（遗传学专业论文）栉孔扇贝chlamys+farreri大片段基因组文库的构建及应用分析.pdf

嬲嬲 栉孔扇贝( c h i a m y sf a r f e f i ) 大片段基因组文库的构建 及应用分析 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得l 洼；垫遨直基丝螽塞擅型童塑的! 本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：移沾 签字日期：j 。f 。年月1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将 本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服 务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：。才娶沌 导师签字： 签字日期：jp ，口年6 , qj 日 签字日期：力，拜月 日 _ 栉孔扇贝( c h l a m y s j a r r e d ) 大片段基因组文库的构建及应用分析 栉孔扇贝( c h l a m y sf a r r e r i ) 大片段基因组文库的构建及应用 分析 摘要 栉孔扇贝( c m a m y sf a r t e r l 3 是我国北方最重要的海水经济养殖贝类之一，在 海水养殖产业中占有极其重要的地位。而大片段基因组文库是当前分子遗传学和基 因组学研究必不可少的工具，为了深入开展栉孔扇贝( c h l a m y s 如r 阳r f ) 基因组学 研究、阐明其基因组的结构与功能、图位克隆重要功能基因、构建高密度物理图谱 并最终实现与已有遗传连锁图的整合，本研究成功构建了栉孔扇贝f o s m i d 文库，并 在其构建技术的基础上，以细菌人工染色体( b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ，b a c ) 为载体，成功构建了栉孔扇贝的b a c 文库。进一步通过栉孔扇贝f o s m i d 文库和微卫 星连锁图谱，对文库进行了基础研究的应用。主要结果如下： 1 、栉孔扇贝f o s m id 基因组文库的构建和鉴定 本研究构建了第一个栉孔扇贝的f o s m i d 基因组文库，该文库包含1 3 3 ，8 5 1 个 克隆。对随机挑取的8 0 个克隆的限制性酶切分析表明，克隆的空载率低于1 2 5 ， 克隆的插入片段大小分布在3 0 - - 4 5 k b ，插入片断平均长度为4 0 k b 。该文库覆盖栉孔 扇贝基因组的4 3 倍，得到任意单拷贝d n a 序列的概率为9 8 7 。f o s m i d 克隆的稳 定性检测实验表明栉孔扇贝d n a 在f o s m i d 传代中表现得较为稳定，没有发现插入片 段的丢失或重排。为了方便后续的p c r 筛选，我们对所有的克隆进行了超级池和二 级池的构建，并利用所构建的超级池和二级池筛选了2 个基因和7 个微卫星，结果 阳性克隆数介于2 到8 之间。由此可见，该文库可以很好的用于目的基因或标记的 筛选，将有利于物理作图和基因的图位克隆研究。 。 2 、栉孔扇贝b a c 文库的构建和鉴定 本研究以一只栉孔扇贝为材料，成功构建了两个栉孔扇贝b a c 文库，分别为 栉孔扇贝l g f ，c 硼y s | 咖e ，i ) 大片段基因组文库的构建及应用分析 厥槲i 文库和h i n d l i i 文库，其中b a n f i i 文库包含3 3 ，7 2 8 个b a c 克隆，平均插入片 段约为8 0k b ，覆盖栉孔扇贝基因组约2 1 倍：h i n d l l l 文库包含9 7 ，6 8 0 个b a c 克 隆，平均插入片段约为1 0 2k b ，覆盖栉孔扇贝基因组约7 7 倍。两个栉孔扇贝b a c 文库总共由1 3 1 ，4 0 8 个克隆组成，平均插入片段约为9 6 k b ，覆盖率为栉空扇贝单倍 体基因组9 8 倍。对随机挑取的6 0 个b a c 克隆进行限制性酶切分析表明，克隆的空 载率低于1 6 7 ，从文库中得到任意单拷贝d n a 序列的概率为9 6 8 。b a c 克隆的稳 定性检测实验表明栉孔扇贝d n a 在b a c 传代中表现得较为稳定，没有发现插入片段 的丢失或重排。为了方便后续的p c r 筛选，我们对所有的克隆进行了超级池和二级 池的构建。由此可见，该b a c 文库可以很好的用于物理作图和基因的图位克隆研究， 也为将来栉孔扇贝的大规模基因组测序提供了一个良好的平台。 