（微生物学专业论文）抗性浸矿细菌的选育及抗性机理研究.pdf

博士学位论文 摘要 摘要 本研究选育对重金属等毒性离子具有抗性的高效浸矿菌株，并对 抗性菌株对重金属等毒性离子的耐受能力、耐受机理、抗性相关基因 及基因差异表达、阴离子对细菌的影响等进行研究。用9 k 培养基分 别以f e 2 + 及元素s 作为能源，对来自江西德兴铜矿、湖北大冶铜矿、 广西大厂等多个矿区的矿坑水样本进行了硫化矿浸矿细菌的富集、筛 选、驯化、分离纯化，得到能氧化f e 2 + 及元素s 的纯化菌株。提取纯 化细菌基因组d n a ，通过p c r 聚合酶链反应扩增出其1 6 sr d n a 片段， 测定其1 6 sr d n a 片段的核苷酸序列，用b l a s t 对其1 6 sr d n a 序列进 行比较分析以鉴定选育出的浸矿细菌并构建进化树。在9 k 培养基中 分别加入c u 2 + ，a g + ，h 9 2 + ，p b 2 + ，m 9 2 + 等重金属离子，通过重铬酸 钾滴定法测定培养基中的f e 2 + 浓度来确定所分离的菌株在重金属离 子抑制情况下对f e 2 + 的氧化能力变化并筛选出重金属抗性菌株。对抗 性菌株的最高耐受能力进行测定并在最高耐受浓度时对f e 2 + 的氧化 能力进行测定和分析。对筛选出的重金属抗性菌株进行紫外诱变以获 得具有更高的f e 2 + 氧化能力及更高重金属离子耐受能力的突变菌株。 根据g e n b a n k 中的抗性基因序列自行设计抗性基因引物，对实验菌株 的重金属抗性基因( 抗铜基因、抗砷基因及抗银基因) 进行p c r 扩增、 分子克隆及序列测定，用b l a s t 搜索工具对上述抗性基因进行分析； 对上述抗性基因编码的蛋白质进行分析并构建进化树。在不同铜离子 浓度时对抗铜基因差异表达进行分析并进行铜蓝浸矿实验。在以f e 2 + 为能源的9 k 培养基中加入不同锌盐，研究在同种阳离子存在时阴离 子对浸矿菌株的f e 2 + 氧化能力的影响。 1 6 sr d n a 的序列分析结果表明，本研究的实验菌株均为嗜酸氧 化亚铁硫杆菌( a c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ，简称为a t f e r r o o x i d a n s ) 。 实验菌株对重金属离子的耐受能力测定结果表明，驯化后筛选出对重 金属离子有较高抗性的抗性菌株，对c u 2 + ，a g + ，h 孑+ ，p b 2 + ，m 9 2 + 的最高耐受能力分别为3 2 0 0 0m g l ，2 4 0m g l ，0 9m g l ，3 5 0 0m g l ， 2 2 5 0 0m g l 。而野生菌株对上述离子的最高耐受浓度分别为1 9 0 0 0 m g l ，6 0m g l ，0 1m g l ，4 0 0m g l ，1 3 5 0 0m g l ，说明驯化后抗性 菌株对重金属离子的耐受能力明显增强。对具有较高c u 2 + 抗性和g g + 抗性的抗性菌株进行紫外诱变，获得的突变菌株生长性能稳定，比诱 博士学位论文 摘要 变前菌株及野生菌株具有更高的f e 2 + 氧化能力和更强的耐受重金属 离子性能。其对c u 2 + 和a g + 的耐受能力分别是野生菌的2 3 倍，是驯 化菌的1 1 1 3 倍。对其抗铜机理及抗银机理研究的结果表明：彳t f e r r o o x i d a n s 有抗铜基因a f e 0 4 5 4c o p p e rr e s i s t a n c ep r o t e i n ；但没有发 现抗银基因s i l c 。在不同铜离子浓度时抗铜基因表达有明显差异。铜 蓝浸矿实验发现m 2 6 “的浸矿能力明显高于d c 4 和2 6 “，在c u s 浓度为 9 时m 2 6 ”浸出率可达6 6 8 7 。 