（环境科学专业论文）环境激素莠去津对蚕豆、斑马鱼、蚯蚓的dna损伤及相关酶的影响.pdf

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化酶和过氧化物酶的活性先升高而后降低，而过氧化氢酶活性则出现时高 时低的变化。1 0 m g k g 1 的莠去津对蚯蚓的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶 活性均有较明显的抑制作用，对过氧化物酶活性的影响则是明显的激活作 用。 4 单细胞凝胶电泳试验结果显示，在设定的四个检n m j n ( 7 伽，1 4 m ， 2 l 皲，2 8 m d ) ，经不同浓度莠去津处理，蚕豆、斑马鱼和蚯蚓细胞d n a 均 有损伤，而且随着浓度的增加和时间的延长，彗星拖尾长度、o l i v e 尾矩 的值均有上升的趋势，这说明d n a 损伤程度与莠去津的浓度和处理时间 环境激素莠去津对蚕豆、斑马鱼、蚯蚓的d n a 损伤及相关酶的影响 均有依赖性。 关键词：莠去津蚕豆斑马鱼蚯蚓氧化胁迫彗星试验 d n a d a m a g ea n de f f e c t so na n t i o x i d a t i v ee n z y m e s i n b r o a db e a n ，z e b r a f i s ha n de a r t h w o r m b ya t r a z i n e s o n g y a n ( c o l l e g eo fr e s o u r c ea n de n v i r o n m e n t ，s h a n d o n ga g r i c u l t u r eu n i v e r i s t y , t a i a n ，c h i n a ，2 7 1 0 1 8 ) a b s t r a c t i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t a k i n ga t r a z i n ea sam o d e lp o l l u t a n t ，e c o t o x i c i t yo f t h ep e s t i c i d e sw a se v a l u a t e db ys m d y i n gi t st o x i c i t ya n dt r a u m ae f f e c t so n v i c i af a b a ，d a n i or e r i oa n de i s e n i af o e t i d a t h ee f f e c t so na c t i v i t yo f s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，c a t a l a s e ( c a t ) a n dp e r o x i d a s e ( p o d ) o f a t r a z i n eo nv i c i af a b a ，d a n i or e r i oa n de i s e n i af o e t i d aw e r es t u d i e d r e s p e c t i v e l y f r o mt h eb i o c h e m i s t r ya s p e c t ，t o x i c i t ye f f e c t so ft h ep e s t i c i d e s o nv i c i a f a b a ，d a n i or e r i oa n de i s e n i a f o e t i d aw e r ee v a l u a t e d 。t r a u m ae f f e c t s o fa t r a z i n eo nd n aw e r et e s t e db yu s i n gs i n g l ec e l lg e le l e t r o p h o r e s i st e s t f r o mm o l e c u l el e v e l ，s o m ep r i m a r yd i s c u s s i o n so ft h e p o s s i b l ei n d u c e d m u t a t i o nw e r em a d ei nt h ee x p e r i m e n t s t h er e s u l t st o d db es u m m a r i z e da s f o l l o w s ： 1 e f f e c t so na c t i v i t yo fs u p e m x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，c a t a l a s e ( c a t ) ， p e m x i d a s e ( p o d ) o fa t r a z i n eo