毕业设计（论文）-柠檬酸对小鼠肝细胞凋亡的影响.doc

河 南 科 技 大 学毕 业 设 计（论 文）柠檬酸对小鼠肝细胞凋亡的影响EFFECT OF CITRIC ACID ON MICE LIVER CELL APOPTOSIS姓 名 马 振 斌 院 系 动物科技学院 专 业 动 植 物 检 疫指导教师 陈 晓 光 2012年 6月 6日毕业设计（论文）任务书（指导教师填表） 填表时间：2012年1月3日学生姓名马振斌专业班级动植物检疫081班指导教师陈晓光课题类型论文题目柠檬酸对小鼠肝细胞凋亡的影响主要研究内容本实验拟通过检测不同浓度柠檬酸对小鼠肝脏组织凋亡的影响，从而了解柠檬酸对肝脏的毒副作用。主要研究内容如下： （1）检测柠檬酸对肝细胞DNA破坏程度的影响； （2）检测柠檬酸对Caspase-3活性的影响。主要技术指标(或研究目标)1. 要求能够独立查找资料，独立完成实验项目；2. 要求完成与本专业相关的英文文献翻译工作，文章要求10000个字符；3. 本项试验查阅20篇以上与本题有关的文献资料；撰写不少于1万字的论文；中文摘要400字以上，且译成外文；独立完成1万字以上印刷字符与本题有关的外语译文。进度计划1. 2012.2中旬 查找和阅读有关资料，撰写开题报告；2. 2012.2下旬2012.3上旬 完成开题报告，购买有关的实验试剂，完成预期实验工作；3. 2012.3下旬2012.4下旬 完成正式试验，收集试验数据完成数据分析4. 2012.5 完成毕业论文的撰写工作；5. 2012.6上旬 完成论文的修改、审阅、评阅工作，如期进行论文答辩主要参考文献1. 沈立明，兰子尧，刘琼，等.柠檬酸镧诱导肿瘤细胞凋亡的研究J.中国稀土学报，2009，27(3)：441-446.2. 张自强，刘玉梅，邓雯，等.柠檬酸对小鼠肝脏组织氧化应激的影响J.西北农业学报，2011，20(4)：16-19.3. Biyah K, Molimard M, Emonds-Alt X, et a1. SR 140333 prevents potentiation by citric caid of plasma exudation induced by histamine in airwaysJ. Europen Journal of Pharmacology, 1996, 308(3): 325-328.4. Aktac T, Kaboglu A, Bakar E, et a1. The short-term effects of single toxic dose of citric acid in miceJ. Journal of Cell and Molecular Biology, 2003, 2: 19-23.5. Ylmaz S, nal F, Yzbasolu D, et al. Clastogenic effects of food additive citric acid in human peripheral lymphocytesJ. Cytotechnology, 2008, 56(2): 137-144.教研室主任签字： 年 月 日24 柠檬酸对小鼠肝细胞凋亡的影响摘 要目的：通过检测不同剂量的柠檬酸对小鼠肝脏细胞凋亡的影响，探讨柠檬酸对肝脏的毒副作用。方法：将40只健康昆明系小白鼠随机分为四组，每组10只。通过腹腔注射不同浓度的柠檬酸，建立实验动物模型：正常对照组（生理盐水）；低剂量组组（柠檬酸：120 mg/kgbw）；中剂量组（柠檬酸：240 mg/kgbw）；高剂量组（柠檬酸：480 mg/kgbw）。每周注射1次，连续3周，第3次注射后一周取小鼠肝脏，制成0.5%组织匀浆液。用Caspase-3酶活性检测试剂盒检测各实验组样品中Caspase-3酶活性；用DNA Ladder方法检测各实验组肝细胞的凋亡情况。结果：（1）Caspase-3酶活性检测发现，与对照组相比，柠檬酸低、中剂量组Caspase-3活性增加，有极显著差异（P0.01），高剂量组亦有显著差异（P0.05）。（2）DNA ladder图谱显示，对照组中没有出现凋亡特征性的DNA“梯状”条带；低、中、高剂量组均中出现5条典型的DNA“梯状”条带。结论：与其它剂量柠檬酸处理组相比，中剂量的柠檬酸（240 mg/kgbw）对小鼠肝细胞的凋亡诱导作用更为明显。关键词：柠檬酸，小鼠，肝脏，细胞凋亡EFFECT OF CITRIC ACID ON MICE LIVER CELL APOPTOSISABSTRACTObjective: By detecting the effect of citric acid on mice liver cell apoptosis and to explore its toxic and side effects on liver. Method: Fouty healthy Kunming mice were randomly divided into 4 groups of 10. Animal models were established by intraperitoneal injection