3 、大片段基因组文库的应用：栉孔扇贝遗传图谱与物理图谱的整合初试 本研究利用第一个栉孔扇贝f o s m i d 文库以及微卫星遗传连锁图谱，通过构建 f o s m i d 文库的三维两步p c r 筛选系统，选取分布于栉孔扇贝1 9 个连锁群上的1 1 0 个微卫星标记对部分文库( 2 7 基因组) 进行筛选和分析，总共1 0 2 个微卫星标记 ( 9 2 7 ) 经筛选得到至少一个阳性克隆，最终得到1 9 5 个含有微卫星标记的f o s m i d 克隆，每个标记的阳性克隆数介于l 到7 之间。这1 9 5 个f o s m i d 克隆与连锁图谱上 的微卫星标记相关联，实现了f o s m i d 克隆与遗传连锁图的整合。同时，我们构建了 一个包含f o s m i d 克隆、与其相关联的微卫星位点、扩增引物与p c r 条件等相关信息 的数据库。 另外，本研究还将f o s m i d 文库的三维两步p c r 筛选与a f l p 技术结合起来，初 步尝试建立一种高通量的筛选文库中含有a f l p 标记信息克隆的系统。我们用一对 a f l p 引物组合对f o s m i d 文库的8 个超级池进行了分析，共得到4 6 个阳性克隆，这 都为今后栉孔扇贝物理图谱的构建，以及高质量的遗传图谱与物理图谱的整合提供 了一个经济、高效的技术平台。 上述的研究，都是栉孔扇贝目的基因的筛选以及图位克隆，细胞遗传图和物理 图的构建以及遗传连锁图谱和物理图谱整合等研究的有力工具，也为将来栉孔扇贝 大规模基因组测序以及其结构和功能基因组学研究提供了良好的平台 关键词：栉孔扇贝( c h l a m y sf a r r e r f ) ；f o s m id 文库；b a g 文库；遗传连锁图谱； 物理图谱；图谱整合 栉孔扇( c h l o m y s i o r r e r i ) 大片段基因组文库的构建及应用分析 c o n s t r u c tio na n da p p i c a tio no fl a r g ein s e r t lib r a rie sf o rz hik o n gs c a i io p ( c h i a m y sf a r r e r 力 a b s t r a c t z h i k o n gs c a l l o p ( 劬j a 啦矿sf a r t e r l 9 i so n eo ft h em o s tc o m m e r c i a l l y i m p o r t a n tb i v a l v e si nc h i n a ，b u ts t u d yo ni t sg e n o m ei su n d e r d e v e l o p e d t o a p p l y g e n o m e b a s e d t e c h n o l o g i e s f o r g e n e t i c i m p r o v e m e n t s u s i n g m a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n ，g e n o m er e s e a r c hi n v o l v i n gl a r g e i n s e r tg e n o m e 1 i b r a r yc o n s t r u c t i o n ，g e n e t i c1 i n k a g em a p p i n ga n dp h y s i c a l m a p p i n gi s r e q u i r e d ，a n di n t e g r a t i o no fg e n e t i ca n dp h y s i c a lm a p sw o u l ds i g n i f i c a n t l y e n h a n c et h ec a p a c i t i e sf o rg e n o m er e s e a r c h i nt h i ss t u d y ，t h ef i r s tf o s m i d 1 i b r a r ya n da n o t h e rt w ob a c1 i b r a r i e so fz h i k o gs c a l l o pa r ec o n s t r u c t e da n d c h a r a c t e r i z e d a d d i t i o n a l l y ，1 i n k a g e g r o u ps p e c i f i cc l o n e sf r o m f o s m i d li b r a r ya r es c r e e n e dw i t hm a r