nv i c i af a b aw e r es t u d i e d ，a n dt h er e s u l t s s h o w e dt h a t ，t h es o d ，c a ta n dp o d a c t i v i t ya t2 5a n d10m g 蚝dt r e a t m e n t i n c r e a s e da tt h es t a r ta n dt h e nd e c r e a s e d ，w h i l ea t5 m g k 9 1 t r e a t m e n t i n c r e a s e di nt h ew h o l ee x p e r i m e n t 2 e f f e c t so na c t i v i t yo fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，c a t a l a s e ( c a t ) ， p e r o x i d a s e ( p o d ) o fa t r a z i n eo nd a n i or e r i ow e r es t u d i e d ，a n dt h er e s u l t s 2 s h o w e dt h a t ，c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l s t h es o da n dc a ta c t i v i t ya t2 5 m g l t r e a t m e n tw e r es i g n i f i c a n t l ys t i m u l a t e d w h i l et h ep o da c t i v i t ya t2 5 m g 。l t r e a t m e n tw a ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e d t h es o da c t i v i t ya t5 ，10 m g l 。1 i n c r e a s e da tt h es t a r ta n dt h e l ad e c r e a s e d w h i l et h ec a ta n dp o da c t i v i t i e sa t 5 10 m g l 叫f l u c t u a t e da ti n t e r v a l s ， 3 e f f e c t so na c t i v i t yo fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，c a t a l a s e ( c a t ) ， p e r o x i d a s e ( p o d ) o f a t r a z i n eo ne i s e n i af o e t i d aw e r es t u d i e d ，a n dt h er e s u l t s s h o w e dt h a t ，c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l s ，t h es o da c t i v i t ya t2 5 m g l 1 t r e a t m e n tw a si n h i b i t e d ，w h i l et h ec a ta n dp o da c t i v i t i e sa t2 5 m g l 。1 t r e a t m e n tw e r es i g n i f i c a n t l ys t i m u l a t e d t h es o da n dp o da c t i v i t i e sa tt h e5 m g l 。1 t r e a t m e n ti n c r e a s e da tt h es t a r ta n dt h e nd e c r e a s e d w h i l et h ec a t a c t i v i t ya tt h e5m g l 1 。t r e a t m e n tf l u c t u a t e da ti n t e r v a l s ，c o m p a r e dt ot h e c o n t r o l s t h es o da n dc a ta c t i v i t i e sa tt h el0 m g l 叫t r e a t m e n tw e r e s i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e d w h i l et h ep o da c t i v i t ya tt h e1 0m g l 1t r e a t m e n tw a s s i g n i f i c a n t l ys t i m u l a t e d 4 i nt h