（植物学专业论文）黄檗干旱生理基础及差异蛋白质组学研究.pdf

摘要 本论文以植物生理生态学理论和方法，应用蛋白质组学的实验手段对 、工 培育的黄檗实生幼苗在不同浓度p e g 模拟胁迫处理下进行研究，旨在告宋哥r 参量檗 抗旱逆境生理与所产生的蛋白质之间的关系，为从分子水平揭示黄檗抗旱椭u 奠 定基础。 本论文测定了黄檗幼苗在不同浓度p e g 干旱胁迫处理下的丙二醛、脯氨酸 和小檗碱的含量变化以及叶片质膜透性、s o d 活性和光合速率、蒸腾速率和气 孔导度的变化随时间进程变化。建立了一整套从黄檗叶片中提取全蛋白质的方 法，同时，在不同胁迫处理条件下，通过s d s 凝胶电泳得到差异带后，进一步 以双向电泳为研究手段，以考马斯亮兰染色法显示蛋白质斑点，总共分离得到 1 8 个蛋白质差异点样品，根据肽质量指纹谱检测结果及m s f i t 和m a s c o t 检索数 据库初步鉴定出了其中的7 个蛋白质点，其它1 1 个为未知的新蛋白。并进一步 探讨了所鉴定出的七个蛋白质在干旱胁迫中的生理功能。 关键词：黄檗；干旱；胁迫生理；双向电泳；蛋白质组； 泰鞋作者、导师伺煮 a b s t r a c t p h e l l o d e n d r o na m u r e n s ei sc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n em a t e r i a l i t sm a i n m e d i c i n a lc o m p o s i t i o ni sb e r b e r i n e ，a ni m p o r t a n ti s o q u i n o l i n ea l k a l o i d ，w h i c h p o s s e s ss t r o n g a n t i b a c t e r i a l b i o a c t i v i t y s t r e s sp h y s i o l o g y a n dd i f f e r e n t i a l p r o t e o m i c so fp h e l l o d e n d r o na m u r e n s e s e e d l i n g s w i t h t h e o r y o f p l a n t p h y s i o l o g i c a le c o l o g ya n df u n c t i o n a lp r o t e o m i c sw e r es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e di n t h i st h e s i s w ed i s c u s s e dr e l a t i o no f d r o u g h t - r e s i s t a n c ea n dp l a n tp r o t e i nu n d e r p e gs t r e s s ，a n da t t e m p t e dt or e v e a lm e c h a n i s mo fd r o u g h t r e s i s t a n c eo fp a m u r e n s e s e e d l i n g si nm o l e c u l a r l e v e l t h er e s e a r c hd e t e r m i n e dt h ec o n t e n t v a r i e t yo fm d a ，p r o l i n e ，b e r b e r i n ei n l e a v e so fpa m u r e n s e s e e d l i n g w i t hd e a lt i m eu n d e r d i f f e r e n tp e g c o n c e n t r a t i o ns t r e s s ，a sw e l la ss o d a c t i v i t y , m a x i m u mn e tp h o t o s y n t h e t i cr a t e ， t r a n s p i r a t i o nr a t ea n ds t o m a t ac o n d u c t i v i t yw e r em e a s u r e d as e r i a lo fp r o t e i n e x t r a c tm e t h o df r o ml e a v e so fpa m u r e n s e u n d e rt h e d i f f e r e n tt r e a t e d c o n d i t i o n s ，d i f f e r e n t i a lb a n d sw e r eo b t a i n e dt h r o u g hs o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e t r o p h o r e s i s ，a n dt h e ne s t a b l i s h