对抗铜基因编码的蛋白质进行分析发现了结构域c o p d 和p e o d 。 结构域c o p d 编码抗铜蛋白，而p c o d 的预测产物是铜离子导出蛋白。 p c o d 与c o p d 均与c u z + 抗性有关。通过自行设计的抗砷基因引物对另 一个抗性基因抗砷基因a r s h j 荭行p c r 扩增、克隆及测序。结果显示， 实验菌株的抗砷基因a r s h 的序列与模式菌株a t f e r r o o x i d a n s a t c c 2 3 2 7 0 的序列有1 4 个碱基不同。对口培h 基因编码的a r s h 蛋白进行 分析，找到了一段以硫作为信号的n a d p h ( 还原性辅酶i i ) 依赖的 f m n ( 黄素单核苷酸) 还原酶的功能域。推n 4 t f e r r o o x i d a n s 菌中a r s h 的功能可能与a r s c 基因编码的还原酶的氧化还原作用有关。 除了重金属离子x c a t f e r r o o x i d a n s 菌的影响，阴离子对细菌生长 活性及f e 2 + 氧化能力也有重要影响，其影响的强弱顺序为： s 0 4 2 _ 耋c 1 一 c l 一 8 0 4 2 一a n dt h eb a c t e r i a lt o l e r a n c el e v e l st o a n i o n sh a dv i s i b l ed i f f e r e n c e sf r o md i f f e r e n ts t r a i n s k e yw o r d sa c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n so tf e r r o o x i d a n s ) , b r e e d i n g ，h e a v ym e t a lr e s i s t a n c e ，m e c h a n i s m so f r e s i s t a n c e s v 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说 明。 作者签名：量三近日期：2 q q z 年土月三日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 博士学位论文 第一章文献综述 1 1 前言 第一章文献综述 在世界矿产资源日渐贫乏的情况下，传统的方法已经不再适用于那些低品位 的矿石。由于资源的枯竭及人们对矿物原料需求量的不断增加，迫使人们不得不 开发利用品位低、分散、难处理矿石，同时还要保护环境，细菌冶金因此而有代 替传统冶金工艺之势 a b h a ，2 0 0 2 ；n e s t o r ，2 0 0 1 ；k u m a r i ，2 0 0 2 ；m a z u c l o s ，2 0 0 1 ； l i u ，2 0 0 1 。生物浸矿作为一种新的、成本低、操作简单、作用对象广泛、环境 污染小的矿产开发技术f 邱冠周等，1 9 9 8 ，越来越引起人们的兴趣。生物浸矿是 指利用微生物从矿石中溶解有价金属( 如铜、镍、铀) ，主要依据微生物在矿物 表面的吸附作用及微生物的氧化作用来处理难浸矿石，多为用传统方法无法利用 的低品位矿、废石、多金属共生矿等 李宏煦等，2 0 0 3 。近2 0 年来微生物浸矿 已被广泛采用，从各种贫矿、废矿、尾矿中提取回收金、铜等许多重要金属，既 可节约资源，又可减少环境污染。据初步统计，全世界铜的总产量中有1 5 一 2 0 来自生物浸出【邓恩建等，2 0 0 5 】。美国每年铜产量约1 0 是通过生物浸矿实 现的i t 伟等，1 9 9 7 1 。