es i n g l ec e l lg e le l e t r o p h o r e s i st e s t ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，t h et a i l l e n g t h sa n do l i v et a i lm o m e n t so fv i c i af a b a ，d a n i or e r i oa n de i s e n i af o e t i d a w e r ee n h a n c e da f t e rt r e a t m e n tw i t hd i f f e r e n td o s e so fa t r a z i n eo nt h e7 m ，14 饥， 21 吼，a n d2 8 md ，a n dd n a f r a g m e n t a t i o ns h o w e dad o s e r e s p o n s er e l a t i o n s h i p ， a n ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sw e r ef o u n dc o m p a r e dt ot h ec o n t r o l s k e y w o r d s ：a t r a z i n e ；v i c i af a b a ；d a n i or e r i o ；e i s e n i af o e t i d a ；o x i d a t i v e s t r e s s ；c o m e ta s s a y 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 环境激素( e n v i r o n m e n t a lh o r m o n e ) ，又称“内分泌干扰物质”、“环境荷 尔蒙”，英文名e n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s 或e n d o c r i n ed i s r u p t o r s ，是一 类对人类健康和生态环境极其有害的化学物质。环境激素是2 0 世纪9 0 年代以来才引起世界重视的一种公害。1 9 7 7 年日本曾经提出过环境激素 这一概念，但是没有引起广泛的注意。1 9 9 6 年美国波士顿环境报记 者安达玛诺斯在被夺去的未来一书中把环境激素这一概念明确提了 出来，指出：环境激素是一种并不直接毒害生命的化学物质，但它以激素 的面貌对生物体起作用；即使数量极少，也会使生物体内的内分泌失调， 出现生殖器官畸形等诸多病变。世界卫生组织给环境激素作了严密的定 义：“使内分泌功能发生变化，并因此而对个体及其子孙或者集团( 部分是 亚集团) 产生有害影响的外因性化学物质或者混合物”。环境内分泌干扰物 可以模拟自然激素，抑制激素作用，或者改变免疫系统、神经系统和内分 泌系统正常的调节功能( t h o m a smc ，1 9 9 8 ) ，国外己有研究表明多种在环 境中广泛存在的有机化合物具有类雌激素作用，产生对水生生物特别是鱼 类繁殖的影响( j o b l i n gs ，1 9 9 8 ) ，例如抑制鱼类卵泡发育、改变鱼体内性激 素水平。 2 0 世纪中叶，为了提高单位面积上的粮食产量，各种农药相继被开 发出来，粮食生产率得以大幅度提高。特别是除草剂的使用，极大地减轻 了劳动强度，直接或间接地提高了农业的生产水平。但是，很快就发现许 多农药稳定性强、残留期长并且难于降解，从而对生态系统构成威胁，特 别严重的可导致动物及人类的死亡、疾病、畸形，对人类生存和繁衍造成 威胁。在已公布的6 7 种环境激素中杀虫剂、杀菌剂、除草剂占了4 4 种， 可见农药在环境激素中占有重要的份额。农药的毒性给人类和环境带来了 不利的影响，它决定了农药发展方向及具体品种取舍的关键因素，因此而 成为毒理学研究领域的一个热点( 徐培渝， 2 0 0 4 ) 。 1 1 莠去津的结构和理化性质 莠去津( a t r a z i n e ) ，又名氯乙异丙嗪，化学学名2 - 氯一4 一乙胺基- 6 一异丙 环境激素莠去津对蚕豆、斑马鱼、蚯蚓的d n a 损伤及相关酶的影响 胺基1 ，3 ，5 三嗪，属于三嗪类除草剂，分子式为c 8 h 1 4 c i n 5 ，分子量 2 1 5 7 ，结构式为： s 1 n 公n ll i 健外 ( c h 3 ) 2 c h n h 、n 7n h c 2 h 5 纯品为无色结晶，熔点1 7 3 c 1 7 5 c ，蒸气压4 0 1 0 p a ( 2 0 c ) ，2 5 c 时在水中的溶解度为3 3 m g l ，正戊烷中为3 6 0 m g l ，二乙醚中为 2 0 0 0 m g l ，醋酸乙酯中为2 8 ，0 0 0 m g l 一，甲醇中为1 8 ，0 0 0 m g l ，氯仿 中为5 2 ，0 0 0 m g - l 。在微酸及微碱介质中较稳定，在较高的温度下能被较 强的酸和较强的碱水解。