（高分子化学与物理专业论文）蜂毒肽片段类似物结构与生物活性的研究.pdf

ab s t r a c t sf. 1to me l i t t i n h a s m a n y b i o a c t i v i t e s a n d p h a r m a c e u n f c a l a c t i v i t i e s s t r o n g h e m o l y s i s l i m i t s i t s p r a c t i c a l h e m o t y s i s a n d a n t i b a c t e r i a i s n o t c l e a t a p p l i c a t i o n . a l t h o u g h t h e ho we v e r me c h a n i s m i t h a s b e e n p r o % e d t h a t t h e me 1 1 5 , t h e t r u n c a t i o n f r o m t h e m e l i t t i n s c - t e r m i n a l , w i t h f i f t e e n a mi n o - a c i d r e s i d u e s , s h o w s m u c h l o w e r h e m o l y t i c a c t i v i t y t h a n t h a t o f m e l i t t i n . w h i l e i t s a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y c h a n g s l i t t l e . t h e r e f o r e , i n t h e f i r s t p a r t , u s i n g me l 1 5 a s t h e m o d e l , f i v e a n a lo g u e s o f m e l 1 5 a n d t w o t r u n c t i o n s o f m e l i t t i n w e r e p r e p a r e d b y t h e s o l i d p h a s e m e t h o d . t h e h e m o l y t i c a b i l i t i e s a g a i n s t a - e r y t h r o c y t e a n d t h e a n t ib a c t e r i a l p r o p e r t i e s - mi c ( mi n i m u m i n h i b it o r y c o n c e n t r a t i o n ) a g a in s t s .a u r e u s a n d b .s u b t i l i s o f me l 1 5 a n d it s a n a l o g u e s w e r e e x a m in e d . t h e c o n t r i b u t i o n s o f t h e u % p t o p h a n r e s i d u e ( t r p ) , h y d r o p h o b i c i t y a n d t h e a m p h i p h i l i c i t y o f t h e ct - h e l i x t o h e m o l y s i s a n d a n t i b i o t i c s h a v e b e e n s t u d i e d . a n d t h e c o n t r i b u t io n o f g lu t a m in e a t t h e m e l 1 5 s c - t e r m i n a l h a s b e e n a l s o d e t e r m i n e d . t h e r e s u lt s s h o w th a t th e h y d r o p h o b i c i t y o f n - t e r m i n a l h a s h i g h e r e ff e c t o n t h e h e m o l y t i c a c t i v i t y m o r e t h a n t r p , h o w e v e r t r p a f f e c t s t h e a n t ib a c t e r i a l a c t i v i t y o f mc i i 5 m o r e t h a n t h e h y d r o p h o b i c i t y o f n - t e r m i n a l . t h e g l u t a m i n e a t t h e me l i 5 s c - t e r m i n a l a ff e c t s n e i t h e r . t h e