微生物在矿物表面的吸附，可不同程度地改变矿物表面的 物理化学性质，如疏水性、表面元素的氧化、还原、溶解、沉淀等行为。浸矿细 菌与硫化矿物短暂接触后即引起矿物表面性质的改变，常使其失去疏水性。有研 究表明【s m i t h ，1 9 9 l 】，细菌在其固紧器、菌毛或矿物表面粘着力的作用下，选择 性地吸附于硫化矿物表面的晶界、位错区及某些活性中心，并利用其细胞内特有 的活性酶的催化氧化作用，沿着金属、硫化矿物晶界及晶体缺陷部位不断地氧化 金属矿物，以获得自身新陈代谢所需的能量。氧化结果导致矿物晶格严重破坏， 矿物形成多孔状，重金属被暴露出来。 1 9 4 7 年，美国c o i m e r 和h i n l r d e 从矿山酸性坑水中分离鉴定出嗜酸氧化亚铁 硫杆菌似c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ，简称a t f e r r o o x i d a n s ) ，并证实了微生物在 浸出矿石中的生物化学作用。细菌浸出在冶金工业上获得成功应用主要是3 种金 属的回收：铜、铀、金。自1 9 5 8 年美国利用微生物浸铜和1 9 6 6 年加拿大利用微 生物浸铀的研究及工业化应用成功之后，已有3 0 多个国家开展了微生物在矿冶 工程中的应用研究工作。而且继铜、铀、金的微生物湿法提取实现工业化生产之 后，钴、锌、镍、锰的微生物湿法提取也正由实验室研究向工业化生产过渡【李 雄等，2 0 0 6 。我国微生物浸矿技术方面的研究是从2 0 世纪6 0 年代末开始的，已 先后在铀铜等金属的生产应用中取得成功 黄导等，2 0 0 4 。 博士学位论文第一章文献综述 生物浸出中主要使用的是化能自养微生物，这类细菌可从无机物的氧化过程 中获得能量，并以c 0 2 为主要碳源和以无机含氮化合物作为氮源合成细胞物质。 这类自养细菌又可分为硫化细菌、氢细菌、铁细菌和硝化细菌4 种生理亚群。 在硫化矿生物浸出中应用最多的是硫化细菌中的a t f e r r o o x i d a n s ，它最初是由 t e m p l e 和c o l m e r 发现并命名的武华平等，2 0 0 4 ；t e m p l e ，1 9 5 3 ；c o l m e r , 1 9 4 7 。 a t f e r r o o x i d a n s 属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细 菌科、硫杆菌属李宏煦等，2 0 0 3 。它是一种嗜酸、革兰氏阴性、专性好氧的 化能自养菌，能氧化元素硫、亚铁离子及还原态化合物来获得细胞新陈代谢所需 要的能量 l e a t h e n ，1 9 5 6 】。a t f e r r o o x i d a n s 广泛分布于土壤 8 r o w n , 1 9 8 2 】、淡水 【b r o w n , 1 9 8 3 、海水 e h r l i c h ，2 0 0 0 、矿泥 童雄，1 9 9 7 、酸性矿水 沈萍，2 0 0 0 】、 矿泉及其它含硫丰富的地方钟慧芳，1 9 8 2 ，尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑 水中( p 8 3 7 。在相同的培养条件 ( 时问、温度、初始p h 、接种量【体积比：4 】) 下，5 “菌氧化硫的能力最强。 其次为d c 4 和3 2 # ，培养1 1 天后，5 0 、d c 8 和3 2 # 的p h 值分别下降到1 4 7 、1 5 l 和1 7 1 ，氧化硫能力最弱的为1 8 4 ，培养l l 天后，其p h 值下降到1 7 9 。 博士学位论文第二章嗜酸氧化亚铁硫杆菌的筛选及1 6 sr d n a 鉴定 2 3 3 基因组d n a 的提取及1 6 sr d n ap c r 扩增 提取细菌基因组d n a 后琼脂糖凝胶电泳检测，所得电泳图见图2 - 2 ，所有 实验菌株的d n a 都可见很清晰的条带。 