。真菌多糖可以从子实 体中分离得到，也可以通过液体发酵的方式从发酵液中提取，还可以从液 体或固体发酵的菌丝体中提取1 7 1 1 。 5 1 子实体多糖的提取 用于多糖提取的子实体通常是干品，在粉碎前应置于6 0 。c 左右的条件 下烘干，宾文等在提取蛹虫草子座多糖之前还用无水乙醇脱脂1 2 h 【，。 子实体粉末通常以热水和稀碱浸提多糖，其温度、稀碱的浓度和用量 等都对多糖的浸出率有影响，热水温度常为9 5 1 0 0 ，稀碱从0 】娃地 1 m o l l 的n a o h 溶液都有人采用p 3 7 4 1 ，在不明显影响浸出率的情况下， 浸出液体积越少越好，当体积一定时，分多次浸提比一次浸提的多糖浸出 率高。 般认为在多糖的提取过程中应尽可能地避免使用酸作为浸提剂，因 为酸对糖苷键有破坏作用，从而影响多糖的提取率p 1 巧】。 浸提液在加多糖沉淀剂之前，一般先中和，再进行适当的浓缩至1 3 甚至1 5 r r ”。沉淀多糖最常用的沉淀剂是乙醇，通常加入3 倍体积的9 5 的乙醇就可很好的沉淀多糖删，也有人认为将溶液的乙醇含量调至7 0 时， 多糖的沉淀最掣7 6 1 。另外也有用硫酸铵、醋酸、氯化钙、甲醇和季铵盐等 沉淀多糖的m l ，由于上述以乙醇沉淀的多糖中还含有较多的蛋白质等非多 糖杂质，因此这种多糖通常叫粗多糖。 去除粗多糖中蛋白质的常用方法是s e v a g 法，用氯仿和正丁醇( 或正 戊醇) 按5 ：l 的比例混合，加入粗多糖溶液中，剧烈震荡后，氯仿使多糖 溶液中的蛋白质变陆，离心除去沉淀于正丁醇( 或正戊醇) 中的蛋白质， 上清液反复加s e v a g 试剂，直至没有蛋白沉淀为止。陈石良等以蛋白酶和 s e v a g 法相结合的方法去除多糖溶液中的蛋白质，降低了多糖的折损，减 少了脱蛋白的次数，提高了效率【7 “。 多糖溶液除去蛋白质后。接下来常常要脱色，常用的脱色剂有活性碳 和h 2 0 2 【7 “。也有人发现以高锰酸钾和亚硫酸钠相结合的方法脱出多糖溶液 的色素比前两种方法效果好1 7 3 j 。 为了分析多糖的分子量、结构和功能等，还需进一步分离纯化以得到 较单一纯正的多糖组分。其方法有溴化十六烷基三甲基胺( c ；a ) 络合 法、离子交换色谱法和凝胶色谱法等，主要是利用多糖分子间或多糖分子 和其它杂质分子间分子量、分子形态和分子带电荷的差异等来使多糖得到 分离纯化f 1 1 。 5 2 胞外多糖提取 真菌类深层发酵物经分离后得到的液体部分含有菌丝体分泌的胞外 多糖。发酵液浓缩后，多糖的沉淀分离纯化与上述子实体多糖的分析方法 是一致的。于溢等在对蛹虫草胞外多糖的提取和纯化试验中，将发酵液以 4 0 0 0 r r a i n 离心1 5 m i n 去残渣，上清液加3 倍9 5 的乙醇沉淀1 0 h ，发现 此时胞外多糖提取率最大f ”。赵明文等在发酵结束后，离心除去菌丝体， 上清液浓缩至原来体积的l 3 ，加3 倍9 5 的乙醇沉淀，6 0 烘干至恒重， 得到虫草多糖粗品 7 8 1 。 5 3 胞内多糖的提取 真菌发酵产物经过过滤或离心得到菌丝体，菌丝体经干燥粉碎后用于 提取胞内多糖。其提取方法与子实体多糖的提取过程基本上是一致的。 黄建忠等将发酵所得的粉被虫草菌丝体用匀浆器打碎，加1 0 倍体积的 蒸馏水，9 6 1 0 0 7 y , 渤n 热浸提3h ，抽滤，滤渣反复浸提3 次，合并滤 液，减压浓缩后加4 倍体积的9 5 乙醇低温沉淀过夜，离心得沉淀，并用 乙醇和丙醇分别洗涤2 次，再透析、脱色，s e v a g e 法除去蛋白，醇析，真 空干燥后得到粗多糖r 7 9 1 。 李汴生等对虫草菌丝体做了各种溶菌破壁实验，发现采用高压均质和 纤维素结合处理可达到很好的破壁效果，菌丝明显断裂，利于有效物质的 提取削。 大量研究表明通过液体发酵产生的菌丝体内的多糖和子实体多糖之间 并没有明显的差异，在某些情况下，菌丝体多糖甚至比子实体多糖要好p ”。 6 古尼虫草的研究概述 f 吁尼虫草是寄生于湖南蝙蝠蛾幼虫的一一种较大型虫草，属虫草属、真 虫草亚属( s u b g e n e u c o r d y c e p s ) 的垂直埋生组( s e c t c y s t o c a r p o n ) ，1 9 8 3 年我国首次报道了古尼虫草阻j ，张志光在1 9 8 5 年对分布于湖南桃江、浏阳 的古尼虫草进行了生活史的研究【跎】。