s e r e s u l t s c a n b e u s e f u l i n t h e d e s i g n a n d s y n t h e s i s o f t h e p e p t i d e s w it h l o w h e m o l y t i c a c t i v i t i e s a n d h i g h a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y . b e c a u s e t h e p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f l - c y s t i n e a n d l - t y r o s i n e s u c h a s d i s s o l u b i l i t y a n d e q u i v a l e n t p o i n t a r e v e r y s i m i l a r , i t i s v e r y d i f f i c u l t t o s e p a r a t e t h e m w i t h n o r m a l p h y s ic a l m e t h o d s . i n t h e s e c o n d p a r t , a c c o r d i n g t o a n a l y s i s o f t h e i r s t r u c t u r a l d i f f e r e n c e b e t w e e n l - c y s t i n e a n d l - t y r o s i n e , w e h a v e f o u n d t h a t l - t y r o s i n e h a s a h y d r o p h o b i c b e n z e n e r i n g a n d a p h e n o l ic h y d r o x y l g r o u p . a p t t o f o r m a h y d r o g e n b o n d , a n d l - c y s t i n e o n l y h a s a d i s u l f i d e b o n d . t h e r e f o r e . w e h a v e d e s i g n e d a n d u t h _i z c x l t h e n - a c e t y l a t e d b e n z i a i u i n c t c s i n . t h e h y d n ,h h o b i c a b s o r p t i o n t a k e s p l a c e b e t w e e n t h e b e n z e n e r i n g a t t h i s r e s i n a n d t h a t o f t h e 1 .- t y r o s i n e ; c a r b o n y l g r o u p i n i t f o r m s a h y d r o g e n b o n d w i t h t h e h y d r o x y l g r o u p o f t h e l - t y r o s i n e . a s a r e s u l t , t h e 4 r e t e n t i o n t i m e i . - t y r o s i n e i s s o l a r g e r t h a n t h a t o f t h e l - c y s t i n e t h a t l - c y s t i n e a n d l - t y r o s i n e i n t h e m i x t u r e p r e p a r e d f r o m t h e h y d r o l y s a t e o f t h e h a i r c a n b e s e p a r a t e d c o m p l e t c h . f u r t h e r m o r e , w e h a v e a l s o s y s t e m a t a c i a l l y s t u d i e d t h e f a c t o r s t h a t i n f l u e n c e d t h e s e p a r a t i o n , s u c h a s t h e p h v a l u e o 自h e m o b i l e p h a s e . t h e s p e e d o f t h e m o b i l e p h a s e a n d t h e w e i g h t o f t h e m i x t u r e t o f i l l . wi t h t h e s e r e s u l t s , w e c a n p r o v i d e t