图2 - 2 提取基因组d n a 后琼脂糖凝胶电泳 用通用引物2 7 f 1 4 9 2 r 或6 3 f 1 3 8 7 r 扩增菌株5 ，l 酽，3 扩，3 2 # ，d c 。，b 2 # ， 分别得到约1 5k b 的扩增片段，其1 6 sr d n a 的p c r 扩增产物电泳图见图2 - 3 。 上述p c r 产物经试剂盒纯化后送往北京三博远志生物技术有限责任公司测 序。 图2 - 3 1 6 sr d n ap c r 扩增产物电泳图 博士学位论文 第二章嗜酸氧化亚铁硫杆菌的筛选及1 6 sr d n a 鉴定 2 3 4 实验菌株1 6 sr d n a 序列分析 将9 个实验菌株的1 6 sr d n a 序列进行b l a s t 搜索，选取下载部分相似性比 较高，具有代表性的菌株的1 6 sr d n a 序列，通过g e n e d o c 分析，求得各菌株 序列之间的相似性。 博士学位论文 第二章嗜酸氧化亚铁硫杆菌的筛选及1 6 sr d n a 鉴定 博士学位论文第二章嗜酸氧化亚铁硫杆菌的筛选及1 6 sr d n a 鉴定 博士学位论文第二章嗜酸氧化亚铁硫杆菌的筛选及1 6 sr d n a 鉴定 博士学位论文 第二章嗜酸氧化亚铁硫杆菌的筛选及1 6 sr d n a 鉴定 图2 - 4 实验菌株1 6 sr d n a 序列比对 博士学位论文 第二章嗜酸氧化亚铁硫杆菌的筛选及1 6 sr d n a 鉴定 2 3 5 实验菌株的系统发育分析 用c j e n e d o e 分析序列，通过p a i r w i s ea l i g n m e n t 分析，可得图2 _ 4 ，如下所 列。 从图中可知，菌株5 0 、a f 4 6 5 6 0 4 1 的碱基差异性很小，只在8 4 0 ，1 2 1 0 两 个位置有差别，在5 4 菌的第8 4 0 ，1 2 1 0 个碱基的位置上分别是碱基g ，一， a f 4 6 5 6 0 4 1 与之对应的碱基为一，t ；菌株1 8 4 和a f 4 6 5 6 0 4 1 的碱基只在一个位 置有差别，在1 8 0 菌的第1 3 5 3 个碱基的位置上是碱基c ，a f 4 6 5 6 0 4 1 与之对应 的碱基为一；菌株5 ”和1 8 0 的碱基差异性也很小，只在8 4 0 ，1 2 1 0 ，1 3 5 3 三个位 置有差别，在5 0 菌的第8 4 0 ，1 2 1 0 ，1 3 6 0 个碱基的位置上分别是碱基g ，一， 一，1 8 “菌与之对应的碱基分别为一，t ，c ；菌株3 矿，5 。，1 8 ”和a f 4 6 5 6 0 4 1 的碱 基差别则比较大，在1 8 个位置上均有不同程度的差别。菌株3 岁，d ，b 24 和 a j 6 2 1 5 5 9 1 的碱基相互之间差异性比较小，从图中可以看出，对比排列比较整 齐的碱基，菌株3 2 # ，b 2o 序列之间的完全一样，d c 8 和a j 6 2 1 5 5 9 1 菌株序列完 全一样。菌株3 2 4 ，b 2o 和d c ”，a j 6 2 1 5 5 9 1 的碱基在1 8 个位置有差别。 1 6 sr d n a 是生物细胞共有的功能同源，既含保守序列又含可变序列的核酸 序列，其序列变化速度与进化速率相适应，常用于生物物种的分子进化分析，人 们称之为进化计时器f 陈文新，1 9 9 8 。根据细菌分类标准，新的分类单位应当同 核苷酸序列的系统发育学分析相一致，1 6 sr d n a 序列的系统发育学进化距离和 表型特征及化学分类数据有非常好的相关性。因此，通过1 6 sr d n a 全序列分析 测定了实验菌株与已知a t f e r r o o x i d a n s 相关菌株的遗传距离，可以揭示它们之间 的亲缘关系。