原粉为白色粉末，纯度在9 2 以上( 王险峰， 2 0 0 0 ) 。 1 2 莠去津的应用概况及存在问题 莠去津属选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，适用于玉米、高粱、 甘蔗、茶园、果园和林地及铁路等防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草，对 多年生杂草也有一定的抑制作用( 中国化工产品大全，1 9 9 4 ) 。现在生产上 常用的多为莠去津与酰胺类除草剂乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺的混配制 剂。 该除草剂自1 9 5 9 年投入商业生产以来，在世界各国得到了大面积的 推广和使用。在美国，莠去津被列为最广泛使用的除草剂之一，每年喷洒 3 5xl0 h ( a g e n c yf o rt o x i cs u b s t a n c e sa n dd i s e a s er e g i s t r y , 2 0 0 3 ) ，占其除 草剂使用量的6 0 。在日本，莠去津于1 9 6 5 年作为农药登录，现在全日 本每年的生产量为1 7 5 0 t ，产值达3 0 亿日元。我国从2 0 世纪8 0 年代初 开始使用，近年来使用面积不断扩大，1 9 9 6 年莠去津全年的使用量为 1 8 0 0 t ，1 9 9 8 年为2 1 3 0 t ，1 9 9 9 年为2 2 0 5 t ，2 0 0 0 年为2 8 3 5 2 t ( 束放，2 0 0 0 ) ， 每年用量平均以2 0 的速度递增。 莠去津虽然是一种低毒除草剂，但由于其残留期长( 4 - - - 5 7 周) ，多年 的投入使用，形成了对土壤、水体等自然媒介的污染( g f r e r e re ta 1 ，2 0 0 2 ； 6 山东农业人学硕士学位论文 g ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 。近年来，人们从环境中不断检测到残留的莠去津，因而 环境中莠去津的污染和防治也日益引起学术界和公众的关注。 1 3 莠去津对环境的污染状况 莠去津的广泛应用，导致了严重的环境污染。许多莠去津使用历史较 长的国家的地表水和地下水均受到了不同程度的污染。美国环保署报道， 在美国大约2 5 个州的地下水中检测到了莠去津。1 9 8 7 年，在对爱荷华州 的公共水系的调查中发现，离农药销售点1 0 0 0 英尺范围内的1 8 口井中的 1 6 口井中能够检测到包括莠去津在内的农药；在爱荷华州2 8 个销售点的 土壤、地表水和地下水中能够检测到高剂量的农药，在土壤中莠去滓的最 大含量为1 1 0 0 9 9 g ，在地表水中为1 6 9 9 - l 一，地下水中为1 5 0 0 9 9 l ， 均超过美国环保署规定的最大安全浓度3 9 9 l ( f a w c e t t ，1 9 8 9 ) 。在1 9 9 1 1 9 9 2 年美国u s g s 调查发现，w e s tl a k e 湖的1 3 个水样中有1 1 个水样的 莠去津的浓度超出了饮用水的标准。h o f f m a n 等( 2 0 0 0 ) 在对美国8 条城市 河流中农药含量作比较时，发现莠去津、西玛津、甲草胺等除草剂被检出 率很高。在对加拿大魁北克市y a s m s k a 河河口附近的水域及其5 个直流 的研究发现，莠去津的最高浓度一般超过了加拿大为保护水生生物而制定 的水质标准， 2 p g k g ( m a g u i r e ，1 9 9 3 ) 。 很多水样中不但检测到了莠去滓而且还检测出了其代谢产物，如脱烷 基代谢产物d e a ( d e s e t h y l a t r a z i n e ) 、d i a ( d e i s o p r o p y l a t r a z i n e ) 、 d e i ( d e s e t h y l d e i s o p r o p y l ) ( p u c a r e v i ce ta 1 ，2 0 0 2 ) 矛u 羟基水解产物h a ；水样 中这些代谢产物的浓度已超出母体的浓度，有时甚至可超出莠去津母体浓 度的1 0 倍左右( c l a ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。1 9 9 6 年，美国u s g s 再次对夏威夷的 地下水进行调查，发现5 0 的水井样品都能检测到除草剂莠去津和其脱 乙基代谢产物d e a ( d e s e t h y l a t r a z i n e ) 。法国t i s s e a u 通过七年的研究调查 发现，巴黎地下水中d e a 的含量已超出母体莠去津( t i s s e a ue ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 莠去津在环境中的持留期较长。