h e o r e t i c h a s i s a n d m o r e e x p e r i m e n t a l p a r a m e t e r s f o r t h e i n d u s t r i a l p r o d u c t i o n o f t h e s e a mi n o a c i d s k e y w o r d sme l i t t i n s o l i d - p h a s e n - a c e t y l a t e d b e n z e n e a mi n e r e s i n p e p t i d e s y n t h e s i s 瓶 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位 )论文 第一部分 蜂毒肤片段类似物结构与生物活性的研究 1 . 前 言 蜂毒肤是蜜蜂击的 _ 要部分，约: if -f - 蜂毒的 5 0 % ( a 7 / w) .最早蜂毒肤是山 n e u m a n等人丁 1 9 5 2 s1 =. i刊 电泳分离得到的。当时它被命名为直 接溶血素 f i ( d e r i c t h e m o l y s i n f i ) i l o 1 9 6 7 年， h a b e r m a n 等人测定 报道了 蜂毒 肤的氨基酸组成序 jj m , 后 来又被l u b k e 等人用多肤合成技术所确认13 1 蜂毒肤是一 种具有高度药理活性和生物活性的天然毒素。溶血活性是蜂毒肤最 显著的生物活性之 一 除此之外，蜂毒肤还有很多药理活性，包括抗菌、抗炎、抗 辐射、抗肿瘤及对神经系统和心血管系统的作用等。 1 . 工 蜂毒肤的结构研究 1 . 1 1蜂毒肚的一级结构 从蜂毒中提取得到的蜂毒肤至少含有三种一级结构相似的组成:蜂毒肚 i ,蜂毒 肤 i i 和蜂毒肤 f( 见表 1 - 1 ) 。而且来自 不同亚种蜜蜂群的蜂毒肚，它们的一级结构 也略有差别。但无论何种情况，蜂毒肤整条肤链都可以分为较长的 n 一 端疏水部分 ( 1 - 2 0 )和碱性的c - 端亲水部分 ( 2 1 - 2 6 ) ，并且，对于肤链构象具有关键性意义的脯 氨酸残基总是出现在第 1 4 位。 t a b l e i 一 i p r i ma r y s t r u c t u r e s o f me l i t t i n 1 , 1 1 a n d f me l i t t i n i g i g a 5 v l k v l 0 t t g l p a l i s w z 0 i k r k r - s q q - n h 2 me l i t t i n 1 1g i g a s v l k v l 0 t t g l p a l i s w 2 1 1 s r k r- k q q - n h = me l i t t i n fv l t t s g l p a l 0 i s w i k s r k r q q - n h 2 文献中研究最多的是取自 西方蜂群的蜂毒肤。在此蜂毒肤整条肚链中，没有任何 酸性纂团， 只有6个碱性正电荷，其中4个集中在c 一 端碱性4 月 太 序列r - k - r - k ,另 外两个分别是n - 端氨基和冲s 7 的 侧链氨基 序列中 疏水性氨基酸残基含剥 高，然 而蜂毒肤钧 _ 水中却有很高的溶解度，大于 2 5 0毫克/ 毫升，在甲醇中亦有i i i 等程度的 溶解性，约 2 0毫克/ 毫升。 城i , .。 华 南开大学硕士研究生毕业( 学位 )论文 1 . 1 . 2蜂毒肤的二 级结构 溶解在不同水介质中的蜂毒肤，具有小同的构象形态和聚集形式。单条肤链的 分散形式!a -9 和四条肤链的聚集形式是蜂毒肤在水介质中的主要聚集态， 二 体聚集形 1 t 很难稳定存 i : d in 一m 一 向色性光; ( c d ) .- 1 f n n mr i 实验均表明:溶解在水介质 中的蜂毒肤单条肤链、没有确定的 _ 级结构，呈典型的 “ 随机线团”( r a n d o m c o i l ) 构象对! 几 不含二硫键的短链多肤，其构象主要取决于肤链分子周围的微环境，在 山高.鸟 -f - 强度溶液中生长得到的晶体中，蜂毒肤以四聚体聚集态的形式存在，用此 品体的 x - 例线衍射数据，可推断溶液当中四聚体蜂毒肤的二级结构。用分辨率分别 为2 入 和2 .5 入 的 晶 体x - 射线 衍 射数 据， 对晶 体中 蜂毒肤的 构象结构进行分 析， 结果 表明:在晶体四聚体中， 蜂毒肤单 体链均采取3 .6 1, a - 螺旋构象9 ,1 0 .1 11 图1 - 1 ) 图 1 - 1 t h e c o n f o r m a t i o n o f mo n o m e r i c s u b u n i t s o f me l l i t i n f r o m t h e c r y s t a l l i n e t e t r a me r p r o 1 4 不含n - h ，不能与其前的第四个氨基酸残基 t h r 1 0 的c = o氧原子形成氢键: _ 。 