将实验菌株与参比菌株的1 6 sr d n a 序列用c l u s t a l x 进行分析，并 在此基础上构建系统发育树，如图2 5 所示。 从1 6 sr d n a 构建的系统发育树上看，菌株3 0 和a f 4 6 5 6 0 6 1 ，d q 4 5 8 0 2 3 1 ， d q3 5 5 1 8 3 1 分在同一类群中，序列同源性分别为8 7 ，9 2 ，8 9 ；菌株b 2 4 、 3 2 * 、d c 4 和a j 6 2 1 5 5 9 1 分在同一类群中，序列同源性分别为8 9 ，8 7 ，8 9 。 菌株5 8 、1 8 0 与d q 3 2 1 7 4 5 1 ，d q 0 6 2 11 7 1 ，a f 4 6 5 6 0 4 1 分在同一类群中，序列 同源性分别为9 2 ，9 1 ，9 3 。 2 4 本章小结 本文通过稀释分离法得到纯化细菌，扩大培养后分别收集细菌，提取细菌基 因组d n a ，经1 6 sr d n ap c r 扩增后纯化p c r 产物，然后测序并进行序列分析， 得到如下结论： 博士学位论文第二章嗜酸氧化亚铁硫杆菌的筛选及1 6 sr d n a 鉴定 1 6 7 4 6 2 5 i o i g b l d q 0 6 2 1 ，z i i g t l 2 8 1 9 4 0 5 3 g b f 4 6 5 6 0 4 1 i | s s 啦 1 8 4 0 5 9 8 6 4 1 s b l d l 口, 2 1 7 4 j 川 3 s q 1 6 7 4 6 2 3 1 l l g b i i ) 0 0 6 2 1 1 81 l g l i d 7 卯，口，l 驴i d 印6 ，t j l # o s e q 1 9 j j j 9 9 2 4 g b l d q 4 $ 8 0 2 5 1 i 1 2 8 1 9 4 0 5 5 1 9 b l a f # 6 5 6 0 61 i g t l 8 6 1 4 3 0 6 3g b i d q 3 5 ，1 8 31 i 1 9 0 1 0 2 1 8 9 1 9 b l l 硷4 2 7 1 0 21 i 纠 5 6 4 6 2 4 9 6 g b i a y 8 5 0 9 0 2 1 l 5 0 0 7 0 9 7 0 g b 5 j 2 0 9 21 i 圳j 1 0 4 1 6 2 1 5 4 1 d b j l a b 2 4 5 4 3 4 i i 1 1 0 4 1 6 2 1 5 2 1 d b f a b 2 4 5 4 5 21 i 剖1 1 0 4 1 6 2 1 5 0 1 d b a b 2 4 3 4 3 0 川 3 2 5 e z ? b z s q d c s e q 一1 4 1 2 2 2 j 1 6 1 1 w - b l a d 6 2 1 3 5 9 1 1 图2 - 5 根据1 6 sr d n a 构建的系统发育树 根据国际系统细菌学委员会提出的细菌种属分类标准，结合系统发育树和 1 6 sr d n a 序列同源性分析，本试验所鉴定的菌株都是舭f e r r o o x i d a n s 菌。其中 来自江西德兴的5 。菌和来自湖北大冶的1 8 。属于a t f e r r o o x i d a n s a t c c 2 3 2 7 0 ，来 自湖北大冶的3 d 4 属于菌株舭启舢卿豇勋黜t f i ，来自湖北大冶的3 2 4 和b 2 “属于a t f e r r o o x i d a n s 玎w ；来自广西大厂的d c 。属于a t f e r r o o x i d a n ss s 4 。 