研究发现，莠去津在土壤表层中的 消解分为两个阶段：最初12 天衰变一半，而后4 7 年衰变一半( t h o m a sa n d m o o r m a n ，1 9 9 7 ) 。由于莠去津在土壤中残留期较长，德国从1 9 9 1 年开始 7 环境激素莠去津对蚕豆、斑马鱼、蚯蚓的d n a 损伤及相关酶的影响 停止使用莠去津，但是莠去津及其衍生物仍可检测到。在研究莠去津污染 的水田时发现，切断污染源1 年后，在农田灌溉水中仍能检测出莠去津的 残留；在作物生长期内也可以在作物体内检测到莠去津残留( 王立仁等， 2 0 0 0 ) 。此外，残留在土壤中的莠去津可以与c d 、z n 、c u 等重金属结合 形成复合物，也有一部分与土壤腐殖质相结合( m a n d e l b a u me ta 1 ，1 9 9 3 b ) 。 研究表明，莠去津在有机质含量高的土壤中年结合残留量高达5 4 ( k h a n ， 1 9 9 5 ，s i e b e r s ，1 9 9 4 ) ，且通过自然环境因素的相互作用无法去除这些结合 残留物。因而，这种结合残留对整个生态系统构成潜在的威胁。 此外，莠去津可以通过挥发和浮尘进入大气，并通过干沉降和湿沉 降返回地面。因此，它对生态环境的影响具有全球性，已引起世界各国的 重视。在德国b i g h t 地区的莠去津的年度大气沉降为2 0 i ，t g m 一( b e s t e re ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。在温暖的季节，瑞典的降雨中含有莠去津，作者认为是由于莠去 津的挥发和风蚀的作用，导致了莠去津在大气和降雨中出现，从而使高山 湖泊中也检测到了莠去津( b u s t e r , 1 9 9 0 ) 。美国衣阿华州，在4 - 8 月间降 雨中也能够检测到莠去津，浓度为o 1 - 一4 0 9 9 l 一。 我国在2 0 世纪8 0 年代开始使用莠去津，到2 0 世纪9 0 年代在华北、 东北地区的得到广泛推广和大量应用。代表性莠去津生产厂家有吉林吉 化、河北宣化农药厂和浙江长兴，莠去津原粉产量可达7 0 0 0 - - 一8 0 0 0t a 。 虽然生产时间不长，但这三个地区均已发生过严重的农田污染事件，并在 媒体公开报道过。我国在管理和监控莠去津污染方面采取措施比较晚， 1 9 9 6 年制定了农作物中莠去津最大残留限量标准，玉米、甘蔗中的含量 o 0 5 m g k g ，( g b16 3 2 3 一l9 9 6 ) ；2 0 0 2 年规定莠去津在地表水i 、i i 、 i i i 类水域中的特定项目标准值为3 9 9 l ( g b 3 8 3 8 2 0 0 2 ) 。任晋( 2 0 0 2 ) 对张 家口地区洋河流域和官厅水库中莠去津及其降解产物进行了调查研究，结 果在宣化农药厂排污口以下的地表水中均检出莠去津及其毒性代谢产物 d e a 和d i a ，大部分超出地表水中3 9 9 l q 的标准；在农药厂周围的深井 水中已发现莠去津及其降解产物；在官厅水库及其下游永定河中均检出莠 去津及其代谢物d e a 、d i a 和h a ，且d e a 浓度最高，为d i a 和h a 浓 度的2 1 0 倍。官厅水库为北京市重要的地表水源，在官厅水库及下游永 定河中检测出莠去津及其代谢产物，说明莠去津已进入北京地表水系，值 8 山东农业大学硕士学位论文 得引起注意。利用多介质环境模型对白洋淀地区的土壤、地下水和玉米中 3 0 年莠去津的含量进行了预测，结果表明，在莠去津开始施用1 0 年后， 在地下水中的浓度将超过美国环保局( e p a ) 规定的3 9 9 l 。1 饮水标准；5 年 后在玉米籽粒中的含量将接近加拿大规定o 1 m g k 手1 的最高允许浓度( 叶 常明等，2 0 0 0 ) 。 1 4 莠去津的生态毒理学效应 莠去津对水体中的低等动物毒性极大( p h y ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。当莠去津的 浓度为0 5 2 m g - l 1 时，能使水底节肢动物的数量减少一半，长期接触莠 去津的雌雄黑鲈鱼体内酮丁糖和求偶激素雌二醇浓度增加，但蜻蜓和鞘翅 目的幼虫数量却增加了一倍。由于水体中莠去津直接的毒性作用或对食物 链的破坏，从而对所有的水生植物产生不良影响。莠去津能有效抑制植物 和藻类的光合作用和生长。莠去津的浓度达1 5 p m o l l 1 时小球藻的生长立 即受到抑错i j ( e l s h e e k he ta 1 ，1 9 9 4 ) 。莠去津对绿藻生长的影响表现为阻碍 绿藻细胞数量的增加，其作用机理与莠去津对水稻等作物的致毒机理相似 ( l e b o u l a n g e re ta 1 ，2 0 01 ；w e i n e re ta 1 ，2 0 0 4 ；d o r i g oe ta 1 ，2 0 0 4 ) 。土壤中的 莠去津能刺激黄曲霉、托姆青霉、蠕形青霉的繁殖对土壤中微生物产生毒 害作用，显著降低土壤微生物生物量碳的含量( b 6 r a r de ta 1 ，2 0 0 3 ；o k a m u r a e ta 1 ，2 0 0 0 ；h a n s o na n ds o l o m o n ，2 0 0 2 ) 。 