of different concentrations citric acid：the control group (normal saline), low dose group (citric acid: 120mg/kgbw), middle dose group (citricacid: 240mg/kgbw), high dose group (citric acid: 360mg/kgbw), injection dose is 0.2 ml.Once time per week, continuous infusion for 3 weeks, after the third injection on day 7 all mice were sacrificed cervical, whichever is the liver. Produced 0.5% of the liver tissue. Caspase-3 active detection kit and take an examination of MaSiLiang LAN protein determination kit were respectively used to detect various samples Caspase-3 enzyme activity and protein content. DNA Ladder extraction kit was used to processing samples, and analysis the DNA Ladder through the agarose gel electrophoresis. Result: (1) Caspase-3 enzyme activity detection result showed that compare with the control group the level of unit weight protease vigor increased in low dose group and middle dose group, very significant difference (P0.01). High dose group also has significant difference (P0.05). (2) The DNA Ladder detection result display that there are no DNA ladder shape strip in the control group . There are 5 typical DNA ladder shape strip appear in the the other three groups. Conclusion: The results indicated that middle doses of citric acid( 240 mg/kgbw) increased mice liver cell apoptosis degree, and has a certain stimulative effect .KEY WORDS: citric acid, mice, liver, cell apoptosis 目 录1 前 言11.1 柠檬酸的理化性质及作用11.1.1 柠檬酸的理化性质11.1.2 柠檬酸的应用11.2 柠檬酸的毒性作用21.3 细胞凋亡31.3.1 细胞凋亡31.3.2 Caspase-3与细胞凋亡31.3.3 DNA损伤与细胞凋亡41.4 本研究的目的及意义42 材料与方法52.1 实验动物分组及处理52.2 主要的仪器设备、试剂及其配制52.2.1 主要仪器设备52.2.2 主要试剂52.2.3 主要药品及试剂的配制62.3 方法62.3.1 小鼠肝脏组织采集及组织匀浆制备62.3.2 样品Caspase-3酶活性的测定62.4 数据处理93 结果103.1 柠檬酸对小鼠肝脏细胞Caspase-3活性的影响103.1.1 pNA标准曲线103.1.2 小鼠肝细胞Caspase-3的酶活力103.2 柠檬酸对DNA损伤的影响114 分析与讨论125 结论13参考文献14致 谢16外文资料译文171 前 言 柠檬酸又名枸橼酸，是一种重要的有机酸，是参与机体三羧酸循环的重要化合物。凭借其优良的理化性质以及生物技术的进步，柠檬酸被广泛应用于食品、医药和日化等行业。随着柠檬酸的广泛使用，针对柠檬酸的各项研究也在不断地深入。 而其对机体的毒副作用也逐渐引起研究者们的关注。大量的研究提示，长期大量使用外源性柠檬酸对机体存在一定的危害。1.1 柠檬酸的理化性质及作用1.1.1 柠檬酸的理化性质柠檬酸最早被8世纪的伊朗炼金术士贾比尔发现。在1784年，C.W.舍勒首次从柠檬汁中结晶分离出柠檬酸。从结构上讲，柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此与其他羧酸有相似的物理和化学性质，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。