k e r so nt h em ic r o s a t e l lit e1i n k a g em a po f z h i k o n gs c a l l o p t h em a j o rr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 c o n s t r u c t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no ff o s m i dl i b r a r yi nz h i k o n gs c a l l o p t h ef i r s tz h i k o n gs c a l l o pf o s m i di i b r a r yw a sc o n s t r u c t e di nt h i ss t u d y i tc o n s i s t so f1 3 3 ，8 5 1c l o n e sw i t ha na v e r a g ei n s e r ts i z eo fa b o u t4 0k b ， a m o u n t i n gt o4 3g e n o m ee q u i v a l e n t s f o s m i ds t a b i l i t ya s s a y si n d i c a t et h a t z h i k o n gs c a l l o pd n aw a ss t a b l ed u r i n gp r o p a g a t i o n i nt h ef o s m i ds y s t e n l l i b r a r ys c r e e n i n gw i t ht w og e n e sa n ds e v e nm i c r o s a t e l l i t em a r k e r sy i e l d e d b e t w e e n2a n d8p o s i t i v ec l o n e s ，a n dn o n eo ft h o s et e s t e dw a sa b s e n tf r o m t h e1 i b r a r y t h ef o s m i d1 i b r a r yw i l ls e r v ea sa u s e f u lr e s o u r c ef o rp h y s i c a l m a p p i n ga n dp o s i t i o n a lc l o n i n g ，a n dp r o v i d e ab e t t e ru n d e r s t a n d i n go f z h i k o n gs c a l l o pg e n o m e 2 c o n s t r u c t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o no ft w ob a cl i b r a r i e si nz h i k o n g s c a l l o p t w oz h i k o n gs c a l l o pb a cl i b r a r i e sw e r ec o n s t r u c t e dw i t hb 融d l ia n dh i 优i i i i s e p a r a t e l y ，u s i n go n l yo n es c a ll o pi n d i v i d u a l t h e w h o l eb a cli b r a r y c o n s i s t so f1 3 3 ，8 5 1c l o n e s ( 3 3 7 8 2a n d9 7 6 8 0f o re a c h ) w i t ha na v e r a g ei n s e r t s i z eo fa b o u t9 6 k b ( 8 0 k ba n d1 0 2 k bf o re a c h ) ，a m o u n t i n gt o9 8 g e n o m e e q u i v a l e n t s b a cs t a b i1i t ya s s a y si n d i c a t et h a tz h i k o n gs c a l o pd n aw a s s t a b l ed u r i n gp r o p a g a t i o ni nt h eb a cs y s t e mt h eb a cl i b r a r yw i l ls e r v ea s au s