毒理学研究表明，莠去津是一种内分泌干扰抑$ 1 j 齐t j ( h a y e se ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。每天强制给出生4 6 - - 一4 8 天后的小鼠喂食浓度为5 0 m g k g 。1 体重的莠 去津，小鼠体内睾丸激素的浓度显著下降大约5 0 ：莠去津能抑制睾丸激 素的产生，但小鼠体内羟基胆固醇的存在能减轻甚至阻止莠去津对睾丸激 素的抑制作用。目前，仍不清楚莠去津对睾丸激素的作用机n ( f r e n d m a r m ， 2 0 0 2 ) 。将蝌蚪放在含有不同浓度莠去津的水中，结果发现，0 。1 g l 。1 的莠 去津水溶液就能导致青蛙产生雌雄同体现象；将雄性青蛙放在浓度为 2 5 9 9 l o 的莠去津水中观察，青蛙体内睾丸激素的浓度显著下降( d a l t o n ， 2 0 0 2 ；h a y e se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。当把在含有莠去津的淡水中喂养的大麻哈鱼转移 到与淡水中含相同莠去津浓度的海水中时，大麻哈鱼降低了在海水中生存 9 环境激素莠去津对蚕豆、斑马鱼、蚯蚓的d n a 损伤及相关酶的影响 的能力( w a x i n ga n dm o o r e ，2 0 0 4 ) 。 莠去津对人体影响的数据很少。有研究报道，莠去津可能对人体具 有致癌性，长期接触莠去津会导致乳腺癌和卵巢癌的发生( s u s a n n e ，1 9 9 2 ； t h o m a s ，1 9 9 9 ) 。因此，美国e p a 把莠去津列为可能的致癌物。但研究莠 去津对培养的人体淋巴细胞的基因毒性作用表明，莠去津具有弱细胞毒 性，但不会引起染色体畸变的反应( r i b a se ta 1 ，1 9 9 8 ) 。美国e p a 规定饮用 水中莠去津的浓度不超过3 9 9 l 。但研究发现，h a m s t e r 细胞的染色体暴 露在该剂量下，4 8 小时后发生断裂，而人体内相同的染色体的断裂会致 癌和致畸。但莠去津对人体的危害至今结论尚不一致。 莠去津代谢产物可根据其毒性分为两类：一类是毒性与莠去津相似 的脱烷基代谢产物d e a 、d i a 和d a c t ( g e i g yc o r p o r a t i o n ，1 9 9 3 ) i 另一 类是毒性很小的羟基取代代谢物( h a 、d e h a 、d i h a ) 。但是，莠去津的 羟基代谢产物h a 对大鼠也具有毒性，半数致死量大于3 9 k g ，但是没有 致畸和致突变作用。除h a 外，莠去津的大部分羟基代谢物被认为是无毒 的。 1 5 生物毒性实验的指示生物 农药对生物的毒理作用主要取决于毒性程度和暴露水平，化学监测 的手段虽然已经精确测定化学物质，甚至是痕量的浓度，但农药对生物的 毒性作用只能通过生物测试的手段来获得。污染物接触生物体后，导致细 胞蛋白质和核酸结构改变，细胞膜破裂而使正常细胞膜生物功能破坏，这 些都会不同程度地破坏生物体正常的生命活动，从而表现出毒性。生物学 指标是以生物体有关生化反应指标表征污染危害效应，达到对污染物毒性 程度及其浓度作出定量检测的目的( w a l k e r , 19 9 5 ) 。 在常用的指示生物中，蚕豆是经典的研究好材料，它具有三个优点： ( 1 ) 染色体数目少( 2 n = 1 2 ) ，个体较大，便于观察分析；( 2 ) 生长速度快，其 根尖的分生组织细胞周期在适宜条件下仅2 0 h 左右，而且大部分时间处于 对诱变剂敏感的问期；( 3 ) 实验重复性好，可信度高( r e e d ，1 9 5 9 ) 。蚕豆与 小鼠在分类上属于同一个层次，蚕豆细胞染色体的损伤可以在一定程度上 1 0 山东农业火学硕士学位论文 反映同样暴露条件下高等动物遗传物质的损伤( 陈光荣等，1 9 8 3 ) 。 蚯蚓是维持土壤肥力的重要生物，它是陆生生物与土壤生物之间的 传递污染物的桥梁，是农田生态系统中土壤物质生物小循环中的重要一 环。蚯蚓在土壤中有机物质的分解转化上具有重要作用，同时其活动可以 改善土壤的结构，增强土壤的透气和排水保水功能，因此在土壤中保持健 康的蚯蚓生态种群对于土壤环境的保护具有重要价值。而从生态学上来 看，蚯蚓处于陆地生态食物链的底部，对大部分杀虫剂和重金属都具有富 积作用。这些被富积的化学物质可能并不对蚯蚓造成严重的伤害，但却可 能影响食物链中更高级的生物( 张壬午，1 9 8 6 ) 。蚯蚓作为土壤的污染的指 示生物己得到了广泛的应用。人们研究发现，蚯蚓的生存、发育的健康状 态反映了土壤的污染状况。大量的研究发现：农药污染影响蚯蚓的种群的 数量和分布( 王振中等，1 9 9 6 ) ，影响蚯蚓的生长、活动及生殖过程( c a p o w i e z e ta l ，2 0 0 2 ；夏卫生等，l9 9 4 ：宋玉芳等，2 0 0 5 ) ，影响蚯蚓体内酶活。