。-c 不 v yl2而 印 侧 浑-c 一 t h r l l h o l c u l 3 比- - - - - - - - - - - - - - - - - - 一- - - - - - - - - - - - - 4- - - 一 “ 由于 p r o的空间位阻作用使整条肤链的a - 螺旋由此处断开，分成两段。 螺旋 g l y l - l e u 9和 l e u l 3 - l l e 2 0 o t h r 1 0 , 1 1 和g l y 1 2 作为节点。p r o l 4毗咯环的空i i 位阻 作用，使t h r l l - g l y l 2间 肤链方向，与正 常的a - 螺旋结构中的 肤键方向相比 较，旋转 了1 8 0 ，而l e u - 1 3 - p r o 1 4 间肤键，为了维持。 一 螺旋构象的需要，采取反式构型，如 此两个a - 螺旋轴相交成 1 2 0 0角 即两段螺旋的弯折角为 6 0 ) ，整个主链的形状就 南开大学硕士研究生毕业( 学位 )论文 像一根弯折的圆 柱( 图1 - 1 ) a 氨基酸侧链围 绕这根圆柱的分布在 极性上是不对称的: 卜 个大的非极性氨基酸残基，全部隐蔽在弯折圆柱内侧的 i f 汁处，极性氨基酸侧链 k g rkrqq 1 . 图1 - 2 t w o - d i a me n s i o n a l a - h e l i c a l w h e e l d i a g r a m s f o r t h e s e q u e n c e o f m e l i t t i n 和带电 荷的氨基酸侧链， 则分布在弯折圆柱外侧的凸面上 ( 图1 . 2 ) ; c 一 端的极性六肤 序列 k r k r q q ， 像“ 尾巴” 一样， 游荡在外侧极性部分。从而 使整条肚链显示出两 亲性 ( a m p h i p h i l i c ) 特征。 如果 把蜂毒 肤放到。 一 螺旋轮上， 能够看到多 肤中 极性和 非极性氨基酸的不对称分布情况! n 1 ( 图 1 - 2 ) 。其中非极性氨基酸聚集在螺旋轮的一 侧，极性氨基酸则位于螺旋轮的另一侧。这种被称为 “ 两亲性”的特征是许多膜结 合蛋白的肤链所共有的，这种两亲性的a 一 螺旋结构被假定为能够穿透细胞膜( 18 -2 0 1 对于不含二硫键的短链多肤，其构象主要取决于肤链分子周围的微环境。因此 蜂毒肤在晶体、水溶液、甲醇和与磷脂酞胆碱泡囊结合后的三级结构有着异同点。 ( 1 ) 蜂毒肤的晶 体结构 在由高离子强度溶液中生长得到的品体中， 蜂毒肤以四聚体聚集态的形式存在“ 5 ,3 5 ) ( 图 1 - 3 ) 。 分析此晶体的 x 一 射线衍射数据，可以推断溶液中蜂毒肤四聚体的二级结构。用 分辨率分别为 2人和 2 . 5入的晶体 x - 射线衍射数据，对刀f 本 1书 蜂毒肤的构象结构进 行分析 ”3 5 1 结果表明:品体四聚体是山相同结构的单链组成，在晶体四聚休中， 每条单链均采取3 .6 , 3 c 6 - 螺旋构象。 ( 如图1 一 1 所示) 侮两条。 一 螺旋构象的蜂毒肚链，通过非极性侧面的疏水作) 刊 ，以反平行方式构 飞 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位 )论文 成个亚基 ( a链和b链组成一个亚基，c链和 d链组成 个亚基) 。两亚基同理以 图1 - 3 i l l u s t r a t i o n o f t h e a r r a n g e m e n t o f m e l l i t i n a - h e l i c a l m o n o m e r s i n t h e c r y s t a l l i n e t e t r a m e r 垂直币交形式构成四聚体聚集态f i ll ( 图 1 - 3 ) 。非极性疏水氨基酸侧链包埋于四聚体 内 部 ( 作为疏水 性的t r p 一 残基也被包埋于四聚体内部) ， 极性的和带正电荷的亲水侧 基暴露于外部 水介 质环境中。 最近的电 荷一 电 荷位置是在a链和c链的l y s 2 3 之间， 以 及b链和d链的l y s 2 3 之间，大约为4 - 6 人 。 非极性疏水侧链包埋在内部，可以 避 免它们与水接触，而反平行排列则是由于c - 端电荷静电排斥的结果。四个m e l i t t i n 分 子的四条多肚链以完整的2 2 2 对称性紧密堆砌在一起。 通过拉曼光谱检测到的蜂毒肤晶体四聚体的螺旋含量11 2 哟为 9 0 %,高于通过 c d 光谱检测到的溶液中四聚体的相应值11 3 . 14 1 ，约为 5 0 - 6 0 %。这可能是因为晶体四聚体 是通过非常高的离子强度和多肤浓度得到的p 5 1 ( 2 ) 蜂毒肤在水溶液中的构象 虽然蜂毒q t 分子序列中疏水性氨基酸残基含量很高，但它在水中却有很高的溶解 度:大于 2 5 0毫克 / 毫升。大量研究表明:溶解在不同水介质中的蜂毒肤，具有不同 的构象形态和o f 集形式。