经过多途径和多批次的分离，梁宗琦 在贵州省都匀地区采得的天然古尼虫草标本中，首次分离、确证和报道了 古尼虫草的无性型为古尼拟青霉( p a e c i l o m y c e s g u n n i i ) 新种h 。 古尼虫草是一种复型真菌，具有有性型和无j 陛型两种生活形态。其假 定生活史为：在自然界中古尼虫草成熟子实体通过发射次生子囊孢子，后 经微循环产孢形成分生孢子，或由子囊中进行微循环产孢形成分生孢子这 两个途经感染寄主昆虫湖南蝙蝠蛾幼虫，从虫体空壳头部长出子座，形成 子实体、子囊和子囊孢子，完成有性循环；次生子囊孢子可能不直接侵染 寄生昆虫，发射的次生子囊孢子或分生孢子亦可萌发形成菌丝体、分生孢 子梗、产孢细胞及分生孢子，完成无j f 生循环。一般在人工培养基上，古尼 虫草主要为此种生活形态【2 j 。 目前对古尼虫草的药理、成分和安全性进行了许多实验，发现古尼虫 草能提高机体免疫力，改善和提高记忆力，在常压缺氧条件下对大脑及心 脏有明显的保护作用；并有镇静和镇痛等作用，其强度与杜冷丁相似，但 持续时间更长；还能促进睡眠，缩短入睡时间，睡眠持续时间增长；另外 古尼虫草还有平喘、祛痰及诱生干扰素等作用1 2 】。 古尼虫草的菌丝干粉及水、醇提液急慢性试验均为无毒性、无诱变陛、 无胚胎毒性和致畸作用陬8 4 1 。 7 本文研究的目的和意义 从高等真菌中寻找新药物是目前国际上药物研究的热点，虫草属真菌 是类独特类型的真菌，其中一些种类具有丰富而特殊的生理活性成分和 广泛的药理作用。我国虫草资源丰富，随着虫草属真菌药化、药理的深入 研究，必将带来多层面、多功能的开发应用。 冬虫夏草是一种名贵滋补中药材，但野生资源已受到过度的采掘，而 其生长需要特定的生态环境和寄主昆虫，故资源稀少，远不能满足市场需 求，因此为了解决野生资源过少，药源过度紧缺的状况，研究及人r ：培养 异种虫草，寻求虫草新资源、新品种就显得格外重要，已引起，。1 泛的关注。 而古尼虫草作为湖南和贵州虫草资源的主要种类，因其生理活性物质、 遗传背景、菌种培养及药理毒理学研究不深入，而不能像蛹虫草一样成为 冬虫夏草的代用品，造成了古尼虫草这一丰富的资源不能合理利用开发。 目前的研究工作已发现古尼虫草具有比较明显的药用价值，初步证实其无 毒生和诱变致畸陛，但真正要使其成为冬虫夏草的代用品，还有更多的工 作。 本文在前人研究了生物学特性和生理活性物质的基础上，进一步研究 了古尼虫草的液体深层发酵条件，以期更快大量的获得古尼虫草菌丝体， 并且分析和提取菌丝体和发酵液中的有效成分，为开发利用古尼虫草提供 了理论和技术指导。 二、材料与方法 1 实验材料 古尼虫草 c o r d y c e p s g u n n i i ( b e r k ) b e r k 】，采自湖南浏阳市，由湖南 师范大学真菌实验室鉴定；古尼拟青霉( p a e c i l o m y c e s g u n n i i ) ，从古尼虫 草子实体中分离纯化所得；古尼虫草发酵菌粉。 2 供试试剂与仪器 2 1 培养基( s ) ( ) ：p h 值均为自然 s l ：马铃薯2 0 ( 选取新鲜无芽马铃薯，去皮，切片，加水煮沸3 0r a i n ， 纱布过滤) ，蛋白胨1 0 ，葡萄糖2 0 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 ，k h 2 p 0 40 1 ， k 2 h p 0 40 0 5 ； s 2 ：麦芽汁0 5 ，蛋白胨】5 ，葡萄糖2 0 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 ，k h 2 p 0 4 0 1 ， k 2 h p 0 4 0 0 5 ，酵母浸出膏0 7 5 ： s 3 ：玉米粉0 5 ( 1 2 1 ，o 1 m p a 水解1 5 m i n ，纱布过滤) ，蛋白胨0 4 ， 蔗糖2 0 ，m g s 0 4 7 h z o0 0 2 ，k h 2 p o0 0 4 ，酵母浸出膏0 3 ： s 4 ：酵母浸出膏o 0 4 ，蔗糖5 0 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 0 2 ，k h 2 p o 0 0 4 ， ( n h 4 ) 2 n 0 30 0 4 ，k