e das e to fm e t h o do f t w o d i m e n s i o n a l p o l y a c r y l m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，s p o t sa p p e a r e db yt h e c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u ed y i n g , a n dt h e n18 s p o t s w e r e o b t a i n e d ，m a p p i n g p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t i n go fp r o t e i ns p o t sb ym a l d i t o f m s ，1 1 s p o t s w e r ei d e n t i f i e dw i t hn e wp r o t e i n ，a n d7s p o t sw e r ei d e n t i f i e dw i t hk n o w n p r o t e i n s f r o m p r o t e i n d a t a b a s e u s i n g m s f i ta n d m a s c o t ，p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n so f7p r o t e i n sw e r ea n a l y s e da tt h ec o u r s eo fpa m u r e n s ed r o u g h t s t r e s s k e y w o r d s ：p h e l l o d e n d r o n a m u r e n s e ；d r o u g h t ；s t r e s sp h y s i o l o g y ；2 - d e p r o t e o m i c s 黄檗干旱生理基础及筹异蛋白质缉学研究 1前言 水是切生物赖以生存的基础，也是影响着社会发展的一个重要因素。目前 水资源短缺是公认的全球环境焦点问题之一，我国的人均占有水资源量( 2 3 0 0 m 3 ) 仅为世界人均量的四分之一，是世界上1 3 个贫水国家之。由于我国大部分地 区属于亚洲季风区，干旱灾害具有普遍性、区域性、季节性和持续性的特点，旱 灾十分严重。据统计，全国平均每年受旱面积达2 1 7 3 3 3 力- h m 2 ，直接造成粮食 减收1 0 0 亿k g 以上，约占各种自然灾害造成粮食损失的6 0 。干旱不仅造成农 业的重大损失，而且还加剧了生态环境的恶化以及土地沙漠化和水土流失，因此， 干旱缺水已成为制约我国国民经济可持续发展及西部开发的重要因素，且在一些 地区已威胁到人类的生存和发展。为了保持和维护好人类的生存环境，充分利用 植物来改善人类赖以生存的生态环境，通过对植物本身所潜在的水分适应能力的 认识以及植物对水分胁迫的生态适应了解，寻找植物改良途径，改造我们的生态 环境。 1 1 植物的抗旱性及对干旱胁迫应答的研究 1 1 1 植物的抗旱性对策 地球上三分之一多的陆地是干旱和半干旱地区( 胡新生和王世绩，1 9 9 8 ) ， 由于不同物种甚至不同品种之间存在着基因型差异，在自然条件下，不同植物对 于干旱的适应能力也有很大差异：有些植物在缺水条件下很快死亡，而有些植物 仍能保持较高的体内水分状况，或者产生延迟缺水的症状( 如叶片卷缩和萎蔫) 。 b o h n e r t ( 2 0 0 0 ) 比较了植物在极端干旱条件下不同进化水平的抗旱性，提出了 几条植物抗旱的机制。大概来说，如果干旱不是致死性的，植物在适应缺水环境 主要有以下三种机制( f u k a i 和c o o p e r ，1 9 9 5 ) ： l 、干旱逃避：短生育期或较强的茁期生长势的植物以便在干旱到来之前成 熟；主要是沙漠中短生植物和生长有明显干湿季节的植物，这些植物大多是一年 生植物，它们在严重干旱胁迫发生之前就完成了整个生命周期，是种真丁f 的逃 避干旱。 2 、干旱躲避：这种类型的植物具有深根性，根有照好的土壤穿透能力以利 j 、北林业人学博十学位论文 于吸收土壤底层的水分，有着较高的根茎比。这类植物为了减少水分损失，增加 气孔和角质层的扩散阻力，通过叶片的反射特性和叶子的运动减少叶片对太阳辐 射的吸收，或通过加速叶片衰老和叶片卷曲来减少叶片蒸发面积。 3 、耐旱：这类植物在低水势下仍能保持细胞膨压以提供植物在严重水分胁 迫下生长的物理力量和保持原生质及其主要器官在严重脱水下伤害较少或基本 保持不伤害。这种植物能增强保持体内水分含量的能力，在复水后有很好的恢复 能力。 总之，植物在遭遇干旱胁迫时，首先通过保持水分的吸收和减少水分的丧失 来维持体内水分平衡，进而保持细胞一定的膨压，以维持植物在干旱胁迫条件下 能继续生长。由于植物对干旱胁迫的应答是一个多基因控制的复合性状，而且存 在抗旱机制的多样性，这给植物抗旱性研究带来诸多困难，但是，随着研究的不 断深入，植物对于旱胁迫适应的机理将会越来越清楚。 