在物理性质上，柠檬酸为无色半透明晶体，或白色颗粒，或白色结晶性粉末，无臭，虽有强烈酸味但令人愉快，稍有一点后涩味。它在温暖空气中会逐渐风化，在潮湿空气中微有潮解性，溶于水、乙醇、乙醚，不溶于苯，微溶于氯仿，水溶液显酸性。柠檬酸结晶形态因结晶条件不同而不同，有无水柠檬酸C6H8O7，也有含结晶水的柠檬酸2C6H8O7H2O、C6H8O7H2O或C6H8O72H2O。 结晶时控制适宜的温度可获得无水柠檬酸。商品化柠檬酸主要是无水柠檬酸和一水柠檬酸（C6H8O7H2O）。 当加热至175 时它会分解产生二氧化碳和水，并剩余一些白色晶体。1.1.2 柠檬酸的应用随着工业技术的快速发展，柠檬酸及柠檬酸盐被越来越多的应用于不同行业。在食品加工工业，由于柠檬酸有温和爽快的酸味，普遍用于各种饮料、汽水、葡萄酒、糖果、点心、饼干、罐头果汁、乳制品等食品制作中。在所有有机酸中，柠檬酸的市场占有率在70%以上。其中，一水柠檬酸可用作食用油的抗氧化剂，也可改善食品的感官性状，增强食欲和促进体内钙、磷物质的消化吸收。无水柠檬酸被大量用于固体饮料加工。柠檬酸盐如柠檬酸钙和柠檬酸铁可作为某些食品中需要添加钙离子和铁离子的强化剂。在化学技术上，柠檬酸可作化学分析用试剂，用作实验试剂、色谱分析试剂及生化试剂；用作络合剂，掩蔽剂；用以配制缓冲溶液。柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液由于其蒸气压低、无毒、化学性质稳定、对SO2吸收率高等原因，可用于烟气脱硫1，是极具开发价值的脱硫吸收剂。柠檬酸作为果酸的一种，能加快角质更新2，因此还常用于乳液、乳霜、洗发精、美白用品、抗老化用品、青春痘用品中。 在畜禽养殖业，柠檬酸常作为仔猪饲料的添加剂，可以提早断奶，提高饲料利用率5103。 皮守祥等在日粮中添加柠檬酸育肥猪试验中发现每千克饲料中添加柠檬酸粉20 g，试验组比对照组日少耗料0.37 Kg，均重比对照提高16.6%，饲料转化率可提高9.73%4。在水产饲料中添加柠檬酸可提高胃蛋白酶的活性，降低饲料的pH值，使水产动物胃内的pH值下降，从而促进无活性的胃蛋白酶原转化为有活性的胃蛋白酶5。研究显示添加0.75% 柠檬酸可显著提高21日龄肉仔鸡的屠宰率6。也有报道称0.05%0.55% 柠檬酸添加量显著降低软蛋率和破蛋率7。在医疗方面，邢书霞等在柠檬酸与热力联合杀菌作用的研究中发现，柠檬酸与80 温度联合作用具有良好杀灭细菌芽孢的作用，并有效杀灭血液透析机管路中污染的细菌芽孢8。由于柠檬酸离子由于与血中钙离子结合可形成难以解离的可溶性络合物，从而降低了血中钙离子浓度，达到抗凝作用。基于这一作用机理，柠檬酸被用于血液透析中。简讯等人研究发现，与传统血液透析相比，构椽酸透析能使碱血症发生率降低9。1.2 柠檬酸的毒性作用随着科技的进步，柠檬酸越来越多的用于食品、工业、化工等方面，这也就意味着人类接触柠檬酸的机会越来越多。柠檬酸对机体的副作用也日趋显现，如在2004年流行病学调查中发现，儿童饮料中毒生化检验中显示明显的低血糖，患儿抽搐症状较明显，体检证实肝脏压疼并肿大，这一系列的症状均与儿童饮料中添加柠檬酸有关。1987年张幼辰等研究发现，柠檬酸在一定浓度下对小鼠具有致畸作用10；2003年蒋东升等发现，柠檬酸对机体能产生不良影响，认为长期饮用含柠檬酸的饮料可使小鼠肝脏受损11；2004年秦淑贞等对添加柠檬酸对小鼠毒理作用进行了观察，结果发现各实验组末期体重均低于对照组，表明柠檬酸对小鼠体重有影响12。国外亦有对此方面的研究，如1997年Aruga 等研究发现注射一定浓度的柠檬酸能够造成小鼠的代谢性酸中毒13；2007年Sifaturkoglu 等通过研究发现柠檬酸具有较强的毒性。在柠檬酸对机体组织的影响方面，2006年黄剑峰等进行了柠檬酸对中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞生长和代谢影响的研究，发现柠檬酸能阻碍 CHO细胞DNA的合成，对CHO细胞生长有明显的抑制作用14。另外，Biyah 等在1996年研究发现，雾化柠檬酸可以诱导速激肽释放，24小时后可诱发气道膨胀，引起微血管渗露15 ；土耳其专家Aktac等人对单一毒性剂量的柠檬酸对小鼠的短期影响研究发现，柠檬酸处理组小鼠体重较对照组显著减轻，肝脏组织变形，肝细胞核膜内陷、空泡化，细胞核坏死16；Serkan Yllmaz 等在2008年报道柠檬酸在100-200 mg/L 时即可显著增加人外周血淋巴细胞染色体畸变率, 显著降低有丝分裂指数17；W.C.Lan等人研究表明，一定浓度的柠檬酸接触牙周组织可导致齿龈组织受损，影响其细胞活力、粘着力及蛋白质合成18。部分研究发现，柠檬酸能够促进机体组织细胞的凋亡。例如有研究发现柠檬酸对星形胶质细胞能够产生凋亡作用；2009年，沈立明等进行的柠檬酸镧诱导肿瘤细胞凋亡的研究发现，柠檬酸镧作用24 h后，HeLa细胞出现明显的凋亡特征，表明柠檬酸镧能诱导癌细胞发生凋亡19。1.3 细胞凋亡1.3.1 细胞凋亡肝脏是哺乳动物机体的重要器官，有外分泌、内分泌、代谢、物质转化、解毒、吸收、运转、储存、造血、合成胆色素、再生等功能20，并参与糖、脂肪、维生素等营养物质代谢、储存和重新分配，对维持机体的代谢平衡有重要作用。