e f u lr e s o u r c ef o rp h y s i c a lm a p p i n ga n dp o s i t i o n a lc l o n i n g ，a n dp r o v i d e ag o o dt o o lf o rl a r g es c a l es e q u e n c i n go fz h i k o n gs c a l l o pg e n o m e 3 i d e n t i f i c a t i o no fi i n k a g eg r o u ps p e c i f i cc l o n e sf r o mf o s m i dl i b r a r yo f z h i k o n gs c a l l o p ：ar e s o u r c ef o ri n t e g r a t i o no fl i n k a g ea n dp h y s i c a lm a p s t h ef i r s tz h i k o n gs c a ll o pf o s m i dii b r a r yw a su s e dt oc o n s t r u c t t h r e e d i m e n s i o n a lp c rs c r e e n i n gs y s t e m ，11 0m i c r o s a t e lli t em a r k e r sf r o m1 9 l i n k a g eg r o u p so fz h i k o n gs c a l l o pw e r eu s e dt os c r e e nas u b s e t ( 2 7x ) o f t h ef o s m i dl i b r a r y o ft h e1 1 0m i c r o s a t e l l i t e s ，1 0 2 ( 9 2 7 ) g a v ea tl e a s t o n ep o s i t i v ec l o n ea n d8 ( 7 3 ) f a il e dt oh i ta n yc l o n e a sar e s u l t ，1 9 5 p o s i t i v ef o s m i dc l o n e sr e p r e s e n t i n g1 9l i n k a g eg r o u p sw e r ei d e n t i f i e d ， f u r t h e rv e r i f y i n gt h eg e n o m ec o v e r a g ea n du t i l i t yo ft h e1 i b r a r y t h e s e l i n k a g eg r o u p s p e c i f i cc l o n e sp r o v i d er e s o u r c e se s s e n t i a lf o rr e s e a r c ho f t h ez h i k o n gs c a ll o p sg e n o m e ，c o n n e c t i n gli n k a g eg r o u pt oi t sc h r o m o s o m e ， p h y s i c a lm a p p i n ga n di n t e g r a t i o no ft h eg e n e t i cm a pa n dp h y s i c a lm a p a n o t h e r ，ah i g h t h r o u g h p u tp c r b a s e ds c r e e n i n gm e t h o dw a sd e v e l o p e d w h i c hc o m b i n e sf o s m i dt h r e e d i m e n s i o n a lp c rs c r e e n i n gs y s t e ma n da m p li f i e d f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h is m ( a f l p ) t e c h n o l o g y w eu s e d1a f l pp r i m e rt o s c r e e n8s u p e r p o o l so ft h ef o s m i d1i b r a r y ，a n dg o t4 6a f l p - l i n k e dp o s i t i v e c l o n e s t h i