1 1 2 植物对环境干旱的生态适应及耐旱机制 水分占植物体的绝大部分，是植物体的重要组成成分。植物体一切的生长发 育，也只有在定细胞水分含量状况下才能生长，否则植物的正常的生长发育就 会受阻，甚至停止导致死亡。植物为适应环境干旱等逆境因子，在长期进化过程 中也产生了对环境胁迫的防御机制。现在己经知道植物对环境胁迫的适应性与组 织、细胞类型和发育时期有关，胁迫诱导产生了许多基因的表达，这些基因至少 可分为两类：一类基因用于防止细胞脱水的基因( 结构基因) ：另一类基因是胁 迫诱导的与基因表达有关以及与信号传导有关的基因( 调节基因) ，这些干旱胁 迫诱导基因产物不仅通过重要代谢蛋白保护细胞结构，而且起调节信号传导和基 因表达作用：通过水分通道蛋白、a t p 酶、跨膜受体蛋白、离子通道、有机小分 子载体等膜蛋白加强了细胞与环境的信息交流和物质交换；通过代谢蛋白酶合成 各种渗透保护剂( 主要是低分子量糖、脯氨酸、甜菜碱等多元醇和偶极合氮化合 物) 提高细胞渗透吸水能力：通过l e a 蛋白、渗调蛋白、抗冰冻蛋白、分子伴 侣蛋白、蛋白酶、热激蛋白等逆境诱导蛋白提高缅胞抗脱水能力；通过超氧化物 歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、抗坏血酸过氧化酶 ( a p s ) 等提高细胞排毒、抗氧化防御能力；通过蛋白激酶、转录因子、磷脂酶 c 等调控蛋白来提高细胞内信息传递和基因表达能力，来提高植物对胁迫环境的 适应能力( 图1 - 1 ) 。 1 1 2 1 植物对干旱胁迫的渗透调节 在受到轻度干旱胁迫时，植物能够通过渗透调节降低水势，保持膨压。植物 黄檗干旱生理基础及差异蛋白质组学研究 的这种渗透调节主要是通过在植物体内积累一些诸如脯氨酸、甜菜碱等亲和性溶 质丽实现的，认为这些渗透调节物质的积累可以调节渗透压，降低植物体内的渗 透势，从而可能增加植物对渗透胁迫的抗性( h a s e g a w a 和b r e s s a n ，2 0 0 0 ) 。绝 大部分用于渗透调节的物质直接来自于当前同化和代谢的 图卜1 干旱诱导的基因蛋白质的表达及其在胁迫应答中的作用 f i g 卜1( y a m a g u e h s h i n o z a k i 和s h i n o z a k i 1 9 9 8 ) 产物，然而体内储藏的碳水化合物的水解产物也可以作为渗透物质的及时补充。 此外，离子和水分通道的变化调节着离子和水分的进出细胞，也是渗透调节的一 个重要方面。 植物积累的渗透调节物质基本上分为两大类：一类是外界环境进入细胞内的 无机离子，二是细胞内合成的脯氨酸、甜菜碱等有机溶质，主要是多元醇和含氮 化合物。尽管无机离子有着较好的渗透调节作用，但是，高浓度的无机离子常常 引起植物代谢紊乱( y a n c e y p h 等，1 9 8 2 ) 。而脯氨酸、甜菜碱等小分子有机物 的大量积累不会破坏生物大分子的结构和功能，而且具有较强的渗透调节作用， 因此，是比较理想的渗透物质。 5 0 年代k e m b l e 等首先发现在受早的多年生黑麦草叶子中有游离脯氨酸积 累，此种现象现己在小麦、高粱、玉米等多种植物中发现。脯氨酸是植物蛋白质 东北林业大学博十学位论文 的组分之一，是水溶性最大的一种氨基酸，具有较强的水合能力，是良好的渗透 调节物质。 脯氨酸以游离状念广泛存在于植物体中，但是，在正常条件下，植物体中游 离脯氨酸的含量并不多，占总游离氨基酸的百分之几。在受到干旱胁迫时，植物 体内的游离氨基酸会大量积累，可增加1 0 1 0 0 倍，有时可达到总游离氨基酸的 3 0 4 0 甚至更高。例如，在严重缺水时，狗牙草( c y n o d o nd a c y l o n ) 叶中脯 氨酸含量达到了1 2 m g g 干重。脯氨酸在许多胁迫条件下的植物中积累以及它所 涉及到的适应机制已经进行了总结( a l i 等，1 9 9 8 ) 。脯氨酸含量大量增加并不单 单由于蛋白质分解的结果，更主要的原因在于其脯氨酸重新合成( g z i k 等，1 9 9 6 ) 。 在水分和盐胁迫时，脯氨酸累积主要定位在细胞液( c y t o s 0 1 ) 中。 根据脯氨酸的生物合成途径和其代谢途径，脯氨酸的总积累可能来自于以下 几个方面( k i y o s u et 等，1 9 9 6 ；) ：( 1 ) 脯氨酸降解的下降；( 2 ) 脯氨酸合成的 增加；( 3 ) 蛋白质合成的降低或脯氨酸利用的降低：( 4 ) 蛋白质的水解。 脯氨酸在胁迫植物中积累的意义可能有：( 1 ) 作为渗透物质柬维持渗透调节， 即增加可增加束缚水含量，增大束缚水和自由水相对含量的比值，从而增加植物 的抗脱水能力，降低植物的渗透势及水势：( 2 ) 确保细胞质中的酶不变性，例如 对蛋白质的热变性有保护作用并且影响蛋白质的溶化作用；( 3 ) 胁迫后植物恢复 生长的氮和碳源；( 4 ) 蛋白质合成的稳定剂；( 5 ) 有害毒物自由基的清道夫，例 如减少高光诱导下自由基的产生，专一性地清除羟自由基和单线念氧( 王娟等， 2 0 0 1 ) ，清除蛋白质分解初期产生的n h 3 、防止有毒氨基酸积累；( 6 ) 调控氧化 还原作用的能量库( 即维持n a d “n a d h 的比率) ，作为植物进行呼吸的能源 为复水后植物的恢复提供还原力；( 7 ) 调控细胞质的酸碱性( 脯氨酸的合成比吡 咯琳一5 一羧酸多消耗两个氢) ；( 8 ) 植物细胞的低温防护剂；( 9 ) 通过和磷脂的相 互作用稳定膜的结构。 