单条肤链的分散形式和四条肤链的聚集形式i t -2 5 i是蜂毒肤在 水介 质 护 的要 聚 集态，二 体聚 集形式很难稳定存在 12 7 1圆二向 色 性光iiv ( c d ) 1 u .1 1, 2 z 表明:蜂毒形 、 在水溶液中的单条肤链没有确定的二级结构;ic j 分辨率 h - n m 8 12 3 1 的化 学位移数据也表明了溶解在水介质中的蜂毒肤单条肤链呈典型的 “ 无规线闭” ( r a n d o m c o i l )构象。与其它含有脯氨酸的多肚一样，水溶液中蜂毒肤单条肤链的 4 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位 )论文 l e u l 3 - p r o l 4月 太 键以足够低 ( s o 4 ， 一 c 1 0 4 c l - 顺序依次减弱。 d r a k e等13 3 !认为， 这可能是由 于h p 0 4 2 一 更容易与 精氨酸残基中的 肌基结合的 缘故。 y u j i 等12 8 1还给出了五 种单价阴离子对蜂毒肤聚集倾向的影响顺序: c c i 厂0 0 c i 0 4 - c f 拟0 0 c l f (3 ) 蜂毒肤在甲 醇中的 结构 蜂毒肤在甲 醇中有中 等程度的溶解性 ( 当p h值 低于n端氨基基团的p k a 值时， 约2 0毫克/ 毫升) 。蜂毒肤在甲醇中以单链和a - 螺旋结构存在3 1 . 3 6 1在 一 h - n mr谱图 上，构成肤链的酞氨键上质子的偶合常数 j n h c h 和 n o e s值表明了 其典型的a - 螺旋 结构特征。但 t h r l 0 - g l y l 2之ia 缺乏a -旋结构17 r 特有的n o e ( n u c l e a r o v e r h a u s e i e n h a n c e m e n t ) 效应， 而且t l u 1 0 和丁 h r l l 酞氨质子的偶合常数j n h c h 。 大一 -. 其它残基 的偶合常数 7j n h c h 。 值。 这些数据都支持了 c 4 - 螺旋结构在p r o 1 4附 近的松弛 及 l e u 3 - p r o l 4间肤键取反式构型。 这与 ( 1 ) 中描述的构成蜂毒 肤晶体四 聚体的单肤链的结构相 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位)论文 一致。 在 h - n mr的 n o e s y谱图上13 1 1 ，还缺乏较远残基间的 n o e效应，从而不能确 定两段螺旋的弯折情况。 在分 子 动力学计算的最后 通过用 n o e距离限定数据，对分 f 进行分子动态模拟表明: s o p s 通过平均结构方法计算t - 11d c i ii . 约为 2 0 0， 分子结构中 大大小于测得的品体四聚体结构中的弯折角 6 0 ili 段螺旋的弯折角人 也就是说， r 蜂, - jr p r o基团附近井不需要一个大的弯折。图 i - 4表7 了 用 h - n mr和分子 动力学模拟方法得到的蜂毒肤分 f 在甲醇e p 以单链形式存了 阎勺 方 体构象1 3 1 1 嘴 图 1 - 4 s t e r e o v i e w o f t h e s t r u c t u r e o f m o n o m e r i c m e l i t t i n i n m e t h a n o l d e t e r m i n e d f r o m h - n m r a n d m o l e c u l a r d y n a m i c s s i m u l a t i o n s d e m p s e y ,c .e . 13 e 1通过酞 氨置换的 方法对蜂毒肤在甲 醇中的单分子 链作了 全面的 研 究，得到了分子间氢键的信息，其结论与前面通过 h - n mr 万法得到的结果是相同 的。处于 n 一 端序列 ( 氨基酸残基 5 - 1 1 ) 和 c 一 端序列 ( 氨基酸残基 1 6 - 2 3 )的酞氨键 上的 h对溶剂置换是稳定的，表明它们被一个稳定的螺旋结构上的氢键所保护;处 于肚段中间 ( 氨基酸残基1 2 - 1 5 )的酞氨上的h对置换反应有弱的稳定性，表明它们 被不稳定的氢键所保护 ( 图 1 - 5 ) 。也就是说，蜂毒肤分子n - 端和 c - 端a - 螺旋结构被 中间一端柔性序列所连接。c - 端末尾几个氨基酸残墓的酞氨键稳定性逐渐降低表明 这儿个残基由一个松弛的c c - 螺旋结构组成。 ( 4 ) 蜂毒肤与膜结合后的二级结构 蜂毒肤与膜模型一 磷脂酞胆碱泡囊结合后，用 h - n mr 方法对其结构作了 研究 13 7 3 8 ,3 9 ，结果与蜂毒肤在甲醇中的构象有基本相同的特征:都采取a - 螺旋结构;都在 螺旋中间部位缺乏n o e的连续性，表明了 螺旋在残基 i 1 - 1 2附近的松弛现象13 7 1 a .-j 蜂毒肤在甲醇中的构象相比，与泡囊结合的蜂毒肤其两亲性二 一 螺旋疏水侧的酸氨显 示了最大的化学位移变化和最低的酞氨置换速率，表明了蜂毒肤分子中a 一 螺旋结构 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位 )论文 的非极性侧面向泡囊的内部，从而使这一 侧的酞氨基团不容易与溶剂发生酞氨置换。 