由于肝脏有诸多重要生理功能，因此当由于外界物理或化学刺激引起肝脏受损时，常引发各种病症，如当肝功能受到破坏时出现不同程度的凝血障碍，因此肝功能衰竭常伴有严重的出血症状。在1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞，但它们的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集、从其周围组织中脱落并被吞噬，但无炎症发生。1972年Kerr等首次提出了细胞凋亡的概念。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡是一个主动过程，涉及一系列基因的激活、表达、调控等一系列生物学事件，它并不是病理条件下的一种自体损伤现象，而是为更好适应环境而主动争取的一种死亡过程21。肝细胞凋亡的病理学特征为肝细胞的嗜酸性变，又称嗜酸性坏死。表现为个别肝细胞胞浆的嗜伊红性增强，胞核固缩，形成嗜酸小体（eosinophilic body），脱离肝细胞索后坠入肝窦或窦间隙22。凋亡过程中核小体连接区被切开，DNA片段化。研究显示，许多伤害性刺激都可启动肝细胞的死亡，如缺血、缺氧再灌注、有毒物质（如CCl4、二甲基亚砜）等。其中一些刺激诱导的细胞凋亡需要死亡受体（death receptors）及细胞内信号传导机制的参与。细胞凋亡信号途径复杂多样，如死亡受体介导的凋亡途径、内质网途径、线粒体途径等。这些途径之间相互促进或制约，形成复杂的调控网络，其中以线粒体途径尤为重要。具体来说，当受到凋亡信号的刺激后，Bcl-2家族蛋白、胞内Ca2+通过调控线粒体通透性调控孔（MPTP）促使线粒体释放细胞色素C、Smac/DIABLO和AIF等线粒体凋亡因子。其中，细胞色素C释放到细胞浆后，在dATP、ATP存在下，首先与Apaf-1结合，形成多聚复合体，从而激活Caspase-9。活化的Caspase-9进而激活下游的Caspase-3，进入线粒体和死亡受体凋亡途径的最后通路，最终导致细胞凋亡23。1.3.2 Caspase-3与细胞凋亡Caspase是一类结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，主要以无活性的酶原形式存在于活细胞中，其主要功能是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键，导致细胞凋亡。Caspase家族由14个成员组成，根据发现顺序被依次命名为Capase-1-Caspase-14。它们不仅在氨基酸序列有同源性、还在空间结构及底物特异性上具有相似性24。尤其是Caspase-3，它是Caspases家族中关键的凋亡执行者之一，在凋亡执行阶段，负责对全部或部分蛋白关键酶的剪切。Caspase-3广泛从在于各种细胞中，其前体相对分子质量为32000，活性形式的相对分子质量为1700025。Caspase-3能被多种因素活化，如可被Fas/Fasl途径活化，也可被颗粒酶B活化。在细胞凋亡启动时，Caspase-3将多聚聚合酶PARP（poly ADP-ribose polymerase）剪切成31 kD和85 kD两个片段，从而将PARP中与DNA结合的两个锌指结构与羧基端催化区域分离，使其丧失DNA修复和完整性监护的功能。 结果使受PARP负调控影响的Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶活性增高，加速核小体之间DNA的裂解，引起细胞凋亡。1.3.3 DNA损伤与细胞凋亡 DNA损伤是诱发细胞凋亡的一个诱因，其主要信号通路具有p53依赖性。具体来说，DNA损伤通过ATM蛋白和DNA依存性激酶（DNA-PK）的介导促进p53的表达；p53继而通过转录激活作用诱导p21waf表达，导致细胞凋亡26。细胞凋亡的一个显著特点是细胞DNA的降解。 细胞凋亡的这种DNA降解非常特异而且很有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数，这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体之间的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段。研究显示，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的“梯状”条带，与坏死所呈现得弥漫连续图谱有明显区别27。1.4 本研究的目的及意义查阅国内外文献，对于柠檬酸的研究与讨论不再是局限于柠檬酸的生产及应用上，越来越多的专家和学者将精力放在了柠檬酸对机体影响的研究上。例如，国内研究方面，黄剑峰等做了柠檬酸对CHO细胞生长和代谢的影响的研究。国外研究方面，土耳其专家Aktac等人对单一毒性剂量的柠檬酸对小鼠的短期影响进行了研究。但纵观国内外报道，有关柠檬酸对肝细胞凋亡影响的研究还很少。