i _ 生( h a n s e ta l ，1 9 9 3 ；钟远等，1 9 9 9 ) ，影响蚯蚓的细胞、组织结构形态( t l 志明等， 1 9 9 9 ) ，甚至对蚯蚓d n a 也产生了很大的影响( 陈颖等，2 0 0 5 ) 。同时蚯蚓 对某些污染物比许多其他土壤动物更为敏感，因此利用蚯蚓作为土壤环境 的指示生物，可以提供一个保护整个土壤动物区系的安全域值。此外蚯蚓 体型较大，分布广泛，易于养殖，因此十分便利于研究和监测工作的进行。 斑马鱼( d a n dr e r i o ) ，是国际公认的发育生物学模式动物( o b e r e m ， 2 0 0 0 ) 。具有体型小、繁殖速度快，饲养管理简便、其胚胎的整个发育过 程透明可见，荧光染色或使用其它标记物可使细胞系观察得更清楚 ( c o o p e re ta l ，1 9 9 9 ) 等优点，为研究其发育过程中毒性的影响提供了便利 条件，有很多国际组织和国家已将它作为制定环境毒性标准的模式动物 ( o e c d ，2 0 0 2 ) ，o e c d 在1 9 9 6 年将斑马鱼胚胎发育方法列入测定单一化 学品毒性的标准方法之一，并制定了详细的操作指南( o e c d ，1 9 9 6 ) 。自 2 0 世纪7 0 年代末起，斑马鱼已用于环境中许多化学物的累积效应的研究， 例如用于研究锌、镉、硒、汞、钴、镍、铁、铜、铅、铬及有机物如苯酚、 苯胺、环己胺以及其衍生物( v i t o z z ia n dd ea n g e l i s ，1 9 9 1 ) 。2 0 世纪9 0 年 代初，斑马鱼开始被用于混和化学物的检钡j j ( e n s e n b a c ha n dn a g e l ，19 9 5 ) 及其中一种化学物相对其它化学物的生物累积效应的研究( r i b e y r ee ta l ， 环境激素莠去津对蚕豆、斑马鱼、蚯蚓的d n a 损伤及相关酶的影响 1 9 9 5 ) 。利用斑马鱼对一系列环境毒物包括致癌物进行短期及长期的暴露 效应研究都比较方便。环境毒物的慢性生物学效应鉴定可使用斑马鱼的整 个生命周期试验以检测死亡率、生长抑制情况、生殖毒性以及发育毒性和 神经行为毒性( g a h t a ne ta l ，2 0 0 2 ；j o b l i n ge ta l ，19 9 8 ) 。 1 6 本文研究内容 随着生态环境问题的日益突出，生态毒理的研究尤为紧迫而具有意 义。其研究的核心就是生态毒理效应，即有毒、有害物质对生命有机体危 害的程度与范围的研究以及剂量效应关系的确定。随着环境污染出现新 的特点以及人类对环境毒物认识的不断深入，生态毒理研究将朝着深入探 讨环境毒物作用机理；揭示环境毒物及次生毒物的化学结构、浓度同它们 的生态毒性之间的关系；充分吸收分子生物学的最新成就，加强分子生态 毒理学的研究，提高生态毒理效应的微观认识水平的方向发展。农药作为 一类有毒化学品，其大量重复使用，使土壤及地下水的污染态势日趋严峻， 其生态毒理研究尤为重要。 本论文拟进行以下研究： ( 1 ) n 定莠去津对蚕豆的氧化胁迫和基因毒性； ( 2 ) n 定莠去津对斑马鱼的氧化胁迫和基因毒性； ( 3 ) n 定莠去津对蚯蚓的氧化胁迫和基因毒性； 从生物化学和分子水平两个方面评价莠去津对蚕豆、斑马鱼和蚯蚓的 毒性效应，探讨其可能的诱变作用，为正确评价莠去津对细胞遗传物质的 毒性，合理的使用农药，提供科学依据。 1 2 山东农业人学硕l 学位论文 2 材料与方法 2 1 药品试剂 莠去津纯度9 5 5 丙酮分析纯 氮蓝四唑生化试剂 甲硫氨酸生化试剂 无水乙醇分析纯 盐酸分析纯 磷酸分析纯 双氧水3 0 分析纯 冰乙酸分析纯 溴化乙锭生化试剂 核黄素生化试剂 愈创木酚生化试剂 氢氧化钠分析纯 磷酸二氢钠分析纯 磷酸氢二钠分析纯 氯化钠分析纯 氯化钾分析纯 正常熔点琼脂糖生化试剂 低熔点琼脂糖生化试剂 愈创木酚甘油醚生化试剂 乙二胺四乙酸分析纯 碳酸钙分析纯 台盼兰生化试剂 乙二胺四乙酸二钠分析纯 二甲基亚砜分析纯 曲拉通生化试剂 肌氨酸钠生化试剂 山东京博农化有限公司 天津市永大化学试剂开发中心 上海恒星应用化学研究所 上海伯奥生物技术有限公司 天津市广成化学试剂厂 山东省莱阳市化工厂 莱阳市双双化工有限公司 天津市永大化学试剂开发中心 天津市博迪化工有限公司 s i g m a 公司 上海蓝季科技发展有限公司 国药集团化学试剂有限公司 博山化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂 天津市永大化学试剂开发中心 国药集团化学试剂有限公司 天津市盛奥化学试剂有限公司 宜兴市钮家化学试剂厂 s i g m a 公司 天津市巴斯夫化工有限公司 中国江苏南京中山集团公司化工厂 北京索莱宝科技有限公司 天津市大茂化学试剂厂 国药集团化学试剂有限公司 天津市科密欧化学试剂开发中心 s i g m a 公司 环境激素莠去津对蚕豆、斑马鱼、蚯蚓的d n a 损伤及相关酶的影响 磷酸二氢钾分析纯 三羟甲基氨基甲烷生化试剂 考马斯亮蓝g 2 5 0生化试剂 牛血清白蛋白生化试剂 2 2 仪器设备 天津市大茂化学试剂厂 上海伯奥生物技术有限公司 上海伯奥生物技术有限公司 上海伯奥生物技术有限公司 h p g 2 8 0 b 型光照培养箱哈尔滨东联电子技术开发有限公司 h p s 2 8 0 型生化培养箱哈尔滨东联电子技术开发有限公司 2 0 2 型电热鼓风干燥箱龙口先科仪器公司 b c d 2 0 0 c 冰箱青岛海尔集团 p h s j 一3 f 精密p h 计上海精密雷磁公司 奥林巴斯5 1 荧光显微镜日本o l y m p u s 电泳仪日本b i o r a d 公司 c e 粤f u g e 5 8 0 4 台式高速冷冻离德国e p p e n d 。