沪吕胃 、蒸蒸徽霎臀 厂 护 .妇 ， 、 奋 . .伸二 川. 1 . 图1 - 5 v a r i a t i o n i n t h e s t a b i l i t y o f b a c k b o n e a m i d e s o f m o n o m e r i c m e l i t t i n i n m e t h a n o l t o e x c h a n g e wi t h s o l v e n t d e u t e r o n s , d e m o n s t r a t i n g r a p i d e x c h a n g e i n a c e n t r a l t u r n o f h e l i x a r o u n d t h e p r o - 1 4 r e s i d u c . ( l a r g e n e g a t i v e l o g k mi n v a l u e s i n d i c a t e s t a b l e h y d r o g e n b o n d s ) . t h e r e l a t i v e s t a b i l i t y o f h e l i c a l h y d r o g e n b o n d s i s i l l u s t r a t e d s c h e m a t i c a l l y a b o v e . 1 .2 蜂毒肤的溶血活性机理 1 .2 . 1蜂毒肤的溶血活性 大量研究表明:蜂毒肤的溶血活性及其它的一些生物活性均起源于它对细胞膜 的干扰作用。即具有很强的溶解血红细胞膜的能力 ， 4 2 1 。当 蜂毒肤的浓度为 l u g / m l 时，蜂毒肤就能很快与红细胞结合，增强血红细胞膜的通透性，引起包括血红 ， 蛋白 在内的胶体的大量渗出，最终招致血红细胞的裂解，而产生”胶体渗出性溶血” 。研 究表明:蜂毒肤是以 单链的形式与血红细胞结合的4 0 1 。从构象研究来看，四聚体表 面分布着大量极性基团，使蜂毒肤分子保持良 好的水溶性，因而限制了与膜的直接 相互作用。只有到达细胞膜时，这种四聚体解离成单体，使内埋的非极性的侧面外 露，蜂毒肤分子与膜的相互作用刁 能发生。在 1 . 1 2 c 2 )己经提到磷酸欲能够诱导蜂 毒 肤形成四聚体， 所以 它在某种程度上 抑制溶血过程， 当h p 0 4 2 一 的 浓度大十0 . 5 m时， 溶血作用可以 完全被抑制。 用交联剂 d i m e t h y l s u b e r i m i d a t e交联蜂毒肤得到的线性聚 合物能够抑制磷酸盐诱导的自聚发生，保证它以单分子链的形式与血红细胞结合， 因此该聚合物在高浓度的磷酸盐溶液中保持了溶血活性阴。至于溶血过程的发生是 否需要与 膜结合的多肤单分子链在膜上再次缔合，目前还是 一 个有争议的话题。 在蜂毒肤为单分子 链的条件 下 ，把它加到血红细胞中，在几秒钟内蜂毒肤分子 完全与血红细胞结合 ( 大约 1 5 s 以后血红蛋白泄漏) ，在每 一 个血红细胞上有 1 .8 x i 犷 个结合位点4 9 ,5 0 。这一结果说明了蜂毒肤主要的作用位点是膜脂而不是特殊的 “ 受 7 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位 )论文 体” 。蜂毒肤对血红细胞的离解常数为 1 0 一 m0 9 1 和 3 . 1 0 -8 m5 0 ，这个值与蜂毒肚对膜脂 的离解常数 !i 常接近，也支持了 蜂毒肚主要与膜中的脂类相互作用的观点。 蜂毒肤分子结构的不对称性，使其具有很强的表面活性能力，蜂毒肤分子能够穿 透空产 到水界向的洗涤剂中层膜，并形成它自已的单层膜4 1 . 4 4 . 4 5 j t o s t e s o n等1, n 认为蜂毒肤的溶血过程是胶体渗透的机制:膜上形成了离子可以 通过的 “ 孔”( 孔的尺寸不允许血红蛋白通过) ，膜的平衡被扰乱，然后血红蛋自泄 漏出来。i iu b e r m a n n曾综合比较了 t o种蜂毒肤及蜂毒肤的片段的溶血活性和表面活 ,胜 ( t a b l e 2之间的关系，发现二者并不存在一 致性。说明蜂毒肤并不是通过表面活 性作用而导致溶血的。蜂毒肤的溶膜活性是蜂毒肤分子与膜双层中的磷脂分子的作 用。最初蜂毒肤的碳端正电荷与磷脂极性端的负电荷，通过静电吸引，将二者结合 在一起。通过 c - 端与膜结合的蜂毒肤的n 一 端是非极性的部分。 在血红细胞外侧微环境的影响下，改变二级结构，形成两亲性的。 一 螺旋构象， 。 一 螺旋的疏水侧面作用于磷脂双层中间的疏水区域，而使得呈a 一 螺旋蜂毒肤分子 c a b l e 1 - 2 h e m o l y t i c a n d s u r f a c e a c t i v e o f m e l i t t i n a n d i t s t r u n c a t i o n a n a l o g u e s p e p t i d eh e m o l y t i c a c t i v i t y s u r f a c e a c t i v i t y % n八曰n曰nucu曰川 nui勺il月n1上ojo门尸0 .1，.11.1 0 n曰n 八u八目q乃1门曰unnn日 ，1.1 八匕了叹u叹划行了n川n划月崎d.dj 99qq自勺臼9q乙1.