植物体中脯氨酸的生物合成有2 条途径，即谷氨酸途径和鸟氨酸途径( 图 卜2 ) 。( 燕平梅等，2 0 0 0 ；d e l a u n e y aj 等，1 9 9 3 ；h u c a 等，1 9 9 2 ；l e r u d u l i e r d 等，1 9 8 4 ) 。这2 条途径在不同的生理状态下表现不同。在渗透胁迫且氮素缺 乏时，谷氨酸途径是合成脯氨酸的主要途径，而在氮素摄入充足时，主要通过鸟 氨酸途径合成脯氨酸( d e l a u n e y aj 等，1 9 9 3 ) 。最近( 赵福庚等，2 0 0 1 ) 的研究 表明，盐胁迫明显激活脯氨酸合成的鸟氨酸途径，该途径对脯氨酸含量上升的贡 献是谷氨酸途径的1 0 h 1 5 倍。一旦渗透胁迫解除后，植物体内的脯氨酸酸含量 能够恢复到正常状态。 甜菜碱是植物中另一类常见的渗透物质，它也广泛存在于高等植物、动物与 细菌中，其生物合成是以胆碱为底物经两步氧化生成( 图卜3 ) ( s z o k e a 等，1 9 9 2 ) 黄檗干旱生理基础及差异蛋白质组学研究 另外，许多植物特别是黎科、禾本科植物在水分或盐分胁迫下，细胞内甜菜碱大 o 酮戊二酸 精氨酸琥m 酸 蛋白质 图1 2 脯氨酸生物合成途径( 燕平梅等，2 0 0 0 ) f i g 1 2p a t h w a yo f p r o l i n eb i o s y n t h e s i si np l a n t ( y a np i n g m e ie t a l ，2 0 0 0 ) 量积累。在豆科植物中也有甜菜碱的积累( s t e v e n s 等，1 9 9 7 ) 。季胺化合物 对干旱、盐渍条件下的植物生理反应起重要作用( z a m a r r e n 。等，1 9 9 7 ) ，盐胁 迫促进了大麦幼苗体内多胺的精氨酸合成途径，使多胺的合成比脯氨酸合成对盐 胁迫更敏感( 赵福庚和刘友良，2 0 0 0 ) 。但溶质的积累在不同的植物中有所不同， 如水稻、烟草体内不能合成甜菜碱( r a t h i n a s a b a p a t h i 等，1 9 9 3 ：朱抗申和黄王生， 1 9 9 4 ) 。王邦锡等( 1 9 8 9 ) 的实验结果表明，c 4 植物玉米、高梁积累脯氨酸的数 量低于c 3 植物小麦。既使是同一物种，不同基因型的植物积累的溶质也不同 ( w e r e t i l n y k 和h a n s o n ，1 9 9 0 ：r h o d e s 等1 9 8 9 ) 。渗透调节物质的积累还可相互 促进，c a ”对无花果细胞盐诱导脯氨酸的积累有促进作用( 汪良驹等，1 9 9 9 ) 。 商振清等( 1 9 8 9 ) 观察到c a 2 + 处理可提高水分胁迫下小麦体内脯氨酸的含量。 植物在受到干旱胁迫时还有其它一些渗透物质参与调节，如可溶性糖，游离 氨基酸，山梨醇、甘露醇、肌醇、可溶性蛋白等等。 东北林业人学博士学位论文 植物的渗透调节还与水通道蛋白( a q u a p o r i n ，a q p ) 有关。水通道蛋白是 胆碱寺甜菜碱醛导甜菜碱 州_o口o 一0tun)掣呈5岛o 黄檗干旱生理基础及差异蛋白质组学研究 的s o d 酶活性仍稍高于对照，而1 0 p e g 处理下的s o d 酶活性与对照相当。 而对于较高浓度的1 5 和2 0 p e g 处理下，则在处理的第1 h 就达到了最高值， 而后持续降低，到第9 h 时，s o d 活性明显低于对照，分别比对照下降了2 3 ，9 和2 8 4 。 从s o d 活性的变化( 图2 - 5 ) 可以看出，黄檗幼苗在短时间胁迫处理时s o d 活性明显增加，因此它能够有效地消除产生的自由基，使植物体免受进一步的伤 害。但随着胁迫处理时间的延长，s o d 酶的活性受到抑制。 2 4 5 p e g 处理对黄檗最大净光合速率、蒸腾速率和气孔导度影响 光合作用是植物生长的基础，水分胁迫则是影响光合作用的主要环境因子， 随着水分胁迫程度的加剧，树木气孔阻力和叶内阻力增加，光合作用受到抑制。 本论文中利用5 、1 0 、1 5 和2 0 四个不同的p e g 浓度梯度对黄檗幼苗 进行模拟干旱处理，分别测定了其最大净光合速率、蒸腾速率和气孔导度。 最大净光合速率的变化干旱胁迫导致黄檗幼苗的最大净光合速率持续降 低。对于不同的p e g 浓度处理，存在着一定的差异。随着处理时间的延长，浓 度为5 和1 0 的p e g 胁迫下，黄檗幼苗在处理的9 h 过程中其光合作用直降 低，在处理的第9 h ，仍能进行微量的光合作用。对于浓度为1 5 的p e g 胁迫下， 茎 l 处理时间t i m e ( ” h 1 5 p e g 直2 0 一。, p e g o一心n竹叶吣h西。曲hmnqto卜o o o 。 