3 0 博士学位论文第三章抗铜嗜酸氧化亚铁硫杆菌的驯化诱变育种及抗铜机理分析 第三章抗铜嗜酸氧化亚铁硫杆菌的驯化诱变育种 及抗铜机理分析 3 1 前言 生物冶金技术在当今矿业研究应用中有了很大的发展与广阔的前景，尤其是 利用微生物浸出难选矿石，因其经济、节能、易操作和无污染，取得了全球范围 内的广大共识，并在较短的时间内获得了较大的经济效益。在国外，对于低品位 铜矿尤其是次生硫化铜矿，细菌浸铜技术已成为首选的提铜工艺【傅建华等， 2 0 0 3 】。嗜酸氧化亚铁硫杆菌( a c i d t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ，简称为血 f e r r o o x i d a n s ) 是生物浸矿的优势菌种，属嗜酸化能自养菌，专性好氧，革兰氏阴 性，不产孢子，无休眠期 杨洪英等，2 0 0 0 。在细菌浸铜的过程中，随着浸出液 中c u 2 + 浓度的不断提高，将会对细菌产生极大的毒害作用，抑制细菌的生长甚 至导致其死亡范有静等，2 0 0 4 。同时，c l p 对在细菌浸出中起催化作用的a g + 有较强的拮抗作用胡岳华等，2 0 0 1 ，因此在高浓度c u 2 + 条件下a t f e r r o o x i d a n s 对环境的适应性、对二价铁的氧化活性及细菌本身的稳定性是铜矿石浸出过程中 的关键因素。筛选具有优良性状及较高c u 2 + 耐受能力的a t f e r r o o x i d a n s 是提高 细菌浸矿能力的重要途径。研究开发高活性、高抗性的优良浸矿菌株以及新的菌 种资源，是生物冶金的重点发展方向。 c u 2 + 是细胞的电子传递体，与细胞的电子传递链及氧化磷酸化过程密切相 关。同时c u 2 + 作为一种重金属，对生物细胞有一定的毒害作用。c h a i 2 0 0 0 等 人认为c u 2 + 可促进a t f e r r o o x i d a n s 的生长。他们使用s p q c ( s e r i e sp i e z o e l e e t d e q u a r t zc r y s t a l ) 法研究a t f e r r o o x i d a n s 的生长动力学，发现c u 2 + 可促进4 f e r r o o x i d a n s 的生长。c u ”可促进a t f e r r o o x i d a n s 铜蓝蛋白的合成。r u s t i c y a n i n 是一种含铜蛋白质，它与几种细胞色素c 和一种细胞色素氧化酶构成电子传递 链。c u 2 + 还能降低表面反应活化能。在p h 2 0 ，l o m g lc u 2 + 存在的情况下，细 菌的表面活化能从2 5 5 6 k j m o l 降到1 8 3 2 k j m o l 。但是0 c d e 等人 1 9 9 7 则认为 c u e + 对a t f e r r o o x i d a n s 的生长没有明显的影响。他们研究发现l o m e 饥c u 2 + 对 a t f e r r o o x i d a n s 的生长无明显的影响。 a t f e r r o o x i d a n s 自身具有调节代谢途径的能力，当环境中有较高浓度c u 2 + 时，细菌经过一段时间的调整，可改变或调整代谢途径以适应新环境。当然这种 适应性可能是暂时的，也可能是永久的，或有限度的。研究发现铜适应性菌株不 3 l 博士学位论文第三章抗铜嗜酸氧化亚铁硫杆菌的驯化诱变育种及抗铜机理分析 仅在c u 2 + 存在时有相对较高的生长和氧化活性，在其它碱金属存在时也有相对 较高的生长和氧化活性。a d a s 1 9 9 7 】等人发现经过2 5 9 nc a 2 + 驯化的菌株在 z n 2 + 存在时比未驯化的菌株有更高的浸矿效率。