月土1 一一一一一一一一一一 t.工111一00曰，.土一了1庄且1了 1.11.1 镶嵌在磷脂双层的外表面，或贯穿磷脂双层。多肤。 一 螺旋疏水侧面的疏水性是多膜 与膜双层相互作用的决 定因素 4 fi 假设一个多 肤的一 级结构1 0 0 % 为。 一 螺旋的话， 跨 越细胞膜的双磷脂层需要这个多肤至少2 1 个氨基酸残基组成。 1 . 2 . 2蜂毒肤可以形成电压依赖性通道 在过膜电压的作用下，蜂毒肤可以增强离子在膜脂中的穿透性。蜂毒肤与黑膜结 合后，在膜的另一钡 1 加电压，由于蜂毒肤的存在， 增加了脂膜的导 廿 胜 协 川 。与这种 电压依赖il 的导电现象相一致的解释是:以单分子链形式与膜脂结合的蜂毒肤在膜 土重新取向，跨膜形成了离子通道，可以允许离子的迁移。通过荧光探针技术对蜂 肃开大学硕士研究生平业 ( 学位 )论文 毒肤分户扣 的第 1 9 个氨基酸残基t r p的定位检测表明:在过膜电 压的影响下， 蜂毒 肤可以改变它在膜 的位r i ,由平行膜的取向变成垂直膜的取向，使部分肤链穿透 膜到达膜的另 一 侧遭受膜内蛋白水解酶的进攻r = 1 蜂击月 丈 、 分r 价 _ )i劳 i ， 形成的离子 通道在膜土疏散分布，能选择性通过阴离子 这可 能是由ht+ 3 l , 1从 c - 端片段的正电荷与阴离自司静电吸引的结果卜 ! 。氨纂乙酞化的蜂 毒肤也能 0 1 q - j 指 中引起电 、 依赖性导电现象，这说明:蜂毒肤分子的 n 一 端a 一 螺旋部 分，4电i f、 作川 形成 跨膜离子通道的这一假设过程，并不是n - 端氨基和l y s 7 侧链 氨基与 膜电压作用的 结果 j5 3 1合成的n 一 端封闭的蜂毒肤和衍s 7 被a s n 7 取代的 蜂毒 肤类似物也表现出了 对膜脂的电压依赖性离子透过的能力，证实了上述结论的正确。 t o s t e s o n 等(5 1 1 的实验结果表明:在恒定电压下，膜脂导电性的增加与蜂毒肤浓度 的四次方成正比，因此他们提出，离子通道的形成需要四个蜂毒肤分子的共同参与， 即在膜脂 ! ， 蜂毒肚分子形成 一 种四聚体聚集态。当然，在膜脂中的四聚体与前面讲 过的晶体中的四聚体是完全不同的。在膜脂中，蜂毒肤分子的疏水性一侧面对同样 图1 - 6 s c h e m a t i c m o d e l o f t e t r a m i c m e l i t t i n i n l i p i d b i l a y e r 是 疏水区 域的 膜脂酞 基部分， 亲水性一 侧面 对离子 通道。 v o g e l 等人 ! 12 1 f lr 据荧光能量 迁移数据，提出了四分子蜂毒肤自组装而成离子通道的模型 ( 图 1 - 6 ) ，然而到日前 为止还没有进 一 步的证据能够证明此模型的正确。 另外一 些实验15 3 ,5 4 1观察到蜂毒肤在 p o p c双层上表现出多级导电性现象，表明了 离子通道结构的不均匀性，也就是说不一定是四聚体聚集态形成的离子通道。结构 被修饰后的蜂毒肤类似物在诱导离子通道能力上表现出不同的浓度依赖性，也说明 了严格的四聚体构成离子通道的模型是不合理的15 5 1 d e n i p e s y j 1 曾 综述四 个小组的研究结果指出: 在低离子强度的溶液中， 膜中的蜂 毒肤分子不能聚集，随离子 强度的增加，聚集程度会有所加强。然而，蜂毒肤分 f 中的静电排斥力，应该不利于蜂毒肤的聚集，而只能促进蜂毒肤在双层膜中的分散 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位)论文 另外也有一些学者的工作说明蜂毒肤在膜中并不发生聚集15 7 .5 8 1 ，或者即使有不同程度 的聚集，也不是统 一 的四聚体，而是各种多分子聚集体15 9 1 1 . 2 . 3蜂毒肤的溶血机理 现在普遍认为溶血是通过蜂毒肤分 r- 对双层膜脂织态结构的扰乱引起的。主要和 两种机理模型:i ) 蜂毒肤分子跨膜形成离子通道，造成膜两侧离子的不平衡，然后 发生胶体渗出性济血6 1 1 。 2 )蜂毒 太 分子以平行于 膜的方式在膜上取向16 2 1 ，疏水的内 表面靠近膜的非极性部分，而 l y s 2 3与g 1 n 2 6侧链曲伸向外，避免进入脂相。在膜 的织态被扰动以后，或者由十多肤与膜的不稳定堆积几何导致脂孔穴的自发形成， 从而使细胞内物质泄漏6 2 1 .或者蜂毒肤分子使膜胶束化，在膜上留下了能泄漏细胞 内物质的 “ 洞”6 0 1 1 . 2 . 4合成蜂毒肤类似物及构效研究 通过合成蜂毒肤类似物，研究其构效关系是阐明溶血机理的有力手段。