处理时间t i m e ( h )处理时间t i m e ( h ) 图2 - - 6 不同浓度p e g 处理对黄檗幼苗最大净光台速率的影响 f i g 2 - 6e f f e c to f m a x n e tp h o t o s y n t h e t i cr a t eo f p l ，8 es e e d l i n g su n d e rp e gs t r e s s ，-眦一g三替簏un督 3 2 l 0 s g 0_，js口d p 2 l h h n-12三诗篇啦书袭忾嚼 pe=p上_chog=_；d， 、二13替蹭如书跫k耐 f i g 2 0 芒 c ol ： 兰 导 趸 皇0 东北林业人学博士学位论文 龠萤 5 p e g 霸霭。蚕窗蕴西 盟国。二 处理时蝴t l m e ( h ) 2 = 1 暑1 口 兰l ：0 0 皇。 处理时间l i m c ( h 处理时间t i m e ( h ) 轧孰氩。撕_ 处理时日j t i 岫( h 图2 - 7 不同浓度p e g 处理对黄檗幼苗蒸腾速率的影响 f i g2 - 7 e f f e c to f t r a n s p i r a t i o nr a t eo f pa r a l l r d r t s es e e d l i n g su n d e rp e gs i t e s s g 茏h 自日 m i 鞠q画疆n工掰翳n 历翰嘲豳讶朔圉一 蕞飘功翻豳囫溺掰翻翻阻止。 画翻翻溯翰翰翻翻瞄嘲豳组。 4 5 3 5 2 5 5 0 7 2 0 i；_rhzopoe_13l#， ，、e：l三舛御屯萎垂 o_ ， 口 (c n m 帅一哩 处 n o 4 5 3 5 2 5 5 0 3 2 0 o_!h-o；pchooo_!j!d 一窨、二2三甜舞采盎蔷 嘶 h i 阳 搦h o o 陷 附 雳 础 口m 旺 m玉珏口 e 一 一 ：蒯| 勇。 函亘：黔薄吨 霭 工搦翻琢垦一 处 措 酬卜日掰囫盟i工玢搦琵搿疆。圯工磁瑷且 历场隰涸固。 烯函喝弱饧囫。 弘乳o：；1k 一一p护。 。，。乒一；三苷埘磊采毒错 剃 甜 (1于n目暑粤瓣艘簦糕 ，i 对 ； 玉。 口_!=言ch*o_o4 p：1日i 卜sh e-ig三瓣艘l錾 m p h co州。d-hac日hl 一s_。日名占糌嘴莲i薯 l 8 5 2 g 6 3 0 一n目_【g一簪翟墼精 。卜曲吲nn 曲i 【 岫o o 直 5 2 5 l 5 0 0，争_o占拇辫趄撼 黄檗干旱生理基础及差异蛋白质组学研究 在处理第7 h 时测定的数据已为负值。而在2 0 p e g 胁迫下第4 h 时，幼苗由于 水分的缺乏，正常的光合已不能进行( 图2 - 6 ) 。 蒸腾速率的变化不同浓度p e g 处理下的幼苗，其蒸腾速率随胁迫时间的 增加而降低，p e g 浓度高的胁迫处理，蒸腾速率变化更强烈一些。对于2 0 的 p e g 处理，在胁迫的第4 h 时黄檗幼苗叶片已不进行蒸腾作用( 图2 - 7 ) 。 气孔导度的变化与蒸腾速率的变化相似。2 0 p e g 浓度处理的黄檗幼苗在胁 迫的第4 h 时其气孑l 导度出现负值。此时的黄檗幼苗叶片为防止组织过度失水而 出现卷蓝现象，气孔已完全关闭。另外，测定值出现负值也说明此时黄檗幼苗叶 片受到水分的影响，其正常的光合生理活动被打破，生理状态已严重紊乱( 图 2 - 8 ) 。 2 4 6 不同浓度p e g 处理对黄檗叶片中小檗碱含量的影响 有关研究表明，水分胁迫有利于植物中生物碱的积累( gr 沃勒等，1 9 8 4 ) 。 但通过对黄檗幼苗用不同浓度的p e g 模拟干旱处理的结果表明，在不同浓度的 00 3 0 0 2 00 l 0u ，51l5z345， 处理时问t i m e ( h ) 图2 9 不同浓度p e g 胁迫处理下黄檗幼苗叶片中小檗碱含量变化 f i g 2 - 9 v a r i a t i o no f b e r b e r i n ec o n t e n ti nl e a v e so f p a t a n s es e e d l i n g su n d e rp e g $ 仃e s s p e g 胁迫条件下生长的黄檗，叶片中小檗碱的含量一直呈上升趋势，达到最大 值后又下降，但胁迫处理9 h 的黄檗幼苗叶片中小檗碱的含量均比对照含量高。 ( 图2 - 9 ) 。 2 5 小结与讨论 植物遭受干旱胁迫后，根系吸水困难， 分损失来维持体内的水分平衡( 彭祚登等， 植物首先通过保持水分吸收和减少水 1 9 9 8 ) 。为减少植物叶片水分的散失， 龌pt。叫耍_r日苫兰340。)蚺如罐霉划 东北林业大学搏l 学位论义 植物叶片的气孔会部分关闭，但在保持水分的同时，也限制了c 0 2 的进入，从 而影响了光合作用，使得叶绿体在碳同化过程中利用c 0 2 的能力受到限制，能 耗降低，光合电子传递给0 2 的比例相对增加，因而形成o 一2 和h 2 0 2 ，另外在线 粒体和细胞质以及质膜上也产生氧自由基。植株细胞内积累了过量的氧自由基， 增大了膜脂上不饱和脂肪酸的过氧化，形成了许多的m d a 等过氧化产物( 林植 芳等，1 9 8 4 ) 。膜脂过氧化产物的增多，也表明叶膜细胞已被伤害，最终导致了 膜的结构及生理完整性的破坏，这已被多数研究者所认可( 王建化等，1 9 8 9 ；杨 暹等，1 9 9 8 ) 。黄檗在p e g 模拟干旱胁迫下，叶片质膜相对透性增加，m d a 生 成增多，与前人研究结果一致。 