sm e t h o d o l o g ya ll o w e du st oi d e n t i f yf o s m i dc l o n e sc o n t a i n i n g a f l pg e n e t i cm a r k e r s ，c a nl i n kd n a b a s e dp h y s i c a lm a pt ot h ez h i k o n gs c a l l o p g e n e t i cm a p t h i sc o m b i n a t i o no fa p p r o a c h e sp r o v i d e sa l o wc o s t ，e f f i c i e n t w a yt ob u i l dh i g h q u a l i t yi n t e g r a t e dg e n e t i ca n dp h y s i c a l g e n o m em a p s k e yw o r d s ：z h i k o n gs c a l l o p ( l 7 7 1 a m 彤$ j f j a r r e r l 7 ：f o s m i dl i b r a r y ；b a cl i b r a r y ； g e n e t i cl i n k a g em a p ；p h y s i c a lm a p p i n g ；m a pi n t e g r a t i o n 栉孔扇贝( c h l o m y s f o r r e d ) 大片段基因组文库的构建及应用分析 栉孔扇( c h l o m y s f o r r e r i ) 大片段基因组文库的构建及应用分析 目录 第一章文献综述1 o 引言1 1 大片段基因组文库的发展1 1 1 第一代载体2 1 2 第二代载体4 1 3 第三代载体8 2 大片段基因组文库的构建及鉴定9 2 1 高分子量( 嗍) d n a 的制备1 0 2 2 载体的制备1 0 2 3m j l d n a 的部分酶切1 0 2 4 适合大小d n a 片段的选择和回收1 1 2 5 连接和转化1 2 2 6 阳性克隆的挑取和筛选1 2 2 7 文库的质量鉴定1 2 3 大片段基因组文库的应用：物理图谱的构建1 3 4 本研究的目的和意义1 5 第二章栉孔扇贝f o s m i d 文库的构建和鉴定1 7 第一节栉孔扇贝f o s m i d 文库的构建1 7 o 引言1 7 l 材料与方法1 7 1 1 材料1 7 1 2 试剂1 7 1 3 仪器1 9 1 4 方法1 9 2 结果与分析2 3 2 1 高质量d n a 的获得2 3 2 2 合适d n a 片段的回收与连接2 4 2 3 包装和转导2 5 2 4 克隆的保存2 6 2 5 超级池和二级池的构建2 6 3 讨论2 7 3 1 栉孔扇贝f o s m i d 文库构建技术体系的建立2 7 第二节栉孔扇贝f o s m i d 文库的质量鉴定2 8 o 引言2 8 1 材料与方法2 8 1 1 插入片段大小的检测2 8 1 2 克隆的稳定性检测2 9 栉孔扇贝( c h l a m y s a r r e r t ) 大片段基因组文库的构建及应用分析 1 3 微卫星与基因的p c r 筛选2 9 2 结果与分析2 9 2 1f o s m i d 克隆的限制性酶切分析2 9 2 2f o s m i d 文库覆盖率的估算3 0 2 3f o s m i d 克隆的稳定性检测3 0 2 4f o s m i d 文库的筛选3 0 3 讨论3 2 3 1 栉孔扇贝f o s m i d 文库的质量鉴定3 2 第三章栉孔扇贝b a c 文库的构建和质量鉴定3 4 第一节栉孔扇贝b a c 文库的构建3 4 o 引言3 4 1 材料与方法3 4 1 1 材料3 4 1 2 试剂及耗材3 5 1 3 仪器4 0 1 4 方法4 0 2 结果与分析5 2 2 1 琼脂糖包埋法高质量m e g a b a s ed n a 提取5 2 2 2 高分子量d n a 部分酶切及最佳酶量的确定5 4 2 3 大片段d n a 的二次选择和电洗脱回收5 6 2 4 连接和电转化5 7 2 5 文库的保存5 8 2 6 超级池和二级池的构建5 9 3 讨论6 0 3 1 栉孔扇贝高分子量基因组d n a 提取方法的改进6 0 3 2 高分子量基因组d n a 的分离条件优化6 0 3 3 连接与电转化6 l 3 4 限制性内切酶的选择6 2 第二节栉孔扇贝b a c 文库的质量鉴定6 3 o 引言6 3 l 材料与方法6 3 1 1 插入片段大小的检测6 3 1 2 