蜂毒 肤分 子的结构的不对称性，使其具有很强的表面活性能力，蜂毒肤分子能穿透空气/ 水界 面上的洗涤剂单层膜，并形成它自己的单层膜16 3 1 . h a b e r m a n n 综述了1 0 中蜂毒肤以 f i g l - 7 a s u g g e s t e d m e c h a n i s m f o r m e l i t t i n - m e m b r a n e i n t e r a c t i o n 及蜂毒肤片段的溶血活性和表面活性 ( 表 1 - 2 ) ，发现溶血活性与表而活性之间井不 存在一致性，这说明蜂毒肤并不是通过简单的表面活j性作用而致溶血。 p a d m a j a 和m e r r i f i e l d 等16 4 合成了l - m e l it t i n , . d - m e l i t t i n 、 反向 的m e l i t t i n l 乙 酞化的 m e l i t t i n ，通过溶血活性检测、c d 光谱分析，导电性测量和能量最小化动力 学计算得出结论:蜂毒肤的溶血机理是形成离子通道。其过程为:1 )蜂毒肤单分子 链在稀溶液中以无规线团形式存在，2 )蜂毒肤分子通过静电力作用与脂双层表而带 负电荷的磷脂结合，3 )发生了重排作用，蜂毒肤分子的亲水侧面与脂双层的极性头 组织接触，疏水性残基与膜内非极性碳氢链接触，4 )分子二聚体插入膜内形成离子 通道， 然后进一步形成四聚体、 五聚体等齐聚物。 图1 - 2 更直观地说明上述溶血过程。 1 0 南开大学硕士研究生毕业 ( 学位)论文 d e g r a d 。等16 5 1 合成了 一个与 蜂毒 肤序列 完 全不一 致的多 肤， 但保 持了 !jij 2 0个氨 基酸的两亲性特征，并且取消了类似于蜂毒肤分子中的弯折区域。其溶血活性是蜂 毒肤的两倍，说明蜂毒肤的分子序列并不是溶血所必需的，a - 螺旋中部p r o 1 4 造成的 弯 折也4 a 要。合成的 蜂毒 肤类似物 a la - 1 4 j m e l i t t i n ( ) 1 a l a 1f ( 代了1 4 iij p r o ,使 螺旋中部没有弯折) ， 其溶血活性也大约是蜂毒 肤的两倍，研究表明汇 a l a - 1 4 1 m e l i t t i n 在膜 卜 有 i卜 常弱的形成电压依赖性离子通道的能力，这似乎否定了第一个机理 为了 评价蜂毒肤的 n端和 c端区域对溶血活性的作用，b l o n d e l l e等c r, l . 成了 卜 一条蜂毒肤片段， 溶血活性显著下降 并比较了它们溶血活性的不同:从 n端移去第一个氮1 l 酸残鉴 随前六个氨基酸残基的逐个移去其溶血活性逐渐消失 毒肤的 n端对溶血的作用很大。然而当从 c端去除 卜 5个v i 基酸残基11,j 说明蜂 列济血活 性儿乎没有影响，只有 c端六个极性氨基酸都被去除后，溶血活性刁显著降低。肤 链 c端至少要有一个碱性氨基酸残基才能保持肤链的溶血活性，这说明了六 _ 溶血过 程的第一个步骤中，是通过蜂毒肤 c端正电荷与膜脂头部的正电荷通过静电吸引作 用，将蜂毒肤分子同膜结合在一起。 b l o n d e l l e 用l y s 取代蜂毒肚中的每一个 氨基酸残基， 合成了2 5 个蜂毒肤类似物。 溶血活性实验结果表明:当 用l y s 取代蜂毒 肤a - 螺旋结构疏水侧面的 任何氨基酸，都 会导致溶血活性的显著下降， 这显然是由于l y s 破坏了 蜂毒肤a - 螺旋结构的两亲性造 成的。 b lo n d e l l e 用天然的1 9 个氨基酸取代l y s 1 7 得到一组蜂毒肤取代类似物，h 的 是考察l y s 7 的作用， 或者更准确地说，考察在这个位置上正电荷的作用。 通过比 较 它 们的 溶 血 活 性 发 现:当 用 亲 水 性的 或 极 性的 氨 基 酸 残 基 ( g lu , g ln . a r g . s e r 和 t y r 等) 取代时， 溶血活性变化不大，说明正电 荷在这个位置的作用不大;而用疏水 j性 氨基酸残基 ( i l e , p h e , l e u , v a l 和c y s 等) 取代时 ( t r p 除外) ，也就是当两亲 性c x - 螺旋结构的亲水面被改变时，溶血活性显著下降，再次说明了肤链两亲寸 对溶 曹一.u告己返1。1二省夏。工 f i g 1 - 8 h e m o ly t i c a c t i v i ty o f l y s i n e s u b s t i t u t i o n a n a l o g u e s o f t n e l i t t i n ( t li e o n e - l e t t e r c o d e r e f e r s t o t h e r e s i d u e s u b s t i t u t e d a t p o s i t i o n 7 a n d t h e d o t t e d l i n e r e p r e s e n t s m e li t t i n s a c t i v i t y ) 南开大学硕士研究生平业 ( 学位 )论文 血活性的重要。 另人奇怪的是， 当 用疏水性的t r p 取代l y s 7 时，取代产物的溶血活性有了显