脯氨酸作为植物抗逆反应的一个重要指标已被研究者认同( 汤章城，1 9 8 4 ； 斯钦巴特尔等，1 9 9 7 ；李波等，2 0 0 3 ) ，黄檗在模拟干旱胁迫下脯氨酸含量先降 低后升高，而且浓度越大的p e g 处理，脯氨酸升高的越多。说明脯氨在植物体 的累积有助于提高黄檗幼苗的抗旱性，其高低可以作为鉴定黄檗抗旱性的生化指 标。 植物在干旱条件下活性氧增加，抗旱性强弱与细胞对活性氧的清除能力有关 ( 蒋明义等，1 9 9 6 ) 。s o d 作为清除活性氧的一个关键酶，对植物的抗性研究意 义较大。黄檗在p e g 胁迫下，短时间内，s o d 活性升高，但随着胁迫时间的增 长，酶活性下降，表明植物细胞在渗透胁迫下能忍受的活性氧水平可能存在一个 阈值，超过了这个阈值，胁迫可能导致植物受到较大损伤。 植物在干旱胁迫下光合速率降低已被证实，黄檗幼苗在p e g 模拟干旱胁迫 下光合速率的变化呈降低趋势，浓度越大，对幼苗光合影响越大。植物蒸腾速率 是受气孔导度调节和一个生理过程。在干旱胁迫下。黄檗幼苗叶片的气孔导度降 低，进而造成蒸腾下降。 在逆境情况下，植物次生代谢产物含量的变化是一个新的研究点。有研究表 明，植物在逆境下其次生代谢产物含量会提高( m a n n i n e ne ta l ，2 0 0 2 ；z uy u a n g a n g 吖a l ，2 0 0 3 ：s a t ut u r t o l ae la l ，2 0 0 3 ) 。在对黄檗幼苗在不同浓度p e g 胁迫下， 小檗碱含量随胁迫时间延长面舟高，胁迫一定时间后，含量又下降。并且不同浓 度的p e g 处理小檗碱含量达到最大值的时间不完全一致。 黄檗干旱生理基础及差异蛋白质组学研究 3 黄檗叶片蛋白质的提取及s d s 凝胶电泳分析 3 1 试剂与仪器 3 1 1 药品与试剂配制 本论文从黄檗叶片中提取蛋白质及进行s d s 电泳所用药品及试剂如下 药品： t c a ( 三氯乙酸)上海化学试剂公司 p h a r m a l y t e p h 3 1 0 ( 两性电解质)沃德赛斯生物公司 磷酸天津市化学试剂三厂 乙酸北京化工厂 丙酮北京化工厂 乙醇北京化工厂 d t ts i g m a s d ss i g m a a p ( 过硫酸铵)s i g m a t e m e ds i g m a t h i o u r e a ( 硫脲)s i g m a u r e a ( 尿素)s i g m a e d t as i g m a p v p - 4 0s i g m a g l y s i n e n o v o n a c r y l a m i d e ( 丙烯酰胺) n o v o n t r i s - b a s ea m r e s c o b i s - a c r y l a m i d e ( 二叉丙烯酰胺) a m r e s c o c l y c e r o l ( 甘油) a m r e s c o c o o m a s s i er 2 5 0a m r e s c o c o o m a s s i eg 2 5 0a m r e s c o c h a p sa m r e s c o p m s fa m r e s c o b s aa m r e s c 0 东北林业大学博十学位论文 试剂： d d h 2 0 ：是经过食用纯净水器过膜后再进行双蒸处理得到 蛋白质提取用试剂及其配制： 10 t c a 丙酮溶液配制： l o t c a ( 、“v ) 0 ，0 7 d t t ( w v ) 丙酮至终体积 8 0 丙酮溶液配制： 8 0 丙酮( v v ) o 0 7 d t t ( w v ) d d h2 0 至终体积 裂解液所用试剂及配比： 试剂配比 尿素( u r e a ) 硫脲( t h i u r e a ) c h a p s d t t p h a r m a l y t e ( p h 3 1 0 ) e d t a p m s f ( 用时加入) d d h 2 0 8 m 2 m 2 w v l w v 2 5 v v l m m l m m 至终体积 电泳试剂及配制： 丙烯酰胺储液：3 0 a c r y l a m i d e + 0 8 b i s a c r y l a m i d e 4 分离胶缓冲液( 4 x r e s o l v i n gg e lb u f f e r ) 1 5 mt r i s h c i ，p h 8 8 4 x 浓缩胶缓冲液( 4 x s t a c k i n gg e lb u f f e r ) ：1 o m t r i s h c i ，p h 6 8 1 0 s d s 1 0 过硫酸铵 2 样品缓冲液： ( 2 x t r e a t m e n tb u f f e r ) ：0 1 2 5 mt r i s h c i ，4 ( m v ) s d s s d s - p a g e 电泳缓冲液：o 0 2 5 my r i s ；0 1 9 2 mg l y c i n e ：0 1 s d s 染色试剂： 考玛斯亮蓝染色液：0 1 考玛斯亮蓝r 2 5 0 ：5 0 无水乙醇；1 0 乙 酸；4 