l ih o n g m e i 2 0 0 1 等人则发现 c u 2 + 适应菌株对n i 2 + 的耐受性也增强了，而对m 9 2 + 的耐受性则没什么变化。 a t f e r r o o x i d a n s 能够在高浓度c u ”存在的情况下起作用，肯定有一定的抗 铜机制。本试验从f i g r 数据库中的a t f e r r o o x i d a n sa t c c 2 3 2 7 0 的基因组序列中 找到了预测的抗铜基因a f e 0 4 5 4 及其编码蛋白。目前，还很少有人对4 f e r r o o x i d a n s 的抗铜基因及其编码蛋白一抗铜蛋白进行分析。因此，对抗铜基因 及抗铜蛋白的分析，将有助于人们了解a t f e r r o o x i d a n s 的抗铜机理，并有可能 对其作出改进，使其更能适用于实际。 目前，菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方法，属于经典育种的范畴， 随着微生物学和生物遗传学的发展，出现了转化、转导、接合、原生质体融合、 代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法【胡岳华等，2 0 0 1 】，但这些方法成功 用在生产上的例子目前还不是很多，驯化、诱变育种仍是当前用得最为普遍也是 最经济实用的育种手段。本研究利用添加铜盐的选择性培养基对实验菌株进行筛 选、驯化及紫外诱变，获得了一株在高c u 2 + 浓度条件下具有强氧化活性和高稳 定性的a t f e r r o o x i d a n s 突变株，为生物冶金在重金属抗性菌种选育及抗性机制 研究方面奠定了基础。 3 2 材料与方法 3 2 1 实验菌株与培养基 本实验室保存的9 个菌株分别为来自江西德兴的5 0 、广西大厂的d 一和湖北 大冶的1 5 。、l 旷、2 6 # 、3 0 # 、3 1 。、3 2 # 、b 2 。经1 6 sr d n a 序列分析，己鉴定这9 个菌均为a t f e r r o o x i d a n s 。 培养基：本实验采用9 k 培养基邓恩建等，2 0 0 5 来富集实验菌株。 第一部分：( n i - h ) 2 s 0 43 0 9 ，k c io 1 9 ，k 2 h p 0 4o 5 9 ，m g s 0 4 7 1 - 1 2 0o 5 9 ， c a o q 0 3 ) 20 0 1 9 ，h 2 07 0 0 m l ； 第二部分：f e s 0 4 7 h 2 02 5 9 。h 2 03 0 0 m l 第一部分经高压蒸汽灭菌法灭菌，第二部分过滤除菌，与第一部分混合，振 荡摇匀，用5 0 的硫酸调节溶液的p h 值为2 0 左右【陈泉军等，2 0 0 1 3 。 分析纯c u s 0 4 5 h 2 0 博士学位论文第三章抗铜嗜酸氧化亚铁硫杆菌的驯化诱变育种及抗铜机理分析 3 2 2 菌株的富集 从矿区采集的菌种经分离纯化并鉴定后保藏于冰箱。取保存于冰箱的9 个 a t f e r r o o x i d a n s 进行活化富集，过程如下：在9 个已灭菌的1 5 0 m l 三角瓶中各加 入7 2 i n l 新配制的灭菌9 k 培养基，再分别移取上述9 个菌株的菌液8 m l 于上述 三角瓶中，作好标记，注意防止不同菌液间的交叉污染。接种完毕后将三角瓶放 入摇床，3 0 转速1 6 0r p m 振荡培养。 3 2 3 筛选天然抗铜能力最高菌株 当菌液变为橙红色而且浑浊时，通过计数保持菌株维持在1 0 8 个m l 数量 级，以用于接种余俊棠等，2 0 0 3 。对每个菌株设置的c u 2 + 浓度梯度分别为 ( t o o l l ) ：0 ，0 0 1 ，0 0 2 ，0 0 4 ，0 1 0 ，0 2 0 张苏文，1 9 9 8 】。