故本研究通过对昆明小白鼠定期腹腔注射不同浓度的的柠檬酸，建立小鼠试验模型。最后采取小鼠肝脏组织，通过检测Caspase-3活性和观察DNA Ladder图谱，分析不同浓度柠檬酸对小鼠肝细胞凋亡的影响，为进一步研究柠檬酸对机体的毒副作用提供一定的理论依据。2 材料与方法2.1 实验动物分组及处理本实验用的昆明系小白鼠购于郑州大学动物医学院，共40只，随机分为4组：对照组，柠檬酸低、中、高剂量组，每组10只。待小鼠适应环境1周后，对各组小鼠进行如下处理：对照组，腹腔注射生理盐水；低剂量组，腹腔注射120 mg/kgbw柠檬酸；中剂量组，腹腔注射240 mg/kgbw柠檬酸；高剂量组，腹腔注射480 mg/kgbw柠檬酸。每周注射一次，连续3周。2.2 主要的仪器设备、试剂及其配制2.2.1 主要仪器设备SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；JH752紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；SIGMA1-15小型台式离心机，德国；XW-80A 漩涡混合器，上海精科实业有限公司；DYY-11型电泳仪，北京六一仪器厂；DYCP-31C型电泳槽，北京六一仪器厂；荧光/可见光凝胶成像分析系统（AlphaImager HP），美国；光明电子万用炉，北京市永光明医疗仪器厂；正华ZH-GL型离体组织灌流装置，淮北正华生物仪器设备有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，金坛市晓阳电子仪器厂；HHB11电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械一厂； JA2003电子天平，上海上平精密仪器有限公司；BLD-269/HL电冰箱，广东容声电器有限公司；BBD-386H冷柜，河南新飞电器有限公司；DRAGONLAB微量移液器，Dragon Laboratory Instruments Limited；DR-200Be酶标分析仪，无锡华卫德朗仪器有限公司；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；2.2.2 主要试剂柠檬酸(C6H8O7H2O) 分析纯AR，成都市科龙化工试剂厂；Caspase -3活性检测试剂盒，碧云天生物技术研究所；细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒，碧云天生物技术研究所；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程有限公司EB，碧云天生物技术研究所；Tris平衡苯酚，北京索莱宝科技有限公司；氯仿，烟台市双双化工有限公司；无水乙醇，烟台市双双化工有限公司；5% 溴酚蓝，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；琼脂糖，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；Marker（NMW002），北京鼎国昌盛生物技术有限公司；EDTA，北京鼎国昌盛生物技术有限公司。2.2.3 主要药品及试剂的配制（1）0.9%生理盐水：NaCl 9 g，用少量的蒸馏水溶解，定容至1000 mL。（2）柠檬酸注射液：用电子天平分别称取2.4 mg、1.2 mg、0.6 mg的柠檬酸，加入少量双蒸水溶解，然后定容至50 mL，最终浓度为：480 mg/L、240 mg/L、120 mg/L。（3）5TBE储存液：Tris 粉54 g，硼酸 27.5 g，0.5 mol/L EDTA（pH 7.9） 20 mL，加入蒸馏水定容至1000 mL。（4）70%乙醇：70 mL无水乙醇，双蒸水定容至100 mL。（5）1%琼脂糖凝胶：琼脂糖0.3 g，0.5TBE 30 mL溶解并加热，煮沸后停止加热，加入EB 1 L。（6）10%电泳缓冲液：5TBE储存液30 mL，蒸馏水定容至300 mL。（7）磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl 9 g、NaH2PO4 0.4 g、Na2HPO4 6 g，加入800 mL双蒸水中溶匀，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L，保存于4冰箱中。2.3 方法2.3.1 小鼠肝脏组织采集及组织匀浆制备第三次柠檬酸处理1周后，颈椎脱臼处死小鼠，剖开腹腔，取出肝脏，冰生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称取肝脏组织，然后加入肝组织重量9倍的生理盐水，用玻璃匀浆器充分研磨小鼠肝脏组织并制成匀浆。将制备好的10% 组织匀浆，3000 r/min离心1015 min，取匀浆上清液保存待用。2.3.2 样品Caspase-3酶活性的测定原理：Caspase-3可以催化底物Ac-DEVD-NA产生黄色的NA，在405 nm附近有强吸收，因此通过测定405 nm附近NA吸光度来检测Caspase-3的活性。