0 d d h 2 0 脱色试剂： 黄檗干早生理基础及差异蛋白质组学研究 考玛斯亮蓝脱色液：1 0 无水乙醇；1 0 冰醋酸；8 0 d d h 2 0 蛋白质定量用试剂： b r o a d f o r d 液：o 0 0 7 考玛斯亮蓝g 2 5 0 ；5 9 5 乙醇；8 5 乙酸 1 0 磷酸 干胶液：4 0 醇；1 0 甘油；7 5 冰乙酸 3 1 2 仪器设备 h o e f e rs e 6 0 0 冷却式垂直电泳系统( 1 4 x 1 6 c m )a m e r s h a mp h a r r n a c i a e p s6 0 1 电源a m e r s h a mp h a r m a c i a s i g m a3 k 3 0 高速冷冻离心机s i g m a u n i c o210 0 型可见光分光光度仪上海尤尼柯 r e v c o 超低温冰箱美国 干胶设备promega 微量移液器gi l s o n 干式恒温器国产 快速混匀器国产 纯水仪国产 t s - 1 0 0 脱色摇床国产 3 2 黄檗叶片中蛋白质的提取 对于不同类型的蛋白质进行样品制备时，需要采用不同的方法和条件。某些 蛋白在天然状态下与细胞膜、核酸或其他蛋白质形成复合物；某些蛋白形成各种 非特异性聚合体；而某些蛋白蛋在脱离其正常环境时则发生沉淀。溶解的效果依 靠选择细胞破碎方法、蛋自解聚和溶解方法、去污剂和裂解液成分等方法来实现。 如果其中任何一个步骤没有得到优化，分离很可能是不完全的，或者样品被修饰， 导致重复性降低。 从黄檗叶片中提取全蛋白遵循以下原则： l 、尽可能采用简单的方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。 2 、尽可能减少蛋白的降解。在制备时保持低温并加入蛋白酶抑制剂以防止 蛋白的降解。 3 、通过高速离心清除所有杂质 4 、由于裂解液中有尿素加入，加温不能超过3 7 ，以防止氨甲酰化。 本论文利用t c a 丙酮法从黄檗叶片中提取蛋白，采用尿素，硫脲裂解液法来 裂解黄檗叶片全蛋白，具体的提取步骤见图3 一l 。这种提取蛋白质的方法对于黄 檗这种植物来说，是一种比较好的提取方法，能较好去除蛋白质中的盐离子，这 东北林业人：学博士学位论文 将在论文后续的双向电泳中能加以证实。 再加液氨研磨一次后加液氪将叶粉集中( 所用金属药匙预冷) l 叶粉转入i 5 m l 离心管中 i 去上清液，沉淀加1 m l8 0 冷丙酮混匀。- 2 0 保存o 5 h i 去t ：清液，沉淀加1 mj 8 0 冷丙酮混匀，2 0 保存o5 h 4 c ，3 0 0 0 0 9 离心2 0 r a i n 图3 1 黄檗叶片中全蛋白的提取步骤 f i g 3 1f l o wc h a r to ff u l lp r o t e i ne x t r e c t e df r o ml e a v e so f pa m u r e n s e ，+ 黄檗干旱生理基础及差异蛋白质组学研究 3 3 蛋白质定量 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目 前常用的有以下几种方法：定氮法、双缩尿法( b i u r e t 法) 、紫外吸收法、l o w r y 法( f o l i n 酚试剂法) 、b r a d f o r d 法( 考玛斯亮蓝法) 等。 定氮法比较繁复，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标 准蛋白。 紫外吸收法简便、灵敏、快速不消耗样品，测定后样品仍能回收利用。缺 点是准确度较差，干扰物质多，用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标 准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。 l o w r y 法是较早发展的一种灵敏的检测方法，最低灵敏度为5 9 9 ，通常测定 范围2 0 2 5 0 9 9 。优点是灵敏度高，缺点是费时较长，要精确控制操作时间，标 准曲线不是严格的直线形式，且专一性差，干扰物质较多。 b r a d f o r d 法是灵敏度更高的一种方法，优点有：灵敏度高，比l o w r y 法高4 倍左右，最低检测达1 5 p g ；测定快速、简便，染色稳定；干扰物质少。缺点 是用于不同蛋白质测定时有较大的偏差； 这四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质 溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无 缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精 确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。根 据实验要求，本论文采用b r a d f o r d 法来定量从黄檗叶片中提取得到的蛋白质。 