克隆的稳定性检测6 4 2 结果分析6 4 2 1b a c 克隆平均插入片段大小及文库覆盖率6 4 2 2b a c 克隆的稳定性6 6 3 讨论6 6 3 1 栉孔扇贝b a c 文库质量鉴定6 6 3 2 栉孔扇贝大片段基因组文库比较分析6 7 栉孔扇( c h l a m y s f a r r e d ) 大片段基因组文库的构建及应用分析 第四章栉孔扇贝大片段基因组文库的应用：遗传图谱与物理图谱的整 合初试6 9 第一节栉孔扇贝遗传连锁的微卫星标记在大片段基因组文库中的筛选 和鉴定6 9 o 引言6 9 1 材料与方法6 9 1 1 材料6 9 1 2 方法6 9 2 结果与分析7 1 2 1 超级池、二级池的构建与p c r 筛选系统的建立7 1 2 2 微卫星筛选结果7 2 3 讨论8 5 3 1 实验结果对文库质量的反映8 5 3 2 遗传图谱与物理图谱的整合8 5 3 3 文库筛选与f i s h 定位8 7 第二节高通量的基于a f l p 的遗传图谱与物理图谱整合的方法尝试8 9 o 引言8 9 1 材料与方法8 9 1 1 材料8 9 1 2 仪器8 9 1 3 试剂9 0 1 4 方法9 0 2 实验结果9 4 3 讨论9 6 3 1 以a f l p 为基础的文库筛选系统9 6 3 2 总结9 7 本论文创新点9 8 参考文献9 9 致谢1 0 8 个人简历1 1 0 发表的学术论文1 1 0 获得奖励1 1 l 栉孔扇( c h l o m y s f a r r e r i ) 大片段基因组文库的构建及应用分析 栉孔扇i 贝( c h l a m y s j a r r e d ) 大片段基因组文库的构建及应用分析 第一章文献综述 o 引言 自上个世纪八十年代中期开始，随着人类基因组计划的启动，基因组学已经 成为当前生命科学研究的热点和重点之一。在基因组学研究中，大片段基因组文 库( l a r g e i n s e r tg e n o m el i b r a r y ) 、物理图谱( p h y s i c a lm a p ) 和高密度遗传连 锁图谱( g e n e t i cl i n k a g em a p ) 的构建是必要的基础工作。大片段基因组文库由 于其较大的容量、遗传的稳定性和易操作性等特点而被广泛应用于人类、动植物 和微生物的基因组研究中，在物理图谱构建、全基因组测序、基因图位克隆、基 因结构功能和进化等研究中起到了重要作用，已经逐渐成为基因组学研究的关键 平台。 海洋约占地球总面积的7 1 ，孕育着丰富的生物资源，每年向全世界提供约 9 0 0 0 万吨的渔产品，为人类的生存发展做出了巨大的贡献。在人类基因组计划 的带动下，越来越多的动植物基因组计划相继启动。与陆地生物相比，海洋生物 的基因组计划起步稍晚，但海洋生物以其独特的发育和进化地位以及重要的经济 价值，很快成为生物学以及基因组学研究的热点。栉孔扇贝( c h l a m y sf a r r e r i ) 是我国传统的经济养殖贝类，具有很高的经济价值，并在生态环境检测和进化中 有重要意义，近些年来，关于其的基因组研究已经开始并在逐步深入。为了进一 步深入开展栉孔扇贝( c h l a m y sf a r r e r i ) 基因组学研究、阐明其基因组的结构 与功能、图位克隆重要功能基因、构建高密度物理图谱并最终实现与已有遗传连 锁图的整合，对其进行大片段基因组文库的构建以及应用分析具有很重要的意 义。 1 大片段基因组文库的发展 作为遗传学研究的重要内容，基因组文库的概念早在上世纪7 0 年代就已提 出( c l a r k e 等，1 9 7 6 ) 。基因组文库是指含有某种生物全部基因的随机片断的重 组d n a 克隆群体。这个文库象是一个贮存有基因组全部序列的信息库，故称为基 因组文库( g e n o m i c1 i b r a r y ) ，又称为人工构建的基因“活期储蓄所”( g e n o m i c h a n k ) 。 栉孔扇( c h l a m y s j ：a r r e r i ) 大片段基因组文库的构建及应用分析 克隆载体作为基因组文库构建的重要媒介，提高其容纳量一直是重要发展方 向之一，因此大片段基因组文库的发展过程实际上就是大片段克隆载体系统的发 展历程。自1 9 7 3 年c o h e n 构建了第一个质粒载体p s l 0 1 以来( c o h e n 等，1 9 7 3 ) ， 越来越多的克隆载体相继出现，使得克隆载体的整体结构和克隆效率有了很大改 善，极大的推动了结构基因组学和功能基因组学的研究。