Caspase-3酶活力单位定义：一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37可以剪切1 nmol Ac-DEVD-NA 产生1 nmol NA的Caspase-3 的酶量。计算公式： OD值= 实际NA吸光度=A405标准品-A405标准品空白； Caspase-3催化产生的NA吸光度=A405样品-A405样品空白； NA浓度相当于A405的标准方程：A405=具体操作如下：（1）准备工作：a. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。b. 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。（2）测定pNA标准曲线：a. 标准品稀释液的配制：按照每0.9 mL检测缓冲液加入0.1 mL裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。b. 将试剂盒提供的NA（10mM）用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200 uM，分别编号为A1、A2、A4、A5、A7、A8。c. 每个浓度取适当量用容量不超过100 uL的比色杯进行检测，测定A405。 d. 每一个标准品的A405减去不含NA的空白对照得A405计算出实际的因NA而导致的吸光度，并制作出pNA浓度相当于A405的标准曲线。（3）样品收集：各实验组分别随机选取5个样品：a. 肝脏组织匀浆：从-20 冰箱中取出肝脏组织样品，根据取样量，每0.0030.01g加入100 L裂解液，在冰浴中用玻璃匀浆器匀浆。匀浆后将匀浆液转移到1.5 mL离心管中，继续冰浴裂解5 min。b. 4 下，16000-20000 r/min离心10-15 min。c. 然后把上清液转移到冰浴预冷的离心管中。d. 立即测定Caspase-3的酶活性或-20 保存。（4）Caspase-3酶活性的测定：a. 取NA和适量的Ac-DEVD-NA（2 mM），置于冰浴上备用。b. 如下设置反应体系：试剂空白对照样品检测缓冲液90 L80 L待测样品10 LAc-DEVD-NA (2mM)10 L10 L总体积100 L100 L 在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。然后再加入10 L Ac-DEVD-NA（2 mM）。c. 加入Ac-DEVD-NA（2 mM）后混匀，注意避免混匀时产生气泡。 37 孵育60-120 min。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。d. 样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中Caspase-3催化产生的NA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的NA。（5）考马斯亮兰法测定肝组织的总蛋白量a. 样本前处理：准确称取待测组织的重量，按重量体积比加生理盐水制备成10% 的组织匀浆，2000 r/min，离心10 min，然后取组织匀浆上清再用生理盐水按1:19稀释成0.5% 的组织匀浆，待测。b. 操作如下：试剂空白管标准管测定管蒸馏水（mL）0.05-0.563g/l标准液（mL）-0.05-样品（mL）-0.05考马斯亮兰显色剂（mL）3.03.03.0混匀，静置10 min，于595 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，测各管的OD值。c. 计算：按下面公式计算：蛋白浓度（g/L）=2.3.3 DNA Ladder 检测（1）样品收集各实验组分别随机选取1个样品，取一定重量的肝脏组织，剪成小块，直接冰浴匀浆。（2）DNA Ladder 抽提a. 每1 mL 样品裂解液中加入5 L 蛋白酶K，混匀。b. 对于上述收集好的样品，每0.01 g 组织中加入500 L 添加了蛋白酶K的样品裂解液，Vortex混匀，充分裂解组织。c. 50 水浴消化过夜。d. 加入500 L 的Tris平衡苯酚。e. Vortex剧烈混匀，使有机相和水相充分混合，以达到抽提效果。4 ，12000 g离心5 min。f. 缓慢吸出酚相及中间相， 剩余水相用等体积Tris平衡酚再抽提一次（同步骤e）。g. 缓慢吸出酚相及中间相，剩余水相用等体积氯仿再抽提一次（同步骤e）。h. 慢慢吸出约300 L 上清液，加入60 l 10M醋酸铵和600 l 无水乙醇，颠倒数次混匀，此时可见DNA沉淀产生，冻存过夜。i. 4 下，12000 r/min 离心10 min，弃上清。j. 加入600 L 70%乙醇，轻轻颠倒约2次。4 下，12000 r/min 离心10 min，小心吸去上清。k. 尽量吸除残余的乙醇，待看不到明显的液体时，立即加入50-100 L TE溶解DNA。