b r a d f o r d 法定量蛋白原理：在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色 的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在 5 9 5 n m 处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系， 因此可检测5 9 5 n m 光吸收值的大小来计算蛋白质的含量。 3 4 蛋白质浓度的标准曲线 标准蛋白为牛血清白蛋白( b s a ) 。 按汪家政( 2 0 0 3 ) b r a d f o r d 法进行标准蛋白的标准曲线绘制，由于使用光程 为l c m 的玻璃比色杯，包括标准蛋白在内的所用试剂都增加到原来3 倍，震荡 混匀，3 m i n 后从中取3 m l 溶液在可见光分光光度仪使用波长为5 9 5 n m 下比色测 定，所有测定在1 0 m i n 内完成。结果见图3 - 2 所示。建立吸光度值( y ) 依蛋白 质浓度( x ) 而变化的回归方程式：y = 0 0 9 1 1 x - 0 0 4 5 4 ( r 2 = o 9 8 5 6 ) ，然后根据 吸光度值求样品蛋白质浓度。 东北林业大学博士学位论文 坦 求 督 02 557 5l o1 2 51 51 7 ，52 0 蛋白质浓度ug ul 图3 - - 2 标准蛋白( b s a ) 浓度标准曲线 f i g3 2 s t a n d a r dc a l v eo f b s a 3 5 黄檗叶片蛋白质s d s 凝胶电泳 采用a m e r s h a mb i o s c i e n s e s 公司s e 6 0 0 凝胶电泳系统和e p s 6 0 1 电源，对p e g 浓度为5 、1 0 、1 5 和2 0 四个不同处理后的黄檗叶片提取的蛋白进行电泳， 分离胶浓度1 2 5 ( 表3 - 1 ) ，4 的堆积胶( 表3 2 ) ，蛋白上样量为2 0 “g ，每个 泳道上样为2 0 此，蛋白质分子量标准为上海华舜低分子量标准蛋白。电泳在1 0 冰箱中进行。电泳条件为不限制电压和功率( 分别设置为4 5 0 v 和2 0 w ) ，电流 为在电泳开始时每胶1 6 m a ，当电泳进行至溴酚蓝前端达到分离胶时，此后电流 为每胶3 2 m a 。约4 至6 个小时电泳结束。 s d s - p a g e 电泳胶配制如下( 表3 - 1 和表3 2 ) ： 表3 - 1 3 0m l1 2 5 分离胶配制 t a b l e3 - 1e l e m e n ta n dd o s a g eo f1 2 5 r e s o l u t i o ng e l ( 3 0 m l ) 溶液体积 丙烯酰胺储液 4 分离胶缓冲液 1 0 s d s d d h 2 0 a p t e m e d 毗 l l 也 u 铀眦m钿扯儿 垃 吣蝣僦珥 黄檗干旱生理基础及差异蛋向质绢学研究 表3 21 0 m l4 分离胶配制 t a b l e3 - 2e l e m e n ta n dd o s a g eo f 4 s t a c kg e l ( 1 0 m l ) 溶液体积 丙烯酰胺储液 4 x 浓缩胶缓冲液 1 0 s d s d d h 2 0 a p t e m e d 电泳所使用的低分子量标准蛋白质m a r k e r 的分子量依次为：9 7 4 k d ( 兔磷 酸化酶b ) 、6 6 2 k d ( 牛血清白蛋白) 、4 3 k d ( 兔肌动蛋白) 、3 1 k d ( 牛碳酸酐 酶) 、2 0 1 k d ( 胰蛋白酶抑制剂) 和1 4 4 k d ( 鸡蛋清溶菌酶) 。 电泳结束后，凝胶染色采用考玛斯亮蓝染色液染色。目前，考玛斯亮蓝染色 是蛋白质组学研究中对蛋白质染色较常用的一种方法，它既克服了氨基黑染色灵 敏度不高和进行定量扫描的限制，又比银染色简便，尽管银染色的分辨率远高于 考玛斯亮蓝染色，但考染的可重复性、可定量性以及迸行生物质谱的后续工作时 的简易性是银染无法相比的，因此本论文中无论是s d s p a g e 还是后面的2 - d e 均使用考玛斯亮蓝染色和脱色。其步骤为：用考玛斯亮蓝染色液室温下染色2 3 h 或更长时问，但不能超过1 2 小时，然后用考玛斯亮蓝脱色液脱色，并且每隔 2 4 小时换次脱色液，脱色至背景色满意为止。 凝胶脱色后进行电泳结果扫描，并使用i m a g e m a s t e r 2 de l i t e2 0 0 3 进行差异 带的分子量分析。 3 6 干胶制备 将数字化后的凝胶用p r o m e g a 干胶设备制成千胶，以便长期保存，具体操作 步骤如下： 1 、将脱色完后的凝胶置入干胶液中浸泡3 5 分钟。 2 、把一个干胶框放在一个干净、光滑的平面上，将已在干胶液中浸泡过后 干胶薄膜居中放置在框上，使干胶膜尽量展平。 3 、把浸泡好的干胶小心取出放在干胶薄膜上，赶净胶和干胶薄膜之间的气 泡以免在干燥过程中裂胶。 4 、将第二张薄膜也放在干胶液中浸泡1 2 分钟后取出，慢慢地覆盖在胶上， 放置过程中要防止气泡产生。 m m旺札儿 。 笛娜呲 东北林业大学博士学位论文 5 、将第二个于胶框放在第一个的上面并对齐，从干胶框的一边将干胶薄膜 露在外面的边缘包在框上。 6 、用夹子夹住干胶框边缘，垂直放置