取5 4 支灭菌大试 管，分为9 组，每组分别加入8 m l 含上述不同浓度c u 2 + 的9 k 培养基，再分别 加入2 m l 菌液，作好标记，放入摇床振荡培养，摇床转速为1 6 0r p m ，温度3 0 0 ( 2 。 从这9 组试管定时取样，用重铬酸钾滴定法 w ue ta l ，2 0 0 7 】测定其中f e ”的 含量。 3 2 4 菌株的驯化 将选出的天然抗铜能力最强的菌株进行驯化以进一步提高其对c u 2 + 的耐受 能力。使用的驯化介质c u 2 + 的浓度梯度如下：o 1 5 m o l l ，0 2 0 m o l l ，0 2 5 m o f l ， 0 3 0 m o l l 。观察细菌的生长情况并测定其fe ：2 + 氧化率。 3 2 5 紫外诱变 将上述驯化菌株进行紫外诱变。用e p 管取2 0 u l 驯化菌液计数，以确定诱变 前的菌数。取5 m l 菌液于培养皿，放入紫外诱变仪中，调节功率为3 0 w 的紫外 灯，使其距离菌液约3 0e r a 刘亚洁等，2 0 0 5 1 ，调节时间( 时间梯度为4 0 s ，8 0 s ， 1 2 0 s ，1 6 0 s ，2 0 0 s ，2 5 0 s ，以此来控制诱变剂量) ，打开电源开关开始诱变。诱 变完毕，先取样放入e p 管用作计数，然后迅速将其余菌液接种于预先准备好的 9 k 培养基中，摇床振荡培养，条件同上。同时进行避光处理以避免细菌的光修 复熊英等，2 0 0 1 。将上述不同时间诱变后传代三次的菌接种到灭菌的9 k 培养 基中，摇床振荡培养，条件同上。定时取样测定培养基中的f e 2 + 含量变化。 3 2 6 制作驯化诱变菌与驯化菌生长曲线 筛选出诱变后活性最强的诱变菌株，将该诱变菌与诱变前的驯化菌以1 0 接种量分别接种到含0 2 5m o l lc u 2 + 的9 k 培养基中，每隔5 8 小时取样一次 滴定培养基中剩余f e 2 + 的含量。 博士学位论文第三章抗锕嗜酸氧化亚铁硫杆菌的驯化诱变育种及抗铜机理分析 3 2 7 基因组d n a 的提取 取纯化菌种的5 m l 菌液接种到4 9 5 m l 培养基中，3 7 、1 6 0r p m 恒温振荡培 养4 d 。收集培养液到离心管中，1 0 0 0 0 r m i n 室温离心2 0 m i n ，去掉上清液。向 离心管中加入p h2 0 的硫酸，吹打使菌体悬浮。收集菌悬液到1 5 m l 的e p 管中， 1 0 0 0 0r p m 室温离心1 0 m i n ，去上清液，再加硫酸悬浮，然后离心。去上清液后 再加入t e 缓冲液悬浮、离心、去上清液两次，至沉淀中无黄褐色杂质。提取细 菌基因组d n a 。 ( 1 ) 向收集的菌体中加入4 0 0 i t l t e 缓冲液，充分混匀，加入4 0 p l2 0 s d s ，混匀， 再加入8 l 蛋白酶k ，混匀，置于5 5 c 水浴锅水浴1 5 m i n ，至溶液变澄清。 ( 2 ) 加入1 0 0 p l5 m o l l n a c l ，混匀后加入8 0 9 lc t a b n a c l ，混匀，置于6 5 c 水浴锅 水浴1 0 m i n 。 ( 3 ) 加入等体积的2 4 ：1 的氯仿异戊醇，混匀，1 2 0 0 0r m i n 室温离心1 0 m i n ，容 液分为三层。 “) 取上清液移入新鲜的e p 管中。 ( 5 ) 加入两倍体积的冷无水乙醇。颠倒几次，溶液中出现丝状沉淀。 ( 6 ) 1 5 0 0 0r m i n 室温离心5 m i n ，去上清。 ( 7 ) 加入l m l7 0 乙醇，颠倒几次，倒掉乙醇，重复两次。 ( 8 ) 加入1 0 0 p l t e 溶解d n a ，再加入5 1 t lr n a s e a 。3 7 水浴l h 。 ( 9 ) 取出溶液，重复步骤( 3