冻存样品。（3）琼脂糖凝胶的制备a. 用电子天平称取琼脂糖0.3 g，倒入锥形瓶。b. 量取5TBE储存液30 mL，加蒸馏水至300 mL，稀释为0.5TBE电泳液。c. 取0.5TBE液30 mL，加入盛有琼脂糖的锥形瓶中，混匀，放于电子炉上加热，煮沸。d. 煮沸后加入EB 1 L，混匀，缓缓倒入凝胶槽，插梳子。e. 凝胶凝固后，拔掉梳子。待用。（4）琼脂糖凝胶电泳a. 将带有凝胶的凝胶槽放在电泳槽中，缓缓倒入0.5TBE电泳液，电泳液没过凝胶3 mm。b. 取出冷存的样品、DNA Maker，常温溶解。c. 取各样品1 L， 分别与微量溴酚蓝溶液混匀。 然后将混合溴酚蓝的样品和DNA Maker分别加入加样孔。 加样完毕后盖上电泳槽盖板。d. 将电泳槽阴阳极与电泳仪正确连接。e. 打开电泳仪，设置电压为90 V，电泳时间为35 min。f. 电泳结束后，关闭电源，取出凝胶槽。g. 利用荧光/可见光凝胶成像分析系统，分析DNA Ladder。2.4 数据处理实验数据以“平均数标准差”（xs）表示。采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），再进行LSD和Duncan多重比较。P0.05表示统计学上有显著差异。3 结果3.1 柠檬酸对小鼠肝脏细胞Caspase-3活性的影响3.1.1 NA标准曲线由表1中pNA浓度和其对应的OD值进行线性回归，得标准曲线方程。由图1可知，pNA浓度与吸光度的回归方程是：y=447.99x-3.2675，相关系数达到0.9985。 表1 标准曲线测定表 编号C1A1A2A4A5A7A8吸光度-0.010.0290.0520.1250.2180.458NA浓度空白0102050100200图1 小鼠肝脏组织pNA标准曲线3.1.2 小鼠肝细胞Caspase-3的酶活力用SPSS 18.0软件统计比较各实验组单位重量蛋白的Caspase-3酶活力，结果如表2所示，经过腹腔注射的小鼠，柠檬酸低、中和高剂量组的Caspase-3活性均显著高于对照组，其中柠檬酸中剂量处理组酶活性最强；比较各实验组单位重量蛋白的Caspase-3酶活力的差异显著性发现，与对照组相比，柠檬酸低、中剂量处理组有极显著差异（P0.01），高剂量组有显著差异（P0.05），表明柠檬酸处理组的细胞凋亡现象较对照组明显。表2 柠檬酸对小鼠肝脏组织中Caspase-3（UI/mg）活性的影响 组别 小鼠数量（n） 酶活力（UI/mg） 对照组 5 (1.460.28)106a 低剂量组 5 (1.940.17)106b 中剂量组 5 (1.960.20)106b 高剂量组 5 (1.860.33)106b注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同小写字母表示差异不显著（P0.05）。显著性水平为P0.05。3.2 柠檬酸对DNA损伤的影响图2显示的是柠檬酸诱导的小鼠肝脏组织细胞凋亡的DNA Ladder图谱。由图2可知：对照组中（C）无梯形条带出现，说明无细胞凋亡现象发生；柠檬酸低剂量处理组（L）中出现6条凋亡特征性的DN“梯状条带”，分别位于100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、1600 bp左右；柠檬酸中剂量处理组（M）和高剂量处理组（H）亦清晰地出现6条DNA“梯状”条带，且条带所处位置与低剂量组大致相同。该结果表明，与对照相比，低、中、高剂量的柠檬酸对小鼠肝细胞凋亡均具有诱导作用。图2 柠檬酸诱导的肝脏细胞凋亡DNA Ladder电泳图谱注：C：对照组；L：柠檬酸低剂量组；M：柠檬酸中剂量组; H：柠檬酸高剂量组4 分析与讨论肝细胞凋亡为自身程控性细胞死亡，其主要生理变化为肝细胞通过嗜酸性变而发生固缩，胞体变小，胞质变致密，DNA裂解、核浓缩致消失，形成嗜酸性小体。细胞凋亡过程包括凋亡的启动、凋亡调控蛋白间的相互作用、蛋白水解酶的活化、下游的级联反应等阶段。其中，凋亡启动是细胞凋亡过程的第一步，其诱导因素有很多，既有内源性因素（如许多应激条件、化学治疗试剂和药物）也有外源性因素（如Fas和TNF-R）。而且诱导因素不同，启动细胞凋亡的方式不同，所扳动的信号转导途径也不一样。目前比较清楚的是细胞凋亡的膜受体通路（Fas/FasL），以及Cyt-C和Caspase激活的生物化学途经。前者主要通过配体诱导受体三聚体化，在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，引起细胞一系列特征性变化，导致细胞死亡。后者通过线粒体释放到细胞浆的细胞色素C与Apaf-1和Caspase-9形成凋亡复合体，其中的Caspase-9被激活后继而激活Caspase-3，诱导细胞凋亡。近年来不断有研究发现，作为目前被广泛使用的食品和饲料添加剂的柠檬酸也会引起组织细胞的凋亡。如2009年沈立明等发现柠檬酸镧能诱导癌细胞发生凋亡19。邓雯等在柠檬酸对小鼠辜丸影响的研究中发现，240 mg/kgbw和480mg/kgbw柠檬酸处理小鼠后，其睾丸组织出现凋亡特征的DNA“梯状”条带；而且Caspase-3活性也显著高于对照，表明柠檬酸能够诱导小鼠睾丸组织细胞的凋亡28。