载体的发展大致经过三 个阶段：第一代是以质粒( p l a s m i d ) 、入噬菌体( 入b a c t e r i o p h a g e ) 和粘粒 ( c o s m i d ) 为代表的载体；第二代的代表为酵母人工染色体y a c ( y e a s t a r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ) 、细菌人工染色体b a c ( b a c t e r i a la r t i f i c i a l c h r o m o s o m e ) 及p 1 噬菌体人工染色体p a c ( p l - d e r i v e da r t i f i c i a l c h r o m o s o m e ) ；第三代为近几年发展起来的双元细菌人工染色体b i b a c ( b i n a r y b a c ) 及可转化人工染色体t a c ( t r a n s f o r m a t i o nc o m p e t e n ta r t i f i c i a l c h r o m o s o m e ) 为代表的新型文库载体，其不仅具有第二代载体的所有特征，而且 具备了植物的转化功能。几种克隆载体的性质比较见表1 - 1 。 1 1 第一代载体 1 1 1 入噬菌体和粘粒载体 入噬菌体是在构建大片段基因组文库中最早使用的克隆载体，其插入片断仅 2 0k b 左右( m u r r a y 等，1 9 7 4 ) 。随着研究的开展，出现了c o s m i d 粘粒( c o l l i n s 等，1 9 7 8 ) ，c o s m i d 是一类人工构建的含有入d n a 的c o s 序列和质粒复制子的特 殊类型的质粒载体，能够容纳4 5k b 的外源片段，这比入噬菌体载体的克隆能力 强。r o y a l 等( 1 9 7 9 ) 首先确定了在c o s m i d 载体中克隆大片段的可能性。此后， 粘粒克隆曾用于构建果蝇、小鼠和人的基因组文库，并从数种生物中分离得到基 因( m e y e r o w i t z 等，1 9 8 0 ；g r o s v e l d 等，1 9 8 2 ) 。不过，由于c o s m i d 插入片段 的稳定性较差，限制了它的应用。 1 1 2f o s m i d 载体 1 9 9 2 年k i m 等将p b c 引入p u c c o s ，构建了f o s m i d 载体系统( k i m 等，1 9 9 2 ) 。 该载体在宿主菌中以单拷贝形式存在，稳定性好。而近年来发展的c o p y c o n t r o l 克隆系统共享单拷贝和高拷贝的优点，是用于替代c o s m i d 构建大片段文库的新 载体。图i - i 是e p i c e n t r e 公司的c o p y c o n t r o l 疆f o s m i dl i b r a r yp r o d u c t i o nk i t 中的载体c o p y c o n t r o lp c c l f o s 伯的结构示意图。 2 栉孔塑墨! 竺丝! 竺复! 竺型奎生垦薹里塑壅壁箜塑壅丝查旦坌堑 一 i _ _ - _ _ i _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - - _ _ _ 一 表1 1 几种大片段克隆载体的比较 一 载体种类 结构功能元件来源 宿主细胞 插入片段大小 噬菌体 闭环大肠杆菌 e c o l i 1 7 - 2 0 k b 酵母人工染色体( y a c ) 线状d n a酵母染色体 p 1 衍生人工染色体( 眦)环状质粒p 1 噬菌体 e c o l i 1 0 0 3 0 0 k b 人类人工染色体( h a c ) 线状d n a人类染色体 人组织细胞 1 0 0 0 k b 萝零碧谬甄霪；囊；鍪骥够0 ，琴鉴雾掌 1 ( b i b a e 弛震懿鏊篓囊篷毫纛葛讧；o ：毫慧怒糯薹纛嚣鬣 可转化人工染色体( t a c ) 环状质粒大肠杆菌p 农杆菌 e c o l i l o o k b 亡0 7 21 3 6 1 a 绝i4 5 6 7 图卜1c o p y c o n t r o lp c c l f o s t m 的结构示意图 3 栉孔扇贝( 功j a ，r i 】眄删) 大片段基因组文库的构建及应用分析 分析表明该载体有如下几个优点：其一，它含有大肠杆菌f 因子，保证了 它有较好的稳定性；其二，它含有可诱导的高拷贝复制起始位点，方便了后续工 作的开展；其三，此载体只能携载3 0 一5 0 k b 之间的片段，所以不会出现b a c 文库 和其他文库容易出现的不同位置基因片段的嵌合现象，保证了克隆的准确性。