r f 公司 心机 可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司 k d m 电子调温电热套山东省龙口市先科仪器公司 k q 5 0 0 d b 型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 万分之一电子分析天平德国s a r t o r i u s 公司 百分之一电子分析天平德国s a r t o r i u s 公司 微量取液器( 2 0 0 9 l 、l m l 、5 m l )德国e p p e n d o r f 公司 u v 7 6 2 紫外可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司 电热恒温水浴锅北京长风仪器仪表公司 纯水仪美国m i l l i p o r e 公司 y s l 0 0 光学显微镜日本产 r c t b a s i c 磁力加热搅拌器德国i k a 产 培养皿( d - - 1 8 c m ) 、刻毒试管、解剖针、眼科剪、研钵、试管、离心 管、移液管、洗瓶、烧杯、容量瓶、载玻片、盖玻片、滴管等实验室常规 玻璃仪器。 1 4 山东农业人学硕士学位论文 2 3 供试材料 2 3 1 供试植物 松滋青皮_ 豆( v i c i a f a b a ) ，由华中师范大学生命科学学院遗传学教研室 筛选出来的微核试验敏感品种。种子成熟晒干后用牛皮纸袋装好放入4 c 冰箱内保存备用。 2 3 2 供试水生动物 斑马鱼( d a n i or e r i o ) ，购于泰安市其鑫水族馆，在实验室2 6 士1 条件 下驯养1 周，每日保持1 2 h 的光照，自然死亡率 o o o 捌 米 督 o 2o 40 60 8 蛋白质浓度m g m l 。1 p r o t e i nc o n c e n t r a t i o n 图1 标准曲线 f i g 1t h es t a n d a r dc u r v e 2 4 1 2 2 2 莠去津处理蚕豆酶源蛋白质含量测定 取酶液0 1 m l ，用制定标准曲线的方法测5 9 5 n m 吸光度，用标准曲 线计算蛋白质含量，若样品蛋白质浓度过高，可适当稀释后再测定，使 o d 值在标准曲线内。 2 4 1 2 3 超氧化歧化酶( s o d ) 活性测定 2 4 1 2 3 1 试剂配制 ( 1 ) 0 2 m o l l 以n a 2 h p 0 4 溶液：用蒸馏水溶解3 5 8 2 9n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 并定容至5 0 0 m l 。 ( 2 ) 0 2 t o o l l n a h 2 p 0 4 溶液：用蒸馏水溶解3 1 2 1 9n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 并 定容至1 0 0 m l 。 ( 3 ) 0 0 5 m o l l 以磷酸盐缓冲液q h = 7 8 ) ：吸取9 1 5 m l 0 2 m o l l n a 2 h p 0 4 溶液和8 5 m l0 2m o l l n a h 2 p 0 4 溶液，用蒸馏水定容至 山东农业火学硕士学位论文 4 0 0 m l 。 ( 4 ) 1 3 0 m m o l l 1 甲硫氨酸溶液：用0 0 5 m o l l 1 磷酸盐缓冲液溶解 1 9 3 9 9 9 甲硫氨酸并定容至1 0 0 m l 。 ( 5 ) 7 5 0 i ，t m o l l 。氮蓝四哗溶液：用o 0 5 m o l l 1 磷酸盐缓冲液溶解 0 0 6 1 3 3 9 氮蓝四唑并定容至1 0 0 r n l ，避光保存。 ( 6 ) 1 0 0 1 a m o l l e d t a n a 2 ：用0 0 5 t o o l l 1 磷酸盐缓冲液溶解0 0 3 7 2 1 9 e d t a n a 2 并定容至10 0 0 m l 。 ( 7 ) 2 0 9 m o l l 。1 核黄素：用蒸馏水溶解0 0 0 7 5 3 9 核黄素并定容至10 0 0 m l ，避光保存。 ( 8 ) 反应液：由水：磷酸缓冲液：甲硫氨酸：氮蓝四唑：e d t a n a 2 ： 核黄素= 5 ：3 0 ：6 ：6 ：6 ：6 的混合溶液组