在本研究中，Caspase-3活性检测结果显示，与对照组相比，柠檬酸低、中、高剂量处理组小鼠肝脏组织中每毫克蛋白酶活力分别提高了32%，34%、27%，并且柠檬酸低、中、高剂量组Caspase-3酶活性与对照组相比均有显著差异（P0.05）。该结果提示，3种剂量的柠檬酸均能显著提高Caspase-3活性，促进小鼠肝细胞凋亡。DNA Ladder 检测结果显示，对照组中无DNA Ladder的出现；柠檬酸低、中、高剂量处理组中均出现6条凋亡特征性的DNA“梯状”条带，表明柠檬酸处理组小鼠肝细胞的确发生了凋亡。综合上述结果，与对照组相比，不同浓度的柠檬酸处理后均能引起小鼠肝细胞的凋亡。另外，中剂量处理组的Caspase-3酶活力要比其他两个处理组的高，且DNA“梯状”条带更为明显，说明柠檬酸在240 mg/kgbw时更能促进肝细胞凋亡。但另一方面，与柠檬酸低、中剂量处理组相比，高剂量处理组的Caspase-3酶活性反而降低。而在张自强等人有关柠檬酸对小鼠肝脏组织氧化应激影响的研究中发现，各柠檬酸处理组小鼠均出现肝细胞索排列紊乱，中央静脉大量淤血，周围淋巴细胞浸润等一系列病变，且高剂量柠檬酸组小鼠的肝脏T-SOD 和GSH-Px 活性显著降低29，他们的结果说明，虽然各剂量的柠檬酸均能对肝细胞造成损伤，但高剂量柠檬酸的毒性更强，这显然与本研究结果不完全一致。其原因可能是是由于高剂量柠檬酸毒性增加造成一部分肝细胞坏死而使凋亡的细胞数量减少所致。5 结论经Caspase-3活性检测试验结果分析和DNA Ladder 进行检测，得出如下结论：一定剂量的柠檬酸可促进小鼠肝脏组织Caspase-3酶活性的显著增加，进而促进细胞凋亡，其中，中剂量柠檬酸（240 mg/kgbw）的细胞凋亡诱导效应最为明显。参考文献1 袁孝竞，何杰.柠檬酸柠蒙酸钠缓冲溶液在烟气脱硫中的应用.石油化工设计， 1998，4：35-39.2 林惠芬，李斌，李伟光，等.表皮角质层的更新及其测定J.日用化学工业，1998，1：41-43.3 李小亭.延胡索酸和柠檬酸可用作幼猪饲料添加剂.饲料广角，1986，2：51-52.4 皮守祥，徐廷瑞，李花香，等.日粮中添加柠檬酸育肥猪试验.当代畜牧，1995，3：31-32.5 李振.绿色饲料添加剂柠檬酸在水产养殖中的应用.渔业经济研究，2005，5：33-35.6 王淑琴，史光华，史彬林，等.柠檬酸对肉仔鸡屠宰性能的影响J饲料工业，2010，31(6)：9-11.7 曹雨莉，孙小琴日粮添加柠檬酸对蛋鸡生产性能的影响J.畜牧兽医杂志，2007，26(1)：8-10.8 邢书霞，马玲，张剑，等.柠檬酸与热力联合杀菌作用的研究.中国消毒学杂志.2006，5：26-29.9 简讯，樊均明，罗海，等. 枸橼酸在血液透析中的应用. 中国血液净化，2003，6：327-330.10 张幼辰，成志强.柠檬酸对大鼠的致畸作用来源.上海医科大学学报，1987，3：32-35.11 秦淑贞，蒋东升，张俊刚，等. 实验室仿制饮料对小鼠生化指标的影响J. 冷饮与速冻食品工业，2003，1：35-37.12 秦淑贞，蒋东升，王庭欣，等.添加剂柠檬酸对小鼠的毒作用观察.冷饮与速冻食品工业，2004，3：31-32.13 Aruga S, Preisig PA, Moe OW, etc. Chronic metabolic acidosis(CMA) increase renal cortical NaDC-1 mRNA and protein abundance in rats. J Am Soc Nephrol, 1997,8: 2A .14 黄剑锋，张元兴，张立，等. 柠檬酸对CHO细胞生长和代谢的影响. 华东理工大学学报（自然科学版），2006，5：556-560.15 Biyah K, Molimard M, Emonds-Alt X, et a1. SR 140333 prevents potentiation by citric caid of plasma exudation induced by histamine in airwaysJ. Europen Journal of Pharmacology, 1996, 308(3): 325-328.16 Aktac T, Kaboglu A, Bakar E, etc. The short-term effects of single toxic dose of citric acid in miceJ. Journal of Cell and Molecular Biology, 2003，2: 19-23.17 Ylmaz S, nal F, Yzbasolu D, etc. Clastogenic effects of food additive citric acid in human peripheral lymphocytes. Cytotechnology, 2008，56: 137-144.18 Lan WC, Lan WH, Chan CP, etc. T