近 年来它已成为大片段基因组文库构建中比较受欢迎的载体之一，并广泛应用于栉 孔扇贝( z h a n g 等，2 0 0 7 ) 、半滑舌鳎( w a n g 等，2 0 0 8 ) 、绿头鸭( m o o n 和m a g o r ， 2 0 0 4 ) ，海鞘( t o m a s o 和w e i s s m a n ，2 0 0 3 ) ，大猩猩( k i m 等，2 0 0 3 ) 和人( g i n g r i c h 等，1 9 9 6 ) 等的基因组研究。 1 2 第二代载体 1 2 1 酵母人工染色体( y e a s ta r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ，y a c ) 第二代克隆载体是以酵母人工染色体( y e a s ta r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ，y a c ) 为主要代表的。与第一代载体比较起来，该载体的最主要特点就是其容载能力的 显著扩大。所谓人工染色体，是指一类能在生物细胞中独立稳定存在和遗传的人 工重组d n a 分子，它至少应具备三种功能元件的类似组份：复制起始区( o r i g i n o fr e p l i c a t i o n ) ，参与染色体d n a 复制起始结构的形成；着丝粒( c e n t r o m e r e ) ， 负责染色体向子细胞的传递；端粒( t e l o m e r e ) ，对染色体d n a 两个末端起封口 和保护作用。酵母人工染色体是最早发展起来的真正意义上的人工染色体，在成 功分离出在寄主细胞中稳定地复制和遗传所必须的三个元件( 复制启动区序列元 件、端粒、中心粒) 之后，这些序列被连于同一线性载体中并引入芽生酵母细胞 中，成为第一条人工染色体( m u r r a y 等，1 9 8 3 ) 。y a c 载体可以插入长达1 m b 甚 至能容纳超过1m b 的外源插入片段( b u r k e 等，1 9 8 7 ) ，可以用来构建复杂基因 组文库，满足了高等生物基因组研究的需要。b u r k e 等( 1 9 8 7 ) 首次构建了人基 因组d n a 的y a c 文库。其后，牛、猪、绵羊、小鼠、果蝇等动物及拟南芥、玉米、 番茄、甜菜、水稻和马铃薯等植物的y a c 文库也纷纷构建完成。虽然y a c 能容 纳较大的片段，但同时也有一些自身难以克服的缺陷：( 1 ) 文库中嵌合现象 ( c h i m e r i s i n ) 严重。即一个y a c 克隆中的插入子可能来自两个或多个不同的片 段，嵌合体的比例达到4 0 6 0 ，这种现象使染色体步行和基因分离难度加大； ( 2 ) 稳定性差( u n s t a b i l i t y ) 。在一些克隆中存在序列重排和插入丢失现象； 这对染色体物理图谱的构建和基因分离都十分不利；( 3 ) 插入d n a 分离与纯化困 4 栉孔扇贝( c h l o m y $ l a r r e r i ) 大片段基因组文库的构建及应用分析 难；( 4 ) 转化效率低，不能使用电转化。这些都限制了y a c 载体的大范围应用。 1 2 2 细菌人工染色体( b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ，b a c ) 鉴于y a c 载体的应用限制，科学家们把目光转向了更好的载体系统。1 9 9 2 年，k i m 和s h i z u y a 利用b a c 载体的前体p b a c 和p u c c o s 融合构建了p f o s i 粘粒载体( k i m 等，1 9 9 2 ) 。同年，两人又成功构建了另一种新型克隆载体系统 b a c 载体系统( s h i z u y a 等，1 9 9 2 ) 。由于它具有y a c 、p 1 噬菌体载体系统 无可比拟的优点而广泛应用于构建人、动植物基因组d n a 大片段插入文库。 细菌人工染色体( b a c ) 是以大肠杆菌致育因子( f 因子) 为基础的合成载 体。f 因子具有稳定遗传的特点，其复制是严谨型的，在每个细胞中仅有i - 2 个 拷贝，减小了插入片段发生重组的机率，理论上f 因子能够携带i m b 的外源片段。 s h i z u y a 等( 1 9 9 2 ) 以大肠杆菌f 因子的复制点，构建了世界上第一个b a c 克隆 载体p b a c l 0 8 l 。该载体的插入片段长度可长达3 0 0k b ，平均长度为1 0 0k b ，其 具有两个克隆位点是h i n d l i i 和b a z b i ，另外有两个n o t i 切点用来释放插入片 段，其遗传结构图见图1 - 2 。即使传1 0 0 代